Name: Kwantyfikacja miażdżycy u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę kwantyfikacji miażdżycy u myszy, obejmującą analizę aorty wstępującej, łuku aorty i tętnicy ramienno-głowowej. Protokół obejmuje barwienie Sudanem IV i przygotowanie tkanki do obrazowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy wszystkim byłym członkom eksperymentalnej jednostki badawczej Görana K Hanssona, która pomogła rozwinąć ten protokół w ciągu ostatniego ćwierćwiecza. Jesteśmy szczególnie wdzięczni za wkład Antonino Nicoletti, Xinghua Zhou, Anny-Karin Robertson i Inger Bodin. Praca ta była wspierana przez grant 06816 i wsparcie Linneusza 349-2007-8703 ze Szwedzkiej Rady ds. Badań Naukowych oraz przez granty ze Szwedzkiej Fundacji Serca-Płuc, Rady Hrabstwa Sztokholm, Fundacji Profesor Nanny Svartz, Fundacji Loo i Hansa Ostermanów na rzecz Badań Medycznych, Fundacji Badawczej Karolinska Institutet oraz Fundacji Chorób Geriatrycznych przy Karolinska Institutet.

<ol><li>Lozano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+regional+mortality+from+235+causes+of+death+for+20+age+groups+in+1990+and+2010%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).</li>
<li>Gistera, A., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunology+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The immunology of atherosclerosis.</a> Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 368-380 (2017).</li>
<li>Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation%2C+atherosclerosis%2C+and+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease.</a> New England Journal of Medicine. 352 (16), 1685-1695 (2005).</li>
<li>Williams, K. J., Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+response-to-retention+hypothesis+of+early+atherogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">The response-to-retention hypothesis of early atherogenesis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 15 (5), 551-561 (1995).</li>
<li>Pentikainen, M. O., Oorni, K., Ala-Korpela, M., Kovanen, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+LDL+-+trigger+of+atherosclerosis+and+inflammation+in+the+arterial+intima%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modified LDL - trigger of atherosclerosis and inflammation in the arterial intima.</a> Journal of Internal Medicine. 247 (3), 359-370 (2000).</li>
<li>Ruuth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+low-density+lipoprotein+particles+to+aggregate+depends+on+particle+lipidome%2C+is+modifiable%2C+and+associates+with+future+cardiovascular+deaths%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of low-density lipoprotein particles to aggregate depends on particle lipidome, is modifiable, and associates with future cardiovascular deaths.</a> European Heart Journal. 39 (27), 2562-2573 (2018).</li>
<li>Nakashima, Y., Raines, E. W., Plump, A. S., Breslow, J. L., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+VCAM-1+and+ICAM-1+at+atherosclerosis-prone+sites+on+the+endothelium+in+the+ApoE-deficient+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Upregulation of VCAM-1 and ICAM-1 at atherosclerosis-prone sites on the endothelium in the ApoE-deficient mouse.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18 (5), 842-851 (1998).</li>
<li>Goldstein, J. L., Ho, Y. K., Basu, S. K., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+site+on+macrophages+that+mediates+uptake+and+degradation+of+acetylated+low+density+lipoprotein%2C+producing+massive+cholesterol+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Binding site on macrophages that mediates uptake and degradation of acetylated low density lipoprotein, producing massive cholesterol deposition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 333-337 (1979).</li>
<li>Paigen, B., Morrow, A., Brandon, C., Mitchell, D., Holmes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+susceptibility+to+atherosclerosis+among+inbred+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Variation in susceptibility to atherosclerosis among inbred strains of mice.</a> Atherosclerosis. 57 (1), 65-73 (1985).</li>
<li>Russell, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+history+of+mouse+inbred+strains%3A+contributions+of+Clarence+Cook+Little%5BTitle%5D)+AND+%22Origins+of+Inbred+Mice%2C+Morse%2C+HC%2C+eds.+%28Academic+Press%2C+NY%29%22%5BJournal%5D)">Origins and history of mouse inbred strains: contributions of Clarence Cook Little.</a> Origins of Inbred Mice, Morse, HC, eds. (Academic Press, NY). , 33-43 (1978).</li>
