Name: Manipulacja wzorami kolorystycznymi u skaczących pająków do wykorzystania w eksperymentach behawioralnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Poznaj metodę manipulacji wzorami kolorystycznymi u skaczących pająków przy użyciu farb emaliowych i makijażu. Technika ta umożliwia badania nad doborem płciowym i drapieżnictwem u małych stawonogów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez fundusze z National Science Foundation (IOS-1557867 do LAT), Muzeum Historii Naturalnej na Florydzie oraz Wydziału Entomologii i Nematologii Uniwersytetu Florydy. Opłata za publikację tego artykułu została częściowo sfinansowana przez University of Florida Open Access Publishing Fund.

1. Przygotowanie sprzętu
<ol>
	<li>Wybierz odpowiednie farby.
	<ol>
		<li>Aby aplikacja była udana, używaj farb, które są szybkoschnące i mają teksturę, którą można łatwo manipulować za pomocą rozcieńczalnika. Produkty, które są z powodzeniem stosowane, to niewodoodporne kredki do oczu, które można rozcieńczać wodą, oraz farby emaliowane, które można rozcieńczać rozcieńczalnikiem do emalii (tabela materiałów).</li>
		<li>Malując pająki, weź pod uwagę, że pancerz większości gatunków ma stwardniały egzoszkielet, podczas gdy miękki brzuch często rozciąga się i zwęża przy karmieniu40.
		<ol>
			<li>Farby emaliowane wytwarzają solidną, utwardzoną powłokę na malowanej powierzchni, dlatego należy je nakładać na twarde części naskórka (np. pancerz, nogi, pedipalps). Takie powłoki emaliowane są mniej skuteczne w przypadku odwłoka pająka, ponieważ odklejają się od pająka, gdy brzuch zmienia kształt podczas karmienia.</li>
			<li>W przeciwieństwie do tego, kredki do oczu nie wytwarzają utwardzonej powłoki, ale raczej przenikają do kolorowych łusek ciała; w związku z tym używaj ich zarówno na twardych, jak i miękkich częściach ciała (w tym na brzuchach pająków). 
			UWAGA: W kolejnych krokach przedstawiona zostanie najdelikatniejsza technika, która polega na malowaniu twarzy i pedipalpów pająków; Stosuje się farbę emaliowaną, która jest najbardziej uogólnioną metodą ze względu na różnorodność kolorów dostępnych farb emaliowanych.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przed testowaniem farb na żywych zwierzętach, jeśli to możliwe, najpierw zmierz właściwości spektralne farby (po prostu nałożonej na papier lub inną powierzchnię) za pomocą spektrofotometru odbicia UV-VIS, aby upewnić się, że w widmie nie ma żadnych niepożądanych pików UV, które byłyby niewidoczne dla ludzi, ale być może widoczne dla badanych gatunków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj mikroskopu preparacyjnego podłączonego do kamery i komputera, aby łatwiej zrobić zdjęcia wyniku manipulacji w celu dokumentacji i zwiększenia możliwości powielania (Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Włącz mikroskop, komputer i oprogramowanie, które przetwarza dane wejściowe z kamery.</li>
		<li>Wybierz odpowiedni zoom, przy którym zostanie zrobione końcowe zdjęcie.</li>
		<li>Wbij kołek montażowy na owady lub mały gwóźdź (z głową skierowaną na zewnątrz) w kulkę nietwardniejącej plasteliny (mniej więcej wielkości winogrona). (Żywy pająk, który ma zostać pomalowany, zostanie tymczasowo zamontowany na tego kołka w kroku 3.1 poniżej). Umieść modelinę i szpilkę pod mikroskopem, aby wyregulować obiektywy tak, aby z grubsza skupiały się na główce szpilki (miejscu, w którym ma być zamontowany pająk).</li>
		<li>Upewnij się, że obiektywy znajdują się w odpowiedniej odległości od oczu malarza, a aparat nie zasłania pola widzenia podczas malowania (jak ma to miejsce w przypadku, gdy aparat jest zamontowany w jednej z lornetek, utrudniając percepcję głębi).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś pająka do czystej plastikowej fiolki z zatrzaskiem (około 12 dram, bez żadnej taśmy lub martwej zdobyczy).</li>
	<li>Przygotuj sprzęt montażowy i malarski.
	<ol>
		<li>Umieść bardzo cienki kołek montażowy na owady w kulce z nietwardniejącej plasteliny (oprócz tej użytej w kroku 1.2.3) i umieść je po lewej stronie mikroskopu (dla osób praworęcznych). Szpilka ta posłuży do delikatnego dostosowania pozycji nóg i szypułek pająka (w razie potrzeby) podczas malowania.</li>
		<li>Zaopatrz się w mały kawałek chłonnego papieru (takiego jak ręcznik papierowy), kawałek białego papieru do drukarki, farby do nałożenia (w tym przypadku farba emaliowana), oddzielne pojemniki z rozcieńczalnikiem do farb (po jednym na każdy kolor plus jeden utrzymywany w przezroczystości i czystości), indywidualne mikropędzle dla każdego koloru (patrz Tabela materiałów) i jedna mikroszczotka do użytku tylko z czystym rozcieńczalnikiem, wszystkie umieszczone w zorganizowany sposób po prawej stronie mikroskopu (dla osób praworęcznych).</li>
		<li>Za pomocą wykałaczki dodaj kroplę farby do otwartego plastikowego naczynia (takiego jak mała szalka Petriego lub nakrętka fiolki) i dodaj rozcieńczalnik do farb, na przykład za pomocą małej strzykawki. Wymieszaj je wykałaczką do odpowiedniej konsystencji (gdy farba jest całkowicie homogenizowana, ale nie jest zbyt rzadka), testując ją na białym papierze do drukarki za pomocą mikropędzelka. 
		UWAGA: W niektórych przypadkach, jeśli farba szybko wysycha, przygotuj ją z nieco większą ilością płynu niż jest to pożądane do aplikacji i pozwól pędzlom zanurzyć się w garnku z rozcieńczalnikiem do farb do późniejszego użycia (krok 4).</li>
		<li>Umieść kroplę kleju na bazie wody wielkości ziarnka grochu (patrz Tabela materiałów) na rogu papieru drukarki. 
		UWAGA: Musi to być ostatni etap przygotowania, a następny krok musi nastąpić natychmiast po tym, aby klej nie wysechł.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Znieczulenie pająka
<ol>
	<li>Z pająkiem w fiolce i dłonią zaciśniętą na otworze, aby zapobiec ucieczce, powoli dodawaj gaz CO2, aż trzecia para nóg pająka wysunie się do 180 stopni.</li>
	<li>Czas narażenia na CO2 wynosi około 20 sekund do 1,5 minuty, w zależności od średniej wielkości gatunku i pojedynczego pająka. Odkryliśmy, że wydłużenie trzeciej pary nóg jest wiarygodnym wskaźnikiem prawidłowego poziomu znieczulenia u H. pyrrithrix, ale prawdopodobnie różni się to w zależności od gatunku. Jeśli po raz pierwszy używasz tych technik z innym gatunkiem, najpierw przetestuj znieczulenie na kilku próbkach, aby ocenić ich reakcję.</li>
	<li>Podawaj pająkom jak najmniej CO2 , aby osiągnąć wymagany poziom znieczulenia. Podczas gdy opisane tutaj krótkie okresy znieczulenia nie powodowały śmiertelności (i nie powodowały zauważalnych różnic w zachowaniu w stosunku do pająków nieznieczulonych), należy zapewnić wszystkim zwierzętom w eksperymencie równy poziom znieczulenia (w tym pozorowaną kontrolę).</li>
	<li>Trzymaj fiolkę zamkniętą po dodaniu CO2 , aby utrzymać pająka w znieczuleniu; dlatego uwzględnij ten czas przy obliczaniu, jak długo pająk jest wystawiony na działanie CO2 .</li>
	<li>Po wyjęciu pająka z fiolki w celu rozpoczęcia manipulacji kolorem, pozostanie on w pełni znieczulony przez około 1 do 2 minut; dlatego należy niezwłocznie wykonać następujące czynności (punkty 3-6). Ze względu na to ograniczone okno czasowe, wypróbuj następującą metodę malowania martwymi okazami najpierw (dla praktyki) przed próbą malowania żywych pająków.</li>
</ol>
3. Montaż pająka pod mikroskopem
<ol>
	<li>Nałóż bardzo małą ilość kleju na główkę kołka montażowego lub gwoździa w plastelinie przygotowanej w polu widzenia mikroskopu. 
	UWAGA: Użyj najmniejszej ilości kleju, która pozwala utrzymać pająka na miejscu, aby upewnić się, że i) pająk nie zsunie się z główki szpilki (jeśli zostanie użyty zbyt dużo kleju) oraz ii) pająkowi uda się uwolnić po przebudzeniu.</li>
	<li>Delikatnie wsunąć znieczulonego pająka z fiolki na stół brzuszną stroną do góry. 
	UWAGA: Ponieważ odwłoki pająków są miękkie, należy uważać, aby nie stukać ani nie upuszczać pająków na stół, ponieważ może to spowodować obrażenia.</li>
	<li>Delikatnie dociśnij główkę szpilki (za pomocą kleju) do mostka pająka (centralny obszar, w którym nogi pająka przyczepiają się do ciała) tak, aby pająk lekko podskoczył i wyprostował nogi pod niewielkim naciskiem. Aby uzyskać dodatkową kontrolę nad wywieranym naciskiem, trzymaj modelinę obiema rękami, mocno opierając obie ręce o stół.</li>
	<li>Umieść modelinę pod mikroskopem tak, aby obszar do malowania był skierowany do góry i ostry.</li>
</ol>
4. Malowanie pająka
<ol>
	<li>Oceń konsystencję farby przed dotknięciem pędzla do pająka.
	<ol>
		<li>Ponownie przetestuj konsystencję farby (użyj chłonnego papieru do wytarcia pędzli, jeśli były konserwowane w rozcieńczalniku), wyreguluj ponownie w razie potrzeby i zawsze najpierw spróbuj nałożyć farbę na papier drukarki, aby kontrolować ilość farby zawartą we włoskach pędzla.</li>
		<li>Prawą ręką i patrząc przez mikroskop umieść końcówkę pędzla w polu widzenia i upewnij się (po raz drugi), że włoska pędzla nie zawierają zbyt dużej ilości farby, w takim przypadku wytrzyj jej część na papier drukarki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetestuj konsystencję farby na pająku.
	<ol>
		<li>Dotknij pająka pędzlem na największym obszarze, który będzie musiał zostać pomalowany. Dzięki temu malarz będzie wiedział, czy konsystencja i ilość farby jest odpowiednia (np. kiedy farba lekko i powoli wsiąka we włosy/łuski pająka).
		<ol>
			<li>Jeśli farba nie zostanie nałożona, zanurz pędzel w farbie i wróć do kroku 4.1, aby powtórzyć procedurę.</li>
			<li>Jeśli farba szybko wsiąknie i rozleje się na obszar, który nie powinien być pokryty farbą, i zakładając, że rozlanie jest minimalne i że dana osoba może nadal wziąć udział w eksperymencie, przetrzyj pędzel o papier chłonny i wróć do kroku 4.1, aby powtórzyć procedurę. 
			UWAGA: Tego rodzaju rozlania płynu nie można naprawić. Jeśli wyciek dotrze do chelicerae lub oczu lub innych części, które mogą być śmiertelne lub toksyczne dla danej osoby, rozważ natychmiastowe umieszczenie pająka w zamrażarce, aby go uśpić, zanim się obudzi i wykluczyć pająka z eksperymentu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomaluj wszystkie obszary, które wymagają kolorów, wykonując kroki 4.1 i 4.2.
	<ol>
		<li>Jeśli malujesz twarz pająka, użyj dodatkowej cienkiej szpilki lewą ręką, aby przytrzymać przednie nogi i pedipalpy (tak, aby nie przeszkadzały pędzlowi). Najlepiej zrobić to podczas patrzenia przez mikroskop, aby uniknąć uszkodzenia przydatków pająka. Ponadto, jeśli malujesz twarz pająka i w zależności od pędzli użytych do malowania, rozważ pomalowanie obu stron twarzy przed próbą pomalowania środkowej części między oczami - oba pomalowane obszary można połączyć, trzymając pędzel równolegle do twarzy pająka i wywołując działanie kapilarne. 
		UWAGA: Malując twarz pająka, najłatwiej jest najpierw pomalować stronę najbliższą dominującej ręce, a następnie obrócić kulkę gliny (z zamontowanym pająkiem) pod mikroskopem, aby pomalować drugą stronę, a następnie środek.</li>
		<li>Podczas malowania pedipalpów lub nóg należy uważać, aby nie dotykać żadnych połączeń, jeśli farba jest twardniejąca (taka jak farba emaliowana) i uważać, aby nie nakładać farby na narządy dostarczające spermę samca (na spodniej stronie dystalnego segmentu pedipalps).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Robienie zdjęcia pająka
<ol>
	<li>Przełącz obiektyw w tryb aparatu.</li>
	<li>Zrób zdjęcie za pomocą oprogramowania komputerowego, upewniając się, że wybrany zoom jest wybrany na mikroskopie, aby można było dodać podziałkę.</li>
</ol>
6. Uwalnianie pająka z kołka lub gwoździa
<ol>
	<li>Kiedy pająk zacznie się poruszać, przytrzymaj szpilkę tak, aby przednie nogi pająka dotykały fiolki pająka.</li>
	<li>Pozwól pająkowi się uwolnić, a jeśli to konieczne, delikatnie pochyl szpilkę, aby pomóc pająkowi oderwać się od wysuszonego kleju.
	<ol>
		<li>Jeśli pająk obudzi się przed zakończeniem malowania, pozwól mu na co najmniej 15 minut na dojście do siebie, zanim zostanie ponownie znieczulony. Jeśli zostanie to zrobione, upewnij się, że wszystkie grupy otrzymują ten sam poziom znieczulenia (w tym osoby leczone pozorująco, jeśli dotyczy). 
		UWAGA: Wydaje się, że pająki szybko wracają do normalnego zachowania po manipulacji (< 15 minut), ale zalecamy ustandaryzowany czas odpoczynku wynoszący 12 godzin przed użyciem pająka w teście behawioralnym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Analiza zachowania pająków
<ol>
	<li>Porównaj zachowanie osób niezmanipulowanych, pozorowanych i zmanipulowanych, aby ocenić potencjalną toksyczność aplikacji (która może się różnić w zależności od konkretnego rodzaju farby, koloru, obszaru aplikacji i badanego gatunku). Odpowiednie zachowanie do porównania może obejmować wskaźnik aktywności, rodzaj wykonywanej aktywności, sukces w wykonywaniu określonych czynności (np. chwytanie zdobyczy) itp.
	<ol>
		<li>W ramach projektu eksperymentalnego należy wykorzystać pozorowane pająki (na przykład nałożenie farby na niewidoczny obszar lub nałożenie farb o neutralnym kolorze na te same obszary) w celu zmiany koloru tylko u danej osoby, przy jednoczesnym kontrolowaniu innych czynników (np. czasu obsługi, zapachu, tekstury powierzchni itp.). 
		UWAGA: W przypadku malowania nóg lub pedipalpów należy wziąć pod uwagę możliwość, że może to kolidować z włoskami czuciowymi (powszechnymi na nogach pająków i pedipalpach, patrz Foelix 201040) i, w takich przypadkach, samce potraktowane pozorem powinny mieć nałożone farby o neutralnym kolorze na te same obszary jako kontrola.</li>
		<li>Opracowując nowe metody, porównaj pomalowane pająki z niezmanipulowanymi pająkami, aby ocenić, czy osobniki zmanipulowane kolorem nadal zachowują się normalnie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Pomiar właściwości odbicia manipulacji kolorem na malowanym obiekcie
<ol>
	<li>Po eutanazji (po tym, jak pająki zostały włączone do eksperymentu lub specjalnie uśpione w tym celu, patrz uwaga poniżej), zmierz właściwości spektralne manipulacji kolorem za pomocą standardowego przenośnego spektrofotometru UV-VIS (Tabela materiałów), szczególnie dla obszarów o średnicy większej niż 1 mm.</li>
	<li>W przypadku mniejszych obszarów użyj specjalnie skonstruowanego mikrospektrofotometru (spektrofotometr UV-VIS kierowany przez mikroskop), aby uzyskać łatwiejsze i bardziej precyzyjne pomiary, chociaż optyka mikroskopu odcina światło UV, co oznacza, że pomiary są ograniczone do długości fal widzialnych dla człowieka (patrz Taylor i in. 201141).</li>
	<li>W przypadkach, gdy obszary z modyfikacją kolorów są bardzo małe i wymagane są dane dotyczące współczynnika odbicia UV, należy użyć dostępnych na rynku mikrospektrofotometrów UV-VIS, chociaż są one droższe (patrz Taylor et al. 201442). 
	UWAGA: Źródło światła spektrofotometrów UV-VIS zawiera światło UV i może być niebezpieczne dla oczu zwierząt (w tym naszych), dlatego pomiary spektralne powinny być wykonywane dopiero po eutanazji zwierząt, a nie tylko znieczuleniu. W przypadku pająków pomalowanych emalią można to zrobić po użyciu pająków w eksperymentach, ponieważ farba nie się (patrz reprezentatywne wyniki poniżej). W przypadku farb na bazie wody, które czasami blakną po dniach lub tygodniach, zestaw pająków można poświęcić do pomiaru w czasie, gdy ich odpowiednik byłby zaangażowany w eksperyment (w celu uchwycenia danych, które odzwierciedlają rzeczywistą manipulację kolorami użytą w eksperymencie). Raportowanie właściwości spektralnych farb pozwoli na replikację przez innych badaczy, którzy mogą chcieć odtworzyć manipulację kolorem, ale nie mają dostępu do tych samych konkretnych produktów farbiarskich.</li>
</ol>

