Badanie dynamiki jądrowej drożdży rozszczepienia mitotycznego i mejotycznego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Mikroskopia żywych komórek pozwala naukowcom badać dynamikę jądra drożdży w mitozie i mejozie w czasie rzeczywistym. Siła tej metody wynika z badania procesów jądrowych w żywych komórkach w normalnych warunkach fizjologicznych, co eliminuje potrzebę stosowania toksycznych utrwalaczy i plam. Technika ta odpowiada na pytania związane z czasem, stabilnością i ruchliwością białek, które mogą nie być podatne na manipulacje genetyczne lub biomechaniczne.

Bardzo ważne jest, aby zwrócić szczególną uwagę na zdrowie i kondycję rozszczepionych komórek drożdży przed obrazowaniem. Zawsze sprawdzaj morfologię i charakterystykę wzrostu, aby zapewnić spójność wyników we wszystkich eksperymentach. Protokół ten pokazuje stosunkowo prosty sposób przygotowania preparatów mikroskopowych, który po prawidłowym opanowaniu może zwiększyć spójność i odtwarzalność długotrwałego obrazowania żywych komórek.

Aby rozpocząć pobieranie materii komórkowej z kriogenicznej płytki budzącej, nałóż ją na płytki YES i inkubuj je w temperaturze 25 stopni Celsjusza lub 32 stopni Celsjusza, w zależności od genotypu drożdży, aby obudzić szczepy drożdży rozszczepialnych z konserwacji kriogenicznej. Następnie za pomocą sterylnej pętli wybierz komórki z poszczególnych kolonii w obudzonych szczepach drożdży rozszczepienia i zaszczepij je w probówkach zawierających trzy mililitry płynnej pożywki YES. Umieść probówki w wytrząsarce z prędkością od 150 do 220 obr./min, aby rosły w temperaturze 25 lub 32 stopni Celsjusza przez noc do późnej fazy logarytmicznej z pożądanym odczytem gęstości optycznej od 0,7 do 1,0.

Przenieś 10 mikrolitrów kultury na szkiełko mikroskopowe. Załóż szkiełko nakrywkowe i umieść je pod mikroskopem, aby sprawdzić prawidłową morfologię komórek i stan odżywienia. Aby ustawić szkiełko mikroskopowe do analizy mitozy lub mejozy, najpierw dodaj dwa gramy agarozy do 500-mililitrowej kolby zawierającej 100 mililitrów minimalnej pożywki plus suplementy do mitozy lub płynnej pożywki zarodnikującej do mejozy.

Podgrzej roztwór agarozy w kuchence mikrofalowej z mocą 60% w 10-sekundowych odstępach lub umieść zlewkę w łaźni wodnej o temperaturze 55 stopni Celsjusza na 10 minut. Zakręć roztworem, aby zapewnić wydajne topienie. Ustaw dwa szkiełka mikroskopowe na uchwycie końcówki do pipet, tak aby górne szkiełko spoczywało na dwóch stosach taśmy laboratoryjnej na obu końcach jako podpora, tworząc kształt krzyża.

Dostosuj odległość między dwoma szkiełkami do więcej niż dwóch milimetrów, aby w kolejnych krokach utworzyć grubą podkładkę w celu przedłużenia obrazowania. Po schłodzeniu stopionej agarozy przez jedną minutę w temperaturze pokojowej zdejmij górne szkiełko i użyj końcówki pipety o szerokim otworze, aby dozować od 50 do 100 mikrolitrów na dolną szkiełko, aby uzyskać plamkę. Zanim agaroza ostygnie, umieść górne szkiełko na górze, aby wytworzyć podkładkę do rozprowadzania o średnicy około jednego i 1/2 do dwóch centymetrów.

Optymalne obrazowanie żywych komórek ma kluczowe znaczenie dla kolejnych etapów przetwarzania danych. Upewnij się, że usunąłeś wszelkie bombki powietrzne ze stopionej agarozy i utwórz cienką podkładkę na okresy obrazowania dłuższe niż cztery godziny. Aby zbadać zdarzenia mitotyczne, hoduj komórki z kultur starterowych w płynnym EMM lub PMG plus suplementy przez noc.

