Name: Różnicowanie śródbłonka hemogennego od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w zdefiniowanym stanie wolnym od karmnika i ksenotypu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Poznaj metodę różnicowania śródbłonka hemogennego z ludzkich komórek macierzystych w warunkach wolnych od karmnika. Technika zapewnia powtarzalne wyniki i ma zastosowanie w modelowaniu chorób oraz badaniach hematologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Alinie Li i Seiko Benno za ich pomoc techniczną. Chcielibyśmy również podziękować Pani Harumi Watanabe za pomoc administracyjną oraz dr Peterowi Karagiannisowi za redakcję artykułu. Praca ta była wspierana przez Core Center for iPS Cell Research of Research Center Network for Realization of Regenerative Medicine z Japońskiej Agencji Badań i Rozwoju Medycznego (AMED) [M.K.S.], Program Badań nad Chorobami Nieuleczalnymi. Specyficzne dla choroby komórki iPS AMED (17935423) [M.K.S.] i programu Center for Innovation Japońskiej Agencji Nauki i Technologii (JST) [R.O. i M.K.S.].

1. Odczynniki
<ol>
	<li>Linie komórkowe (ludzkie PSC): uzyskuje się embrionalne komórki macierzyste (ESC) lub linie iPSC 409B2 i 201B7(317-9)) oraz CBA11.</li>
	<li>Przygotowanie odczynnika
	<ol>
		<li>Pożywka galwaniczna PSC: zmieszać pożywkę konserwacyjną PSC z 10 μM Y-27632 i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Pożywka sferoidalna PSC: tuż przed użyciem zmieszać pożywkę konserwacyjną PSC z 625–1 250 ng/ml ludzkiego rekombinowanego fragmentu Lamininy-511 E8 (LM511-E8) (w zależności od linii komórkowej). 
		nuta: LM511-E8 można mieszać w media15. Inne matryce, takie jak laminina o pełnej długości, muszą być wstępnie powlekane, a nawet jeśli to zrobią, nie utrzymują mezodermalnych organoidów przylegających podczas procesu różnicowania.</li>
		<li>Pożywka różnicująca dnia 0: zmieszać mezodermalną pożywkę podstawową z 2 μM CHIR99021, 80 ng/ml białka morfogenetycznego kości 4 (BMP4) i 80 ng/ml czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF).</li>
		<li>Pożywka różnicująca dnia 2: zmieszać hemogeniczne podłoże podstawowe z 1 μM SB431542, 80 ng/ml VEGF i 100 ng/ml czynnika komórek macierzystych (SCF).</li>
		<li>Przygotować bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS) bez wapnia i magnezu (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>1 mM bufor kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA): dodać 1 ml 0,5 M EDTA do 500 ml PBS.</li>
		<li>Pożywka EHT: zmieszać podstawowe podłoże hematopoetyczne z 50 ng / ml SCF, 20 ng / ml trombopoetyny (TPO), 50 ng / ml liganda kinazy tyrozynowej 3 związanej z FMS (Flt-3L), 20 ng / ml receptora alfa interleukiny-6 / interleukiny-6 (IL-6 / IL-6Rα), insuliny-transferyny-selenu-etanoloaminy, L-glutaminy i penicyliny/streptomycyny/amfoterycyny B.</li>
		<li>Bufor FACS: zmieszać PBS z 2% płodową surowicą cielęcą i 1 mM EDTA.</li>
		<li>Przygotować bufor do separacji magnetycznej (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Przygotować podłoża na bazie metylocelulozy (patrz tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Formacja kolonii PSC
<ol>
	<li>Hoduj hPSC do 70 – 80% konfluencji na 6-dołkowej płytce pokrytej 0,5 μg cm-2 LM511-E8 w mTeSR1 w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Dysocjacja PSC (dzień -4)
	<ol>
		<li>Odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki PBS. Przepłucz komórki roztworem dysocjacyjnym. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut (w tym czasie komórki nie wysychają).</li>
		<li>Zawiesić komórki w pożywce konserwacyjnej PSC, przenieść zawiesinę do probówki o odpowiedniej wielkości i odwirować komórki przy 200 x g przez 3 minuty. Odessać supernatant i zawiesić komórki w pożywce do powlekania PSC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zawiesinę PSC o gęstości 48 000 – 70 000 komórek cm-2 (w zależności od linii komórkowej) umieścić w mikroprefabrykowanym naczyniu z tworzywa sztucznego i inkubować przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
	nuta: Zalecamy 100 μl zawiesiny komórkowej w 96-dołkowym mikroprefabrykowanym naczyniu z tworzywa sztucznego. Zazwyczaj wysiewa się 20 000 komórek studzienki 1 w 96-dołkowej płytce, aby uzyskać około 100 sferoid.</li>
	<li>Kafelkowanie sferoid PSC na LM511-E8 (dzień -3)
	<ol>
		<li>Zbierz sferoidy PSC do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, delikatnie pipetując za pomocą mikropipetera P1000 i pozostaw sferoidy w temperaturze pokojowej na 2 minuty, aby wytrąciły się grawitacyjnie. Odessać supernatant.</li>
