Name: Badanie dynamiki jądrowej drożdży rozszczepienia mitotycznego i mejotycznego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Poznaj dynamikę jądrową drożdży rozszczepienia Schizosaccharomyces pombe podczas mitozy i mejozy za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek. Ta metoda umożliwia obserwację procesów jądrowych w czasie rzeczywistym bez toksycznych utrwalaczy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Natalii La Fourcade i Mon LaFerte za uczynienie przygotowania tego rękopisu przyjemniejszym przedsięwzięciem. Podziękowania dla członków Laboratorium w Forsburgu, którzy przyczynili się do ukończenia tej pracy swoim wglądem, pomysłami na eksperymenty i wsparciem moralnym. Projekt ten był wspierany przez NIGMS R35 GM118109 SLF.

<ol><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+microscopy%E2%80%93tips+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Live-cell microscopy–tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li>
<li>Green, M. D., Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Microscopy techniques to examine DNA replication in fission yeast. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MD+%22DNA+Replication%22">DNA Replication</a>. (13-41), Humana Press. New York, NY. (2015).</li>
<li>Lee, J. Y., Kitaoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%E2%80%99s+guide+to+rigor+and+reproducibility+in+fluorescence+imaging+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A beginner’s guide to rigor and reproducibility in fluorescence imaging experiments.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1519-1525 (2018).</li>
<li>Ohkura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis%3A+an+overview+of+key+differences+from+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Meiosis: an overview of key differences from mitosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a015859(2015).</li>
<li>Sabatinos, S. A., Ranatunga, N. S., Yuan, J. P., Green, M. D., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+stress+in+early+S+phase+generates+apparent+micronuclei+and+chromosome+rearrangement+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Replication stress in early S phase generates apparent micronuclei and chromosome rearrangement in fission yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (19), 3439-3450 (2015).</li>
<li>Ding, D. Q., Matsuda, A., Okamasa, K., Nagahama, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+cohesin-based+chromosome+structure+is+essential+for+homologous+chromosome+pairing+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Meiotic cohesin-based chromosome structure is essential for homologous chromosome pairing in Schizosaccharomyces pombe.</a> Chromosoma. 125 (2), 205-214 (2016).</li>
<li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622(2012).</li>
<li>Klutstein, M., Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+telomere+bouquet+regulates+meiotic+centromere+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The telomere bouquet regulates meiotic centromere assembly.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 458-469 (2015).</li>
<li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622(2012).</li>
<li>Cooper, J. P., Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fission+yeast+Taz1+protein+is+required+for+meiotic+telomere+clustering+and+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fission yeast Taz1 protein is required for meiotic telomere clustering and recombination.</a> Nature. 392 (6678), 828-831 (1998).</li>
<li>Reyes, C., Serrurier, C., Gauthier, T., Gachet, Y., Tournier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+B+prevents+chromosome+arm+separation+defects+by+promoting+telomere+dispersion+and+disjunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Aurora B prevents chromosome arm separation defects by promoting telomere dispersion and disjunction.</a> Journal of Cell Biology. 208 (6), 713-727 (2015).</li>
<li>Mastro, T. L., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+meiotic+crossovers+and+reduced+genome+stability+in+absence+of+Schizosaccharomyces+pombe+Rad16+%28XPF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Increased meiotic crossovers and reduced genome stability in absence of Schizosaccharomyces pombe Rad16 (XPF).</a> Genetics. 198 (4), 1457-1472 (2014).</li>
<li>Escorcia, W., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilization+of+the+replication+fork+protection+complex+disrupts+meiotic+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Destabilization of the replication fork protection complex disrupts meiotic chromosome segregation.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2978-2997 (2017).</li>