Przenieś jeden mililitr kultury do kuwety i zmierz na spektrofotometrze na długości fali 595 nanometrów. Wzrost komórek jest uważany za fazę mid-log, gdy gęstość optyczna osiąga 0,4. Następnie odwirować jeden mililitr zawiesiny komórek w ilości 1,375 g przez jedną minutę.

Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w minimalnej pożywce plus suplementy do końcowej objętości 100 mikrolitrów. Aby zobrazować zdarzenia mejozyczne, hoduj komórki z kultur starterowych w minimalnej pożywce plus suplementy przez noc. Wzrost komórek jest uważany za późną fazę logarytmiczną, gdy gęstość optyczna przy 595 nanometrach wynosi od 0,7 do jednego.

Następnie, z kultur późnego logarytmu, uzyskaj 500 mikrolitrów każdego szczepu typu mate, H ujemnego i H dodatniego, i połącz w celu uzyskania jednomililitrowej zawiesiny komórek. Odwirować komórki z prędkością 1 375 razy g przez jedną minutę. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze płynnego ekstraktu maltozowego.

Powtórz płukanie ekstraktem z maltozy jeszcze trzy razy, aby zapewnić skuteczne usuwanie składników odżywczych. Po ostatnim przemyciu ekstraktem z maltozy ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze ekstraktu z maltozy i przenieść mieszaninę do 50-mililitrowej kolby zawierającej dziewięć mililitrów ekstraktu maltozowego. Inkubować przez 12 do 16 godzin w temperaturze od 22 do 25 stopni Celsjusza przy minimalnej prędkości obrotowej od 50 do 100 obr./min.

Pojawienie się wielu okrągłych kępek drożdży rozszczepialnych, powstałych w wyniku obfitej samoflokulacji, wskazuje na efektywne krycie. Następnie weź jednomililitrową próbkę z kultury kojarzenia i odwiruj przy 1,375 g przez jedną minutę. Usunąć 750 mikrolitrów supernatantu i ponownie zawiesić komórki w pozostałym supernatancie.

Wiruj energicznie przez pięć sekund, aby rozbić grudki. Dozuj 20 mikrolitrów mitotycznej lub mejotycznej zawiesiny komórek na 2% waciku agarozowym. Usuń nadmiar nośnika, odwracając szkiełko i kładąc je na wierzchu niestrzępiącego się ręcznika papierowego na dwie do trzech sekund.

Odwróć szkiełko i delikatnie umieść szklane szkiełko nakrywkowe na górze podkładki, uważając, aby nie wytwarzać pęcherzyków powietrza. Aby utworzyć monowarstwę komórkową, obróć szkiełko nakrywkowe palcem wskazującym zgodnie z ruchem wskazówek zegara przez jeden pełny obrót w przypadku komórek mitozy lub dwa pełne obroty w przypadku komórek mejozy. Upewnij się, że materia komórkowa rozprasza się w poduszce agarozowej, co pozwala na lepsze oddzielenie pojedynczych komórek lub worka.

Za pomocą małego drewnianego patyczka dozuj stopiony węglowodorowy uszczelniacz wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego, aby uszczelnić każdą podkładkę agarozową. Po uszczelnieniu podkładki agarozowej umieść ją na stoliku mikroskopu. Włącz komorę temperaturową i ustaw ją na żądaną temperaturę.

Umieść płytkę z mokrym ręcznikiem papierowym w komorze, aby kontrolować wilgotność systemu mikroskopowego. Pozwól mu zachować równowagę przez 10 do 15 minut w odpowiednich warunkach obrazowania. Pozwala to na rozproszenie pozostałych pęcherzyków powietrza i wystąpienie wszelkich przesunięć agarozy w ostatniej chwili.

Użyj obiektywu 40X, aby znaleźć odpowiednie pola widzenia do obrazu. Przełącz się na obiektyw 60X, aby rozpocząć gromadzenie danych. W oprogramowaniu sterującym funkcją mikroskopu wybierz zestawy filtrów mikroskopu, które najlepiej pasują do obserwowanych fluoroforów.