<li>Waterston, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+sequencing+and+comparative+analysis+of+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome.</a> Nature. 420 (6915), 520-562 (2002).</li>
<li>Gistera, A., Ketelhuth, D. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-driven+immunometabolic+responses+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Lipidology%22%5BJournal%5D)">Lipid-driven immunometabolic responses in atherosclerosis.</a> Current Opinion in Lipidology. 29 (5), 375-380 (2018).</li>
<li>Maganto-Garcia, E., Tarrio, M., Lichtman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of atherosclerosis.</a> Current Protocols in Immunology. Chapter 15, Unit 15.24.11-23 (2012).</li>
<li>Plump, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+hypercholesterolemia+and+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-deficient+mice+created+by+homologous+recombination+in+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells.</a> Cell. 71 (2), 343-353 (1992).</li>
<li>Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+hypercholesterolemia+and+arterial+lesions+in+mice+lacking+apolipoprotein+E%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E.</a> Science. 258 (5081), 468-471 (1992).</li>
<li>Ishibashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercholesterolemia+in+low+density+lipoprotein+receptor+knockout+mice+and+its+reversal+by+adenovirus-mediated+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery.</a> Journal of Clinical Investigation. 92 (2), 883-893 (1993).</li>
<li>Ishibashi, S., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Herz, J., Burns, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+xanthomatosis+and+atherosclerosis+in+cholesterol-fed+low+density+lipoprotein+receptor-negative+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Massive xanthomatosis and atherosclerosis in cholesterol-fed low density lipoprotein receptor-negative mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 93 (5), 1885-1893 (1994).</li>
<li>Ketelhuth, D. F., Gistera, A., Johansson, D. K., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-based+therapies+for+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">T cell-based therapies for atherosclerosis.</a> Current Pharmaceutical Design. 19 (33), 5850-5858 (2013).</li>
<li>Skalen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subendothelial+retention+of+atherogenic+lipoproteins+in+early+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Subendothelial retention of atherogenic lipoproteins in early atherosclerosis.</a> Nature. 417 (6890), 750-754 (2002).</li>
<li>Boren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+low+density+lipoprotein+receptor-binding+site+in+apolipoprotein+B100+and+the+modulation+of+its+binding+activity+by+the+carboxyl+terminus+in+familial+defective+apo-B100%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Identification of the low density lipoprotein receptor-binding site in apolipoprotein B100 and the modulation of its binding activity by the carboxyl terminus in familial defective apo-B100.</a> Journal of Clinical Investigation. 101 (5), 1084-1093 (1998).</li>
<li>Sanan, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+lipoprotein+receptor-negative+mice+expressing+human+apolipoprotein+B-100+develop+complex+atherosclerotic+lesions+on+a+chow+diet%3A+no+accentuation+by+apolipoprotein%28a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Low density lipoprotein receptor-negative mice expressing human apolipoprotein B-100 develop complex atherosclerotic lesions on a chow diet: no accentuation by apolipoprotein(a).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (8), 4544-4549 (1998).</li>
<li>Gistera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+against+T-cell+epitopes+of+native+ApoB100+reduces+vascular+inflammation+and+disease+in+a+humanized+mouse+model+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Vaccination against T-cell epitopes of native ApoB100 reduces vascular inflammation and disease in a humanized mouse model of atherosclerosis.</a> Journal of Internal Medicine. , (2017).</li>
<li>Johnson, J. L., Jackson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerotic+plaque+rupture+in+the+apolipoprotein+E+knockout+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Atherosclerotic plaque rupture in the apolipoprotein E knockout mouse.</a> Atherosclerosis. 154 (2), 399-406 (2001).</li>
