Name: Izolacja komórek jednojądrzastych blaszki właściwej z mysiej okrężnicy przy użyciu kolagenazy E (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Poznaj izolację komórek jednojądrzastych z blaszki właściwej okrężnicy myszy przy użyciu kolagenazy E. Ta metoda umożliwia immunofenotypowanie populacji immunologicznych jelit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty #1K08HL088260 i #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.) oraz Batchelor Foundation for Pediatric Research (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). Myszy C57BL/6 i BALB/c użyte w tym badaniu zostały wyhodowane w naszej placówce lub dostarczone przez Jackson Labs lub Taconic.

Wszystkie badania zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami badań nad gryzoniami, które zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of the University of Miami Miller School of Medicine, które spełniają standardy weterynaryjne określone przez American Association for Laboratory Animal Science (AALAS).
1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Jak opisano w Tabeli 1, przygotuj bufor dwukropek, pożywkę do separacji gęstości na bazie krzemionki 100%, pożywkę do separacji gęstości na bazie krzemionki 66%, pożywkę do separacji gęstości na bazie krzemionki 44%, bufor do mineralizacji kolagenazy E i bufor FACS.
	<ol>
		<li>Przygotuj bufor jelita grubego dzień przed zabiegiem i przechowuj go przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Dzień przed zabiegiem należy przygotować w 100% gęstościowe podłoża do separacji na bazie krzemionki i przechowywać je przez noc w temperaturze 4 °C, umieszczając w temperaturze pokojowej rano w dniu zabiegu do rozmrożenia.</li>
		<li>Przygotuj 66% i 44% pożywki separacyjne na bazie krzemionki rano w dniu izolacji, używając pożywki do separacji o 100% gęstości na bazie krzemionki w temperaturze pokojowej i buforu dwukropek.</li>
		<li>Odmierz odpowiednią ilość kolagenazy E pochodzącej z Clostridium histolyticum i przechowuj w temperaturze -20 °C przez noc przed zabiegiem. Następnego ranka rozpuścić w odpowiedniej objętości Colon Buffer, aby uzyskać Collagenase Digestion Buffer. W przypadku wszystkich inkubacji z buforem do wytrawiania kolagenazy w dniu zabiegu, roztwory należy wstępnie ogrzać do 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przez wszystkie etapy protokołu utrzymywać jedną wirówkę w temperaturze 20 °C i prędkości obrotowej 859 x g, z wyłączonymi hamulcami (0 opóźnienie) dla wirowania gradientowego. Ustaw kolejną na 4 °C i prędkość obrotową 859 x g, ze standardowym opóźnieniem, dla etapów prania.</li>
</ol>
2. Zbieranie dwukropka
<ol>
	<li>Poddać mysz eutanazji przez uduszenie CO2 , a następnie metodę potwierdzającą zatwierdzoną przez AALAC.</li>
	<li>Umieść mysz w pozycji leżącej na plecach i spryskaj futro 70% etanolem. Za pomocą dużych nożyczek do tkanek wykonaj pionowe nacięcie w linii środkowej i odsłoń nienaruszoną otrzewną.</li>
	<li>Za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych otwórz otrzewną. Użyj kleszczy, aby przesunąć jelito cienkie na bok i odsłonić okrężnicę zstępującą. Lekko pociągnij w górę okrężnicę zstępującą, aby maksymalnie odsłonić odbytniczą część okrężnicy. Przetnij dystalną część odbytnicy głęboko w miednicy i wypreparuj i usuń całą okrężnicę jako jedną jednostkę, od dystalnej odbytnicy do czapeczki kątowej.</li>
	<li>Przenieś okrężnicę do 20 ml schłodzonego buforu jelita grubego w probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml.</li>
</ol>
3. Czyszczenie jelita grubego
<ol>
	<li>Umieść okrężnicę na zwilżonym ręczniku papierowym i usuń stały stolec, wywierając łagodny nacisk na ścianę jelita końcem nożyczek lub kleszczy.</li>
	<li>Umieścić okrężnicę na szalce Petriego i przepłukać jelito 10 ml schłodzonego buforu jelita grubego za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą o sile 18 G.</li>
	<li>Przenieś okrężnicę do zwilżonego ręcznika papierowego Colon Buffer i usuń krezkę i tłuszcz ostrym końcem nożyczek.</li>
	<li>Umieść okrężnicę na szalce Petriego wypełnionej 5-10 ml schłodzonego buforu jelita grubego, mieszając ręcznie w celu umycia pozostałej zawartości okrężnicy. Powtórz 2-3 razy.</li>
	<li>Przeciąć okrężnicę wzdłużnie od bardziej muskularnego końca odbytnicy do bliższej okrężnicy (tworząc pojedynczy prostokątny otwarty kawałek okrężnicy) na szalce Petriego wypełnionej świeżo schłodzonym buforem okrężnicy. Wyrzuć istniejące nośniki i napełnij je czystym, schłodzonym buforem dwukropek.</li>
	<li>Umyj jelito 3 razy, energicznie obracając je na szalce Petriego i zastępując 5-10 ml schłodzonego buforu jelita grubego po każdym przemyciu.</li>
	<li>Umieść prostokątną tkankę jelita grubego na ręczniku papierowym zwilżonym buforem Colon Buffer i pokrój ją, krojąc poziomo, a następnie na małe fragmenty (odcinki 3 mm x 3 mm).</li>
	<li>Ostrożnie zbierz fragmenty jelita grubego za pomocą drobnych kleszczy do 20 ml schłodzonego buforu jelita grubego w stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml. </li>
	<li>Umyj fragmenty jelita grubego 3 razy, za każdym razem przemyj je w 20 ml buforu jelita grubego, energicznie obracając probówkę przez 30 sekund. Pomiędzy każdym mieszaniem pozwól, aby fragmenty tkanki osiadły na dnie probówki. Dekantacja lub odsysanie próżniowe supernatantu, zapobiegając jednocześnie utracie fragmentów tkanek w procesie aspiracji między każdym myciem. 
	nuta: Nie ma potrzeby wymiany rurki po każdym praniu.</li>
</ol>
4. Trawienie kolagenazy 1
<ol>
	<li>Dodaj 20 ml buforu do wytrawiania kolagenazy do umytych fragmentów jelita grubego w stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Umieścić zamkniętą probówkę o pojemności 50 ml w temperaturze 37 °C w inkubowanej wytrząsarce orbitalnej z prędkością obrotową ustawioną na 2 x g przez 60 minut. Upewnij się, że fragmenty tkanki są w ciągłym ruchu podczas mieszania; jeśli to konieczne, stopniowo zwiększaj szybkość rotacji, aby upewnić się, że żadne fragmenty tkanki nie osiądą na dnie probówki.</li>