<li>Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Tomita, K., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+and+centromeres+have+interchangeable+roles+in+promoting+meiotic+spindle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Telomeres and centromeres have interchangeable roles in promoting meiotic spindle formation.</a> Journal of Cell Biology. 208 (4), 415-428 (2015).</li>
<li>Forsburg, S. L., Rhind, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+methods+for+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Basic methods for fission yeast.</a> Yeast. 23 (3), 173-183 (2006).</li>
<li>Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSabatinos%2C+SA+%22Methods+in+enzymology%22">Methods in enzymology</a>. 470, Academic Press. 759-795 (2010).</li>
<li>Diffraction PSF 3D. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.optinav.info/Diffraction-PSF-3D.htm">http://www.optinav.info/Diffraction-PSF-3D.htm</a> (2019).</li>
<li>Optinav.info. Convolve ED. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.optinav.info/Convolve_3D.htm">http://www.optinav.info/Convolve_3D.htm</a> (2019).</li>
<li>Optinav.info. Iterative Deconvolve. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.optinav.info/Iterative-Deconvolve-3D.htm">http://www.optinav.info/Iterative-Deconvolve-3D.htm</a> (2019).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide — IJ 1.46. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html</a> (2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>De Oliveira, F. M. B., Harris, M. R., Brazauskas, P., De Bruin, R. A., Smolka, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+DNA+replication+checkpoint+to+MBF+cell%E2%80%90cycle+transcription+reveals+a+distinct+class+of+G1%2FS+genes%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Linking DNA replication checkpoint to MBF cell‐cycle transcription reveals a distinct class of G1/S genes.</a> The EMBO Journal. 31 (7), 1798-1810 (2012).</li>
<li>Ostapenko, D., Burton, J. L., Solomon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+anaphase+promoting+complex+substrates+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of anaphase promoting complex substrates in S. cerevisiae.</a> PLoS One. 7 (9), e45895(2012).</li>
<li>Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohesin+Rec8+is+required+for+reductional+chromosome+segregation+at+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cohesin Rec8 is required for reductional chromosome segregation at meiosis.</a> Nature. 400 (6743), 461-464 (1999).</li>
<li>Zhu, Y. H., Hyun, J., Pan, Y. Z., Hopper, J. E., Rizo, J., Wu, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+the+fission+yeast+UNC-13%2FMunc13+protein+Ync13+in+late+stages+of+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Roles of the fission yeast UNC-13/Munc13 protein Ync13 in late stages of cytokinesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2259-2279 (2018).</li>
<li>Tay, Y. D., Leda, M., Goryachev, A. B., Sawin, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+global+Cdc42+guanine+nucleotide+exchange+factors+for+fission+yeast+cell+polarity+are+coordinated+by+microtubules+and+the+Tea1%E2%80%93Tea4%E2%80%93Pom1+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Local and global Cdc42 guanine nucleotide exchange factors for fission yeast cell polarity are coordinated by microtubules and the Tea1–Tea4–Pom1 axis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), jcs216580(2018).</li>
<li>Dudin, O., Bendezú, F. O., Groux, R., Laroche, T., Seitz, A., Martin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formin-nucleated+actin+aster+concentrates+cell+wall+hydrolases+for+cell+fusion+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast.</a> Journal of Cell Biology. 208 (7), 897-911 (2015).</li>
<li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+secretory+cargo+transport+within+the+Golgi+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of secretory cargo transport within the Golgi apparatus.</a> Journal of Cell Biology. , jcb-201807194 (2019).</li>
<li>Kraft, L. M., Lackner, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+mechanism+for+mitochondria-dependent+dynein+anchoring%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A conserved mechanism for mitochondria-dependent dynein anchoring.</a> Molecular Biology of the Cell. , mbc-E18 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obrazowanie żywych komórek podczas mitozy i mejozy daje możliwość zbadania dynamiki jądrowej bez znacznego zakłócania fizjologii drożdży rozszczepialnych podczas pozyskiwania danych. Należy jednak zachować ostrożność, aby komórki rosły do pożądanej gęstości wolnej od stresów środowiskowych; a w przypadku mejozy, że komórki są obrazowane w czasie końcowego różnicowania i nie za wcześnie ani późno. Nadmierne stłoczenie komórek, głód i nieodpowiednie temperatury wzrostu są częstymi czynnikami, które przyczyniają się do niepowtarzalnych obserwacji. Ponadto podczas budowy szczepu ważne jest, aby sprawdzić, czy znaczniki fluorescencyjne nie zakłócają funkcji genów docelowych ani nie wpływają na ogólną sprawność komórek. Brak dokładnego zbadania fenotypów szczepów zawierających markery fluorescencyjne może skutkować niespójnymi i nieporównywalnymi wynikami w przypadku podobnych genotypów.