Dostosuj długości fal wzbudzenia, aby pasowały do zastosowanych fluoroforów, zastosuj najniższą moc wzbudzenia, która wytwarza spójny sygnał, i wykorzystaj czasy ekspozycji od czterech do ośmiu godzin, aby wygenerować akceptowalne, ale wymierne i odtwarzalne dane obrazowania. Zbierz co najmniej sześć punktów czasowych zdobywania co godzinę. W oprogramowaniu do zbierania obrazów wybierz co najmniej jeden kanał fluorescencyjny, z którego chcesz pozyskać dane i zastosuj materiał Z składający się z 13 sekcji w odstępach 0,5 mikrometra.

W oprogramowaniu Fiji prześlij zdekonwoluowany obraz, wybierając funkcję Importer formatów biologicznych w menu wtyczek. W wyskakującym oknie Opcje importu wybierz Hyperstack, Domyślny tryb kolorów, zaznacz opcję Automatyczne skalowanie i naciśnij przycisk OK. Upewnij się, że wyświetlane okno ma odpowiednią liczbę kanałów fluorescencyjnych i ram czasowych, przewijając w boki odpowiednie paski na dole.

Zapisz jako plik TIFF, który nie kompresuje danych. Następnie w menu Analizuj użyj opcji Ustaw pomiary, aby wybrać różne parametry. Na przykład: Obszar, Min. maksymalna wartość szarości, Zintegrowana gęstość, Średnia wartość szarości, Mediana, Pozycja stosu, Obwód i Etykieta wyświetlania.

Wybierz Kolor i kliknij narzędzie Kanały. W wyskakującym oknie Kanały zaznacz kanał koloru, dla którego będzie mierzona intensywność lub obszar. Wybierz Obraz, a następnie Typ i kliknij 32-bitowy.

Wybierz funkcje Dostosuj i Próg w menu Obraz. Zaznacz pole Ciemne tło, wybierz metodę domyślną i wybierz czerwony, aby nałożyć interesujące sygnały. Użyj narzędzia różdżki, aby podświetlić każdą interesującą Cię strukturę i naciśnij literę T na klawiaturze, aby dodać wybrany ROI do wyskakującego okna menedżera ROI.

Następnie otwórz spakowany folder ROI, aby załadować menedżera ROI i kliknij każdy identyfikator ROI w lewym panelu bocznym. Wybierz opcję Zmierz z menu Analizuj i powtórz to polecenie dla każdego identyfikatora ROI, aby określić ilościowo interesujące obiekty we wszystkich wycinkach stosu obrazów. Zapisz wyniki jako plik CSV do analizy statystycznej.

W tym badaniu, jeśli komórki głodują z powodu ograniczenia składników odżywczych lub przerostu, wykażą nadmiar wakuoli i zmniejszony rozmiar komórek. Komórki logarytmiczne wykazują aktywną replikację DNA i podział komórki, a także panjądrową ekspresję Tos4-GFP i separację ognisk Sad1-DsRed. Brak krycia, jak to ma miejsce, gdy komórki nie są wystarczająco pozbawione azotu, uniemożliwi im wejście w mejozę.

Pokazano parę komórek rozszczepialnych ulegających kariogamii. Solidna flokulacja zawiesiny komórek współpracujących zwiększa interakcję między komórkami, a tym samym wskazuje na udane kojarzenie i wydajną indukcję mejotyczną. Pęcherzykowe worki mogą przybierać różne formy, w tym kształty komórek zygzakowatych i bananowych.

W mitozie, gdy komórki przechodzą z metafazy do telofazy, pierwsza zmiana polega na skurczeniu się wielkości jądra w metafazie, podczas gdy druga pokazuje pękanie jądra podczas anafazy. Oprócz tego, że dzielą pewną dynamikę segregacji z komórkami mitotycznymi, komórki mejotyczne wykazują oscylacje jądrowe podczas rekombinacji homologicznej i dalszej redukcji nukleozydów pod koniec anafazy, II.It jest obowiązkiem naukowców za zapewnienie, że parametry eksperymentu mogą być odtwarzane w różnych eksperymentach i że zebrane dane nadają się do dalszej analizy. Obrazowanie żywych komórek pozwoliło badaczom na dokładne zbadanie mechaniki podziału jądra w mitozie i mejjozie.

Wraz z poprawą właściwości znaczników fluorescencyjnych i możliwości mikroskopu, liczba i rodzaj procesów, które możemy zaobserwować, będzie się zwiększać.