Izolacja komórek jednojądrzastych blaszki właściwej z mysiej okrężnicy przy użyciu kolagenazy E

Izolacja w analizie fenotypowej komórek odpornościowych z jelita przy użyciu tego protokołu okazała się przydatna do zrozumienia przewodu pokarmowego i układowych zaburzeń zapalnych. Metoda ta izoluje znaczną liczbę żywotnych komórek jednojądrzastych poprzez minimalizację zanieczyszczeń, umożliwiając późniejsze fenotypowanie immunologiczne za pomocą atomizmu Fleur lub innych metod. Ponieważ jelito jest głównym miejscem docelowym stanu zapalnego w wielu chorobach, protokół ten może być przydatny do badania populacji odporności jelitowej w mysich modelach raka, alergii, transplantacji i autoimmunizacji.

Aby zoptymalizować wydajność i wydajność tego protokołu, zaleca się, aby kluczowe rozwiązania i materiały zostały przygotowane z wyprzedzeniem, jak wspomniano. Po eutanazji myszy i wykonaniu pionowego nacięcia w linii środkowej, użyj cienkich nożyczek preparacyjnych, aby otworzyć otrzewną. Za pomocą kleszczy przesuń jelito cienkie na bok i odsłoń okrężnicę zstępującą.

Pociągnij lekko w górę okrężnicę zstępującą, aby maksymalnie odsłonić odbytniczą część okrężnicy. Następnie przetnij dystalną odbytnicę głęboko w miednicy i wypreparuj całą okrężnicę jako jedną jednostkę od dystalnej odbytnicy do czapeczki kątowej. Najpierw umieść okrężnicę na zwilżonym ręczniku papierowym i użyj końca nożyczek lub kleszczy, aby wywrzeć łagodny nacisk na ścianę jelita i usunąć stały stolec.

Następnie umieść okrężnicę na szalce Petriego i użyj 10-mililitrowej strzykawki z igłą wypełnioną igłą o rozmiarze 18, aby przepłukać jelito 10 mililitrami schłodzonego buforu okrężnicy. Umieść okrężnicę na szalce Petriego wypełnionej 5-10 mililitrami schłodzonego buforu okrężnicy i mieszaj ręcznie, aby umyć pozostałą zawartość okrężnicy. Powtórz to pranie 2-3 razy, używając nowej szalki Petriego zawierającej świeży bufor do każdego prania.

Następnie przenieś okrężnicę na nową szalkę Petriego zawierającą świeżo schłodzony bufor okrężnicy. Przetnij okrężnicę wzdłużnie od jej bardziej muskularnego końca odbytu do bliższej okrężnicy, aby uzyskać pojedynczy prostokątny otwarty kawałek okrężnicy. Wyrzuć medianę z naczynia i zastąp ją czystym, schłodzonym buforem okrężnicy.

Umieść prostokątną tkankę okrężnicy na ręczniku papierowym zwilżonym buforem okrężnicy i pokrój ją, krojąc poziomo, a następnie na małe fragmenty. Użyj cienkich kleszczy, aby zebrać fragmenty okrężnicy do 50-mililitrowej stożkowej rurki polipropylenowej zawierającej 20 mililitrów schłodzonego buforu okrężnicy. Następnie umyj fragmenty, energicznie obracając tubkę przez 30 sekund.

Po umyciu pozwól fragmentom tkanki osiąść na dnie probówki przed dekantacją lub odsysaniem próżniowym supernatantu, Uważając, aby uniknąć utraty fragmentów tkanki, powtórz cały proces mycia 3 razy, używając świeżego buforu okrężnicy do każdego płukania. Na początek dodaj 20 mililitrów buforu do trawienia kolagenazy do probówki zawierającej umyte fragmenty okrężnicy. Zamknij probówkę i umieść ją w wytrząsarce orbitalnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza z prędkością obrotu 2 razy G przez 60 minut.

Upewnij się, że fragmenty tkanki są w ciągłym ruchu podczas mieszania. Najpierw wlej 5 mililitrów 66% pożywki do separacji gęstości na bazie krzemionki do każdej z 3 oddzielnych 15-mililitrowych probówek polipropylenowych. Następnie użyj pipety serologicznej o pojemności 25 mililitrów, aby zebrać tylko supernatant z Kolagenazy Trawienie 1.

Przefiltrować supernatant przez 40-mikrolitrowe sitko do komórek z tkaniny filtracyjnej umieszczone w czystej 50-mililitrowej stożkowej probówce polipropylenowej. Napełnij probówkę całkowicie schłodzonym buforem okrężnicy, aby ugasić bufor do trawienia kolagenazy. Następnie odkręć komórki, odessaj supernatant i trzymaj osad na lodzie.

Kontynuuj wykonywanie trawienia kolagenazy 2 zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po zakończeniu trawienia kolagenazą 2 energicznie przepłucz fragmenty tkanki tam iz powrotem między rurką a 10-mililitrową strzykawką przez igłę o końcu w rozmiarze 18. Powtarzaj to spłukiwanie przez co najmniej 7-8 przejść, kontynuując, aż nie będą widoczne żadne duże fragmenty tkanek ani zanieczyszczenia.