Chociaż mikroskopowe podkładki agarozowe są proste w montażu, mogą również stanowić przeszkodę w uzyskaniu cennych danych obrazowych. Tworzenie wacików agarozowych jest tak proste, jak umieszczenie trzech szkiełek mikroskopowych równolegle do siebie, dozowanie stopionej agarozy na środkowym szkiełku i umieszczenie szkiełka, które przecina górną część pozostałych szkiełek. Przydatne jest jednak zmontowanie aparatu do tworzenia szkiełek, który pozwala na modyfikację szerokości w celu wytworzenia odpornych, specyficznych dla sytuacji wkładek agarozowych. Prosty preparat do tworzenia preparatów, który zapewnia elastyczność szerokości elektrod, składa się z platformy (uchwytu końcówek do pipet lub stołu), dwóch szkiełek mikroskopowych i taśmy laboratoryjnej działającej jako mechanizm regulacji szerokości pada (ilustracja 1A). Dokładna grubość podkładki będzie zależeć od wymagań dotyczących czasu obrazowania, marki agarozy, temperatury, uszczelniacza do szkiełek nakrywkowych, szybkości parowania itp. Dlatego ważne jest, aby skalibrować system obrazowania przed pozyskaniem danych, aby zwiększyć odtwarzalność techniczną i poprawić jakość obrazowania żywych komórek 1,2,3. Powierzchnia, sztywność i kompozycja padu są niezbędne podczas długotrwałej akwizycji obrazu. Agaroza ma niską fluorescencję tła, łatwo się formuje, a przy odpowiednim stężeniu wytrzymuje odkształcenia strukturalne spowodowane parowaniem. Co więcej, połączenie pożywek drożdżowych rozszczepialnych z agarozą nie wpływa negatywnie na jakość obrazu i pozwala na rozszerzoną obserwację wielu cykli mitoz i mejozy. Ważne jest również, aby unikać pęcherzyków powietrza w mikroskopii poklatkowej. Wewnątrz płatków agarozowych i w próbce kieszenie powietrzne rozszerzają się z czasem, powodując przesuwanie się komórek i zakłócając płaszczyzny ogniskowe. Pod warunkiem, że komórki są skutecznie rozprowadzane przez rotację szkiełka nakrywkowego, naukowcy mogą śledzić procesy mitotyczne na przestrzeni kilku pokoleń i zdarzenia mejotyczne od fuzji jądrowej do zarodnikowania. Wykonanie i wybór odpowiedniej podkładki do eksperymentów obrazowych wymaga czasu, ale raz osiągnięty, może przyczynić się do bardzo pouczających obserwacji mikroskopowych.
Podobnie jak w przypadku innych metod, mikroskopia żywych komórek nie jest wolna od ograniczeń technicznych. Stosowanie białek znakowanych fluorescencyjnie wprowadza granice do eksperymentów, które ograniczają zakres tego, co można badać. Fotowybielanie i fototoksyczność to problemy typowe dla długotrwałej akwizycji obrazu. Można im przeciwdziałać, nie wystawiając komórek na działanie krótkich fal zbyt długo lub zbyt często. W przypadku eksperymentów z udziałem GFP, CFP, YFP, mRFP i DsRed, typowych białek fluorescencyjnych stosowanych w obrazowaniu żywych komórek drożdży rozszczepialnych, do rutynowych eksperymentów stosuje się 5-15% światła wzbudzającego i czas ekspozycji 100-500 ms. Parametry te zmieniają się jednak w zależności od specyficznych wymagań eksperymentu badacza. Ponadto stosy Z składające się z 9-13 sekcji w odstępach 0,5 μm przy użyciu obiektywu 60x wystarczą, aby określić grubość rozszczepienia komórki drożdży. Ponadto ważne jest, aby potwierdzić, że markery fluorescencyjne nie zakłócają prawidłowej regulacji lub funkcji docelowych białek ani nie generują fałszywych fenotypów. W związku z tym wskazane jest konstruowanie szczepów zawierających różne znaczniki fluorescencyjne i powinowactwa do tego samego genu docelowego, aby potwierdzić obserwacje w różny sposób. Ponadto obowiązkiem badaczy jest zapewnienie, aby parametry eksperymentalne mogły być odtwarzane w różnych eksperymentach oraz aby zebrane dane nadawały się do dalszej analizy 1,3. Żadna technologia nie zastąpi sprawdzonej praktyki skrupulatnej walidacji systemów eksperymentalnych przez uważną obserwację i rygorystyczne badanie liniowości w wykrywaniu sygnałów fluorescencyjnych.
Wreszcie, ważne jest, aby analizować dane mikroskopowe w formatach, które nie modyfikują surowych obrazów. Fidżi zapewnia doskonałe narzędzia dokumentacyjne do śledzenia pomiarów surowych danych i umożliwia naukowcom badanie różnych parametrów komórek podczas jednej sesji. Te cechy, a także bogactwo samouczków online i obszerny zakres literatury, sprawiają, że Fidżi jest ważnym narzędziem do pomiaru, analizy i prezentacji danych obrazowania żywych komórek, które opisują dynamikę jądrową drożdży rozszczepialnych w mitozie i mejjozie.