<ol><li>Baeta, R., Faivre, B., Motreuil, S., Gaillard, M., Moreau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carotenoid+trade-off+between+parasitic+resistance+and+sexual+display%3A+an+experimental+study+in+the+blackbird+%28Turdus+merula%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Carotenoid trade-off between parasitic resistance and sexual display: an experimental study in the blackbird (Turdus merula).</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 275 (1633), 427-434 (2008).</li>
<li>Ninnes, C. E., Webb, S. L., Andersson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+red+bishops+red+enough%3F+On+the+persistence+of+a+generalized+receiver+bias+in+Euplectes%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Ecology%22%5BJournal%5D)">Are red bishops red enough? On the persistence of a generalized receiver bias in Euplectes.</a> Behavioral Ecology. 28 (1), 117-122 (2017).</li>
<li>Mappes, J., Marples, N., Endler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+business+of+survival+by+aposematism%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">The complex business of survival by aposematism.</a> Trends in Ecology & Evolution. 20 (11), 598-603 (2005).</li>
<li>Clark, D. L., Macedonia, J. M., Rowe, J. W., Kamp, K., Valle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+Gal%C3%A1pagos+Lava+Lizards+%28Microlophus+bivittatus%29+to+Manipulation+of+Female+Nuptial+Coloration+on+Lizard+Robots%5BTitle%5D)+AND+%22Herpetologica%22%5BJournal%5D)">Responses of Galápagos Lava Lizards (Microlophus bivittatus) to Manipulation of Female Nuptial Coloration on Lizard Robots.</a> Herpetologica. 73, (2017).</li>
<li>Finkbeiner, S. D., Briscoe, A. D., Reed, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warning+signals+are+seductive%3A+Relative+contributions+of+color+and+pattern+to+predator+avoidance+and+mate+attraction+in+Heliconius+butterflies%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Warning signals are seductive: Relative contributions of color and pattern to predator avoidance and mate attraction in Heliconius butterflies.</a> Evolution. 68 (12), 3410-3420 (2014).</li>
<li>Moore, M. P., Martin, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrasexual+selection+favours+an+immune-correlated+colour+ornament+in+a+dragonfly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Intrasexual selection favours an immune-correlated colour ornament in a dragonfly.</a> Journal of Evolutionary Biology. 29 (11), 2256-2265 (2016).</li>
<li>Nokelainen, O., Valkonen, J., Lindstedt, C., Mappes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+predator+community+structure+shifts+the+efficacy+of+two+warning+signals+in+Arctiid+moths%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Ecology%22%5BJournal%5D)">Changes in predator community structure shifts the efficacy of two warning signals in Arctiid moths.</a> Journal of Animal Ecology. 83 (3), 598-605 (2014).</li>
<li>Yewers, M. S. C., Pryke, S., Stuart-Fox, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+differences+across+contexts+may+indicate+morph-specific+strategies+in+the+lizard+Ctenophorus+decresii%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Behaviour%22%5BJournal%5D)">Behavioural differences across contexts may indicate morph-specific strategies in the lizard Ctenophorus decresii.</a> Animal Behaviour. 111, 329-339 (2016).</li>
<li>Baldwin, J., Johnsen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+male+blue+crab%2C+Callinectes+sapidus%2C+uses+both+chromatic+and+achromatic+cues+during+mate+choice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The male blue crab, Callinectes sapidus, uses both chromatic and achromatic cues during mate choice.</a> The Journal of Experimental Biology. 215 (7), 1184(2012).</li>
<li>Künzler, R., Bakker, T. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+preferences+for+single+and+combined+traits+in+computer+animated+stickleback+males%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Ecology%22%5BJournal%5D)">Female preferences for single and combined traits in computer animated stickleback males.</a> Behavioral Ecology. 12 (6), 681-685 (2001).</li>
<li>Landmann, K., Parzefall, J., Schlupp, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sexual+preference+in+the+Amazon+molly%2C+Poecilia+formosa%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Biology+of+Fishes%22%5BJournal%5D)">A sexual preference in the Amazon molly, Poecilia formosa.</a> Environmental Biology of Fishes. 56 (3), 325-331 (1999).</li>
<li>Nelson, X. J., Jackson, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+predator+from+East+Africa+that+chooses+malaria+vectors+as+preferred+prey%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A predator from East Africa that chooses malaria vectors as preferred prey.</a> PLoS ONE. 1 (1), e132(2006).</li>
<li>Bajer, K., Molnár, O., Török, J., Herczeg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+European+green+lizards+%28Lacerta+viridis%29+prefer+males+with+high+ultraviolet+throat+reflectance%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Ecology+and+Sociobiology%22%5BJournal%5D)">Female European green lizards (Lacerta viridis) prefer males with high ultraviolet throat reflectance.</a> Behavioral Ecology and Sociobiology. 64 (12), 2007-2014 (2010).</li>
<li>Gerlach, T., Sprenger, D., Michiels, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fairy+wrasses+perceive+and+respond+to+their+deep+red+fluorescent+coloration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fairy wrasses perceive and respond to their deep red fluorescent coloration.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 281 (1787), 20140787(2014).</li>
<li>Girard, M. B., Elias, D. O., Kasumovic, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+red+coloration+and+song+in+peacock+spider+courtship%3A+insights+into+complex+signaling+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Ecology%22%5BJournal%5D)">The role of red coloration and song in peacock spider courtship: insights into complex signaling systems.</a> Behavioral Ecology. 29 (6), 1234-1244 (2018).</li>
<li>Lim, M. L. M., Land, M. F., Li, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-specific+UV+and+fluorescence+signals+in+jumping+spiders%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sex-specific UV and fluorescence signals in jumping spiders.</a> Science. 315 (5811), 481(2007).</li>
<li>Xu, M., Fincke, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+wing+signal+affects+territorial+contest+outcome+in+a+sexually+dimorphic+damselfly%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Behaviour%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet wing signal affects territorial contest outcome in a sexually dimorphic damselfly.</a> Animal Behaviour. 101, 67-74 (2015).</li>
<li>Hill, G. E., McGraw, K. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHill%2C+GE+%22Bird+coloration%3A+function+and+evolution%22">Bird coloration: function and evolution</a>. 2, Harvard University Press. 137-200 (2006).</li>
<li>Chaine, A. S., Roth, A. M., Shizuka, D., Lyon, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+confirmation+that+avian+plumage+traits+function+as+multiple+status+signals+in+winter+contests%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Behaviour%22%5BJournal%5D)">Experimental confirmation that avian plumage traits function as multiple status signals in winter contests.</a> Animal Behaviour. 86 (2), 409-415 (2013).</li>
<li>Hasegawa, M., Arai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimentally+reduced+male+ornamentation+increased+paternal+care+in+the+Barn+Swallow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ornithology%22%5BJournal%5D)">Experimentally reduced male ornamentation increased paternal care in the Barn Swallow.</a> Journal of Ornithology. 156 (3), 795-804 (2015).</li>
<li>Lawes, M. J., Pryke, S. R., Andersson, S., Piper, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carotenoid+status+signaling+in+captive+and+wild+red-collared+widowbirds%3A+independent+effects+of+badge+size+and+color%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Ecology%22%5BJournal%5D)">Carotenoid status signaling in captive and wild red-collared widowbirds: independent effects of badge size and color.</a> Behavioral Ecology. 13 (5), 622-631 (2002).</li>
<li>Quesada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plumage+coloration+of+the+blue+grosbeak+has+no+dual+function+-+A+test+of+the+armament-ornament+model+of+sexual+selection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Condor%22%5BJournal%5D)">Plumage coloration of the blue grosbeak has no dual function - A test of the armament-ornament model of sexual selection.</a> The Condor. 115 (4), 902-909 (2013).</li>
<li>Safran, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maintenance+of+phenotypic+divergence+through+sexual+selection%3A+An+experimental+study+in+barn+swallows+Hirundo+rustica%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">The maintenance of phenotypic divergence through sexual selection: An experimental study in barn swallows Hirundo rustica.</a> Evolution. 70 (9), 2074-2084 (2016).</li>
<li>Tringali, A., Bowman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plumage+reflectance+signals+dominance+in+Florida+scrub-jay%2C+Aphelocoma+coerulescens%2C+juveniles%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Behaviour%22%5BJournal%5D)">Plumage reflectance signals dominance in Florida scrub-jay, Aphelocoma coerulescens, juveniles.</a> Animal Behaviour. 84 (6), 1517-1522 (2012).</li>
<li>Jerónimo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plumage+color+manipulation+has+no+effect+on+social+dominance+or+fitness+in+zebra+finches%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Ecology%22%5BJournal%5D)">Plumage color manipulation has no effect on social dominance or fitness in zebra finches.</a> Behavioral Ecology. 29 (2), 459-467 (2018).</li>
<li>Hill, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plumage+coloration+is+a+sexually+selected+indicator+of+male+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Plumage coloration is a sexually selected indicator of male quality.</a> Nature. 350 (6316), 337-339 (1991).</li>
<li>Wolfenbarger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+mate+choice+in+northern+cardinals%3A+is+there+a+preference+for+redder+males%3F%5BTitle%5D)+AND+%22The+Wilson+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Female mate choice in northern cardinals: is there a preference for redder males?</a> The Wilson Bulletin. 111 (1), 76-83 (1999).</li>
<li>ten Cate, C., Verzijden, M. N., Etman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+imprinting+can+induce+sexual+preferences+for+exaggerated+parental+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Sexual imprinting can induce sexual preferences for exaggerated parental traits.</a> Current Biology. 16 (11), 1128-1132 (2006).</li>
<li>Davis, A. K., Cope, N., Smith, A., Solensky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wing+color+predicts+future+mating+success+in+male+monarch+butterflies%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Entomological+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Wing color predicts future mating success in male monarch butterflies.</a> Annals of the Entomological Society of America. 100 (2), 339-344 (2007).</li>
<li>Exnerová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoidance+of+aposematic+prey+in+European+tits+%28Paridae%29%3A+learned+or+innate%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Ecology%22%5BJournal%5D)">Avoidance of aposematic prey in European tits (Paridae): learned or innate?</a> Behavioral Ecology. 18 (1), 148-156 (2006).</li>
<li>Forsman, A., Appelqvist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+predators+impose+correlational+selection+on+prey+color+pattern+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Ecology%22%5BJournal%5D)">Visual predators impose correlational selection on prey color pattern and behavior.</a> Behavioral Ecology. 9 (4), 409-413 (1998).</li>
<li>Hebets, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subadult+experience+influences+adult+mate+choice+in+an+arthropod%3A+exposed+female+wolf+spiders+prefer+males+of+a+familiar+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Subadult experience influences adult mate choice in an arthropod: exposed female wolf spiders prefer males of a familiar phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (23), 13390(2003).</li>
<li>Hebets, E. A., Cuasay, K., Rivlin, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+visual+ornamentation+in+female+choice+of+a+multimodal+male+courtship+display%5BTitle%5D)+AND+%22Ethology%22%5BJournal%5D)">The role of visual ornamentation in female choice of a multimodal male courtship display.</a> Ethology. 112 (11), 1062-1070 (2006).</li>
<li>Kingsolver, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+manipulation+of+wing+pigment+pattern+and+survival+in+western+white+butterflies%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Naturalist%22%5BJournal%5D)">Experimental manipulation of wing pigment pattern and survival in western white butterflies.</a> The American Naturalist. 147 (2), 296-306 (1996).</li>
<li>Morehouse, N. I., Rutowski, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+the+eyes+of+the+beholders%3A+Female+choice+and+avian+predation+risk+associated+with+an+exaggerated+male+butterfly+color%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Naturalist%22%5BJournal%5D)">In the eyes of the beholders: Female choice and avian predation risk associated with an exaggerated male butterfly color.</a> The American Naturalist. 176 (6), 768-784 (2010).</li>
<li>Prudic, K. L., Skemp, A. K., Papaj, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aposematic+coloration%2C+luminance+contrast%2C+and+the+benefits+of+conspicuousness%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Ecology%22%5BJournal%5D)">Aposematic coloration, luminance contrast, and the benefits of conspicuousness.</a> Behavioral Ecology. 18 (1), 41-46 (2006).</li>
<li>Rutledge, J. M., Miller, A., Uetz, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+multiple+sensory+cues+as+a+juvenile+affects+adult+female+mate+preferences+in+wolf+spiders%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Behaviour%22%5BJournal%5D)">Exposure to multiple sensory cues as a juvenile affects adult female mate preferences in wolf spiders.</a> Animal Behaviour. 80 (3), 419-426 (2010).</li>
<li>Taylor, L. A., Clark, D. L., McGraw, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+variation+in+condition-dependent+display+colour+does+not+predict+male+courtship+success+in+a+jumping+spider%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Behaviour%22%5BJournal%5D)">Natural variation in condition-dependent display colour does not predict male courtship success in a jumping spider.</a> Animal Behaviour. 93, 267-278 (2014).</li>
<li>Taylor, L. A., McGraw, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+ornamental+coloration+improves+courtship+success+in+a+jumping+spider%2C+but+only+in+the+sun%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Ecology%22%5BJournal%5D)">Male ornamental coloration improves courtship success in a jumping spider, but only in the sun.</a> Behavioral Ecology. 24 (4), 955-967 (2013).</li>
<li>Foelix, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFoelix%2C+R+%22Biology+of+spiders.+Third+edn%22">Biology of spiders. Third edn</a>. , Oxford University Press. (2010).</li>
<li>Taylor, L. A., Clark, D. L., McGraw, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condition+dependence+of+male+display+coloration+in+a+jumping+spider+%28Habronattus+pyrrithrix%29%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Ecology+and+Sociobiology%22%5BJournal%5D)">Condition dependence of male display coloration in a jumping spider (Habronattus pyrrithrix).</a> Behavioral Ecology and Sociobiology. 65 (5), 1133-1146 (2011).</li>
<li>Taylor, L. A., Maier, E. B., Byrne, K. J., Amin, Z., Morehouse, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colour+use+by+tiny+predators%3A+jumping+spiders+show+colour+biases+during+foraging%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Behaviour%22%5BJournal%5D)">Colour use by tiny predators: jumping spiders show colour biases during foraging.</a> Animal Behaviour. 90, 149-157 (2014).</li>
<li>Bates, D., Maechler, M., Bolker, B., Walker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitting+Linear+Mixed-Effects+Models+Using+lme4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Statistical+Software%22%5BJournal%5D)">Fitting Linear Mixed-Effects Models Using lme4.</a> Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).</li>
<li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+language+and+environment+for+statistical+computing%22">R: A language and environment for statistical computing</a>. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. https://www.R-project.org (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj pokazujemy, że kolorami maleńkich części ciała stawonogów można skutecznie manipulować za pomocą barwników, takich jak farby do makijażu i emalii.
Pierwszym krytycznym krokiem do osiągnięcia tak delikatnej manipulacji jest możliwość unieruchomienia małych zwierząt, których zwykle nie można utrzymać w dłoni. Tutaj, aby móc pomalować wrażliwe miejsca, takie jak skacząca twarz pająka, znieczuliliśmy osoby za pomocą CO2 i umieściliśmy je na główce szpilki. Pozwala to na pracę w pobliżu oczu pająka z mniejszym stresem, niż prawdopodobnie doświadczyłby pająk, gdyby nie spał (ze światłem z mikroskopu świecącym w ich twarze podczas procesu malowania).
Metoda wymaga również zaopatrzenia się w dobrej jakości mikropędzle i, co najważniejsze, odpowiednie substancje koloryzujące. Najtrudniejszym krokiem w nakładaniu farby bez rozlewania, ale z dobrym kryciem, jest uzyskanie odpowiedniej konsystencji. Dlatego substancje barwiące należy łatwo rozcieńczać rozcieńczalnikiem i łatwo suszyć w celu zagęszczenia. Można stosować różne rodzaje farb; Tutaj wyniki są prezentowane za pomocą rozpuszczalnych w wodzie (niewodoodpornych) eyelinerów i farb emaliowanych. Niewodoodporne kredki do oczu mają tę zaletę, że łatwo upłynniają się po zmieszaniu z wodą. Odbywa się to jednak w związku z rozcieńczeniem pigmentacji (co może nie być lub może być pożądane (patrz na przykład rysunek 3)). Farby emaliowane mają konsystencję, którą można łatwo kontrolować, dodając rozcieńczalnik do emalii, zapewniając jednocześnie pełne krycie. Jednak ta cecha idzie w parze z możliwością zachowania struktury włosów lub łusek pomalowanej części ciała. Ponadto farby emaliowane są trwałe. Minusem tego jest to, że farba emaliowana i rozcieńczalnik wydzielają silne zapachy podczas aplikacji i przed wyschnięciem. Dodatkową trudnością dotyczącą substancji barwiących może być znalezienie odpowiedniego odcienia, o odpowiednich właściwościach spektralnych. Na przykład trudno jest uzyskać czerwony eyeliner do stosowania równolegle z czarnym eyelinerem, ponieważ eyelinery są często bardziej różowe niż czerwone. Trudno też o puder do makijażu (lub pigmenty), które nie zawierają brokatu (który czasami może być widoczny tylko pod mikroskopem). Wiele produktów do makijażu odbija również światło UV, które, choć niewidoczne dla eksperymentatorów, może być widoczne dla badanych zwierząt.
Manipulowanie ubarwieniem stawonogów poprzez bezpośrednie nakładanie barwników na ich części ciała ma zalety i niedogodności w porównaniu z innymi metodami. Jego głównym ograniczeniem jest to, że nie można absolutnie odrzucić możliwości wystąpienia pewnych subtelnych skutków toksyczności. Można jednak upewnić się, że nie wprowadza się uprzedzeń wobec jednej grupy zabiegowej, nakładając farbę na wszystkie kategorie zabiegów i/lub można sprawdzić, czy nałożenie farby koliduje z zachowaniami będącymi przedmiotem zainteresowania. Dzięki przedstawionym tutaj metodom zebraliśmy wystarczającą ilość dowodów, aby sugerować, że nałożenie farby doprowadziło do znikomego lub żadnego negatywnego efektu (Tabela 1 i Tabela 2). Główną zaletą tej metody jest to, że maleńkie plamy koloru mogą być celowane, ich kolor "usuwany" (patrz Rysunek 2), matowy (Rysunek 3) lub jaśniejszy (Rysunek 4), w izolacji od reszty zabarwienia ciała i środowiska danej osoby. Kontrastuje to z najpowszechniejszą metodą alternatywną, która polega na manipulowaniu warunkami oświetleniowymi, a tym samym modyfikowaniu wyglądu wizualnego całej osoby i jej otoczenia. W rzeczywistości, nawet jeśli nie manipuluje się konkretnie warunkami oświetleniowymi, można z powodzeniem manipulować kolorem i zobaczyć ograniczone lub żadne efekty tej manipulacji, jeśli środowisko oświetleniowe nie jest odpowiednie39. Dlatego ważne jest, aby zmierzyć i wziąć pod uwagę środowisko świetlne, w którym będą przeprowadzane wszelkie eksperymenty (tj. mierzyć natężenie promieniowania) i upewnić się, że ściśle dopasowujesz je do naturalnych warunków oświetleniowych (na przykład używając żarówek o pełnym spektrum, które naśladują naturalne światło w niewoli). Ogólnie rzecz biorąc, dzięki użyciu mikroszczoteczek i mikroskopu, protokół ten pozwala na bardziej precyzyjną manipulację małymi plamami kolorów niż większość innych bezpośrednich metod kolorowania, które były wcześniej stosowane na bezkręgowcach. W większości wcześniejszych badań wykorzystano zwierzęta z kolorowymi plamami, które są stosunkowo duże w porównaniu z twarzami skaczących pająków (np. manipulacja kolorami skrzydeł motyli29,34,35, ciałami dorosłych pluskwiaków ("prawdziwych robaków")30,36 i koników polnych31 lub nogami stosunkowo dużych pająków wilków 32,33,37). Przedstawione tu metody otwierają możliwości badania niesamowitej różnorodności plam barwnych na taksonach, które są niedostatecznie zbadane ze względu na ich niewielkie rozmiary.
Podobne techniki można zastosować do innych stawonogów, które można unieruchomić lub znieczulić, oraz do obszarów, w których farba nie wpłynęłaby na mobilność lub zdrowie osobnika (tj. z wyłączeniem obszarów takich jak stawy, struktury takie jak włosy lub arolia, które są potrzebne do prawidłowego poruszania się, części ust lub innych otworów, takich jak struktury oddechowe). Techniki te można również rozszerzyć, aby uwzględnić większą paletę barwników, farb i makijaży, które są powszechnie dostępne.
Wreszcie, te delikatne techniki mogą być używane nie tylko do manipulowania kolorem na małych organizmach, ale także do manipulowania wzorami (takimi jak paski) u stosunkowo większych organizmów. Powinno to być korzystne dla szerokiego grona badaczy, którzy mogą dostosować nasze metody do własnych badań nad doborem płciowym, komunikacją, aposematycznymi sygnałami ofiar i innymi kontekstami, w których zwierzęta używają kolorów.