<li>Calara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+plaque+rupture+and+secondary+thrombosis+in+apolipoprotein+E-deficient+and+LDL+receptor-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous plaque rupture and secondary thrombosis in apolipoprotein E-deficient and LDL receptor-deficient mice.</a> The Journal of Pathology. 195 (2), 257-263 (2001).</li>
<li>Caligiuri, G., Levy, B., Pernow, J., Thoren, P., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarction+mediated+by+endothelin+receptor+signaling+in+hypercholesterolemic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarction mediated by endothelin receptor signaling in hypercholesterolemic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (12), 6920-6924 (1999).</li>
<li>Daugherty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendation+on+Design%2C+Execution%2C+and+Reporting+of+Animal+Atherosclerosis+Studies%3A+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), e131-e157 (2017).</li>
<li>Paigen, B., Morrow, A., Holmes, P. A., Mitchell, D., Williams, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+atherosclerotic+lesions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice.</a> Atherosclerosis. 68 (3), 231-240 (1987).</li>
<li>Purcell-Huynh, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+expressing+high+levels+of+human+apolipoprotein+B+develop+severe+atherosclerotic+lesions+in+response+to+a+high-fat+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice expressing high levels of human apolipoprotein B develop severe atherosclerotic lesions in response to a high-fat diet.</a> Journal of Clinical Investigation. 95 (5), 2246-2257 (1995).</li>
<li>Nicoletti, A., Kaveri, S., Caligiuri, G., Bariety, J., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+treatment+reduces+atherosclerosis+in+apo+E+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin treatment reduces atherosclerosis in apo E knockout mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 102 (5), 910-918 (1998).</li>
<li>Gistera, A., Ketelhuth, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostaining+of+Lymphocytes+in+Mouse+Atherosclerotic+Plaque%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunostaining of Lymphocytes in Mouse Atherosclerotic Plaque.</a> Methods in Molecular Biology. 1339, 149-159 (2015).</li>
<li>Gistera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta+signaling+in+T+cells+promotes+stabilization+of+atherosclerotic+plaques+through+an+interleukin-17-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta signaling in T cells promotes stabilization of atherosclerotic plaques through an interleukin-17-dependent pathway.</a> Science Translational Medicine. 5 (196), 196ra100 (2013).</li>
<li>Gistera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Density+Lipoprotein-Reactive+T+Cells+Regulate+Plasma+Cholesterol+Levels+and+Development+of+Atherosclerosis+in+Humanized+Hypercholesterolemic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Low-Density Lipoprotein-Reactive T Cells Regulate Plasma Cholesterol Levels and Development of Atherosclerosis in Humanized Hypercholesterolemic Mice.</a> Circulation. 138 (22), 2513-2526 (2018).</li>
<li>Daugherty, A., Whitman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+atherosclerosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantification of atherosclerosis in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 209, 293-309 (2003).</li>
<li>Baglione, J., Smith, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assay+for+mouse+atherosclerosis+in+the+aortic+root%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assay for mouse atherosclerosis in the aortic root.</a> Methods in Molecular Biology. 129, 83-95 (2006).</li>
<li>Schiller, N. K., Kubo, N., Boisvert, W. A., Curtiss, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+gamma-irradiation+and+bone+marrow+transplantation+on+atherosclerosis+in+LDL+receptor-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Effect of gamma-irradiation and bone marrow transplantation on atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 21 (10), 1674-1680 (2001).</li>
<li>Naghavi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+vulnerable+plaque+to+vulnerable+patient%3A+a+call+for+new+definitions+and+risk+assessment+strategies%3A+Part+I%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part I.</a> Circulation. 108 (14), 1664-1672 (2003).</li>