Mikroskopia żywych komórek pozwala badaczom badać dynamikę jądrową bez zabijania komórek drożdży rozszczepienia i eliminuje potrzebę stosowania śmiercionośnych utrwalaczy i barwień. Możliwe jest obserwowanie stabilności, ruchu, lokalizacji i czasu znakowanych fluorescencyjnie białek, które są zaangażowane w ważne zdarzenia, takie jak replikacja chromosomów, rekombinacja i segregacja, a także ruchy błony i cytoszkieletu. Utrzymując żywotność komórek i wykrywając nietoksyczne sygnały, ingerencja fizjologiczna jest minimalna. Przy prawidłowym wykonaniu ta metoda mikroskopowa może zmniejszyć efekty zakłócające, które wynikają z przedłużonej obsługi technicznej lub z fałszywej reaktywności chemicznej. Ponadto podczas eksperymentu badacze mogą dokonać trafnych obserwacji stanów odżywczych i stresu drożdży rozszczepialnych, wydajności proliferacyjnej i stanu apoptozy, które wskazują na niewłaściwe parametry obrazowania lub nieprawidłową fizjologię komórki1,2,3.
Mitoza i mejoza charakteryzują się podziałem jądrowym i komórkowym. W mejozy, w przeciwieństwie do mitozy, zawartość genetyczna zmniejsza się o połowę, ponieważ komórki rodzicielskie dają początek komórkom potomnym4. Ponieważ obrazowanie żywych komórek zapewnia wymiar czasowy oprócz relacji przestrzennej, można badać dużą liczbę komórek w czasie rzeczywistym. Mikroskopia żywych komórek umożliwiła naukowcom zbadanie dynamiki podziału jądra za pomocą znaczników fluorescencyjnych dla histonów5, podjednostki kohezyny6, mikrotubule7, centromery8, kinetochores9, komponenty korpusu wrzeciona (SPB)10, oraz składniki kompleksu pasażera chromosomu (CPC)11. Poza aparatem do segregacji chromosomów, obrazowanie żywych komórek uchwyciło również zachowanie białek niezbędnych, ale nie bezpośrednio zaangażowanych w segregację chromosomów. Wykazano, że funkcja tych białek wpływa na replikację, rekombinację chromosomów, ruch jądra i przyłączanie chromosomów do mikrotubul12,13,14. Obserwacje te przyczyniły się do lepszego zrozumienia zdarzeń komórkowych, których składniki funkcjonalne nie były podatne na badania biochemiczne lub genetyczne. Dzięki nowym postępom w technologii mikroskopii ograniczenia, takie jak niska rozdzielczość, fotowybielanie, fototoksyczność i stabilność ostrości, zmniejszą się, ułatwiając w ten sposób lepsze obserwacje mitotycznej i mejotycznej dynamiki jądrowej w czasie rzeczywistym1,2,3. Mejoza jest szczególnie trudna, ponieważ jest to końcowa ścieżka różnicowania, która wymaga szczególnej uwagi na czas.
Celem tego protokołu jest przedstawienie stosunkowo prostej metody badania dynamiki jądrowej drożdży w czasie rzeczywistym w mitozie i mejozy. Aby to osiągnąć, konieczne jest użycie komórek, które nie były narażone na stres środowiskowy, przygotowanie poduszek agarozowych, które mogą wytrzymać długotrwałe obrazowanie, oraz zamontowanie komórek w gęstościach ułatwiających wizualizację dynamiki pojedynczej komórki. Co więcej, protokół ten wykorzystuje komórki przenoszące znakowane fluorescencyjnie białka, które służą jako użyteczne markery kinetyki jądrowej (Hht1-mRFP lub Hht1-GFP), segregacji chromosomów (Sad1-DsRed), dynamiki cytoszkieletu (Atb2-mRFP), aktywacji transkrypcji w G1 / S (Tos4-GFP) i stabilności kohezji w mejozie (Rec8-GFP). Metoda ta wprowadza również dodatkowe markery jądrowe i cytozolowe (tabela I), które można wykorzystać w różnych kombinacjach do odpowiedzi na pytania dotyczące określonych procesów komórkowych. Ponadto dostępne są podstawowe narzędzia Fidżi, które pomagają naukowcom przetwarzać obrazy żywych komórek i analizować różne typy danych. Siła tego podejścia wynika z wykorzystania obserwacji w czasie rzeczywistym dynamiki białek, czasu i stabilności do opisania procesów, które są integralne dla prawidłowego przeprowadzenia mitozy i mejozy.