Zwierzęta często mają skomplikowane wzory kolorów, które wyświetlają podczas seksualnych spotkań, agonistycznych spotkań lub w celu odstraszenia drapieżników. Cechy te mogą przekazywać odbiorcom informacje, takie jak indywidualna cecha sygnalizatora jako mate1, zdolność do walki jako konkurent2, lub smakowitość jako przedmiot zdobyczy3. Aby zrozumieć adaptacyjne cele cech kolorowych, naukowcy zaprojektowali eksperymenty, które polegają na manipulowaniu kolorami na różne sposoby. Niektórzy badacze używali kolorowych bodźców wabiących, takich jak models4,5,6,7,8, photographs9, lub videos10,11,12 które są prezentowane odbiorcom w eksperymentach behawioralnych. Inni, zwłaszcza podczas korzystania z bezkręgowców, manipulowali środowiskiem oświetleniowym, aby wpływać na wygląd kolorów żywych osobników13,14,15,16,17. Wszystkie te manipulacje, choć pomysłowe, mają tę wadę, że usuwają potencjalnie ważne naturalne zachowanie i/lub wpływają na znacznie więcej niż cechę będącą przedmiotem zainteresowania. U dużych kręgowców, takich jak ptaki, badacze bardzo często manipulują kolorem bezpośrednio na żywych zwierzętach (recenzja w Hill and McGraw, 200618). Poszczególne pióra lub dzioby zostały bezpośrednio pokolorowane markerami2,19,20,21,22,23,24, barwniki zawierające nadtlenek wodoru często stosowane w rozjaśniaczach do włosów25,26,27, lub różne farby, w tym lakier do paznokci28. U bezkręgowców takie badania, które manipulują wzorcami kolorów bezpośrednio na żywych zwierzętach, są stosunkowo rzadkie, ale mimo to dostarczyły ogromnego wglądu w funkcję i ewolucję koloru29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. Nawet badania nad stawonogami wydają się być stronnicze w kierunku większych taksonów, które mogą być łatwiej obsługiwane i malowane, pozostawiając wzory kolorów u bardzo małych gatunków stosunkowo słabo zbadane.
Tutaj opisujemy delikatną technikę manipulacji kolorami, która została opracowana dla bardzo małych taksonów zwierząt. W szczególności metoda ta polega na manipulowaniu ubarwieniem twarzy samców skaczących pająków pod mikroskopem w celu zbadania znaczenia takich kolorowych cech w kontekście wyboru partnera i kanibalizmu seksualnego. W tym przypadku użyliśmy Habronattus pyrrithrix (zebranego z Phoenix, AZ, USA) jako gatunku modelowego (ryc. 1). Wyniki prac eksperymentalnych z wykorzystaniem niektórych z tych technik opublikowaliśmy w innym miejscu38,39, ale tutaj opisujemy metody bardziej szczegółowo niż zostało to zrobione wcześniej, w sposób, który powinien uczynić je dostępnymi dla innych próbujących je powtórzyć lub dostosować do użycia na innych bardzo małych taksonach. Takie protokoły powinny otworzyć możliwości doświadczalne na zwierzętach, które mogą być tak kolorowe jak najbardziej charakterystyczne ptaki, ale które są zwykle niedostatecznie zbadane.