</ol>
5. Przygotuj gradienty mediów separacyjnych na bazie krzemionki
<ol>
	<li>Przygotuj 66% i 44% pożywki do separacji gęstości na bazie krzemionki, używając 100% pożywek do separacji gęstości na bazie krzemionki w temperaturze 20 °C (temperatura pokojowa) i buforu dwukropek.</li>
	<li>Wlej 5 ml 66% pożywki do separacji gęstości na bazie krzemionki do każdej z 3 oddzielnych probówek polipropylenowych o pojemności 15 ml. Przygotuj 3 probówki na dwukropek. Tworzy to podstawę procedury izolacji gradientowej o większej gęstości, na którą zostaną nałożone media separacyjne o mniejszej gęstości w celu utworzenia gradientu separacji.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze 20 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
6. Pobranie supernatantu z trawienia 1
<ol>
	<li>Zebrać tylko supernatant za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml i przefiltrować supernatant przez sitko do komórek z tkaniny filtrującej pory o wielkości 40 μm, umieszczone w czystej probówce stożkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml, po zakończeniu trawienia kolagenazą 1. Należy uważać, aby nie zassać żadnych istniejących fragmentów tkanki. 
	nuta: Zachowaj wszelkie pozostałe widoczne fragmenty tkanek w probówce. Zostaną one poddane drugiemu trawieniu kolagenazy (krok 8).</li>
</ol>
7. Bufor trawienia kolagenazy gaszącej
<ol>
	<li>Napełnij całkowicie probówkę polipropylenową o pojemności 50 ml schłodzonym buforem Colon Buffer. 
	nuta: Kolagenaza jest aktywna w temperaturze 37 °C; Stąd schłodzony bufor dezaktywuje ten enzym.</li>
	<li>Odwirować probówkę w temperaturze 4 °C przy 800 x g przez 5 min.
	<ol>
		<li>Odrzucić supernatant przez zasysanie próżniowe. Umyj komórki 25 ml świeżego buforu jelita grubego i odwiruj przy 800 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Zawiesić osad w mniej niż 1 ml świeżo schłodzonego buforu jelita grubego.</li>
		<li>Umieść stożkową probówkę polipropylenową o pojemności 50 ml na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Trawienie kolagenazy 2
<ol>
	<li>Powtórzyć krok 4 (Trawienie 1) z pozostałymi fragmentami tkanek zachowanymi z kroku 6.1.</li>
</ol>
9. Dezagregacja tkanek po trawieniu 2
<ol>
	<li>Energicznie przepłukać fragmenty tkanki w przód iw tył między probówką a strzykawką o pojemności 10 ml przez igłę o końcu 18 G.</li>
	<li>Powtarzaj to spłukiwanie przez co najmniej 7-8 pełnych pasaży, kontynuując, aż nie będą widoczne żadne duże fragmenty tkanek ani zanieczyszczenia.</li>
</ol>
10. Filtruj komórki
<ol>
	<li>Przepuść zawiesinę dezagregacji tkanek przez sitko do komórek z tkaniny filtracyjnej o porach 40 μm do czystej probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Umyj sitko komórkowe z tkaniny filtracyjnej 10 ml schłodzonym buforem dwukroli, aby odzyskać wszelkie komórki uwięzione w filtrze.</li>
</ol>
11. Gaszenie trawienia kolagenazy
<ol>
	<li>Napełnij 50 ml polipropylenową rurkę stożkową do krawędzi schłodzonym buforem Colon Buffer. 
	nuta: Temperatura buforu jelita grubego ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia wygaszenia aktywności kolagenazy.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 4 °C i 800 x g przez 5 min.</li>
	<li>Odrzucić supernatant przez zasysanie próżniowe.</li>
	<li>Przemyć przez ponowne zamieszanie w 25 ml świeżo schłodzonego buforu dwukroli, a następnie odwirować w temperaturze 4 °C, 800 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Odrzucić supernatant przez zasysanie próżniowe.</li>
	<li>Połączyć zawieszone osady z Trawienia kolagenazy 1 (krok 7) do odpowiedniej probówki z kroku 11.4.</li>
	<li>Powtórz krok 11.4 (mycie i odwirowanie).</li>
</ol>
12. Separacja gęstości na bazie krzemionki Separacja gradientowa mediów
UWAGA: Wykonaj kroki 12-18 tak szybko, jak to możliwe, aby zapewnić szybkie wygaszenie aktywności kolagenazy.
<ol>
	<li>Postępując zgodnie z krokiem 11.7, ponownie zawieś każdą osadkę w 24 ml łącznie 44% pożywki do separacji gęstości na bazie krzemionki na okrężnicę.</li>
	<li>Powoli nałożyć 8 ml pożywki z kroku 12.1 na każdą z trzech probówek przygotowanych w kroku 5.2 (zawierających 66% pożywki do separacji gęstości na bazie krzemionki), używając pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Utrzymuj stały i powolny przepływ mediów separacyjnych o gęstości 44%, jednocześnie nakładając gradient, aby uniknąć zakłóceń interfejsu.</li>
	<li>Ostrożnie zrównoważyć wszystkie probówki w wiadrach wirówki za pomocą wagi lub wagi.</li>
	<li>Obracać probówki przez 20 minut w temperaturze 859 x g w wirówce bez hamulca w temperaturze 20 °C. Przed wyjęciem probówek należy odczekać, aby wirniki całkowicie się zatrzymały, uważając, aby nie zakłócić pracy komórek na granicy faz gradientu.</li>
</ol>
13. Zbieranie komórek jednojądrzastych z interfejsu gradientu
<ol>
	<li>Wizualizuj interfejs gradientu (w pobliżu znaku 5 ml), w którym zwykle występuje biały pasek o grubości 1-2 mm (zawierający MNC). 
	nuta: Można, ale nie trzeba widzieć białego paska. Jednak MNC będzie na tym interfejsie i powinien zaciemnić przejrzystość interfejsu gradientowego.</li>
	<li>Odessać próżniowo i wyrzucić górne 7 ml górnego gradientu, aby umożliwić łatwiejszy dostęp pipety do interfejsu.</li>
	<li>Używając ciągłego ręcznego ssania i stałego ruchu obrotowego nadgarstka, zbierz warstwę graniczną komórek do czystej stożkowej rurki polipropylenowej o pojemności 50 ml. Zbieraj, aż interfejs między 2 gradientami będzie czysty i ogniotrwały (wolny od komórek).</li>
	<li>Napełnij probówkę zbiorczą 50 ml schłodzonego buforu FACS. Wirować w temperaturze 4 °C, 800 x g przez 5 min.</li>
	<li>Zassać supernatant przez aspirację próżniową i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu FACS.</li>
	<li>Policz komórki na hemocytometrze w rozcieńczeniu 1:2 przy użyciu odpowiednich metod wykluczania martwych komórek.</li>
	<li>Przejdź do barwienia FACS lub innych testów ze świeżo wyizolowaną MNC okrężnicy.</li>
</ol>