<table><tbody><tr><td>Soczewka obiektywowa Plan Apochromat 60x</td><td>Olympus</td><td>AMEP4694</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma</td><td>A-8751</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>7558B</td><td>IB4917-10 kg</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma</td><td>A9539-500g</td><td></td></tr><tr><td>Rotator tancerki brzucha</td><td>Stovall</td><td>US Patent #4.702.610</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Sigma</td><td>B-4501</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma</td><td>B-6768-5kg</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H20,</td> <td>Sigma</td><td>C3306-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sigma</td><td>C-0759</td><td></td></tr><tr><td>Wtyczka oprogramowania Convolve 3D</td><td>OptiNav, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD CoolSnap HQ</td><td>Roper</td><td>n/a Szkiełko</td><td></td></tr><tr><td>nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>16004-302</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&middot; 5H20,</td> <td>END</td><td>CX-2185-1</td><td></td></tr><tr><td>Dekonwoluacyjny mikroskop fluorescencyjny DeltaVision</td><td>GE Healthcare/Applied Precision</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Wtyczka oprogramowania Diffraction PSF 3D</td><td>OptiNav, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Edinburgh minimal medium (EMM) Notrogen</td><td>Sunrise</td><td>2023; 1kg</td><td></td></tr><tr><td>FeCl2&middot; 6H2O</td><td>END</td><td>FX9259-04</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G-7021</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzewcza</td><td>Barnstead</td><td>Thermo Lyne</td><td></td></tr><tr><td>Histidine</td><td>Sigma</td><td>H8125-100g</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do dekonwolucji Huygens</td><td>SVI</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do dekonwolucji Imaris</td><td>Bitplane</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Shell lab</td><td>#3015</td><td></td></tr><tr><td>Inositol</td><td>Sigma</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>Iteracyjna wtyczka oprogramowania Deconvolve</td><td>3D OptiNav, Inc.</td><td></td><td></td>brak</tr><tr><td>KCl</td><td>Mallinckvadt</td><td>6858-04</td><td></td></tr><tr><td>Lanolina</td><td>Sigma</td><td>L7387-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Leucine</td><td>Sigma</td><td>L8912-100g</td><td></td></tr><tr><td>Lizyna</td><td>Sigma</td><td>L5626-500g</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt słodowy (ME)</td><td>MP</td><td>4103-032</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H20</td><td>AMRESCO</td><td>0288-500G</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>brak</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>VWR</td><td>16004-422</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4,</td><td>Mallinckvadt</td><td>6192-02</td><td></td></tr><tr><td>Kwas molibdowy</td><td>Sigma</td><td>M-0878</td><td></td></tr><tr><td>Na2S04 </td><td>Mallinckvadt</td><td>8024-03</td><td></td></tr><tr><td>Kwas nikotynowy,</td> <td>Sigma</td><td>N-4126</td><td></td></tr><tr><td>Kwas pantotenowy</td><td>Sigma</td><td>P-5161</td><td></td></tr><tr><td>Wosk parafinowy</td><td>Fisher</td><td>s80119WX</td><td></td></tr><tr><td>Pomedium glutaminianu Pombe (PMG)</td> <td>Sunrise</td><td>2060-250</td><td></td></tr><tr><td>softWorx v3.3 oprogramowanie do przetwarzania obrazu</td><td>GE Healthcare</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Sporulacja Medium w proszku</td><td>Sunrise</td><td>1821-500</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z kontrolowaną temperaturą</td><td>Beckman</td><td>Allwgra 6KR xentrifuge</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>AMRESCO</td><td>0847-500g</td><td></td></tr><tr><td>Wazelina</td><td>Equaline</td><td>F79658</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>EMD</td><td>1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy plus suplementy (TAK)</td><td>Sunrise</td><td>2011-1kg</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&middot; 7H2O</td><td>J.T.Baker</td><td>4382-04</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie dynamiki jądrowej drożdży rozszczepienia mitotycznego i mejotycznego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Obrazowanie żywych komórek to technika mikroskopowa używana do badania dynamiki komórek i białek w żywych komórkach. Ta metoda obrazowania nie jest toksyczna, na ogół nie ingeruje w fizjologię komórki i wymaga minimalnego postępowania eksperymentalnego. Niski poziom zakłóceń technicznych umożliwia naukowcom badanie komórek w wielu cyklach mitozy i obserwowanie mejozy od początku do końca. Korzystając ze znaczników fluorescencyjnych, takich jak zielone białko fluorescencyjne (GFP) i czerwone białko fluorescencyjne (RFP), naukowcy mogą analizować różne czynniki, których funkcje są ważne dla procesów takich jak transkrypcja, replikacja DNA, spójność i segregacja. W połączeniu z analizą danych przy użyciu Fidżi (bezpłatna, zoptymalizowana wersja ImageJ), obrazowanie żywych komórek oferuje różne sposoby oceny ruchu białek, lokalizacji, stabilności i czasu, a także dynamiki jądrowej i segregacji chromosomów. Jednak, podobnie jak w przypadku innych metod mikroskopowych, obrazowanie żywych komórek jest ograniczone przez wewnętrzne właściwości światła, które ograniczają moc rozdzielczości przy dużych powiększeniach, a także jest wrażliwe na fotowybielanie lub fototoksyczność przy wysokich częstotliwościach fal. Jednak przy pewnej ostrożności badacze mogą ominąć te fizyczne ograniczenia, starannie dobierając odpowiednie warunki, szczepy i markery fluorescencyjne, aby umożliwić odpowiednią wizualizację zdarzeń mitotycznych i mejotycznych.