<table><tbody><tr><td>Zbiornik CO2</td><td>AirGas (Radnor, PA)</td><td>#CD 50</td><td>do znieczulenia pająków</td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik do farb emaliowanych</td><td>Testors (Vernon Hills, IL)</td><td>75611792569</td><td>do cienkiej farby emaliowanej</td></tr><tr><td>Emalia płaska</td><td>Testors (Vernon Hills, IL)</td><td>czerwony: 075611115009,: 075611114903, biały: 075611116808</td><td>można rozcieńczyć rozcieńczalnikiem do farb emaliowanych</td></tr><tr>Mikroskop<td>świetlny</td><td>Zeiss (Jena, Niemcy)</td><td>stemi 508</td><td>do precyzyjnego malowania małych powierzchni</td></tr><tr><td>Aparat do mikroskopu świetlnego</td><td>Zeiss (Jena, Niemcy)</td> <td>Axiocam 105 kolor</td><td>do robienia zdjęć przed i po manipulacji do dokumentacji</td></tr><tr><td>Oprogramowanie kamery mikroskopu świetlnego</td><td>Zeiss (Jena, Niemcy)</td> <td>Zen 2 niebieska edycja</td><td>do obróbki zdjęć zrobionych przed i po manipulacji</td></tr><tr><td>Eyeliner w płynie, odcień " Perwersja"</td><td>Urban Decay (Costa Mesa, CA)</td><td>(wycofany)</td><td>niewodoodporny eyeliner, który można rozcieńczyć wodą; eyeliner 2</td></tr><tr><td>MegaLiner eyeliner w płynie,</td><td>WetnWild (Los Angeles, CA)</td><td>SKU# 871Niewodoodporny</td><td>eyeliner, który można rozcieńczyć wodą; eyeliner 1</td></tr><tr><td>Mikropędzle</td><td>MicroMark (Berkeley Heights, NJ)</td><td>#84648</td><td>umożliwiające precyzyjne malowanie małych powierzchni</td></tr><tr><td>Modelowanie nietwardniejące glina</td><td>Van Aken International Claytoon (North Charleston, SC)</td><td>18165</td><td>do wbijania małych gwoździ lub szpilek do owadów i elastycznego dostosowywania ich kątów</td></tr><tr><td>Małe kołki montażowe do gwoździ lub owadów</td><td>BioQuip (Rancho Dominguez, CA)</td><td>#1208B7</td><td>do przyklejania pająków, a także do usuwania pająków" s wyrostki przed obszarem do malowania</td></tr><tr><td>Małe plastikowe pojemniki, takie jak wieczka fiolek do zbierania owadów z zatrzaskową nakrętką</td><td>BioQuip (Rancho Dominguez, CA)</td><td>#8912</td><td>do mieszania farby i rozcieńczalnika do odpowiedniej konsystencji</td></tr><tr><td>Mała strzykawka</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482910F</td><td>do przenoszenia niewielkiej ilości rozcieńczalnika do szkliwa</td></tr><tr><td>Spectralon biały standard</td><td>Labsphere Inc. (North Sutton, NH)</td><td>WS-1-SL</td><td>do pomiaru właściwości spektralnych kolorów</td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-VIS</td><td>Ocean Optics (Dunedin, FL)</td><td>USB 2000 (spektrofotometr) z PX-2 (źródło światła)</td><td>do pomiaru właściwości spektralnych kolorów</td></tr><tr><td>Rozpuszczalny w wodzie klej szkolny</td><td>Elmer's (High Point, NC)</td><td>#E304</td><td>do montażu pająków na gwoździu/szpilce</td></tr><tr><td>Wykałaczki drewniane</td><td>Up& W górę, Target Corporation (Minneapolis, MN)</td><td>#253-05-0125</td><td>do przenoszenia kropli farby emaliowanej</td></tr></tbody></table>