		<li>Zawiesić w pożywce sferoidalnej, dozować zawiesinę do niepowlekanej 6-dołkowej płytki hodowlanej o gęstości 4-sferoid cm-2 i hodować w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez trzy dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Indukcja hemogenna (Dzień 0)
<ol>
	<li>Odessać pożywkę, dodać pożywkę różnicującą Day0 i posiew w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5%O2 i 5% CO2 (inkubator hipoksyjny).</li>
	<li>Po dwóch dniach hodowli w pożywce różnicującej Dzień 0 należy odessać pożywkę, a następnie dodać pożywkę różnicującą Dzień 2 i posiew w inkubatorze do niedotlenienia.</li>
</ol>
4. Izolacja śródbłonka hemogennego (Dzień 4)
<ol>
	<li>Dwa dni później odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki PBS. Przepłucz komórki roztworem dysocjacyjnym. Inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 30 minut.</li>
	<li>Delikatnie zawiesić komórki w 1 mM EDTA, aby dysocjować do poziomu pojedynczej komórki, przenieść zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować komórki przy 200 x g przez 3 minuty. Odessać supernatant i zawiesić osad komórkowy za pomocą 300 μl buforu do separacji magnetycznej.</li>
	<li>Dodaj 100 μl mikrogranulek CD34+ i delikatnie pipetuj. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Można użyć do 20 milionów komórek na 100 μl kulek CD34+.</li>
	<li>Przefiltrować zawiesinę przez sitko o wielkości 40 μm.</li>
	<li>Oddziel ogniwa CD34+ za pomocą separatora magnetycznego.</li>
</ol>
5. Indukcja przejścia śródbłonka do układu krwiotwórczego (EHT)
<ol>
	<li>Powłoka fibronektyny
	<ol>
		<li>Przygotować wymaganą objętość 5 μg/ml roztworu powlekającego fibronektynę, rozcieńczając 1 mg/ml fibronektyny w PBS.</li>
		<li>Dozować 0,5 ml roztworu powlekającego do każdego dołka 24-dołkowej płytki hodowlanej. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować posortowane komórki CD34+ przy 200 x g przez 3 minuty. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki EHT.</li>
	<li>Określ gęstość żywotnych komórek za pomocą licznika komórek. Dostosuj gęstość komórek do 200 000 komórek mL-1, dodając pożywkę EHT.</li>
	<li>Odessać i wyrzucić roztwór powlekający ze studzienki pokrytej fibronektyną. Dozuj 0,5 ml zawiesiny komórek CD34+ do każdej studzienki pokrytej fibronektyną.</li>
	<li>Inkubować w inkubatorze hipoksyjnym przez tydzień.</li>
</ol>
6. Analiza komórek krwiotwórczych metodą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Pływające zbieranie komórek: Przenieść pożywkę hodowlaną do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować pożywkę o sile 200 x g przez 3 min. Odessać supernatant.</li>
	<li>Kolekcja komórek adherentnych
	<ol>
		<li>Umyj komórki dwukrotnie 0,5 ml PBS.</li>
		<li>Przepłukać komórki roztworem dysocjacyjnym i odessać nadmiar płynu.</li>
		<li>Inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu FACS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wymieszaj komórki pływające i komórki przylegające.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 200 x g przez 3 minuty. Odessać supernatant. Zawiesić w 50 μl buforu FACS. Inkubować komórki z przeciwciałami anty-CD34 i anty-CD45 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie PBS i odwirować przy 200 x g przez 3 minuty. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 0,5 ml buforu FACS z 0,5 μg/ml 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu.</li>
	<li>Zmierz ekspresję CD34 i CD45 za pomocą cytometru przepływowego.</li>
</ol>
7. Test komórek krwiotwórczych (CFU)
<ol>
	<li>Pobieranie komórek krwiotwórczych: Przenieść pożywkę z hodowli do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Delikatnie spłucz studzienkę dwukrotnie PBS.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 200 x g przez 3 minuty. Odessać supernatant. Zawiesić w 1 ml pożywki EHT. Określ numer komórki za pomocą licznika komórek.</li>
	<li>Dodać objętość zawiesiny odpowiadającą 10 000 komórek do 3 ml pożywki na bazie metylocelulozy uzupełnionej antybiotykami i dobrze wymieszać 5 razy za pomocą strzykawki 16 G lub 18 G.</li>
	<li>Dozować całą zawiesinę pożywki na bazie metylocelulozy do każdego dołka płytki 6-dołkowej.</li>
	<li>Inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez dwa tygodnie, utrzymując wilgotność. Nie przeszkadzaj w zmywaniu naczynia. Kolonie są wrażliwe na ruch.</li>
	<li>Po dwóch tygodniach policz kolonie pod mikroskopem.</li>
</ol>