Tutaj prezentujemy obrazowanie żywych komórek, które jest nietoksyczną metodą mikroskopii, która pozwala badaczom badać zachowanie białek i dynamikę jądrową w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych podczas mitozy i mejozy.

Badanie dynamiki jądrowej drożdży rozszczepienia mitotycznego i mejotycznego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Mikroskopia żywych komórek pozwala naukowcom badać dynamikę jądra drożdży w mitozie i mejozie w czasie rzeczywistym. Siła tej metody wynika z badania procesów jądrowych w żywych komórkach w normalnych warunkach fizjologicznych, co eliminuje potrzebę stosowania toksycznych utrwalaczy i plam. Technika ta odpowiada na pytania związane z czasem, stabilnością i ruchliwością białek, które mogą nie być podatne na manipulacje genetyczne lub biomechaniczne.Bardzo ważne jest, aby zwrócić szczególną uwagę na zdrowie i kondycję rozszczepionych komórek drożdży przed obrazowaniem. Zawsze sprawdzaj morfologię i charakterystykę wzrostu, aby zapewnić spójność wyników we wszystkich eksperymentach. Protokół ten pokazuje stosunkowo prosty sposób przygotowania preparatów mikroskopowych, który po prawidłowym opanowaniu może zwiększyć spójność i odtwarzalność długotrwałego obrazowania żywych komórek.Aby rozpocząć pobieranie materii komórkowej z kriogenicznej płytki budzącej, nałóż ją na płytki YES i inkubuj je w temperaturze 25 stopni Celsjusza lub 32 stopni Celsjusza, w zależności od genotypu drożdży, aby obudzić szczepy drożdży rozszczepialnych z konserwacji kriogenicznej. Następnie za pomocą sterylnej pętli wybierz komórki z poszczególnych kolonii w obudzonych szczepach drożdży rozszczepienia i zaszczepij je w probówkach zawierających trzy mililitry płynnej pożywki YES. Umieść probówki w wytrząsarce z prędkością od 150 do 220 obr./min, aby rosły w temperaturze 25 lub 32 stopni Celsjusza przez noc do późnej fazy logarytmicznej z pożądanym odczytem gęstości optycznej od 0,7 do 1,0.Przenieś 10 mikrolitrów kultury na szkiełko mikroskopowe. Załóż szkiełko nakrywkowe i umieść je pod mikroskopem, aby sprawdzić prawidłową morfologię komórek i stan odżywienia. Aby ustawić szkiełko mikroskopowe do analizy mitozy lub mejozy, najpierw dodaj dwa gramy agarozy do 500-mililitrowej kolby zawierającej 100 mililitrów minimalnej pożywki plus suplementy do mitozy lub płynnej pożywki zarodnikującej do mejozy.Podgrzej roztwór agarozy w kuchence mikrofalowej z mocą 60% w 10-sekundowych odstępach lub umieść zlewkę w łaźni wodnej o temperaturze 55 stopni Celsjusza na 10 minut. Zakręć roztworem, aby zapewnić wydajne topienie. Ustaw dwa szkiełka mikroskopowe na uchwycie końcówki do pipet, tak aby górne szkiełko spoczywało na dwóch stosach taśmy laboratoryjnej na obu końcach jako podpora, tworząc kształt krzyża.Dostosuj odległość między dwoma szkiełkami do więcej niż dwóch milimetrów, aby w kolejnych krokach utworzyć grubą podkładkę w celu przedłużenia obrazowania. Po schłodzeniu stopionej agarozy przez jedną minutę w temperaturze pokojowej zdejmij górne szkiełko i użyj końcówki pipety o szerokim otworze, aby dozować od 50 do 100 mikrolitrów na dolną szkiełko, aby uzyskać plamkę. Zanim agaroza ostygnie, umieść górne szkiełko na górze, aby wytworzyć podkładkę do rozprowadzania o średnicy około jednego i 1/2 do dwóch centymetrów.Optymalne obrazowanie żywych komórek ma kluczowe znaczenie dla kolejnych etapów przetwarzania danych. Upewnij się, że usunąłeś wszelkie bombki powietrzne ze stopionej agarozy i utwórz cienką podkładkę na okresy obrazowania dłuższe niż cztery godziny. Aby zbadać zdarzenia mitotyczne, hoduj komórki z kultur starterowych w płynnym EMM lub PMG plus suplementy przez noc.Przenieś jeden mililitr kultury do kuwety i zmierz na spektrofotometrze na długości fali 595 nanometrów. Wzrost komórek jest uważany za fazę mid-log, gdy gęstość optyczna osiąga 0,4. Następnie odwirować jeden mililitr zawiesiny komórek w ilości 1,375 g przez jedną minutę.Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w minimalnej pożywce plus suplementy do końcowej objętości 100 mikrolitrów. Aby zobrazować zdarzenia mejozyczne, hoduj komórki z kultur starterowych w minimalnej pożywce plus suplementy przez noc. Wzrost komórek jest uważany za późną fazę logarytmiczną, gdy gęstość optyczna przy 595 nanometrach wynosi od 0,7 do jednego.Następnie, z kultur późnego logarytmu, uzyskaj 500 mikrolitrów każdego szczepu typu mate, H ujemnego i H dodatniego, i połącz w celu uzyskania jednomililitrowej zawiesiny komórek. Odwirować komórki z prędkością 1 375 razy g przez jedną minutę. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze płynnego ekstraktu maltozowego.Powtórz płukanie ekstraktem z maltozy jeszcze trzy razy, aby zapewnić skuteczne usuwanie składników odżywczych. Po ostatnim przemyciu ekstraktem z maltozy ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze ekstraktu z maltozy i przenieść mieszaninę do 50-mililitrowej kolby zawierającej dziewięć mililitrów ekstraktu maltozowego. Inkubować przez 12 do 16 godzin w temperaturze od 22 do 25 stopni Celsjusza przy minimalnej prędkości obrotowej od 50 do 100 obr./min.Pojawienie się wielu okrągłych kępek drożdży rozszczepialnych, powstałych w wyniku obfitej samoflokulacji, wskazuje na efektywne krycie. Następnie weź jednomililitrową próbkę z kultury kojarzenia i odwiruj przy 1,375 g przez jedną minutę. Usunąć 750 mikrolitrów