manipulacja wzorami kolorystycznymi u skaczących pająków do wykorzystania w eksperymentach behawioralnych

Manipulation of Color Patterns in Jumping Spiders for Use in Behavioral Experiments

W dziedzinie ekologii behawioralnej, wiele eksperymentów ma na celu zbadanie ewolucyjnych celów cech kolorowych w kontekście doboru płciowego i drapieżnictwa. Metody są różne, ale głównie polegają na modyfikowaniu wzorów kolorystycznych osób za pomocą różnych barwników. Takie techniki były stosowane w odniesieniu do wielu taksonów kręgowców, szczególnie u ptaków, ale pozostały słabo rozwinięte w przypadku bezkręgowców ze względu na trudności w skutecznym manipulowaniu kolorem u małych organizmów. Zamiast tego, aby manipulować wyglądem bezkręgowców, naukowcy zwykle modyfikowali środowisko oświetleniowe, aby odfiltrować określone długości fal. Taka metoda wpływa jednak nie tylko na interesującą nas cechę fenotypową, ale na cały wygląd osobnika i jego otoczenia. Tutaj, zmniejszając techniki stosowane wcześniej na kolorowych ptakach, przedstawiamy sposoby manipulowania kolorami małych stawonogów, wykorzystując równie emblematyczne, ale niedostatecznie zbadane gatunki: kolorowe skaczące pająki.