<ol><li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).</li>
<li>Lancrin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+haemangioblast+generates+haematopoietic+cells+through+a+haemogenic+endothelium+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The haemangioblast generates haematopoietic cells through a haemogenic endothelium stage.</a> Nature. 457, 892-895 (2009).</li>
<li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Pairwise+Choices+Leading+from+Pluripotency+to+Human+Bone%2C+Heart%2C+and+Other+Mesoderm+Cell+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types.</a> Cell. , 451-467 (2016).</li>
<li>Ng, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+HOXA%2B+hemogenic+vasculature+that+resembles+the+aorta-gonad-mesonephros%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells to HOXA+ hemogenic vasculature that resembles the aorta-gonad-mesonephros.</a> Nature Biotechnology. 34, 1168-1179 (2016).</li>
<li>Batta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Reports. 9, 1871-1884 (2014).</li>
<li>Sturgeon, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+path+to+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Defining the path to hematopoietic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 31, 416-418 (2013).</li>
<li>Ivanovs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+haematopoietic+stem+cell+development%3A+from+the+embryo+to+the+dish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish.</a> Development. 144, 2323-2337 (2017).</li>
<li>Blaser, B. W., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+HSCs+in+vitro%3A+don%27t+forget+the+hemogenic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Making HSCs in vitro: don't forget the hemogenic endothelium.</a> Blood. , (2018).</li>
<li>Speck, N., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+lineage+and+legacy%3A+the+development+of+mammalian+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+imunology%22%5BJournal%5D)">Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells.</a> Nature imunology. , (2008).</li>
<li>Niwa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+serum-free+monolayer+culture+for+orderly+hematopoietic+differentiation+of+human+pluripotent+cells+via+mesodermal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel serum-free monolayer culture for orderly hematopoietic differentiation of human pluripotent cells via mesodermal progenitors.</a> PLoS One. 6, e22261(2011).</li>
<li>Sturgeon, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+controls+the+specification+of+definitive+and+primitive+hematopoiesis+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling controls the specification of definitive and primitive hematopoiesis from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32, 554-561 (2014).</li>
<li>Ditadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+definitive+haemogenic+endothelium+and+arterial+vascular+endothelium+represent+distinct+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human definitive haemogenic endothelium and arterial vascular endothelium represent distinct lineages.</a> Nature Cell Biology. 17, 580-591 (2015).</li>
<li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocyte+potential+marks+the+emergence+of+definitive+hematopoietic+progenitors+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Reports. 2, 1722-1735 (2012).</li>
<li>Sugimura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+and+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 545, 432-438 (2017).</li>
<li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Adhesion+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Laminin+Fragments+in+an+Uncoated+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner.</a> Scientific Reports. 7, 41165(2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Nasza metoda indukcji zdefiniowanej bez zasilaczy i ksenotypów oferuje precyzyjną i ekonomiczną platformę do indukcji komórek HE w skalowalny sposób. Wierne tworzenie śródbłonka hemogennego w konwencjonalnych protokołach 10,11,12,13,14 było utrudnione przez brak precyzyjnej kontroli gęstości i wielkości kolonii PSC, co wpływa na efektywność ukierunkowanego różnicowania opartego na morfogenie/cytokinie. Doświadczyliśmy niespójności indukcji śródbłonka hemogennego w każdej niezależnej partii z konwencjonalnych protokołów. Nowy protokół umożliwia ścisłą regulację gęstości i wielkości kolonii PSC, przezwyciężając w ten sposób niespójność indukcji śródbłonka hemogennego.
Wykorzystali umundurowane formowanie sferoid, a następnie przenieśliśmy zdefiniowany stan wolny od feederu i ksenozy, aby uformować HE w sumie w ciągu 4 dni. Potwierdziliśmy za pomocą trzech niezależnych linii komórkowych, że tworzenie sferoidów zapewnia spójne tworzenie komórek HE. W reprezentatywnym wyniku linie komórkowe 409B2 dały 12,7%-23,6% wydajności komórek CD34 + w oparciu o trzy niezależne eksperymenty. Krytycznym czynnikiem dla sferoid PSC jest LM511-E8. Z naszych doświadczeń wynika, że nie zalecamy zastępowania tego innym matrixem, takim jak Matrigel lub pełnowymiarowe produkty z lamininą. Doświadczyliśmy, że organoidy mezodermalne łatwo odłączały się od Matrigelu i traciły podczas procesu różnicowania. I ani Matrigel, ani pełnowymiarowa laminina nie zakotwiczają komórek bez wstępnego powlekania.
Potencjalnym ograniczeniem tego protokołu jest to, że jesteśmy zależni od pożywki konserwacyjnej PSC w celu utrzymania PSC. Przetestowaliśmy inne media, takie jak StemFit, ale ograniczyliśmy indukcję hemogenną. Przypuszczalnie komórki były odporne na wyjście ze stanu pluripotencjalnego w naszym krótkim czasie (4 dni) protokole indukcji. Jeśli utrzymuje się PSC w innych pożywkach, zalecamy adaptację komórek w pożywce podtrzymującej PSC i przeprowadzenie kilku pasaży przed różnicowaniem. Platforma ta pozwoli na systematyczną manipulację i analizę komórek, a także na produkcję i indukcję komórek krwiotwórczych na dużą skalę do potencjalnego zastosowania klinicznego. Długoterminowym celem tego systemu jest modelowanie chorób niedoboru odporności w humanizowanych modelach mysich w celu zbadania odpowiedzialnych mechanizmów komórkowych i molekularnych oraz przeprowadzenia badań przesiewowych leków.