<ol><li>Schneeman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+physiology+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal physiology and functions.</a> British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).</li>
<li>Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediators+of+inflammation+and+immune+responses+in+the+human+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+inflammation%22%5BJournal%5D)">Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract.</a> Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).</li>
<li>Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+the+intestinal+tract%3A+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+diseases%22%5BJournal%5D)">Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment.</a> Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).</li>
<li>Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Distribution+of+Lymphocytes+and+Plasma+Cells+and+the+Role+of+the+Gut%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut.</a> Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).</li>
<li>Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N. Isolation of T Cells from the Gut. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReibig%2C+S+%22T-Helper+Cells%3A+Methods+and+Protocols%2C+Methods+in+Molecular+Biology%22">T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology</a>. Waisman, A., Becher, B. , Humana Press. New York, NY. 21-25 (2014).</li>
<li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+Specialization+within+the+Intestinal+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regional Specialization within the Intestinal Immune System.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).</li>
<li>Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminology%3A+Nomenclature+of+mucosa-associated+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue.</a> Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).</li>
<li>Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+differentiation+antigens+on+lymphocytes+in+the+human+intestinal+lamina+propria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria.</a> Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).</li>
<li>Mowat, A. M., Viney, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anatomical+basis+of+intestinal+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The anatomical basis of intestinal immunity.</a> Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).</li>
<li>Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irritable+Bowel+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Irritable Bowel Syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).</li>
<li>Harb, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crohn%27s+Disease+of+the+Colon%2C+Rectum%2C+and+Anus%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Crohn's Disease of the Colon, Rectum, and Anus.</a> Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).</li>
<li>Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulcerative+Colitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Ulcerative Colitis.</a> The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).</li>
<li>Mohty, B., Mohty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+complications+and+side+effects+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+cancer+journal%22%5BJournal%5D)">Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update.</a> Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).</li>
<li>Hatzimichael, E., Tuthill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+and+cloning%3A+advances+and+applications%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell transplantation.</a> Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).</li>
<li>Hernandez-Margo, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonic+Complications+Following+Human+Bone+Marrow+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Coloproctology%22%5BJournal%5D)">Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation.</a> Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).</li>
<li>Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abdominal+Complications+Following+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Radio+Graphics%22%5BJournal%5D)">Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation.</a> Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).</li>
<li>Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+Complications+Following+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation+in+Children%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+Journal+of+Radiology%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children.</a> Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).</li>
<li>Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+Graft-Versus-Host+Disease%3A+Mechanisms+and+Management%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management.</a> Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).</li>
<li>Shuyu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+immune+tolerance+in+nonmyeloablative+MHC-mismatched+BMT+for+murine+%CE%B2-thalassemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia.</a> Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).</li>
<li>van der Merwe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recipient+myeloid-derived+immunomodulatory+cells+induce+PD-1+ligand-dependent+donor+CD4%2BFoxp3%2B+regulatory+T+cell+proliferation+and+donor-recipient+immune+tolerance+after+murine+nonmyeloablative+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation.</a> Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).</li>
<li>Couter, C. J., Surana, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Flow+Cytometric+Characterization+of+Murine+Small+Intestinal+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e54114(2016).</li>
<li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+Lymphocytes+from+the+Mouse+Small+Intestinal+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57281(2018).</li>
<li>Weigmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subsequent+analysis+of+murine+lamina+propria+mononuclear+cells+from+colonic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue.</a> Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).</li>
<li>Bull, D. M., Bookman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+characterization+of+human+intestinal+mucosal+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).</li>
<li>Davies, M. D., Parrott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+purification+of+lymphocytes+from+the+epithelium+and+lamina+propria+of+murine+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine.</a> Gut. 22, 481-488 (1981).</li>
<li>Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Lymphocyte+Isolation+Methods+for+Endoscopic+Biopsy+Specimens+from+the+Colonic+Mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa.</a> Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).</li>
<li>Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+Structures%2C+and+Collagen-Degrading+Mechanisms+of+Bacterial+Collagenolytic+Proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).</li>
<li>Harrington, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+collagenases+and+collagen-degrading+enzymes+and+their+potential+role+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease.</a> Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).</li>
<li>Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+collagenases+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial collagenases - A review.</a> Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).</li>
<li>Autengruber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Enzymatic+Tissue+Disintegration+on+the+Level+of+Surface+Molecule+Expression+and+Immune+Cell+Function%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function.</a> European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).</li>
<li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Murine+Small+Intestine+Leukocyte+Isolation+for+Global+Immune+Phenotype+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).</li>
<li>van der Heijden, P. j, Stok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Procedure+for+the+Isolation+of+Functionally+Active+Lymphoid+Cells+from+the+Murine+Intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine.</a> Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Ten protokół wizualny opisuje dobrze tolerowane metody izolacji komórek jednojądrzastych okrężnicy, w tym limfocytów blaszki właściwej (LPL). Biorąc pod uwagę, że protokół ten został zoptymalizowany pod kątem oceny ciężkich modeli zapalenia jelita grubego myszy po przeszczepie, w których cytokiny zapalne i uszkodzenia tkanek sprzyjają słabej żywotności odzyskanego MNC, przewidujemy, że metody te można przełożyć na inne zastosowania wymagające analizy fenotypowej MNC okrężnicy. Obejmują one między innymi ocenę zapalenia j...