Skuteczność manipulacji kolorem
Stosując te techniki, skuteczne są różne stopnie manipulacji kolorem, w tym całkowite maskowanie barw lub zmniejszanie bądź zwiększanie ich intensywności. Wynika to zarówno z fotografii, jak i pomiarów odbicia spektralnego (Rycina 2, Rycina 3oraz Rycina 4). Przedstawiamy tutaj samców z manipulacją kolorystyczną Habronattus pyrrithrix w porównaniu do osobników samców o naturalnie czerwonych twarzach. Właściwości spektralne pomierzono za pomocą spektrofotometru UV-VIS (patrz Tabela materiałów), który umożliwia precyzyjny pomiar kolorowych obszarów o średnicy nawet 1 mm. Pomiary wykonano w odniesieniu do białego wzorca odbicia rozproszonego (patrz Tabela materiałów).
W rzadkich przypadkach (5 na 108 samców, którym na twarzy naniesiono czarną kreskę eyelinerem 1 (patrz Tabela materiałów)), rozpuszczalna w wodzie kreska zaczęła schodzić z twarzy pająków po jednym lub dwóch tygodniach. Nie zaobserwowano tego w przypadku drugiej marki eyelinera (eyeliner 2; patrz Tabela materiałów). W obu przypadkach klatki pająków były spryskiwane wodą od trzech do pięciu razy w tygodniu. Różne warunki utrzymania mogą wpływać na ścieranie się farby na bazie wody. Farba emaliowa pozostała nienaruszona u wszystkich manipulowanych samców (n=21), nawet u tych, które przeżyły ponad 6 miesięcy.
Potencjalna toksyczność manipulacji barwą
Należy unikać nakładania farby na oczy pająków, aby nie ograniczać ich widoczności, a także na chelicery, części gębowe i inne otwory, a potencjalnie również na inne miękkie części ciała, aby zapobiec możliwości połknięcia i zatrucia. Należy również zachować ostrożność podczas malowania stawów lub części zawierających włosy sensoryczne (takich jak odnóża i pedipalpy), aby nie ograniczać ich mobilności lub systemu sensorycznego. Jeśli jednak takie manipulacje kolorystyczne w tych obszarach ciała są konieczne lub jeśli istnieją wątpliwości co do możliwości wystąpienia subtelnych negatywnych skutków, najlepiej jest nakładać farby na osobniki we wszystkich kategoriach badawczych. W ten sposób uniknie się niezamierzonej manipulacji systemami sensorycznymi osobników w sposób, który mógłby być stronniczy tylko wobec jednej z grup. Na przykład w eksperymencie z wykorzystaniem zmanipulowanych samców pokazanych na Rysunku 4, celem było zwiększenie i zmniejszenie liczby czerwonych plam eksponowanych przez samce podczas zalotów. Ponieważ niektórym samcom naturalne czerwone twarze zostały zakryte szarą farbą emaliową (aby zmniejszyć ilość widocznego koloru czerwonego), innym samcom, u których chcieliśmy zachować czerwoną twarz, pomalowano naturalnie czerwoną twarz na czerwono tym samym produktem, co u samców o szarych twarzach. Podobnie, ponieważ chcieliśmy dodać czerwone plamy na pedipalpach u niektórych samców, aby zwiększyć liczbę eksponowanych czerwonych plam, u pozostałych samców użyto szarej farby do pokrycia pedipalpów, tak aby wszystkie samce były malowane w tym wrażliwym obszarze (patrz Rysunek 4). Choć preferowana, strategia ta nie zawsze może być możliwa do zrealizowania. Na przykład w innym eksperymencie czerwone zabarwienie usunięto za pomocą czarnego eyelinera, który zapewniał taką samą właściwość spektralną jak leżąca pod nim kutykula samca, pozostawiając jednocześnie inne kolory samca nienaruszone i naturalne (Rysunek 2). W tym przypadku, w celu uzyskania naturalnego wyglądu samców, taką samą ilość eyelinera nałożono na obszar na górnej części karapaksu, tuż za przednimi oczami środkowymi (obszar niewidoczny dla samic), aby kontrolować potencjalny zapach lub ogólną toksyczność produktu. Jednak miejsce nałożenia farby może w różny sposób wpływać na pająki. Dlatego, aby ocenić subtelne różnice, jakie sposób lub miejsce nałożenia farby mogą mieć dla kondycji pająka, porównano zachowanie obu typów samców w kontekście istotnym dla naszych hipotez (w odniesieniu do wyboru partnera i kanibalizmu seksualnego). Samce umieszczano po dwa w obecności samicy, a następnie za pomocą uogólnionych liniowych modeli mieszanych (używając funkcji lmer z pakietu lme443 w programie R wersja 3.5.24, z tożsamością samicy jako efektem losowym i stosując kryterium maksymalnej wiarygodności w celu uzyskania wartości p) porównano czas do przejścia w stan aktywności, czas do rozpoczęcia zalotów oraz całkowity czas spędzony na zalotach. W tym przypadku wszystkie porównania nie wykazały różnic między grupami (patrz Tabela 1), co pozwoliło wysnuć wniosek, że nie wprowadzono błędu systematycznego na korzyść jednej lub drugiej kategorii badawczej.
W każdym z tych przypadków, gdy kategorie zabiegowe są do siebie bardzo zbliżone (Rysunek 4) lub gdy występują jedynie osobniki poddane zabiegowi pozorowanemu (Rysunek 2 i Rysunek 3), badacze powinni ocenić, w jaki sposób gatunek modelowy reaguje na stosowaną farbę i upewnić się, że osobniki nadal zachowują się w sposób podobny i ekologicznie istotny. Można zarejestrować dane w celu maksymalnego ograniczenia potencjalnych efektów toksyczności, na przykład poprzez porównanie wskaźników aktywności między osobnikami poddanymi zabiegowi a osobnikami nienaruszonymi. Nasze pająki pomalowane farbą emaliową, jak pokazano na Rysunku 4, porównano z nienaruszonymi samcami w identycznym kontekście. W szczególności samce wprowadzano pojedynczo do klatki z samicą, a następnie porównywano czas opuszczenia probówki, czas rozpoczęcia zalotów oraz częstotliwość zalotów (przed kopulacją oraz przed zostaniem zaatakowanym lub zjedzonym). Nie stwierdzono różnic (przy zastosowaniu podobnych liniowych modeli mieszanych jak powyżej), co pozwoliło nam wysnuć wniosek, że pomalowane samce zachowywały się naturalnie (Tabela 2).
Na koniec należy zauważyć, że pająki biorące udział w eksperymentach (zazwyczaj samice), które kanibalizowały samce z manipulacją kolorem, nigdy nie wykazywały oznak negatywnych skutków. Pająki trawią swoją ofiarę zewnętrznie, zazwyczaj pozostawiając nienaruszone pomalowane obszary kutykuli. Jednakże, przy adaptacji tej metody do innych systemów, w których zwierzęta z manipulacją kolorem będą spożywane, należy ocenić potencjalne ryzyko toksyczności.
<img alt="Porównanie rozmiaru pająka z wykorzystaniem monety; badanie pajęczaków; biologia, punkt odniesienia dla skali." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59824/59824fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1Dorosły samiec Habronattus pyrrithrix obrazując, jak niewielkie są ich kolorowe obszary ciała. Zdjęcia: Lyle Buss. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59824/59824fig1large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Odblaskowość barw pysków pająków; obrazy mikroskopowe i wykres widm odblaskowości przy różnych długościach fal." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59824/59824fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2Eksperymentalna manipulacja kolorem zastosowana w celu zamaskowania czerwonego zabarwienia twarzy u Habronattus pyrrithrix. (A) Nienaruszona czerwona koloracja twarzy przed manipulacją kolorem. (B) Koloracja twarzy tego samego samca po zamaskowaniu naturalnej czerwonej koloracji czarnym eyelinerem 1. (C) Reprezentatywne widma odbicia dla naturalnej czerwonej twarzy, naturalnej podstawowej czarnej kutykuli oraz czerwonej twarzy pomalowanej czarnym eyelinerem 2. Zmodyfikowano na podstawie Taylor and McGraw 201339. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59824/59824fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Badanie ubarwienia pająków; widma odbicia; wykres, eksperyment, samce z zabiegiem pozorowanym vs samce okaleczone." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59824/59824fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Eksperymentalna manipulacja kolorem zastosowana w celu zmniejszenia rozmiaru i intensywności czerwieni czerwonej plamy na twarzy samców Habronattus pyrrithrix. (A) Nienaruszona czerwona kolorystyka pyszczka przed manipulacją kolorystyczną. (B) Ubarwienie twarzy tego samego samca po nałożeniu rozcieńczonego czarnego eyelinera (Urban Decay) na przednią część twarzy oraz nierozcieńczonego czarnego eyelinera wzdłuż krawędzi plamy na twarzy w celu zmniejszenia powierzchni czerwonego obszaru. (C) Średnie krzywe widmowe samców kontrolnych poddanych pozorowanej procedurze (n = 21) oraz samców z manipulacją ubarwienia (n = 21), w porównaniu ze średnią dla całej populacji (n = 57) i 10 samców o najmniej nasyconym ubarwieniu z poprzedniego badania41Rysunek powielony z publikacji Taylor et al. 201438. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59824/59824fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie odbicia światła z powierzchni pyszczka pająka; wykresy przedstawiają % odbicia w funkcji długości fali dla wariantów szkliwa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59824/59824fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Eksperymentalna manipulacja kolorem zastosowana w celu zmiany barwy czerwonego obszaru twarzy samców Habronattus pyrrithrix. Habronattus pyrrithrix samce pomalowane (A) czerwony, (B) czerwony i szary, i (C) szarą farbą emaliową na ich naturalnie czerwonych twarzach i naturalnie kremowych pedipalpach. (D) Średnie krzywe widmowe dla samców niepoddanych manipulacjom (n = 9) oraz samców z twarzą pokrytą czerwoną farbą emaliową (n = 9). Poprzez naniesienie jaśniejszej czerwieni na twarz pająka skutecznie wzmocniono jego czerwone ubarwienie twarzy. Ponieważ farba emaliowa całkowicie pokrywa znajdujące się pod nią łuski, kolor mógł zostać również całkowicie zmieniony, co ma miejsce w przypadku emalii szarej. (EW niniejszym eksperymencie wybrano czerwone i szare farby emaliowe tak, aby były one dopasowane pod względem całkowitej jasności (całkowitego odbicia w zakresie długości fal widzialnych dla tych pająków). Różnice w skali osi Y na wykresach D i E wynikają z zastosowania różnych technik (takich jak odległość od próbki i rozmiar mierzonych obszarów) pomiaru próbek kolorów na papierze (E) w porównaniu z bezpośrednimi pomiarami kolorów na powierzchni ciała pająka (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59824/59824fig4v2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >N</td >
			<td >Zmienna zależna</td >
			<td >p</td >
			<td >t</td >
			<td >Czerwonołice</td >
			<td >±SE</td >
			<td >Czarnołice</td >
			<td >±SE</td >
			<td >nFID</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >202b</td >
			<td >Opóźnienie opuszczenia naczynia przez samca</td >
			<td >0.35</td >
			<td >-0.93</td >
			<td >140.0</td >
			<td >23.9</td >
			<td >109.8</td >
			<td >23.9</td >
			<td >102</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >179c</td >
			<td >Opóźnienie rozpoczęcia zalotów przez samca</td >
			<td >0.74</td >
			<td >0.3</td >
			<td >983.4</td >
			<td >127.1</td >
			<td >1031.0</td >
			<td >126.5</td >
			<td >95</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >204a</td >
			<td >Wysiłek zalotowy samca</td >
			<td >0.52</td >
			<td >0.63</td >
			<td >181.2</td >
			<td >24.4</td >
			<td >203.0</td >
			<td >24.4</td >
			<td >102</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >204a</td >
			<td >Wysiłek zalotowy samca przed jakimkolwiek atakiem</td >
			<td >0.41</td >
			<td >0.68</td >
			<td >89.0</td >
			<td >15.7</td >
			<td >97.5</td >
			<td >15.7</td >
			<td >102</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1. Wpływ manipulacji kolorem twarzy samca na zachowanie, w przypadku pomalowania czarną kredką do oczu w porównaniu z grupą kontrolną (Rysunek 2). Przedstawiono strukturę każdego modelu oraz średnie szacunki w sekundach (±SE) dla każdej grupy traktowania. N = liczba samców, p i t = wartość p oraz wartość t dla traktowania samców, nFID = liczba poziomów w losowym efekcie tożsamości samicy. aZ 104 przeprowadzonych testów z udziałem samców 102 zostało pomyślnie zarejestrowanych, co pozwoliło na obserwację 204 unikalnych samców. b2 samce zostały zjedzone przez samicę przed opuszczeniem szalki Petriego. c25 samców zostało zjedzonych przez samicę przed rozpoczęciem zalotów.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >N</td>
			<td >Zmienna zależna</td>
			<td >p</td>
			<td >t</td>
			<td >Brak manipulacji</td>
			<td >±SE</td>
			<td >Malowane</td>
			<td >±SE</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >32a</td >
			<td >Opóźnienie opuszczenia naczynia przez samca</td >
			<td >0.87</td >
			<td >-0.17</td >
			<td >380.8</td >
			<td >143.1</td >
			<td >345.4</td >
			<td >152.4</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >31b</td >
			<td >Opóźnienie rozpoczęcia zalotów przez samca</td >
			<td >0.93</td >
			<td >-0.09</td >
			<td >502.6</td >
			<td >105.8</td >
			<td >48.1</td >
			<td >16.6</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >31b</td >
			<td >Nakład pracy zalotniczej samca</td >
			<td >0.74</td >
			<td >-0.33</td >
			<td >2324.3</td >
			<td >45.0</td >
			<td >2102.1</td >
			<td >484.4</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >31b</td >
			<td >Nakład pracy zalotniczej samca przed jakimkolwiek atakiem</td >
			<td >0.68</td >
			<td >0.42</td >
			<td >1495.1</td >
			<td >450.8</td >
			<td >170.1</td >
			<td >479.9</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 2. Wpływ manipulacji kolorem twarzy samców na zachowanie, gdy zostali oni pomalowani czerwoną lub szarą farbą emaliową (n = 15, Rysunek 4) vs. samce niemanipulowane (n = 17). Przedstawiono strukturę każdego modelu oraz średnie wartości w sekundach (±SE) dla każdej grupy badawczej. N = liczba samców, p i t = wartość p oraz wartość t dla traktowania samców. a17 samców niemanipulowanych porównano z podgrupą wszystkich malowanych samców w naszym eksperymencie (n = 21). W szczególności porównano ich z 15 malowanymi samcami (5 czerwonych (Rysunek 2A), 5 czerwono-szarymi (Rysunek 2B) i 5 szarych (Rysunek 2C)) badanych w tym samym kontekście (w obecności samicy) i w tym samym konkretnym okresie czasu. Jest to istotne, ponieważ samce niemanipulowane były badane pod koniec eksperymentu (w sierpniu i wrześniu 2018 r.), co odpowiada końcowi ich naturalnego sezonu rozrodczego, kiedy samce są zazwyczaj mniej aktywne. Utrzymanie wszystkich tych innych zmiennych na tym samym poziomie pozwala nam porównać traktowanie malowaniem bez wprowadzania innych błędów systematycznych. bJeden samiec (cały szary) został zjedzony przez kanibalizm przed rozpoczęciem zalotów do samicy.

