Różnicowanie śródbłonka hemogennego od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w zdefiniowanym stanie wolnym od karmnika i ksenotypu

Oferujemy produkcję komórek krwi z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Główną zaletą tej techniki jest to, że uzyskujemy stałą i precyzyjną wydajność hemogennych komórek śródbłonka. Oczekujemy, że nasza platforma umożliwi szerokie zastosowania w monitorowaniu chorób i badaniach przesiewowych pod kątem związków leczniczych.

Technika ta jest szczególnie korzystna dla badań hematologicznych i immunologicznych. Metoda może być stosowana do interwencji genetycznej lub edycji genów ludzkich komórek krwi. Pozwala to na łatwą indukcję wektorów w hemogennych komórkach śródbłonka.

Najważniejszym punktem jest powłoka LM511-E8 do typowania kolonii PSC. Nie zalecamy pomijania powłoki ani zastępowania jej inną matrycą. Demonstracje wizualne są ważne, ponieważ chcemy pokazać, jak przepłukać ogniwa buforem dysocjacyjnym i jak pokryć płytki LM511-E8.

Hoduj ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste lub hPSC do konfluencji od 70 do 80% na sześciodołkowej płytce pokrytej LM511-E8 w pożywce mTeSR1. Cztery dni przed indukcją hemogenną odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć PBS. Opłucz komórki roztworem dysocjacyjnym i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Ponownie zawiesić komórki w pożywce konserwacyjnej PSC i przenieść zawiesinę do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Odwirować komórki w temperaturze 200 razy G przez trzy minuty. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce galwacyjnej PSC.

Zawiesinę PSC należy umieścić zgodnie ze wskazówkami manuskryptu na mikroprefabrykowanym plastikowym naczyniu i inkubować przez noc. Trzy dni przed indukcją hemogeniczną delikatnie odpipetuj sferoidy PSC do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i pozostaw je na dwie minuty w temperaturze pokojowej, aby wytrąciły się grawitacyjnie. Odessać supernatant i ponownie zawiesić sferoidy w pożywce sferoidalnej.

Rozprowadzić zawiesinę w pokrytym LM511-E8 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym o gęstości czterech sferoid na centymetr kwadratowy i inkubować przez trzy dni. Po trzech dniach odessać pożywkę, dodać pożywkę różnicującą dzień zero i hodować komórki przez dwa dni w inkubatorze do hipoksyi. Następnie odessać pożywkę dnia zero, dodać pożywkę różnicującą dnia drugiego i hodować przez kolejne dwa dni.

Dwa dni później odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki PBS. Opłucz komórki roztworem dysocjacyjnym i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Po inkubacji rozdziel komórki, delikatnie zawieszając je w jednym milimolowym EDTA.

Przenieś zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i odwiruj komórki w temperaturze 200 razy G przez trzy minuty. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 300 mikrolitrów buforu do separacji magnetycznej. Dodaj 100 mikrolitrów mikrogranulek CD34-dodatnich do komórek i delikatnie wymieszaj pipetując.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie użyć sitka do komórek o wielkości 40 mikrometrów, aby odcedzić zawiesinę i oddzielić komórki CD34-dodatnie za pomocą separatora magnetycznego. Dozować 0,5 mililitra 5 mikrogramów na mililitr roztworu powlekającego fibronektynę do każdej studzienki 24-dołkowej płytki hodowlanej i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. W międzyczasie odwiruj posortowane komórki CD34-dodatnie przy 200 razy G przez trzy minuty i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze pożywki EHT.

Określ żywotną gęstość komórek za pomocą licznika komórek i dostosuj gęstość komórek do 200 000 komórek na mililitr, dodając pożywkę EHT. Odessać i wyrzucić roztwór powlekający z dołków pokrytych fibronektyną i dozować 0,5 mililitra zawiesiny komórek CD34-dodatnich do każdej studzienki. Inkubować komórki w inkubatorze do hipoksyi przez tydzień.

Aby zebrać pływające komórki, przenieś pożywkę hodowlaną do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i odwiruj przy 200 razy G przez trzy minuty. Następnie odessać supernatant. Aby zebrać przylegające komórki, przemyj je dwukrotnie 0,5 mililitra PBS i przepłucz buforem dysocjacyjnym

Odessać nadmiar płynu i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze buforu Facs i wymieszaj komórki pływające i przylegające. Odwirować zmieszane komórki w temperaturze 200 razy G przez trzy minuty, następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 50 mikrolitrach buforu Facs.

Rozcieńczyć przeciwciała anty-CD34 i anty-CD45 w 50 mikrolitrach buforu Facs; Dodaj je do komórek i inkubuj komórki przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie przemyj komórki dwukrotnie PBS, odwirowując przy 200 razy G przez trzy minuty po każdym myciu. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 0,5 mililitra buforu Facs z 0,5 mikrograma na mililitr dappy.

Zmierzyć ekspresję CD34 i CD45 za pomocą cytometrii przepływowej. Aby zebrać komórki krwiotwórcze, przenieś pożywkę hodowlaną do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Zbierz pozostałe komórki, delikatnie spłukując studzienkę dwukrotnie PBS.

Odwirować komórki w temperaturze 200 razy G przez trzy minuty, a następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić w jednym mililitrze pożywki EHT. Po policzeniu komórek dodaj 10 000 komórek do trzech mililitrów pożywki z metylocelulozą, uzupełnionej antybiotykami, i użyj strzykawki o rozmiarze 16, aby wymieszać pięć razy. Dozować całą zawiesinę pożywki do każdego dołka na płytce sześciodołkowej.

Aby komórki były wilgotne, dodaj wodę lub PBS do pustych studzienek na płytce. Inkubuj komórki przez dwa tygodnie, uważając, aby nie naruszyć naczynia, ponieważ kolonie są wrażliwe na ruch. Po dwóch tygodniach policz kolonie pod mikroskopem.

Morfologicznie komórka zmienia się ze śródbłonka na komórki krwiotwórcze po stymulacji koktajlem krwiotwórczym. W hodowli pojawiają się kolonie komórek krwiotwórczych. Hematopoetyczne komórki progenitorowe wykazują ekspresję CD34 i CD45, dlatego cytometria przepływowa służy do potwierdzenia obecności kolonii komórek krwiotwórczych poprzez analizę ekspresji CD34 i CD45.

Test jednostki tworzącej kolonię wykazał wytwarzanie granulocytów lub kolonii makrofagów z komórek progenitorowych hematopoetycznych CD34-dodatnich i CD45-dodatnich. Liczbę kolonii oszacowano na 38 jednostek tworzących kolonie na 10 000 komórek. Najważniejszym krokiem jest zliczenie sferoid PSC.

Odkryliśmy, że metryka powierzchni jest najbardziej deterministycznym czynnikiem wpływającym na wydajność tego protokołu. Po tej procedurze można przeprowadzić gotową produkcję komórek inergicznych, takich jak naturalnie występujące komórki i makrofagi. Platforma ta umożliwia naukowcom badanie kluczowych czynników deterministycznych w rozwoju układu krwiotwórczego u człowieka.