Chociaż przewód pokarmowy (GI) jest głównie przeznaczony do przetwarzania i reabsorpcji składników odżywczych z pożywienia, przewód pokarmowy pełni również kluczową rolę w integralności układu naczyniowego, limfatycznego, nerwowego i wielu innych narządów poprzez swój śluzówkowy i podśluzówkowy układ odpornościowy1. Układ odpornościowy przewodu pokarmowego odgrywa wpływową rolę zarówno w zdrowiu przewodu pokarmowego, jak i ogólnoustrojowego ze względu na ciągłą ekspozycję na obce antygeny z żywności, bakterie komensalne lub atakujące patogeny1,2. W związku z tym układ odpornościowy przewodu pokarmowego musi utrzymywać delikatną równowagę, w której toleruje antygeny niepatogenne, jednocześnie odpowiednio reagując na antygeny chorobotwórcze1,2. Kiedy równowaga tolerancji i obrony zostaje zakłócona, może dojść do miejscowej lub ogólnoustrojowej dysregulacji immunologicznej i stanu zapalnego, co skutkuje niezliczonymi chorobami1,2,3.
W jelicie znajduje się co najmniej 70% wszystkich komórek limfoidalnych w ciele4. Większość pierwotnych interakcji immunologicznych obejmuje co najmniej jedną z trzech stacji immunologicznych w jelicie: 1) łatki Peyera, 2) limfocyty śródnabłonkowe (IEL) i 3) limfocyty blaszki właściwej (LPL). Każdy z nich składa się ze złożonej, połączonej ze sobą sieci komórek odpornościowych, które szybko reagują na normalne wyzwania immunologiczne w gut5. Ograniczona do zrębu powyżej muscularis mucosae, blaszka właściwa o luźnej strukturze jest tkanką łączną błony śluzowej jelit i obejmuje rusztowanie dla kosmków, naczyń krwionośnych, drenażu limfatycznego i błony śluzowej układu nerwowego, a także wiele wrodzonych i adaptacyjnych podzbiorów immunologicznych6,7,8,9. LPL składają się z limfocytów T CD4 + i CD8 + w przybliżonym stosunku 2:1, komórek plazmatycznych i komórek linii szpikowej, w tym komórek dendrytycznych, komórek tucznych, eozynofili i makrofagów6.
Rośnie zainteresowanie zrozumieniem dysregulacji immunologicznej i stanu zapalnego jelit w odniesieniu do różnych stanów chorobowych. Takie schorzenia, jak choroba Leśniowskiego-Crohna i wrzodziejące zapalenie jelita grubego, objawiają się różnym stopniem zapalenia jelita grubego10,11,12. Ponadto u pacjentów ze złośliwymi lub niezłośliwymi zaburzeniami szpiku kostnego lub układu odpornościowego, którzy przechodzą allogeniczny przeszczep szpiku kostnego (allo-BMT), mogą rozwinąć się różne formy zapalenia jelita grubego, w tym 1) bezpośrednia toksyczność wynikająca ze schematów kondycjonowania przed BMT, 2) infekcje spowodowane immunosupresją po BMT i 3) choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD) wywołana przez limfocyty T typu dawcy reagujące na alloantygeny dawcy w tkankach po BMT13, 14,15. Wszystkie te powikłania po BMT skutkują znaczącymi zmianami w środowisku immunologicznym jelit16,17,18. Proponowana metoda pozwala na wiarygodną ocenę akumulacji komórek odpornościowych w okrężnicy myszy, a po zastosowaniu u mysich biorców po BMT ułatwia skuteczne oznaczanie komórek odpornościowych zarówno dawcy, jak i biorcy zaangażowanych w tolerancję przeszczepu19,20. Dodatkowe przyczyny zapalenia jelit to nowotwory złośliwe, alergie pokarmowe lub zaburzenia mikrobiomu jelitowego. Protokół ten umożliwia dostęp do jednojądrzastych komórek jelitowych z okrężnicy oraz, z modyfikacjami, do leukocytów jelita cienkiego w każdym z tych przedklinicznych modeli mysich.
Wyszukiwanie w PubMed przy użyciu terminów "jelito ORAZ komórka odpornościowa ORAZ izolacja" ujawnia ponad 200 publikacji opisujących metody trawienia jelita cienkiego w celu ekstrakcji komórek odpornościowych. Jednak podobne poszukiwania w literaturze dotyczącej jelita grubego nie przyniosły dobrze nakreślonych protokołów określających izolację komórek odpornościowych z okrężnicy. Może to być spowodowane tym, że okrężnica ma więcej warstw mięśniowych i śródmiąższowych, co sprawia, że jest trudniejsza do całkowitego strawienia niż jelito cienkie. W przeciwieństwie do istniejących protokołów, ten protokół wykorzystuje kolagenazę E z Clostridium histolyticum bez innych kolagenaz bakteryjnych (kolagenaza D / Kolagenaza I). Wykazaliśmy, że przy użyciu tego protokołu trawienie tkanki okrężnicy można osiągnąć przy zachowaniu jakości izolowanych jednojądrzastych komórek odpornościowych jelit (MNC) bez dodatku odczynników przeciwzbrylających, takich jak wersynian sodu (EDTA), Dyspaza II i dezoksyrybonukleaza I (DNAse I)21,22,23. Protokół ten jest zoptymalizowany, aby umożliwić powtarzalną, solidną ekstrakcję żywotnego MNC z mysiej okrężnicy do dalszych ukierunkowanych badań i powinien nadawać się do badania immunologii okrężnicy lub (z modyfikacjami) jelita cienkiego24,25.