Rozwój nowych metod leczenia zaburzeń hematologicznych i immunologicznych został utrudniony przez brak solidnych platform do modelowania chorób i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków z autologicznymi hematopoetycznymi komórkami macierzystymi (HSC) pochodzącymi z pacjentów z pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC). Przełom w technologii indukowanych (i)PSC daje nadzieję na modelowanie chorób na podstawie komórek pacjenta, ale ustanowienie funkcjonalnych HSC z iPSC pacjentów było nieuchwytne. Aby uzyskać HSC od ludzkich PSC, kluczowa jest prawidłowa indukcja embrionalnych wzorców i programów transkrypcyjnych1,2,3,4,5,6,7,8. Niedawny postęp w rozwoju układu krwiotwórczego wykazał rolę śródbłonka hemogennego (HE) w rozwoju HSC9. HE może być indukowany z PSC i jest podatny na dalsze interwencje, takie jak transfer genów10,11,12,13. Wykorzystując HE jako platformę, połączenie 5 czynników transkrypcyjnych (ERG, HOXA5, HOXA9, LCOR, RUNX1) z powodzeniem indukowało funkcjonalne HSC, które wszczepiają się długoterminowo i różnicują w wiele linii14. Jednak zmienne i nieefektywne wytwarzanie HE z PSC utrudnia systematyczną manipulację i analizę komórek, a także produkcję z półki i indukcję na dużą skalę komórek krwiotwórczych do użytku klinicznego.
Tutaj opisujemy opłacalną i precyzyjną metodę wyprowadzania HE w ciągu 4 dni ze zdefiniowanym warunkiem wolnym od feedera i kseno. W tej metodzie tworzenie sferoid i spontaniczne ponowne spłaszczanie na iMarix-511 zapewnia stałą gęstość kolonii PSC, co ma kluczowe znaczenie dla efektywnej indukcji komórek HE.

<table><tbody><tr><td>0,5 m EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575</td><td>0,5 m EDTA</td></tr><tr><td>40 &mu; m sitko komórkowe</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>40&mu; Sitko do komórek M</td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Corning</td><td>353046</td><td>6-dołkowa płytka</td></tr><tr><td>antybiotykowo-przeciwgrzybicza</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240-112</td><td>Penicylina/Streptomycyna/Amfoterycyna B</td></tr> przeciwciało <tr><td>anty-CD34</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07776</td> przeciwciało <td>anty-CD34</td></tr> przeciwciało <tr><td>anty-CD45</td><td>Biolegend</td><td>304012</td><td>przeciwciało anty-CD45</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP-010</td><td>BMP4</td></tr><tr><td>CD34 mikrogranulki</td><td>Miltenyi</td><td>130-046-703</td><td>Mikrokulki CD34</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Wako</td><td>038-23101</td><td>CHIR99021</td></tr><tr><td>Essential 6</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A15165-01</td><td>Hemogeniczne podłoże podstawowe</td></tr><tr><td>Essential 8</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A15169-01</td><td>Mezodermalne podłoże</td></tr><tr><td>podstawowe Ezsphere SP Microplate 96well</td><td>AGC</td><td>4860-900SP</td><td>mikro-prefabrykowane naczynie z tworzywa sztucznego&nbsp;</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biosera</td><td>FB-1365/500</td><td>FCS</td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>Milipora</td><td>FC010-100MG</td><td>Fibronektyna</td></tr><tr><td>Flt-3L</td><td>R& D Systems</td><td>308-FK-005</td><td>FLT-3L</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td>L-Glutamina</td></tr><tr><td>IL-6/IL-6R&alfa;</td><td>R& D Systems</td><td>8954-SR</td><td>IL-6/IL-6R&alpha;</td></tr><tr><td>iMatrix-511</td><td>Matrixome</td><td>892 001</td><td>LM511-E8</td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51500-056</td><td>Bufor MACS insuliny-transferyny-selenu-etanoloaminy</td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td><td>bufor separacji magnetycznej</td></tr><tr><td>Methocult 4435MethoCult&trade; H4435 Wzbogacone</td><td>TECHNOLOGIE STEMCELL</td><td>04435</td><td>Pożywki na bazie metylocelulozy</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>85850</td><td>Pożywka konserwacyjna PSC</td></tr><tr><td>PBS</td><td>nacalai tesque</td><td>14249-24</td><td>PBS</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Wako</td><td>031-24291</td><td>SB431542</td></tr><tr><td>SCF</td><td>R& D Systems</td><td>255-SC-010</td><td>SCF</td></tr><tr><td>Stemline II Pożywka do ekspansji hematopoetycznych komórek macierzystych</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0192-500ML</td><td>Hematopoetyczne podłoże</td></tr><tr><td>podstawowe TPO</td><td>R& D Systems</td><td>288-TPN</td><td>TPO</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604-021</td><td>roztwór dysocjacyjny</td></tr><tr><td>VEGF</td><td>R& D Systems</td><td>293-VE-010</td><td>VEGF</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Wako</td><td>253-00513</td><td>Y-27632</td></tr></tbody></table>