Następnie przepuść zawiesinę dezagregacji tkanek przez 40-mikrometrowy sitko do komórek z tkaniny filtracyjnej umieszczone w czystej 50-mililitrowej rurce polipropylenowej. Napełnij probówkę do brzegu schłodzonym buforem okrężnicy, aby wygasić trawienie i odwirować w temperaturze 800 razy G w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 5 minut. Odrzucić supernatant przez aspirację próżniową i wyciągnąć ponownie zawieszony osad z Kolagenazy Trawienie 1 do odpowiedniej probówki.

Następnie ponownie zawiesić każdą granulkę w 24 mililitrach 44% ścierniska do separacji gęstości na bazie krzemionki na okrężnicę. Użyj 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby powoli nałożyć 8 mililitrów tego podłoża na każdą z 3 probówek zawierających 66% pożywki do separacji gęstości na bazie krzemionki. Ostrożnie wyważ probówki w wiadrach wirówkowych za pomocą wagi lub wagi.

Wirować w temperaturze 859 razy G w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 20 minut bez przerwy. Pozwól prętom całkowicie odpocząć przed wyjęciem rurek, uważając, aby nie zakłócić komórek na granicy gradientu. Najpierw zwizualizuj interfejs gradientu w pobliżu znaku 5 mililitrów, gdzie zwykle występuje biały pasek o grubości 1-2 mililitrów.

Odessać próżniowo i wyrzucić górne 7 mililitrów gradientu, aby umożliwić łatwiejszy dostęp pipety do interfejsu. Używając ciągłego ręcznego ssania i stałego ruchu obrotowego nadgarstka, zbierz warstwę interfejsu komórek. Zbieraj, aż granica faz między dwoma gradientami będzie czysta i ogniotrwała, a następnie przenieś granicę faz do nowej 50-mililitrowej stożkowej rurki polipropylenowej.

Następnie dodaj bufor FACS do tej wanny, aż całkowita zawiesina osiągnie 50 mililitrów. Wirować 800 razy G w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 5 minut. Następnie odessać supernatant przez aspirację próżniową i ponownie zawiesić osad w 1 mililitrze buforu FACS.

Procedura opisana w tym filmie może być stosowana do izolowania komórek jednojądrzastych z jelita grubego lub, z modyfikacjami, z jelita cienkiego. Ponadto przeprowadza się cytometrię i analizę danych w celu porównania frakcji apoptotycznych i nekrotycznych / martwych limfocytów przy użyciu kolagenazy E lub D do izolacji, z naszym leczeniem bez DNAzy 1. Po Aneksynie 5 i możliwym do utrwalenia barwieniu żywym martwym niebieskim barwnikiem na zawiesinach pojedynczych komórek po każdej izolacji, kolagenaza E bez DNAzy wykazała znacznie wyższy odsetek żywych komórek po izolacji w porównaniu z kolagenazą D bez DNAzy.

Nawet w porównaniu z obiema kolagenazami z DNAzą. Ponadto zidentyfikowaliśmy komórki martwicze przy medianie procentu 41,0% w grupie kolagenazy E w porównaniu z 90,0% w grupie kolagenazy D. 75,9% w grupie DNAzy kolagenazy E i 80,3% w grupie DNAzy kolagenazy D.

Wieloperymetryczną cytometrię przepływową stosuje się następnie do MNC wyizolowanej z myszy biorcy zastawki C CD45.2 w dniu 7 po otrzymaniu BMT lub allogenicznych lub syngenicznych modeli BMT. Oblicza się i porównuje średnią bezwzględną liczbę limfocytów T CD4-dodatnich i CD8-dodatnich dawcy wyekstrahowanych z jelita grubego biorcy BMT. Dlatego ważne może być zidentyfikowanie i/lub ilościowe określenie rzadkich populacji komórek odpornościowych w takich modelach mysich.

Rzadkie podzbiory, w tym komórki regulatorowe T FOX-P3 pochodzące od dawcy, są oceniane zarówno w syngenicznym, jak i allogenicznym modelu BMT. Za pomocą tej metody można analizować nawet rzadkie podzbiory, takie jak regulator T jelita grubego pochodzący od dawcy naciekający okrężnicę myszy biorcy, po BMT. Należy zauważyć, że kolagenaza E jest aktywna w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Dlatego wszystkie roztwory kolagenazy powinny być wstępnie podgrzane w celu uzyskania odpowiedniej aktywności kolagenazy i dokładnie wygaszone, aby zakończyć aktywność. Protokół ten pozwala na dużą liczbę komórek jednojądrzastych, które można wykorzystać do późniejszej charakterystyki za pomocą cytometrii Fleur, technik biologii molekularnej, mikroskopii, hodowli i miejsca, między innymi. Protokół ten zapewnił wiarygodną ocenę stanu zapalnego w okrężnicy u myszy eksperymentalnych i kontrolowanych w modelu przeszczepu szpiku kostnego.

W ten sposób ułatwiono odkrycie nowych regulacyjnych mechanizmów immunologicznych tolerancji przeszczepów. Kolagenaza z Clostridium Istoliticum to odczynnik, z którym należy obchodzić się przy użyciu laboratoryjnych technik bezpieczeństwa. Stanowi zagrożenie dla zdrowia w przypadku wdychania i może powodować podrażnienie skóry i oczu.