<table><tbody><tr><td>60 mm Petri DIsh</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288 1x</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Lonza BioWhittaker</td><td>BW17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>10 ml jednorazowa pipeta serologiczna</td><td>Corning</td><td>4100</td><td></td></tr><tr><td>10 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>15 mL niesterylne probówki</td> <td>stożkoweTruLine</td><td>TR2002</td><td></td></tr><tr><td>18 G igła</td><td>Becton Dickinson</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Jednorazowa pipeta serologiczna</td><td>Corning</td><td>4250</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m wielkość porów Sitko komórkowe</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon Tube</td><td>Corning</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A4503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Bufor utrwalający</td><td>Biolegend</td><td>420801</td><td></td></tr><tr><td>E. coli Kolagenaza E z Clostridium histolyticum</td><td>Sigma</td><td>C2139</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0,5 M Sterylny Rozwiązanie</td><td>Amresco</td><td>E177-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo /Fisher Scientific -HyCLone</td><td>SV30014.03</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GE Healthcare-HyClone</td><td>SH30237.01</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare-Life Sciences</td><td>1708901</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium</td><td>Corning</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>VWR Life Science Amresco</td><td>97064-646</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy</td><td>Lonza BioWhittaker</td><td>17-942E</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja komórek jednojądrzastych blaszki właściwej z mysiej okrężnicy przy użyciu kolagenazy e

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

Jelito jest domem dla największej liczby komórek odpornościowych w organizmie. Układ odpornościowy jelita cienkiego i grubego kontroluje ekspozycję na antygeny egzogenne i moduluje odpowiedzi na silne bodźce immunologiczne pochodzenia mikrobiologicznego. Z tego powodu jelito jest głównym miejscem docelowym rozregulowania układu odpornościowego i stanu zapalnego w wielu chorobach, w tym między innymi w chorobach zapalnych jelit, takich jak choroba Leśniowskiego-Crohna i wrzodziejące zapalenie jelita grubego, choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD) po przeszczepie szpiku kostnego (BMT) oraz wiele stanów alergicznych i zakaźnych. Mysie modele zapalenia przewodu pokarmowego i zapalenia jelita grubego są intensywnie wykorzystywane do badania powikłań przewodu pokarmowego oraz do przedklinicznej optymalizacji strategii zapobiegania i leczenia. Dane zebrane z tych modeli poprzez izolację i analizę fenotypową komórek odpornościowych z jelita mają kluczowe znaczenie dla dalszego zrozumienia układu odpornościowego, które można zastosować do poprawy zaburzeń zapalnych przewodu pokarmowego i układowego. W niniejszym raporcie opisano wysoce skuteczny protokół izolacji komórek jednojądrzastych (MNC) z jelita grubego przy użyciu mieszanego gradientu gęstości opartego na krzemionce. Metoda ta w powtarzalny sposób izoluje znaczną liczbę żywotnych leukocytów, jednocześnie minimalizując zanieczyszczenia zanieczyszczeń, umożliwiając późniejsze fenotypowanie immunologiczne za pomocą cytometrii przepływowej lub innych metod.