<li>Seijkens, T. T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+CD40-Induced+TRAF6+Signaling+in+Macrophages+Reduces+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Targeting CD40-Induced TRAF6 Signaling in Macrophages Reduces Atherosclerosis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71 (5), 527-542 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Choroby układu krążenia są głównym zabójcą na świecie i potrzebne są nowe pomiary zapobiegawcze2. Mysie modele choroby stanowią kompleksową platformę do badania patofizjologii i eksperymentalnych metod leczenia13. Wiarygodna kwantyfikacja wielkości zmiany ma zasadnicze znaczenie dla tego podejścia. Jednak metody oznaczania ilościowego różnią się w zależności od laboratorium. Standaryzacja i optymalizacja to proces trwający od 1980 roku 13,27,33,34. Korzenie aorty stały się najpopularniejszym miejscem do ilościowego określania eksperymentalnej miażdżycy. Przekroje blaszek umożliwiają porównanie objętości blaszki miażdżycowej pomiędzy grupami. Preparaty en face są preferowane do ilościowego oznaczania zmian w większych segmentach aorty. Metoda en face wizualizuje ilość płytki nazębnej i umożliwia ilościowe określenie pokrycia obszaru płytki nazębnej, ale nie uwzględnia grubości płytki nazębnej. Biologiczne znaczenie obserwowanych różnic jest poparte spójnymi wynikami w różnych miejscach drzewa naczyniowego. Ocena rozwoju miażdżycy w różnych lokalizacjach dotyczy możliwych skutków specyficznych dla danego miejsca. Wpływ przeszczepionych komórek krwiotwórczych na rozwój miażdżycy można ocenić w chimerach Ldlr-/-, z hipercholesterolemią. Jednak napromienianie całego ciała wpływa na proces miażdżycy, wywołując skutki specyficzne dla danego miejsca. Bardziej widoczne zmiany miażdżycowe rozwijają się w korzeniu aorty, natomiast zmniejszony rozwój zmian obserwuje się w łukach aorty35.
Co ważne, w badaniach eksperymentalnej miażdżycy należy zająć się nie tylko wielkością zmiany. Kluczowym parametrem jest również skład zmian chorobowych. Kilka cech płytki nazębnej powiązano z objawami choroby u ludzi36. Seryjne cięcie korzenia aorty pozostawia kilka sekcji dostępnych do dokładnej analizy składu płytki nazębnej. Pęknięcie blaszki miażdżycowej u ludzi charakteryzuje się cienką włóknistą czapeczką z niewielką liczbą komórek mięśni gładkich, rzadką zawartością kolagenu i objawami stanu zapalnego w blaszkach36. Chociaż pęknięcie płytki nazębnej jest rzadkim zdarzeniem w mysich modelach miażdżycy, markery stabilności płytki miażdżycowej są pouczające do oceny. Podejścia translacyjne mogą potwierdzić wyniki badań mechanistycznych z modeli mysich i odkryć ważne cechy chorób u ludzi31. Stan zapalny blaszek miażdżycowych można określić za pomocą barwienia immunohistochemicznego VCAM-1, MHC klasy II, makrofagów i limfocytów30. Niektóre protokoły wykorzystują przekroje podłużne w płaszczyźnie czołowej łuku aorty lub tętnicy ramienno-głowowej do pomiaru wielkości i składu zmian miażdżycowych37. Jednak ta alternatywna metoda pozostawia tylko kilka sekcji do analizy, co ogranicza jej zastosowania.
Pierwszym krytycznym krokiem w tym protokole jest zdolność do skutecznego pobierania aort. Koordynacja ręka-oko pod mikroskopem wymaga praktyki i ma kluczowe znaczenie zarówno dla mikrodysekcji, jak i późniejszego unieruchomienia łuku aorty. Kolejnym krytycznym krokiem w tym protokole jest pobranie szeregowych odcinków z korzenia aorty. Dla każdej myszy należy zebrać osiemdziesiąt kolejnych sekcji, co wymaga zarówno skupienia, jak i cierpliwości. Biegłość metodologiczna mogłaby znacznie przyspieszyć opisane procesy. Niemniej jednak kwantyfikacja zmian miażdżycowych jest nadal czasochłonnym zadaniem. Nowa technologia, zautomatyzowana obsługa i obrazowanie małych zwierząt mogą w przyszłości ułatwić ilościowe określenie eksperymentalnej miażdżycy. Postęp miażdżycy jest powolny, a większość protokołów eksperymentalnych w modelach mysich zajmuje ponad cztery miesiące, aby ukończyć13. W związku z tym aorty muszą być pobierane w zoptymalizowany sposób w punktach końcowych badania. Protokół ten stanowi kompleksowy przewodnik po efektywnym pobieraniu aort, a proponowane przetwarzanie przygotowuje aorty do wielozadaniowego zastosowania, w tym do ilościowego oznaczania zmian w korzeniu aorty, łuku aorty i tętnicy ramienno-głowowej. Miejmy nadzieję, że protokół może zmniejszyć zmienność eksperymentalną, zwiększyć wiarygodność wyników i doprowadzić do odkryć, które utorują drogę do nowych metod leczenia miażdżycy.