różnicowanie śródbłonka hemogennego od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w zdefiniowanym stanie wolnym od karmnika i ksenotypu

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Pozyskiwanie funkcjonalnych hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) było nieuchwytnym celem dla autologicznych przeszczepów w leczeniu chorób hematologicznych i złośliwych. Śródbłonek hemogenny (HE) jest podatną platformą do wytwarzania funkcjonalnych HSPC przez czynniki transkrypcyjne lub do indukowania limfocytów w solidny sposób. Jednak obecne metody oznaczania HE są albo kosztowne, albo mają zmienną wydajność. W tym protokole ustaliliśmy opłacalną i precyzyjną metodę oznaczania HE w ciągu 4 dni w zdefiniowanych warunkach wolnych od feederu i kseno. Powstały w ten sposób HE przeszedł przemianę śródbłonkową do krwiotwórczej i wytworzył klonogenne komórki progenitorowe hematopoetyczne CD34 + CD45 +. Potencjalna zdolność naszej platformy do generowania funkcjonalnych HSPC będzie miała szerokie zastosowanie w modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych pod kątem związków terapeutycznych.

Schemat tworzenia kolonii PSC przedstawiono na Ryc. 1A. Sferoidy PSC są formowane w mikrofabrykowanym naczyniu plastikowym przez jeden dzień. Jako reprezentacyjny wynik, w każdym dołku 96-dołkowego mikrofabrykowanego naczynia plastikowego można było obsłużyć 20 000 komórek 409B2, choć inne linie komórkowe mogą wymagać wyższej gęstości (30 000-40 000 komórek na dołek 96-dołkowego mikrofabrykowanego naczynia plastikowego). Sfery te spontanicznie spłaszczają się do kultury niemal dwuwymiarowej po wysianiu na szalkę hodowlaną w obecności LM511-E8.
Schemat indukcji hemogennej przedstawiono na Rysunku 1B. Gdy kolonie PSC osiągną średnicę 750 µm, pożywkę wymienia się sekwencyjnie, aby zindukować organoidy mezodermalne. W trakcie różnicowania w organoidy mezodermalne poprzez sekwencyjną zmianę pożywki do 4. dnia, kolonie PSC stopniowo przybierają strukturę typu „sunny side up”. W 4. dniu endotelium hemogenne jest wydzielane z organoidów mezodermalnych za pomocą sortowania magnetycznego, a następnie wysiewane na fibronektynę w pożywce EHT. Z sferoidów zawierających 1 milion PSC oczekuje się uzyskania 5-10 milionów komórek CD34+CD45- (Rysunek 1C).
Zaobserwowano, że komórki zmieniają swoją morfologię z komórek śródbłonkowych na komórki krwiotwórcze (Supplementary Video 1). Reprezentatywny obraz w kontraście fazowym progenitorów krwiotwórczych po stymulacji koktajlem krwiotwórczym w 7. dniu przedstawiono na Rysunku 2A. W hodowli pojawiły się kolonie komórek krwiotwórczych.
Reprezentatywny wykres z cytometrii przepływowej przedstawiono na Rysunku 2B. Całą hodowlę stymuluje się koktajlem hematopoetycznym, a w 7. dniu analizuje się ekspresję CD34 i CD45 za pomocą cytometrii przepływowej. Hematopoetyczne komórki progenitorowe wykazują ekspresję CD34 i CD45.
Analiza CFU wykazała powstawanie kolonii granulocytów/makrofagów z hematopoetycznych komórek progenitorowych CD34+ CD45+ (Rysunek 2C). Szacowana liczba kolonii wynosi 38 CFU-G/M na 10 000 komórek (Rysunek 2D)
<img alt="Schemat różnicowania komórek macierzystych z wynikami cytometrii przepływowej i procesu indukcji chemicznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59823/59823fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat układania kolonii PSC oraz następującego po nim różnicowania krwiotwórczego poprzez endotelium hemogenne. (A) Schemat procesu tworzenia kolonii PSC. PSC są utrzymywane na płytce 6-dołkowej powlekanej LM511-E8 w medium do utrzymania PSC. W dniu -4 komórki są odrywane i dysocjowane do poziomu pojedynczych komórek przy użyciu roztworu dysocjującego, a następnie wysiewane do mikrofabrykowanego naczynia plastikowego w medium do utrzymania PSC z dodatkiem Y-27632 i hodowane przez noc w celu utworzenia sferoidów. W dniu -3 sferoidy są wysiewane w medium do utrzymania PSC z LM511-E8 i hodowane przez trzy dni. Do dnia 0 sferoidy spontanicznie spłaszczają się do niemal dwuwymiarowej hodowli. Paski skali = 200 µm. (B) W dniu 0 medium zostaje zastąpione medium do różnicowania Day0 i hodowane w inkubatorze hipoksyjnym. W 2. dniu różnicowania medium zostaje zastąpione medium do różnicowania Day2. W 4. dniu wzbogacania endotelium hemogennego komórki CD34+ są sortowane magnetycznie i hodowane na płytce 12-dołkowej powlekanej fibronektyną w medium EHT przez 6 dni. (C) Reprezentatywny wykres cytometrii przepływowej ekspresji CD45 i CD34 dla komórek z 4. dnia sortowanych według CD34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/59823fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy hodowli komórkowej, wykres cytometrii przepływowej, eksperyment z koloniami komórkowymi, wyniki na wykresie słupkowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59823/59823fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Analiza właściwości krwiotwórczych. (A) Reprezentatywny obraz w kontraście fazowym komórek progenitorowych krwiotwórczych po stymulacji koktajlem krwiotwórczym w dniu 7. Pasek skali = 200 µm. (B) Reprezentatywny wykres cytometrii przepływowej ekspresji CD45 i CD34 w całej hodowli po stymulacji koktajlem krwiotwórczym w dniu 7. (C) Reprezentatywny obraz w kontraście fazowym kolonii granulocytów/makrofagów wygenerowanej z komórek progenitorowych krwiotwórczych z dnia 11. Pasek skali = 500 µm. (D) Liczba CFU na 10 000 komórek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/59823fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopowy obraz hodowli komórkowej; wizualizacja struktur komórkowych do badań biologicznych." src="/files/ftp_upload/59823/59823vid1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Wideo"> 
Wideo uzupełniające 1: Wideo EHT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/EHT_video.avi">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Tutaj prezentujemy protokół precyzyjnego tworzenia hemogennego śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w stanie wolnym od karmów i kseno. Metoda ta będzie miała szerokie zastosowanie w modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych pod kątem związków terapeutycznych.

Różnicowanie śródbłonka hemogennego od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w zdefiniowanym stanie wolnym od karmnika i ksenotypu