Celem tego protokołu jest manipulowanie wzorami kolorów skaczących pająków i innych bardzo małych stawonogów za pomocą farby, w celu zbadania zagadnień związanych z doborem płciowym, kanibalizmem seksualnym, drapieżnictwem, aposematyzmem lub jakąkolwiek inną dziedziną ubarwienia zwierząt.

Manipulacja wzorami kolorystycznymi u skaczących pająków do wykorzystania w eksperymentach behawioralnych

In the field of behavioral ecology, many experiments are designed to investigate the evolutionary purposes of colorful traits in the context of sexual ...

Aby zrozumieć, jak i dlaczego kolory ewoluują, potrzebujemy eksperymentów, w których manipulujemy zwierzęcymi wzorcami kolorów. Małe zwierzęta są często niedostatecznie zbadane, ponieważ ich kolory są trudne do manipulowania. Główną zaletą bezpośredniej manipulacji plamami kolorów jest to, że metoda ta nie wpływa na wygląd reszty zwierzęcia ani nie zmienia jego naturalnego środowiska oświetleniowego.Pokazujemy, w jaki sposób naukowcy mogą nakładać farby emaliowane i makijaż na skaczące pająki. Te same metody działają również na wielu innych małych, kolorowych i słabo zbadanych stawonogach. Radziłbym najpierw spróbować pomalować martwy okaz, aby nie było pośpiechu w uzyskaniu idealnej konsystencji i ilości farby na mikropędzlu.Wizualna demonstracja tej metody jest niezbędna, ponieważ trudno jest na przykład wyjaśnić, jaka jest właściwa konsystencja farby, jak nakładać farbę, pod jakim kątem będzie działał pędzel. Na początek podłącz mikroskop preparacyjny do kamery i komputera, aby łatwiej zrobić zdjęcia wyniku. Włącz wszystkie trzy urządzenia i uruchom oprogramowanie, które przetwarza dane wejściowe z kamery.Następnie wybierz odpowiedni zoom, przy którym zostanie zrobione końcowe zdjęcie. Wbij kołek montażowy na owady lub mały gwóźdź w kulkę nietwardniejącej plasteliny, która jest mniej więcej wielkości winogrona. Umieść modelinę i zestaw szpilek pod mikroskopem i dostosuj obiektywy tak, aby z grubsza skupiały się na główce szpilki, na której zostanie zamontowany pająk.Następnie umieść dodatkowy cienki kołek montażowy na owady w nowej kulce z nietwardniejącej plasteliny i umieść ją obok mikroskopu. Ułóż następujące materiały w zorganizowany sposób obok mikroskopu. Mały kawałek chłonnego papieru, kawałek białego papieru do drukarki, nakładane farby, oddzielne pojemniki z rozcieńczalnikiem do farb dla każdego nakładanego koloru, plus jeden, który ma być przezroczysty i czysty, indywidualne mikropędzle dla każdego koloru i jedna mikroszczotka do użytku tylko z czystym rozcieńczalnikiem.Za pomocą wykałaczki dodaj kroplę farby do otwartego plastikowego naczynia. Dodaj rozcieńczalnik do farb i za pomocą wykałaczki wymieszaj je do odpowiedniej konsystencji, gdzie farba jest całkowicie homogenizowana, ale niezbyt rzadka. Użyj mikroszczotki, aby przetestować zmieszaną farbę na białym papierze do drukarki.Następnie nałóż kroplę kleju na bazie wody wielkości ziarnka grochu na róg papieru drukarki. Najpierw nałóż bardzo małą ilość kleju na główkę kołka montażowego lub gwoździa, który został wcześniej przygotowany i umieszczony pod mikroskopem. Delikatnie wsuń znieczulonego pająka z fiolki na stół brzuszną stroną do góry, uważając, aby nie dotknąć ani nie upuścić pająka na stół.Trzymaj modelinę obiema rękami, upewniając się, że obie ręce są mocno przytwierdzone do stołu. Następnie delikatnie dociśnij główkę szpilki z klejem do mostka pająka, tak aby pająk lekko podskoczył i wyprostował nogi pod niewielkim naciskiem. Zmień położenie zestawu montażowego pod mikroskopem, tak aby obszar, który ma być pomalowany, był skierowany do góry i ostry.Najpierw testujemy konsystencję farby i w razie potrzeby ponownie ją dostosowujemy. Zawsze najpierw spróbuj nałożyć farbę na papier do drukarki, aby kontrolować jakość farby zawartej we włoskach pędzla. Przed dotknięciem pająka należy upewnić się, że farba ma odpowiednią konsystencję i że na mikroszczotce znajduje się tylko odpowiednia ilość farby.Patrząc przez mikroskop, użyj dominującej ręki, aby wprowadzić końcówkę pędzla w pole widzenia i ponownie upewnij się, że włoska pędzla nie zawiera zbyt dużo farby. Jeśli na pędzlu jest za dużo farby, wytrzyj jej część na papier drukarki. Następnie przyłóż pędzel do pająka na największym obszarze, który będzie musiał zostać pomalowany.To pokaże, czy konsystencja i ilość farby jest odpowiednia, czyli wtedy, gdy farba lekko i powoli wsiąka we włosy lub łuski pająka. Jeśli farba nie zostanie nałożona, zanurz pędzel w farbie i powtórz ten proces, zaczynając od przetestowania farby na papierze drukarki. Jeśli farba szybko wsiąknie i rozleje się na obszar, który nie powinien być pokryty farbą, przetrzyj pędzel o chłonny papier i powtórz proces od początku, testując farbę na papierze do drukarki.Jeśli malujesz twarz pająka, użyj dodatkowej cienkiej szpilki w niedominującej ręce, aby przytrzymać przednie nogi i pedipalpy. W zależności od pędzli i farby, rozważ pomalowanie obu stron twarzy przed próbą pomalowania środkowego obszaru między oczami, ponieważ malowanie na bocznych obszarach można połączyć, trzymając pędzel równolegle do twarzy pająka i wywołując działanie kapilarne. Podczas malowania pedipalpów lub nóg upewnij się, że nie dotykasz żadnych połączeń farbą utwardzającą i upewnij się, że nie nakładasz farby na męskie narządy dostarczania nasienia na spodniej stronie dystalnego segmentu pedipalps.Po pomalowaniu jednej strony twarzy pająka pomocne jest obrócenie pająka pod mikroskopem, tak aby drugą stronę twarzy można było pomalować tą samą dominującą ręką. Malowanie należy wykonać zarówno ostrożnie, jak i szybko, zanim pająk obudzi się ze znieczulenia. Na koniec pomniejsz za pomocą mikroskopu, aby sprawdzić ogólną manipulację kolorami i przygotuj się do zrobienia zdjęcia.Najpierw przełącz obiektyw w tryb aparatu. Korzystając z oprogramowania komputerowego, zrób zdjęcie, upewniając się, że wybrany zoom jest wybrany na mikroskopie, aby dodać podziałkę. Kiedy pająk zacznie się poruszać, przytrzymaj szpilkę tak, aby przednie nogi pająka dotykały fiolki pająka.W razie potrzeby delikatnie pochyl szpilkę, aby pomóc pająkowi oderwać się od wysuszonego kleju i pozwolić pająkowi się uwolnić. W tym badaniu maleńkie twarze samców Habronattus pyrrithrix są manipulowane kolorem. Korzystając z przedstawionych tutaj technik, skuteczne są różne stopnie manipulacji kolorami.W tym całkowite ukrycie kolorów lub zmniejszenie lub wzmocnienie ich intensywności. W przypadku pokazanych tutaj samców celem jest zwiększenie lub zmniejszenie liczby czerwonych plam wyświetlanych przez samce podczas zalotów. Niektóre samce mają swoje naturalne czerwone twarze ukryte szarą farbą emaliowaną, podczas gdy inne utrzymują swoje kolory poprzez zamalowanie naturalnej czerwieni czerwoną farbą emaliowaną jako kontrolę.Podobnie, ponieważ niektóre pająki mają czerwone plamy dodane do pedipalpów, aby zwiększyć ilość wyświetlanych czerwonych plam, szara farba jest używana do pokrycia pedipalp innych samców, tak aby wszystkie samce miały nałożoną farbę na wrażliwy obszar. Jednak namalowanie pająków z różnych grup na dokładnie tych samych obszarach, aby kontrolować ewentualny negatywny wpływ farby, nie zawsze jest wykonalne. W innym badaniu czerwone zabarwienie usuwa się za pomocą czarnego eyelinera, który ma takie same właściwości spektralne jak leżący pod spodem naskórek samca, podczas gdy inne męskie kolory pozostają nienaruszone i naturalne.W przypadku naturalnie wyglądających samców, taką samą ilość eyelinera nakłada się na obszar na wierzchu pancerza, tuż za przednimi środkowymi oczami, aby kontrolować potencjalny zapach lub ogólną toksyczność produktu. Zachowanie obu typów samców jest porównywane w danym kontekście, aby ocenić wszelkie subtelne różnice, które mogą sugerować toksyczność lub niezamierzone skutki farb. Udawane samce i samce, których twarze są pomalowane eyelinerem, są umieszczane po dwóch w obecności samicy i obserwuje się określone męskie zachowania.W tym przypadku wszystkie porównania nie wykazują żadnych różnic między zabiegami. W związku z tym można stwierdzić, że nie wprowadza się błędu systematycznego w odniesieniu do żadnej z kategorii leczenia. Podobnie, gdy są wprowadzane pojedynczo do klatki dla kobiet, samce pomalowane szarą lub czerwoną farbą emaliowaną i samce niemanipulowane, nie wykazują żadnych różnic w zachowaniu.Można więc stwierdzić, że pomalowane samce działały naturalnie. Aby w żaden sposób nie utrudniać pająkowi, ważne jest, aby całkowicie unikać dodawania farby do części ustnej lub narządów dostarczających plemniki. Nie należy również dodawać ani pozostawiać żadnej farby na oczach pająka lub stawach.Pająki manipulujące kolorem lub inne stawonogi mogą być wykorzystywane w eksperymentach behawioralnych, aby zrozumieć rolę koloru w różnych kontekstach, od zalotów, przez interakcje między samcami, po unikanie drapieżników. Dziedzina ubarwienia zwierząt jest napędzana głównie przez prace na większych kręgowcach, takich jak ptaki. Dzięki zmniejszonym technikom manipulacji kolorami możemy teraz zadawać więcej pytań na temat koloru u małych zwierząt.