Choroby układu krążenia są główną przyczyną zgonów na świecie, a choroba niedokrwienna serca i udar mózgu odpowiadają za jeden na cztery zgony1. Większość przypadków jest spowodowana miażdżycą, chorobą charakteryzującą się powolnym gromadzeniem się blaszek lipidowych z objawami przewlekłego stanu zapalnego w dużych i średnich tętnicach2. Choroba zwykle pozostaje niezauważona przez kilka dziesięcioleci, aż pęknięcie lub erozja płytki nazębnej wywoła zakrzepicę tętniczą, która prowadzi do niedokrwiennego uszkodzenia tkanki.
Normalna tętnica składa się z warstwy wewnętrznej z komórkami śródbłonka i słabo rozmieszczonymi komórkami mięśni gładkich, warstwy środkowej z komórkami mięśni gładkich i elastycznymi blaszkami oraz otaczającej warstwy przybyszowej z luźną tkanką łączną3. Wewnętrzna retencja LDL kompensuje rozwój miażdżycy4. Akumulacja i modyfikacja lipoprotein prowadzi do agregacji i uwięzienia w obrębie błony wewnętrznej tętnicy5. Reakcja zapalna jest wywoływana przez uwięzione i zmodyfikowane lipoproteiny6. Komórki śródbłonka zaczynają wyrażać cząsteczki adhezyjne, takie jak VCAM-1 w miejscach w drzewie tętniczym o burzliwym przepływie krwi, co prowadzi do rekrutacji krążących monocytów i innych leukocytów7. Naciekające monocyty różnicują się w makrofagi, które pochłaniają lipidy, a następnie przekształcają się w komórki piankowe makrofagów8.
Miażdżyca tętnic jest badana na modelach mysich z coraz większą częstotliwością od połowy lat 80. C57BL/6 jest najczęściej używanym szczepem myszy wsobnych w tych badaniach i jest używany jako tło genetyczne dla większości genetycznie modyfikowanych szczepów9. Szczep ten powstał w 1920<'sup class="xref">10, a jego genom został opublikowany w 200211. Eksperymenty na modelach mysich mają kilka zalet: kolonie rozmnażają się szybko, pomieszczenia są efektywne przestrzennie, a chów wsobny zmniejsza zmienność eksperymentalną. Model pozwala również na manipulacje genetyczne, takie jak celowane delecje genów i wprowadzanie transgenów. Doprowadziło to do nowego patofizjologicznego zrozumienia choroby i nowych celów terapeutycznych12.
Myszy C57BL/6 typu dzikiego są naturalnie odporne na miażdżycę. Większość krążącego cholesterolu w HDL znajduje się u nich, a złożone zmiany miażdżycowe nie powstają nawet wtedy, gdy są karmione dietą wysokotłuszczową i wysokocholesterolową13. Myszy z hipercholesterolemią, takie jak Apoe-/- na tle C57BL/6, są zatem używane jako eksperymentalne modele miażdżycy14,15. Brak ApoE upośledza wychwyt resztkowych lipoprotein w wątrobie i poważnie zaburza metabolizm lipidów. U myszy Apoe-/- krążący cholesterol znajduje się głównie w cząsteczkach VLDL, a myszy rozwijają złożone blaszki miażdżycowe na regularnej diecie żywieniowej.