supernatantu i ponownie zawiesić komórki w pozostałym supernatancie.Wiruj energicznie przez pięć sekund, aby rozbić grudki. Dozuj 20 mikrolitrów mitotycznej lub mejotycznej zawiesiny komórek na 2% waciku agarozowym. Usuń nadmiar nośnika, odwracając szkiełko i kładąc je na wierzchu niestrzępiącego się ręcznika papierowego na dwie do trzech sekund.Odwróć szkiełko i delikatnie umieść szklane szkiełko nakrywkowe na górze podkładki, uważając, aby nie wytwarzać pęcherzyków powietrza. Aby utworzyć monowarstwę komórkową, obróć szkiełko nakrywkowe palcem wskazującym zgodnie z ruchem wskazówek zegara przez jeden pełny obrót w przypadku komórek mitozy lub dwa pełne obroty w przypadku komórek mejozy. Upewnij się, że materia komórkowa rozprasza się w poduszce agarozowej, co pozwala na lepsze oddzielenie pojedynczych komórek lub worka.Za pomocą małego drewnianego patyczka dozuj stopiony węglowodorowy uszczelniacz wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego, aby uszczelnić każdą podkładkę agarozową. Po uszczelnieniu podkładki agarozowej umieść ją na stoliku mikroskopu. Włącz komorę temperaturową i ustaw ją na żądaną temperaturę.Umieść płytkę z mokrym ręcznikiem papierowym w komorze, aby kontrolować wilgotność systemu mikroskopowego. Pozwól mu zachować równowagę przez 10 do 15 minut w odpowiednich warunkach obrazowania. Pozwala to na rozproszenie pozostałych pęcherzyków powietrza i wystąpienie wszelkich przesunięć agarozy w ostatniej chwili.Użyj obiektywu 40X, aby znaleźć odpowiednie pola widzenia do obrazu. Przełącz się na obiektyw 60X, aby rozpocząć gromadzenie danych. W oprogramowaniu sterującym funkcją mikroskopu wybierz zestawy filtrów mikroskopu, które najlepiej pasują do obserwowanych fluoroforów.Dostosuj długości fal wzbudzenia, aby pasowały do zastosowanych fluoroforów, zastosuj najniższą moc wzbudzenia, która wytwarza spójny sygnał, i wykorzystaj czasy ekspozycji od czterech do ośmiu godzin, aby wygenerować akceptowalne, ale wymierne i odtwarzalne dane obrazowania. Zbierz co najmniej sześć punktów czasowych zdobywania co godzinę. W oprogramowaniu do zbierania obrazów wybierz co najmniej jeden kanał fluorescencyjny, z którego chcesz pozyskać dane i zastosuj materiał Z składający się z 13 sekcji w odstępach 0,5 mikrometra.W oprogramowaniu Fiji prześlij zdekonwoluowany obraz, wybierając funkcję Importer formatów biologicznych w menu wtyczek. W wyskakującym oknie Opcje importu wybierz Hyperstack, Domyślny tryb kolorów, zaznacz opcję Automatyczne skalowanie i naciśnij przycisk OK. Upewnij się, że wyświetlane okno ma odpowiednią liczbę kanałów fluorescencyjnych i ram czasowych, przewijając w boki odpowiednie paski na dole.Zapisz jako plik TIFF, który nie kompresuje danych. Następnie w menu Analizuj użyj opcji Ustaw pomiary, aby wybrać różne parametry. Na przykład: Obszar, Min. maksymalna wartość szarości, Zintegrowana gęstość, Średnia wartość szarości, Mediana, Pozycja stosu, Obwód i Etykieta wyświetlania.Wybierz Kolor i kliknij narzędzie Kanały. W wyskakującym oknie Kanały zaznacz kanał koloru, dla którego będzie mierzona intensywność lub obszar. Wybierz Obraz, a następnie Typ i kliknij 32-bitowy.Wybierz funkcje Dostosuj i Próg w menu Obraz. Zaznacz pole Ciemne tło, wybierz metodę domyślną i wybierz czerwony, aby nałożyć interesujące sygnały. Użyj narzędzia różdżki, aby podświetlić każdą interesującą Cię strukturę i naciśnij literę T na klawiaturze, aby dodać wybrany ROI do wyskakującego okna menedżera ROI.Następnie otwórz spakowany folder ROI, aby załadować menedżera ROI i kliknij każdy identyfikator ROI w lewym panelu bocznym. Wybierz opcję Zmierz z menu Analizuj i powtórz to polecenie dla każdego identyfikatora ROI, aby określić ilościowo interesujące obiekty we wszystkich wycinkach stosu obrazów. Zapisz wyniki jako plik CSV do analizy statystycznej.W tym badaniu, jeśli komórki głodują z powodu ograniczenia składników odżywczych lub przerostu, wykażą nadmiar wakuoli i zmniejszony rozmiar komórek. Komórki logarytmiczne wykazują aktywną replikację DNA i podział komórki, a także panjądrową ekspresję Tos4-GFP i separację ognisk Sad1-DsRed. Brak krycia, jak to ma miejsce, gdy komórki nie są wystarczająco pozbawione azotu, uniemożliwi im wejście w mejozę.Pokazano parę komórek rozszczepialnych ulegających kariogamii. Solidna flokulacja zawiesiny komórek współpracujących zwiększa interakcję między komórkami, a tym samym wskazuje na udane kojarzenie i wydajną indukcję mejotyczną. Pęcherzykowe worki mogą przybierać różne formy, w tym kształty komórek zygzakowatych i bananowych.W mitozie, gdy komórki przechodzą z metafazy do telofazy, pierwsza zmiana polega na skurczeniu się wielkości jądra w metafazie, podczas gdy druga pokazuje pękanie jądra podczas anafazy. Oprócz tego, że dzielą pewną dynamikę segregacji z komórkami mitotycznymi, komórki mejotyczne wykazują oscylacje jądrowe podczas rekombinacji homologicznej i dalszej redukcji nukleozydów pod koniec anafazy, II.It jest obowiązkiem naukowców za zapewnienie, że parametry eksperymentu mogą być odtwarzane w różnych eksperymentach i że zebrane dane nadają się do dalszej analizy. Obrazowanie żywych komórek pozwoliło badaczom na dokładne zbadanie mechaniki podziału jądra w mitozie i mejjozie.Wraz z poprawą właściwości znaczników fluorescencyjnych i możliwości mikroskopu, liczba i rodzaj procesów, które możemy zaobserwować, będzie się zwiększać.