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Oferujemy produkcję komórek krwi z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Główną zaletą tej techniki jest to, że uzyskujemy stałą i precyzyjną wydajność hemogennych komórek śródbłonka. Oczekujemy, że nasza platforma umożliwi szerokie zastosowania w monitorowaniu chorób i badaniach przesiewowych pod kątem związków leczniczych.Technika ta jest szczególnie korzystna dla badań hematologicznych i immunologicznych. Metoda może być stosowana do interwencji genetycznej lub edycji genów ludzkich komórek krwi. Pozwala to na łatwą indukcję wektorów w hemogennych komórkach śródbłonka.Najważniejszym punktem jest powłoka LM511-E8 do typowania kolonii PSC. Nie zalecamy pomijania powłoki ani zastępowania jej inną matrycą. Demonstracje wizualne są ważne, ponieważ chcemy pokazać, jak przepłukać ogniwa buforem dysocjacyjnym i jak pokryć płytki LM511-E8.Hoduj ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste lub hPSC do konfluencji od 70 do 80% na sześciodołkowej płytce pokrytej LM511-E8 w pożywce mTeSR1. Cztery dni przed indukcją hemogenną odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć PBS. Opłucz komórki roztworem dysocjacyjnym i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.Ponownie zawiesić komórki w pożywce konserwacyjnej PSC i przenieść zawiesinę do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Odwirować komórki w temperaturze 200 razy G przez trzy minuty. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce galwacyjnej PSC.Zawiesinę PSC należy umieścić zgodnie ze wskazówkami manuskryptu na mikroprefabrykowanym plastikowym naczyniu i inkubować przez noc. Trzy dni przed indukcją hemogeniczną delikatnie odpipetuj sferoidy PSC do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i pozostaw je na dwie minuty w temperaturze pokojowej, aby wytrąciły się grawitacyjnie. Odessać supernatant i ponownie zawiesić sferoidy w pożywce sferoidalnej.Rozprowadzić zawiesinę w pokrytym LM511-E8 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym o gęstości czterech sferoid na centymetr kwadratowy i inkubować przez trzy dni. Po trzech dniach odessać pożywkę, dodać pożywkę różnicującą dzień zero i hodować komórki przez dwa dni w inkubatorze do hipoksyi. Następnie odessać pożywkę dnia zero, dodać pożywkę różnicującą dnia drugiego i hodować przez kolejne dwa dni.Dwa dni później odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki PBS. Opłucz komórki roztworem dysocjacyjnym i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Po inkubacji rozdziel komórki, delikatnie zawieszając je w jednym milimolowym EDTA.Przenieś zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i odwiruj komórki w temperaturze 200 razy G przez trzy minuty. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 300 mikrolitrów buforu do separacji magnetycznej. Dodaj 100 mikrolitrów mikrogranulek CD34-dodatnich do komórek i delikatnie wymieszaj pipetując.Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie użyć sitka do komórek o wielkości 40 mikrometrów, aby odcedzić zawiesinę i oddzielić komórki CD34-dodatnie za pomocą separatora magnetycznego. Dozować 0,5 mililitra 5 mikrogramów na mililitr roztworu powlekającego fibronektynę do każdej studzienki 24-dołkowej płytki hodowlanej i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. W międzyczasie odwiruj posortowane komórki CD34-dodatnie przy 200 razy G przez trzy minuty i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze pożywki EHT.Określ żywotną gęstość komórek za pomocą licznika komórek i dostosuj gęstość komórek do 200 000 komórek na mililitr, dodając pożywkę EHT. Odessać i wyrzucić roztwór powlekający z dołków pokrytych fibronektyną i dozować 0,5 mililitra zawiesiny komórek CD34-dodatnich do każdej studzienki. Inkubować komórki w inkubatorze do hipoksyi przez tydzień.Aby zebrać pływające komórki, przenieś pożywkę hodowlaną do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i odwiruj przy 200 razy G przez trzy minuty. Następnie odessać supernatant. Aby zebrać przylegające komórki, przemyj je dwukrotnie 0,5 mililitra PBS i przepłucz buforem dysocjacyjnym.Odessać nadmiar płynu i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze buforu Facs i wymieszaj komórki pływające i przylegające. Odwirować zmieszane komórki w temperaturze 200 razy G przez trzy minuty, następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 50 mikrolitrach buforu Facs.Rozcieńczyć przeciwciała anty-CD34 i anty-CD45 w 50 mikrolitrach buforu Facs; Dodaj je do komórek i inkubuj komórki przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie przemyj komórki dwukrotnie PBS, odwirowując przy 200 razy G przez trzy minuty po każdym myciu. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 0,5 mililitra buforu Facs z 0,5 mikrograma na mililitr dappy.Zmierzyć ekspresję CD34 i CD45 za pomocą cytometrii przepływowej. Aby zebrać komórki krwiotwórcze, przenieś pożywkę hodowlaną do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Zbierz pozostałe komórki, delikatnie spłukując studzienkę dwukrotnie PBS.Odwirować komórki w temperaturze 200 razy G przez trzy minuty, a następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić w jednym mililitrze pożywki EHT. Po policzeniu komórek dodaj 10 000 komórek do trzech mililitrów pożywki z metylocelulozą, uzupełnionej antybiotykami, i użyj strzykawki o rozmiarze 16, aby wymieszać pięć razy. Dozować całą zawiesinę pożywki do każdego dołka na płytce sześciodołkowej.Aby komórki były wilgotne, dodaj wodę lub PBS do pustych studzienek na płytce. Inkubuj komórki przez dwa tygodnie, uważając, aby nie naruszyć naczynia, ponieważ kolonie są wrażliwe na ruch. Po dwóch tygodniach policz kolonie pod mikroskopem.Morfologicznie komórka zmienia się ze śródbłonka na komórki krwiotwórcze po stymulacji koktajlem krwiotwórczym. W hodowli pojawiają się kolonie komórek krwiotwórczych. Hematopoetyczne komórki progenitorowe wykazują ekspresję CD34 i CD45, dlatego cytometria przepływowa służy do potwierdzenia obecności kolonii komórek krwiotwórczych poprzez analizę ekspresji CD34 i CD45.Test jednostki tworzącej kolonię wykazał wytwarzanie granulocytów lub kolonii makrofagów z komórek progenitorowych hematopoetycznych CD34-dodatnich i CD45-dodatnich. Liczbę kolonii oszacowano na 38 jednostek tworzących kolonie na 10 000 komórek. Najważniejszym krokiem jest zliczenie sferoid PSC.Odkryliśmy, że metryka powierzchni jest najbardziej deterministycznym czynnikiem wpływającym na wydajność tego protokołu. Po tej procedurze można przeprowadzić gotową produkcję komórek inergicznych, takich jak naturalnie występujące komórki i makrofagi. Platforma ta umożliwia naukowcom badanie kluczowych czynników deterministycznych w rozwoju układu krwiotwórczego u człowieka.