Ldlr-/- myszy naśladują rozwój miażdżycy obserwowany u ludzi z rodzinną hipercholesterolemią16. Myszy Ldlr-/- potrzebują diety typu zachodniego, aby rozwinąć miażdżycę17. Zachodnia dieta naśladuje przyjmowanie pokarmu przez ludzi i zwykle zawiera 0,15% cholesterolu. Receptor LDL rozpoznaje ApoB100 i ApoE i pośredniczy w wychwytywaniu cząsteczek LDL poprzez endocytozę. Receptory LDL mają zasadnicze znaczenie dla klirensu LDL z krążenia przez wątrobę, podczas gdy ekspresja receptora LDL w komórkach krwiotwórczych nie wpływa na ten proces. Otwiera to możliwość przeszczepienia komórek Ldlr+/+ szpiku kostnego biorcom Ldlr-/- z hipercholesterolemią i oceny rozwoju miażdżycy. Chimery szpiku kostnego są powszechnie wykorzystywane do badania udziału komórek krwiotwórczych w eksperymentalnej miażdżycy. Jednak przeszczep szpiku kostnego może wpływać na wielkość i skład blaszek miażdżycowych, co sprawia, że interpretacja wyników jest niejednoznaczna.
Różne warianty myszy Apoe-/- i Ldlr-/- z dodatkowymi zmianami genetycznymi zostały opracowane do badania specyficznych procesów choroby18. Jednym z przykładów są ludzkie APOB100-transgeniczne myszy Ldlr-/- (HuBL), które są nosicielami pełnowymiarowego genu APOB100 ludzkiego 19,20. Myszy te rozwijają hipercholesterolemię i miażdżycę przy regularnej diecie żywieniowej. Jednak rozwój złożonych blaszek miażdżycowych trwa co najmniej sześć miesięcy, a krótsze protokoły eksperymentalne zwykle wykorzystują zachodnią dietę21. Duża frakcja cholesterolu w osoczu krąży w cząsteczkach LDL, co nadaje myszom HuBL bardziej podobny do ludzkiego dyslipidemiczny profil lipoprotein w porównaniu z myszami Apoe-/- i Ldlr-//-. Myszy HuBL pozwalają również na badania ludzkiego apoB jako autoantygenu22.
Mysie modele miażdżycy rozwijają złożone blaszki miażdżycowe o wspólnych cechach ludzkiej choroby. Jednak blaszki są dość odporne na pęknięcie i wynikający z niego zawał mięśnia sercowego. Zakrzepica tętnic jest wykrywana tylko sporadycznie i eksperymentalnie trudna do oceny23,24,25. Opracowano specjalne modele pękania płytki nazębnej, ale w dziedzinie eksperymentalnej brakuje wiarygodnego i powtarzalnego modelu do oceny środków stabilizujących blaszkę miażdżycową.
Kwantyfikacja miażdżycy została opisana na wiele sposobów w literaturze. Ostatnie wysiłki miały na celu standaryzację projektowania eksperymentów, wykonywania i raportowania badań na zwierzętach26. Badacze mają różne preferencje i techniki dostosowane do ich laboratoriów. Większość projektów badawczych jest również wyjątkowa w tym sensie, że wymagają pewnych modyfikacji protokołu. Ze względu na wieloczynnikowy charakter choroby, optymalne kontrole różnią się w zależności od projektu. Lokalne warunki i brak standaryzacji mogą powodować obserwowane różnice w rozwoju choroby, co hamuje postęp w tej dziedzinie badań. Różnice w zmienności eksperymentalnej oznaczają również, że obliczenia mocy statystycznej muszą opierać się na badaniach pilotażowych w warunkach lokalnych.