Podczas pracy z modelami chorób jelita grubego u myszy pomocna jest możliwość ilościowej i jakościowej oceny wielu podgrup komórek odpornościowych uczestniczących w procesie zapalnym wśród MNC jelita grubego. Zawiesina pojedynczych komórek MNC uzyskana dzięki zastosowaniu niniejszego protokołu umożliwia taką charakterystykę fenotypową w sposób niezawodny i powtarzalny. Jako dowód słuszności zastosowania tej metody izolacji w różnych warunkach eksperymentalnych, pobrano MNC z jelita grubeg...

Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek jednojądrzastych, które znajdują się w blaszce właściwej jelita grubego, poprzez enzymatyczne trawienie tkanki za pomocą kolagenazy. Protokół ten pozwala na efektywną izolację komórek jednojądrzastych, w wyniku której powstaje zawiesina pojedynczej komórki, która z kolei może być wykorzystana do solidnego immunofenotypowania.

Izolacja komórek jednojądrzastych blaszki właściwej z mysiej okrężnicy przy użyciu kolagenazy E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

Izolacja w analizie fenotypowej komórek odpornościowych z jelita przy użyciu tego protokołu okazała się przydatna do zrozumienia przewodu pokarmowego i układowych zaburzeń zapalnych. Metoda ta izoluje znaczną liczbę żywotnych komórek jednojądrzastych poprzez minimalizację zanieczyszczeń, umożliwiając późniejsze fenotypowanie immunologiczne za pomocą atomizmu Fleur lub innych metod. Ponieważ jelito jest głównym miejscem docelowym stanu zapalnego w wielu chorobach, protokół ten może być przydatny do badania populacji odporności jelitowej w mysich modelach raka, alergii, transplantacji i autoimmunizacji.Aby zoptymalizować wydajność i wydajność tego protokołu, zaleca się, aby kluczowe rozwiązania i materiały zostały przygotowane z wyprzedzeniem, jak wspomniano. Po eutanazji myszy i wykonaniu pionowego nacięcia w linii środkowej, użyj cienkich nożyczek preparacyjnych, aby otworzyć otrzewną. Za pomocą kleszczy przesuń jelito cienkie na bok i odsłoń okrężnicę zstępującą.Pociągnij lekko w górę okrężnicę zstępującą, aby maksymalnie odsłonić odbytniczą część okrężnicy. Następnie przetnij dystalną odbytnicę głęboko w miednicy i wypreparuj całą okrężnicę jako jedną jednostkę od dystalnej odbytnicy do czapeczki kątowej. Najpierw umieść okrężnicę na zwilżonym ręczniku papierowym i użyj końca nożyczek lub kleszczy, aby wywrzeć łagodny nacisk na ścianę jelita i usunąć stały stolec.Następnie umieść okrężnicę na szalce Petriego i użyj 10-mililitrowej strzykawki z igłą wypełnioną igłą o rozmiarze 18, aby przepłukać jelito 10 mililitrami schłodzonego buforu okrężnicy. Umieść okrężnicę na szalce Petriego wypełnionej 5-10 mililitrami schłodzonego buforu okrężnicy i mieszaj ręcznie, aby umyć pozostałą zawartość okrężnicy. Powtórz to pranie 2-3 razy, używając nowej szalki Petriego zawierającej świeży bufor do każdego prania.Następnie przenieś okrężnicę na nową szalkę Petriego zawierającą świeżo schłodzony bufor okrężnicy. Przetnij okrężnicę wzdłużnie od jej bardziej muskularnego końca odbytu do bliższej okrężnicy, aby uzyskać pojedynczy prostokątny otwarty kawałek okrężnicy. Wyrzuć medianę z naczynia i zastąp ją czystym, schłodzonym buforem okrężnicy.Umieść prostokątną tkankę okrężnicy na ręczniku papierowym zwilżonym buforem okrężnicy i pokrój ją, krojąc poziomo, a następnie na małe fragmenty. Użyj cienkich kleszczy, aby zebrać fragmenty okrężnicy do 50-mililitrowej stożkowej rurki polipropylenowej zawierającej 20 mililitrów schłodzonego buforu okrężnicy. Następnie umyj fragmenty, energicznie obracając tubkę przez 30 sekund.Po umyciu pozwól fragmentom tkanki osiąść na dnie probówki przed dekantacją lub odsysaniem próżniowym supernatantu, Uważając, aby uniknąć utraty fragmentów tkanki, powtórz cały proces mycia 3 razy, używając świeżego buforu okrężnicy do każdego płukania. Na początek dodaj 20 mililitrów buforu do trawienia kolagenazy do probówki zawierającej umyte fragmenty okrężnicy. Zamknij probówkę i umieść ją w wytrząsarce orbitalnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza z prędkością obrotu 2 razy G przez 60 minut.Upewnij się, że fragmenty tkanki są w ciągłym ruchu podczas mieszania. Najpierw wlej 5 mililitrów 66% pożywki do separacji gęstości na bazie krzemionki do każdej z 3 oddzielnych 15-mililitrowych probówek polipropylenowych. Następnie użyj pipety serologicznej o pojemności 25 mililitrów, aby zebrać tylko supernatant z Kolagenazy Trawienie 1.Przefiltrować supernatant przez 40-mikrolitrowe sitko do komórek z tkaniny filtracyjnej umieszczone w czystej 50-mililitrowej stożkowej probówce polipropylenowej. Napełnij probówkę całkowicie schłodzonym buforem okrężnicy, aby ugasić bufor do trawienia kolagenazy. Następnie odkręć komórki, odessaj supernatant i trzymaj osad na lodzie.Kontynuuj wykonywanie trawienia kolagenazy 2 zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po zakończeniu trawienia kolagenazą 2 energicznie przepłucz fragmenty tkanki tam iz powrotem między rurką a 10-mililitrową strzykawką przez igłę o końcu w rozmiarze 18. Powtarzaj