examination-mitotic-meiotic-fission-yeast-nuclear-dynamics

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Drożdże szczapowe, Schizosaccharomyces pombe, stanowią dobry system modelowy do badania podstawowych procesów komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowej analizy żywych komórek drożdży szczapowych. W tym konkretnym doświadczeniu skupiamy się na organizacji genomu w obrębie jądra komórkowego, jednak metoda ta może być również wykorzystana do badania czynników cytozolowych.

Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Zapewniamy powtarzalną podstawową metodę długoterminowej mikroskopii cyklu życia płciowego drożdży rozszczepialnych. Z niewielkimi korektami, przedstawiony protokół pozwala na skupienie badań na różnych etapach procesu rozrodczego.

Mikroskopia płciowego cyklu życiowego drożdży rozszczepialnych

Drożdże rozszczepienia, Schizosaccharomyces pombe, to doskonały system modelowy do badania cytokinezy, ostatniego etapu podziału komórki. Tutaj opisujemy podejście mikroskopowe do analizy różnych zdarzeń cytokinetycznych w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych.

Analiza czasoprzestrzenna zdarzeń cytokinetycznych w drożdżach rozszczepialnych

Tutaj prezentujemy protokół do oceny dynamiki powstawania wrzeciona i progresji mitotycznej. Nasze zastosowanie obrazowania poklatkowego umożliwia użytkownikowi identyfikację komórek na różnych etapach mitozy, śledzenie i identyfikację defektów mitotycznych oraz analizę dynamiki wrzeciona i losu komórek mitotycznych po ekspozycji na leki antymitotyczne.

Obrazowanie żywych komórek w celu oceny dynamiki czasu metafazy i losu komórki po perturbacjach wrzeciona mitotycznego

Mikroskopia poklatkowa jest cennym narzędziem do badania mejozy u pączkujących drożdży. Protokół ten opisuje metodę, która łączy synchronizację cyklu komórkowego, mikroskopię poklatkową i warunkowe wyczerpanie białka docelowego, aby zademonstrować, jak badać funkcję określonego białka podczas segregacji chromosomów mejotycznych.

Zastosowanie mikroskopii poklatkowej i specyficznego dla etapu zubożenia komórek białek do badania mejozy u S. cerevisiae

Protokół ten opisuje dwie metody zatrzymania cyklu komórkowego drożdży oraz opcjonalnego uwalniania oraz rozwija zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej do badania procesów zależnych od cyklu komórkowego u S. cerevisiae.

Manipulacja i analiza procesów zależnych od cyklu komórkowego u drożdży pączkujących

Wybór, mikroiniekcja i obrazowanie znakowanej fluorescencyjnie F-aktyny za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii plamkowej (FSM).

Obrazowanie żywych komórek w celu analizy dynamiki F-aktyny za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii plamistej (FSM)

W niniejszej pracy opisujemy podstawowy protokół obrazowania i kwantyfikacji czasu trwania mitozy w żywych komórkach ssaków hodowlanych po transfekcji siRNA.

Obrazowanie time-lapse mitozy po transfekcji siRNA

Opisano niezawodną metodę monitorowania transportu organelli do kwaśnego światła wakuoli drożdżowej w celu ich degradacji i recyklingu. Metoda ta opiera się na specyficznym znakowaniu docelowych organelli za pomocą genetycznie kodowanego dwuemisyjnego fluorescencyjnego biosensora pH oraz wizualizacji pojedynczych komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Analiza z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania mitofagii w drożdżach Saccharomyces cerevisiae

Prezentujemy prosty protokół do uzyskiwania filmów z mikroskopii fluorescencyjnej rosnących komórek drożdży, oraz pakiet oprogramowania oparty na graficznym interfejsie użytkownika do ekstrakcji danych szeregów czasowych pojedynczych komórek. Analiza obejmuje automatyczne przypisywanie czasu pochodzenia i podziału zintegrowane z inspekcją wizualną i ręczną selekcją śledzonych danych.

Pozyskiwanie fluorescencyjnych filmów poklatkowych pączkujących drożdży i analiza dynamiki pojedynczych komórek za pomocą GRAFTS

Poznaj dynamikę jądrową drożdży rozszczepienia Schizosaccharomyces pombe podczas mitozy i mejozy za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek. Ta metoda umożliwia obserwację procesów jądrowych w czasie rzeczywistym bez toksycznych utrwalaczy.

Badanie dynamiki jądrowej drożdży rozszczepienia mitotycznego i mejotycznego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek (Wideo) | JoVE Journal

Badanie dynamiki jądrowej drożdży rozszczepienia mitotycznego i mejotycznego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Przeglądaj więcej filmów