Lokalizacja immunofluorescencji in vivo do oceny terapeutycznej i diagnostycznej biodystrybucji przeciwciał w badaniach nad rakiem

Ten protokół lokalizacji immunofluorescencji in vivo lub IVIL ocenia biodystrybucję in vivo przeciwciał diagnostycznych i terapeutycznych lub środków opartych na przeciwciałach do badań, wykrywania i leczenia raka. W przeciwieństwie do konwencjonalnego barwienia immunofluorescencyjnego, w którym ekspresja komórkowa antygenów ujawnia się ex vivo, metoda IVIL wyjaśnia, w jaki sposób przeciwciała i czynniki oparte na przeciwciałach rozprowadzają się w żywym zwierzęciu. Ten film pomoże zrozumieć ogólny przebieg pracy metody IVIL.

Pokazuje ważne szczegóły dotyczące pomyślnego odtworzenia protokołu dla innych zastosowań i przeciwciał. Przed kontynuowaniem obserwuj myszy z pożądanego modelu raka pod kątem odpowiedniego wzrostu guza za pomocą badania palpacyjnego lub pomiaru suwmiarką. Oczyścić królicze przeciwciała kontrolne przeciwko myszemu B7-H3 i króliczemu izotypowi IgG na kolumnie odsalającej w celu usunięcia konserwantów i magazynowych zgodnie z instrukcjami producenta.

Podwielokrotne dawki 33 mikrogramów każdego przeciwciała sprzężonego w poszczególnych probówkach do mikrowirówek. Po znieczuleniu zgodnie z opisem w protokole tekstowym należy przygotować się do inokulacji roztworów przeciwciał do żyły ogonowej. Zdezynfekuj ogon zwierzęcia, przecierając go trzykrotnie chusteczką nasączoną alkoholem.

Rozszerz żyły ogonowe, ogrzewając się poduszką rozgrzewającą przez około 30 sekund. Unikaj podgrzewania całego zwierzęcia. Za pomocą cewnika do żyły ogonowej o rozmiarze 27 włóż igłę motylkową do jednej z dwóch bocznych żył ogonowych.

Wizualizuj cofanie się krwi do cewnika, aby upewnić się, że igła jest prawidłowo umieszczona, tak aby roztwory w pełni dostały się do zwierzęcia, a nie zostały schwytane w ogon. Użyj kawałka taśmy chirurgicznej, aby ostrożnie przymocować ogon z włożoną igłą do stolika. Przepłukać cewnik 25 mikrolitrami sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami.

Następnie wstrzyknąć roztwór przeciwciała do cewnika za pomocą strzykawek insulinowych. Ponownie przepłukać cewnik 25 mikrolitrami sterylnego PBS. Usuń igłę z ogona i uciskaj, aby zatrzymać krwawienie.

Przeprowadzić humanitarną eutanazję myszy zgodnie z opisem w protokole tekstowym i ułożyć mysz w pozycji leżącej. Użyj nożyczek chirurgicznych i kleszczy, aby wyciąć tkanki nowotworowe. Użyj kleszczy, aby chwycić tylko zewnętrzną warstwę skóry między zestawem gruczołów sutkowych znajdujących się najbliżej ogona i wykonaj małe nacięcie nożyczkami chirurgicznymi.

Wprowadź zamknięte nożyczki do nacięcia i powoli otwórz końcówkę, aby ostrożnie oddzielić skórę od leżącej poniżej błony ściany brzucha, utrzymując ją nienaruszoną. Wykonaj pionowe nacięcie w górę brzucha, kontynuując oddzielanie skóry od błony wewnętrznej. Pomiędzy trzecim a czwartym gruczołem sutkowym wykonaj poziome nacięcie w poprzek brzucha, aby umożliwić cofnięcie skóry i wizualizację gruczołów sutkowych.

Chwytając każdy guz lub normalny gruczoł kleszczami, ostrożnie odetnij przyczepioną skórę za pomocą nożyczek chirurgicznych. Umieść wycięte tkanki w jednorazowych formach bazowych do tkanek, które są wstępnie oznaczone i wypełnione medium do osadzania w optymalnej temperaturze cięcia. Szybko zamroź foremki, umieszczając je na suchym lodzie.

W celu zbadania dostarczania poza celem należy wyciąć inne tkanki lub narządy będące przedmiotem zainteresowania. Za pomocą kriostatu pokrój zamrożone bloki tkanek o grubości 10 mikronów i umieść sąsiednie sekcje na wstępnie oznakowanych szkiełkach adhezyjnych. Płukać zamrożone szkiełka tkankowe PBS o temperaturze pokojowej przez pięć minut, aby usunąć pożywkę do zatapiania.

Odgranicz skrawki tkanek za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego, aby zmniejszyć objętość roztworów potrzebnych podczas barwienia. Utrwal skrawki tkanki 4% roztworem paraformaldehydu przez pięć minut. Po płukaniu szkiełek w PBS przez pięć minut, należy przepuszczać skrawki tkanek za pomocą 0,5% Triton X-100 w PBS przez 15 minut.