to spłukiwanie przez co najmniej 7-8 przejść, kontynuując, aż nie będą widoczne żadne duże fragmenty tkanek ani zanieczyszczenia.Następnie przepuść zawiesinę dezagregacji tkanek przez 40-mikrometrowy sitko do komórek z tkaniny filtracyjnej umieszczone w czystej 50-mililitrowej rurce polipropylenowej. Napełnij probówkę do brzegu schłodzonym buforem okrężnicy, aby wygasić trawienie i odwirować w temperaturze 800 razy G w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 5 minut. Odrzucić supernatant przez aspirację próżniową i wyciągnąć ponownie zawieszony osad z Kolagenazy Trawienie 1 do odpowiedniej probówki.Następnie ponownie zawiesić każdą granulkę w 24 mililitrach 44% ścierniska do separacji gęstości na bazie krzemionki na okrężnicę. Użyj 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby powoli nałożyć 8 mililitrów tego podłoża na każdą z 3 probówek zawierających 66% pożywki do separacji gęstości na bazie krzemionki. Ostrożnie wyważ probówki w wiadrach wirówkowych za pomocą wagi lub wagi.Wirować w temperaturze 859 razy G w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 20 minut bez przerwy. Pozwól prętom całkowicie odpocząć przed wyjęciem rurek, uważając, aby nie zakłócić komórek na granicy gradientu. Najpierw zwizualizuj interfejs gradientu w pobliżu znaku 5 mililitrów, gdzie zwykle występuje biały pasek o grubości 1-2 mililitrów.Odessać próżniowo i wyrzucić górne 7 mililitrów gradientu, aby umożliwić łatwiejszy dostęp pipety do interfejsu. Używając ciągłego ręcznego ssania i stałego ruchu obrotowego nadgarstka, zbierz warstwę interfejsu komórek. Zbieraj, aż granica faz między dwoma gradientami będzie czysta i ogniotrwała, a następnie przenieś granicę faz do nowej 50-mililitrowej stożkowej rurki polipropylenowej.Następnie dodaj bufor FACS do tej wanny, aż całkowita zawiesina osiągnie 50 mililitrów. Wirować 800 razy G w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 5 minut. Następnie odessać supernatant przez aspirację próżniową i ponownie zawiesić osad w 1 mililitrze buforu FACS.Procedura opisana w tym filmie może być stosowana do izolowania komórek jednojądrzastych z jelita grubego lub, z modyfikacjami, z jelita cienkiego. Ponadto przeprowadza się cytometrię i analizę danych w celu porównania frakcji apoptotycznych i nekrotycznych / martwych limfocytów przy użyciu kolagenazy E lub D do izolacji, z naszym leczeniem bez DNAzy 1. Po Aneksynie 5 i możliwym do utrwalenia barwieniu żywym martwym niebieskim barwnikiem na zawiesinach pojedynczych komórek po każdej izolacji, kolagenaza E bez DNAzy wykazała znacznie wyższy odsetek żywych komórek po izolacji w porównaniu z kolagenazą D bez DNAzy.Nawet w porównaniu z obiema kolagenazami z DNAzą. Ponadto zidentyfikowaliśmy komórki martwicze przy medianie procentu 41,0% w grupie kolagenazy E w porównaniu z 90,0% w grupie kolagenazy D. 75,9% w grupie DNAzy kolagenazy E i 80,3% w grupie DNAzy kolagenazy D.Wieloperymetryczną cytometrię przepływową stosuje się następnie do MNC wyizolowanej z myszy biorcy zastawki C CD45.2 w dniu 7 po otrzymaniu BMT lub allogenicznych lub syngenicznych modeli BMT. Oblicza się i porównuje średnią bezwzględną liczbę limfocytów T CD4-dodatnich i CD8-dodatnich dawcy wyekstrahowanych z jelita grubego biorcy BMT. Dlatego ważne może być zidentyfikowanie i/lub ilościowe określenie rzadkich populacji komórek odpornościowych w takich modelach mysich.Rzadkie podzbiory, w tym komórki regulatorowe T FOX-P3 pochodzące od dawcy, są oceniane zarówno w syngenicznym, jak i allogenicznym modelu BMT. Za pomocą tej metody można analizować nawet rzadkie podzbiory, takie jak regulator T jelita grubego pochodzący od dawcy naciekający okrężnicę myszy biorcy, po BMT. Należy zauważyć, że kolagenaza E jest aktywna w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Dlatego wszystkie roztwory kolagenazy powinny być wstępnie podgrzane w celu uzyskania odpowiedniej aktywności kolagenazy i dokładnie wygaszone, aby zakończyć aktywność. Protokół ten pozwala na dużą liczbę komórek jednojądrzastych, które można wykorzystać do późniejszej charakterystyki za pomocą cytometrii Fleur, technik biologii molekularnej, mikroskopii, hodowli i miejsca, między innymi. Protokół ten zapewnił wiarygodną ocenę stanu zapalnego w okrężnicy u myszy eksperymentalnych i kontrolowanych w modelu przeszczepu szpiku kostnego.W ten sposób ułatwiono odkrycie nowych regulacyjnych mechanizmów immunologicznych tolerancji przeszczepów. Kolagenaza z Clostridium Istoliticum to odczynnik, z którym należy obchodzić się przy użyciu laboratoryjnych technik bezpieczeństwa. Stanowi zagrożenie dla zdrowia w przypadku wdychania i może powodować podrażnienie skóry i oczu.

isolation-lamina-propria-mononuclear-cells-from-murine-colon-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano wydajną metodę izolacji limfocytów z dróg rodnych myszy. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne oraz separację w gradiencie Percoll w celu zapewnienia efektywnej izolacji. Technikę tę można również dostosować do zastosowania u innych...