hemogenic-endothelium-differentiation-from-human-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten film demonstruje wieloetapowy proces różnicowania ludzkich iPSC w mikronaczyniowe komórki śródbłonka mózgu. Powstałe w ten sposób zróżnicowane komórki ściśle naśladują komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, charakteryzujące się ścisłymi połączeniami, co czyni je idealnymi do badań nad chorobami mózgu.

Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu

Komórki grzebienia nerwowego (NC) pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) mają ogromny potencjał w modelowaniu rozwoju i chorób człowieka oraz w terapiach zastępczych komórek. W tym artykule przedstawiono bezżywieniową adaptację obecnie powszechnie stosowanego protokołu różnicowania in vitro do wyprowadzania komórek NC z hPSC.

Bezkarmowe wyprowadzanie komórek progenitorowych grzebienia nerwowego z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje efektywną indukcję hemogennego śródbłonka i wielopotencjalnych hematopoetycznych komórek progenitorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych.

Bezpośrednia indukcja hemogennego śródbłonka i krwi przez nadekspresję czynników transkrypcyjnych w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Ta praca opisuje protokół różnicowania in vitro do produkcji pigmentowanych, dojrzałych melanocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą grzebienia nerwowego i etapu pośredniego melanoblastu przy użyciu 25-dniowego protokołu bez karmienia.

Bezkarmowe pozyskiwanie melanocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) pochodzą z wyspecjalizowanych (hemogennych) komórek śródbłonka podczas rozwoju, jednak niewiele wiadomo o procesie, w którym niektóre komórki śródbłonka decydują się na ukrwienie. Przedstawiono metodę opartą na cytometrii przepływowej, pozwalającą na jednoczesną izolację hemogennych komórek śródbłonka i HSPC z mysich tkanek embrionalnych.

Izolacja mysich embrionalnych hemogennych komórek śródbłonka

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), używane do różnicowania hPSC na hematopoetyczne komórki progenitorowe CD34+. Metoda ta wykorzystuje specyficzną dla etapu manipulację kanoniczną sygnalizacją WNT w celu określenia komórek wyłącznie do ostatecznego lub pierwotnego programu krwiotwórczego.

Ukierunkowane różnicowanie pierwotnych i ostatecznych progenitorów hematopoetycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Produkcja wyspecjalizowanych komórek siatkówki z pluripotencjalnych komórek macierzystych jest punktem zwrotnym w rozwoju terapii chorób siatkówki opartej na komórkach macierzystych. W niniejszej pracy opisano prostą metodę wydajnego generowania organoidów siatkówki i nabłonka barwnikowego siatkówki do badań podstawowych, translacyjnych i klinicznych.

Zdefiniowano warunki hodowli wolnej od ksenotypów i karmówek w celu wytworzenia modeli ludzkich komórek siatkówki pochodzących z iPSC

Ten protokół demonstruje indukcję programu hemogennego w ludzkich fibroblastach skóry poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych GATA2, GFI1B i FOS w celu wytworzenia hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych.

Hemogenne przeprogramowanie ludzkich fibroblastów poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych

Prezentowany tutaj jest prosty protokół do bezpośredniego różnicowania hemogennych komórek śródbłonka od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w ciągu około 1 tygodnia.

Ukierunkowane różnicowanie hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy protokół, rozszerzoną metodę hodowli komórek śródbłonka (EECM), która umożliwia różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych do komórek podobnych do komórek mikronaczyniowych śródbłonka mózgu (BMEC). Komórki te wykazują ekspresję cząsteczki adhezyjnej komórek śródbłonka, a zatem są modelem bariery krew-mózg odpowiednim do badania interakcji komórek odpornościowych in vitro.

Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych do komórek podobnych do mikronaczyń śródbłonka mózgu o dojrzałym fenotypie immunologicznym

Poznaj metodę różnicowania śródbłonka hemogennego z ludzkich komórek macierzystych w warunkach wolnych od karmnika. Technika zapewnia powtarzalne wyniki i ma zastosowanie w modelowaniu chorób oraz badaniach hematologicznych.

Różnicowanie śródbłonka hemogennego od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w zdefiniowanym stanie wolnym od karmnika i ksenotypu (Wideo) | JoVE Journal

Różnicowanie śródbłonka hemogennego od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w zdefiniowanym stanie wolnym od karmnika i ksenotypu

Przeglądaj więcej filmów