Ponownie płukać szkiełka w PBS przez pięć minut. Zablokować tkanki PBS zawierającym 3% wagowo albuminy surowicy bydlęcej i 5% objętości surowicy koziej na jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po przepłukaniu szkiełek w PBS przez pięć minut, należy inkubować skrawki z podstawowymi przeciwciałami prowadzącymi dokumentację, takimi jak powszechny marker jądrowy, naczyniowy lub cytoplazmatyczny.

W tym przypadku szczurzy anty-mysz CD31 jest stosowany w rozcieńczeniu od 1 do 100 w roztworze blokującym. Szkiełka z przeciwciałem pierwotnym pozostawia się na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chronione przed odwodnieniem na tacy na szkiełkach. Po inkubacji płukać szkiełka w PBS przez pięć minut trzy razy.

Zmieniaj PBS za każdym razem. Inkubować szkiełka z przeciwciałami drugorzędowymi, aby oznaczyć przeciwciała pierwszorzędowe. W tym zastosowaniu uwidocznij przeciwciało anty-B7-H3 za pomocą sprzężonego koziego przeciwciała anty-królika Alexa Fluor 546 i zwizualizuj CD31 za pomocą koziego przeciwciała wtórnego przeciwko szczurom Alexa Fluor 488 w roztworze blokującym.

Chroń szkiełka przed światłem i odwodnieniem na tacy na szkiełkach przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po przepłukaniu szkiełek w PBS jak poprzednio, nałóż jedną kroplę podłoża mocującego na środek wycinka tkanki. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe, unikając uwięzienia pęcherzyków powietrza.

Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci i pozostaw do wyschnięcia. Kontynuuj obrazowanie mikroskopią konfokalną i ilościową analizę obrazu zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Reprezentatywne mikrofotografie konfokalne pokazują porównanie lokalizacji swoistego koniugatu przeciwciało B7-H3-ICG i koniugatu przeciwciała kontrolującego niespecyficzny izotyp w tkankach prawidłowych lub rakowych w mysich gruczołach sutkowych zawierających tkanki normalne lub rakowe.

Normalne mysie gruczoły sutkowe od zwierzęcia, któremu wstrzyknięto dożylnie Iso-ICG lub B7-H3-ICG i podbarwione przeciwstawnie CD31, nie wykazują barwienia koniugatów przeciwciał. Wykazano, że normalne tkanki nie mają ekspresji B7-H3 za pomocą standardowego barwienia immunofluorescencyjnego ex vivo. W inwazyjnych nowotworach sutka B7-H3-ICG silnie wiąże się z naczyniami krwionośnymi, pierwszym punktem kontaktu in vivo, a następnie jest w stanie wynaczynić z naczynia krwionośnego, aby niejednorodnie zabarwić nabłonek guza.

Iso-ICG wykazuje niespecyficzną akumulację w tkankach nowotworowych. Standardowe barwienie immunofluorescencyjne ex vivo wykazuje jednolitą ekspresję markera B7-H3 na komórkach nabłonka i śródbłonka. Reprezentatywne mikrofotografie konfokalne pokazują metodę lokalizacji immunofluorescencji in vivo w celu wykrycia ekspresji netryny-1 lub ekspresji kontrolnej izotypu w raku myszy i prawidłowych gruczołach sutkowych.

Lokalizacja immunofluorescencji in vivo potwierdza sygnał nabłonkowy dla netryny-1 w guzach MMTV-PyMT, ale nie w normalnych gruczołach sutkowych. Ponadto w komórkach śródbłonka w guzach piersi występuje silny sygnał netryny-1, na co wskazuje kolokalizowany żółty sygnał. Sygnał jest znacznie słabszy w normalnych gruczołach sutkowych.

Metoda IVIL będzie musiała zostać zoptymalizowana pod względem dawkowania przeciwciał, czasu pobierania tkanek i wtórnego rozcieńczenia przeciwciał, aby można ją było pomyślnie wdrożyć. IVIL umożliwia celowanie w epitopy konformacyjne, których nie można wykryć za pomocą standardowego barwienia immunofluorescencyjnego, co wymaga przetwarzania tkankowego. Można również pobrać zdrowe narządy myszy z nowotworem, aby ocenić niewłaściwe dostarczanie przeciwciał terapeutycznych.

Wraz ze zwiększonym stosowaniem terapii opartych na przeciwciałach i środków kontrastowych w badaniach i leczeniu raka, metoda IVIL ma szerokie zastosowanie w badaniach i rozwoju farmaceutycznym. Naukowcy zajmujący się terapiami nowotworów, obrazowaniem molekularnym, stanami zapalnymi i innymi obszarami mogą uznać, że metoda IVIL dostarcza przydatnych informacji.