Izolacja limfocytów z błony śluzowej dróg rodnych myszy

W tym filmie pokazujemy izolację komórek jednojądrzastych blaszki właściwej z tkanki okrężnicy myszy poprzez trawienie enzymatyczne przy użyciu kolagenazy E i separacji gradientowej mediów do separacji gęstości opartej na krzemionce. Wyizolowane komórki jednojądrzaste można wykorzystać do dalszej analizy.

Izolacja komórek jednojądrzastych Lamina Propria: technika wirowania w gradiencie gęstości na bazie krzemionki w celu uzyskania komórek jednojądrzastych z mysiej okrężnicy

Miofibroblast jest wpływową komórką zrębu przewodu pokarmowego, która reguluje ważne procesy fizjologiczne zarówno w stanie normalnym, jak i chorobowym. Opisujemy technikę, która pozwala na izolację pierwotnych miofibroblastów zarówno z mysjej, jak i ludzkiej tkanki okrężnicy, którą można wykorzystać do eksperymentów in vitro.

Izolacja pierwotnych miofibroblastów z tkanki okrężnicy myszy i człowieka

Tutaj opisujemy prostą metodę izolacji przestrzennie odrębnych komórek powierzchni nabłonka mysiego okrężnicy od leżących poniżej komórek o kryptobazie.

Metoda kriosekcji do mikrodysekcji mysiej błony śluzowej okrężnicy

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji limfocytów z miejsc indukcyjnych, w tym tkanki limfatycznej związanej z jelitami, plam Peyera i drenujących węzłów chłonnych krezkowych, oraz miejsc efektorowych, w tym blaszki właściwej i nabłonka jelitowego układu odpornościowego jelita cienkiego.

Izolowanie limfocytów od układu odpornościowego myszy w jelicie cienkim

Opisany tutaj protokół wykorzystuje metodę fotoznakowania u nowonarodzonych myszy do specyficznej identyfikacji komórek odpornościowych, które migrują z jelita grubego do miejsc pozajelitowych. Strategia ta będzie przydatna do badania interakcji gospodarz-mikrobiom we wczesnym okresie życia.

In vivo (in vivo) Fotoznakowanie komórek w okrężnicy w celu oceny potencjału migracyjnego komórek krwiotwórczych u nowonarodzonych myszy

Tutaj prezentujemy protokół hodowli ludzkich monowarstw enteroidowych lub kolonoidowych, które mają nienaruszoną funkcję bariery, do badania interakcji nabłonkowo-mikrobiota gospodarza na poziomie komórkowym i biochemicznym.

Ludzkie monowarstwy okrężnicy do badania interakcji między patogenami, komensalami i nabłonkiem jelitowym gospodarza

W tym badaniu szczegółowo opisujemy procedurę zwłóknienia jelit za pośrednictwem TNBS, które wykazuje porównywalną patofizjologię do zwłóknienia Leśniowskiego-Crohna. Omawiamy również to podejście w świetle hamującego działania rapamycyny na zwłóknienie jelit.

Mechanistyczny wgląd w rozwój zwłóknienia jelit za pośrednictwem TNBS i ocena hamującego działania rapamycyny

W tym protokole opisujemy, jak generować monowarstwy mysiego pierwotnego nabłonka jelita grubego bezpośrednio z krypt jelitowych. Zapewniamy eksperymentalne podejścia do generowania zlewających się monowarstw na filtrach przepuszczalnych, monowarstw konfluentnych do gojenia ran drapanych i badań biochemicznych oraz rzadkich i zlewających się monowarstw do analizy immunofluorescencyjnej.

Generowanie monowarstw nabłonka pierwotnego jelita grubego myszy z krypt jelitowych

Tutaj przedstawiamy i demonstrujemy protokół izolacji pierwotnych komórek śródbłonka sinusoidalnego wątroby myszy (LSEC). Protokół opiera się na perfuzji kolagenazy wątrobowej, oczyszczaniu komórek niemiąższowych przez wirowanie z niską prędkością oraz selekcji kulek magnetycznych CD146. Zajmujemy się również fenotypowaniem i charakteryzacją tych izolowanych LSEC za pomocą cytometrii przepływowej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Izolacja i charakterystyka pierwotnych sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby myszy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji mysich mezenchymów jelitowych, w tym telocytów. Mogą one być wykorzystywane do kilku zastosowań, takich jak współhodowla z organoidami pochodzącymi od myszy lub ludzi, w celu wsparcia wzrostu i lepszego odzwierciedlenia sytuacji w oryginalnej tkance.

Izolacja mysiej mezenchymy jelitowej skutkująca wysoką wydajnością telocytów

Poznaj izolację komórek jednojądrzastych z blaszki właściwej okrężnicy myszy przy użyciu kolagenazy E. Ta metoda umożliwia immunofenotypowanie populacji immunologicznych jelit.

Izolacja komórek jednojądrzastych blaszki właściwej z mysiej okrężnicy przy użyciu kolagenazy E

Przeglądaj więcej filmów