manipulation-color-patterns-jumping-spiders-for-use-behavioral

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Pomiar momentu obrotowego odchylenia (yaw torque) przywiązanej muchy Drosophila za pomocą miernika momentu obrotowego pozwala neurobiologowi na precyzyjną kontrolę warunków stymulacji zwierzęcia doświadczalnego. W połączeniu z unikalnymi narzędziami genetycznymi dostępnymi u muszki owocówki, paradygmat ten jest wykorzystywany w szerokim zakresie badań neurobiologicznych.

Uczenie instrumentalne muszek *Drosophila* przy użyciu torquemetru

Opisujemy metodę rejestracji aktywności motorycznej, zsynchronizowaną z elektrycznie rejestrowanym sygnałem kontaktu stopowego u uwięzionego owada chodzącego po śliskiej powierzchni. Metoda ta jest wykorzystywana do badania neuronalnych podstaw adaptacyjnego zachowania przy zredukowanym wpływie oddziaływań mechanicznych między odnóżami a podłożem.

Badanie neuronowych podstaw adaptacyjnego zachowania lokomocyjnego u owadów

Larwy Drosophila są wrażliwe na światło i reagują na zmiany w otaczającym świetle. Ten film opisuje test, który testuje ich zdolność do unikania światła, zwany testem plamki świetlnej. Prezentowany protokół pokazuje, jak skonfigurować test z niebieską diodą LED i pokazuje, jak rejestrować zachowanie zwierzęcia w odpowiedzi na spotkanie ze światłem.

Test plamki świetlnej: metoda badania zachowania fototaktycznego Drosophila

Ten film pokazuje badanie zachowania nawigacyjnego larw Drosophila w odpowiedzi na optogenetyczną stymulację węchowych neuronów czuciowych (ORN). Transgeniczne larwy Drosophila wykazujące ekspresję światłoczułych kanałów jonowych w ORN są umieszczane na agarozie w obrębie areny behawioralnej. Stymulacja optogenetyczna światłem otwiera kanały, powodując napływ kationów, który wyzwala przekazywanie sygnału do mózgu, a zachowanie nawigacyjne jest rejestrowane.

Zachowania nawigacyjne larw Drosophila w odpowiedzi na optogenetyczną stymulację węchowych neuronów czuciowych

Genetycznie kodowane narzędzia optogenetyczne umożliwiają nieinwazyjną manipulację specyficznymi neuronami w mózgu Drosophila. Takie narzędzia mogą identyfikować neurony, których aktywacja jest wystarczająca do wywołania lub stłumienia określonych zachowań. W tym miejscu przedstawiamy metodę aktywacji rodopsyny kanałowej2, która ulega ekspresji w docelowych neuronach u swobodnie chodzących muszek.

Optogenetyczna stymulacja zachowań ucieczkowych u Drosophila melanogaster

Ten protokół opisuje prosty, ekonomiczny sposób indywidualnej identyfikacji Drosophila lub innych owadów. Dane demonstracyjne badające sukces godowy trzech gatunków Drosophila pokazują, że metoda ta jest porównywalna lub lepsza niż zastosowanie znieczulenia CO2 .

Barwienie owadów do testów behawioralnych: zachowanie godowe znieczulonych Drosophila

Ten protokół analizuje zachowanie nawigacyjne larwy Drosophila w odpowiedzi na jednoczesną optogenetyczną stymulację jej neuronów węchowych. Światło o długości fali 630 nm służy do aktywacji pojedynczych neuronów węchowych wyrażających rodopsynę z przesuniętym ku czerwieni kanałem. Ruch larw jest jednocześnie śledzony, rejestrowany cyfrowo i analizowany za pomocą specjalnie napisanego oprogramowania.

Śledzenie zachowań larw Drosophila w odpowiedzi na optogenetyczną stymulację neuronów węchowych

Areny do testowania biologicznego przyciągania zdjęć są używane do określenia optymalnego koloru (kolorów) światła, aby zmaksymalizować atrakcyjność owadów; jednak testy biologiczne i metody są specyficzne dla docelowych zachowań i siedlisk owadów. Konfigurowalny sprzęt i modyfikacje są wyjaśnione dla owadów prowadzących nocny lub dzienny tryb życia oraz lądowych lub powietrznych.

Kluczowe elementy testu biologicznego przyciągania zdjęć do badań owadów lub programów monitorowania

Ten protokół wprowadza test plamki świetlnej do zbadania fototaktycznego zachowania larw Drosophila. W tym teście plamka świetlna jest generowana jako stymulacja światłem, a proces unikania światła larwalnego jest rejestrowany przez system obrazowania oparty na świetle podczerwonym.

Test punktowy świetlny do analizy fototaksji larw Drosophila

Ten artykuł przedstawia metody manipulacji optogenetycznej u Drosophila melanogaster, wykorzystując CsChrimson i GtACR2 do aktywacji i wyciszania określonych neuronów. Opisano cztery eksperymenty wykorzystujące optogenetykę do badania zachowań termotaktycznych i smakowych, dostarczając wglądu w podstawowe mechanizmy neuronalne rządzące tymi procesami.

Testy behawioralne do optogenetycznej manipulacji obwodami neuronalnymi u Drosophila melanogaster

Poznaj metodę manipulacji wzorami kolorystycznymi u skaczących pająków przy użyciu farb emaliowych i makijażu. Technika ta umożliwia badania nad doborem płciowym i drapieżnictwem u małych stawonogów.

Manipulacja wzorami kolorystycznymi u skaczących pająków do wykorzystania w eksperymentach behawioralnych

Przeglądaj więcej filmów