Ilościowe określenie miażdżycy jest zalecane w kilku miejscach drzewa naczyniowego. Protokół ten opisuje, w jaki sposób uzyskać wyniki z korzenia aorty, łuku aorty i tętnicy ramienno-głowowej u jednej myszy, oprócz pozostawienia reszty aorty piersiowo-brzusznej do innych analiz. Preparaty na twarz umożliwiają szybkie ilościowe określenie blaszek lipidowych w łuku aorty. Obciążenie chorobą w tętnicy ramienno-głowowej można również określić ilościowo, jeśli próbki są starannie wyeksponowane. Bardziej czasochłonne przecięcie korzenia aorty pozostawia kilka sekcji dostępnych do szczegółowej oceny składu płytki nazębnej.

<table><tbody><tr><td>Aceton</td><td>VWR Chemicals</td><td>20066.296</td><td>Do utrwalania skrawków do immunohistochemii.</td></tr><tr><td>taśma elektroizolacyjna (szerokość 50 mm)</td><td>Każdy wyspecjalizowany sprzedawca-Do</td><td></td> <td>tworzenia łóżek przypinających do łuków aorty.</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5417C</td><td>Mikrowirówka stołowa.</td></tr><tr><td>Tablica korkowa</td><td>Każdy wyspecjalizowany sprzedawca</td> <td>-</td> <td>Do wycinania serc w ramach przygotowań do kriomontażu korzeni aorty.</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Scientific</td><td>Microm HM 560</td><td>Do seryjnej kriosekcji korzeni aorty.</td></tr><tr><td>Woda dejonizowana</td> <td>-</td><td></td> <td>do płukania i przygotowywania roztworów.</td></tr><tr><td>Cyfrowy aparat</td><td>Leica Microsystems</td><td>DC480</td><td>5,1 megapiksela CCD do zdjęć w wysokiej rozdzielczości łuków aorty i odcinków korzeni aorty.</td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne (10 cm, proste)</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td>Do ogólnego preparowania narządów.</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5 (11 cm, proste)</td><td>World Precision Instruments</td><td>500341</td><td>Do mikrodysekcji aorty.</td></tr><tr><td>Etanol 70% (v/v)</td><td>VWR Chemicals</td><td>83801.290</td><td>Wysoce łatwopalne ciecze i pary, przechowywać w dobrze wentylowanym miejscu i przechowywać w chłodnym miejscu.</td></tr><tr><td>Etanol absolutny &ge; 99,8%</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.310</td><td>Wysoce łatwopalne ciecze i pary, przechowywać w dobrze wentylowanym miejscu i przechowywać w chłodnym miejscu.</td></tr><tr><td>Formaldehyd 4% stabilizowany, buforowany (pH 7,0)</td><td>VWR Chemicals</td><td>9713.1000</td><td>Działa szkodliwie przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do</td><td></td> <td>analizy obrazu</td> <td>ImageJ NIH.</td></tr><tr><td>Kleszczyki do tęczówki (10 cm, zakrzywione, ząbkowane)</td><td>World Precision Instruments</td><td>15915-G</td><td>Używane jako kleszcze anatomiczne.</td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Merck</td><td>1096341011</td><td>łatwopalna ciecz, powoduje poważne podrażnienie oczu i może powodować senność lub zawroty głowy.</td></tr><tr><td>Kaiser's glicerol gelatyna</td><td>Merck</td><td>1092420100</td><td>Wodne podłoże montażowe zawierające fenol. Podejrzewa się, że powoduje wady genetyczne.</td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM LB2</td><td>Do analizy podczas przekrojów i dokumentacji mikrofotografii barwionych czerwienią olejową.</td></tr><tr><td>Mayer's hematoxylin</td><td>Histolab</td><td>1820</td><td>Nietoksyczny roztwór barwiący bez hydratu chloralu, ale powoduje poważne podrażnienie oczu.</td></tr><tr><td>Nożyczki Mayo (17 cm, proste)</td><td>World Precision Instruments</td><td>501751-G</td><td>Do ogólnego rozwarstwienia.</td></tr><tr><td>Uchwyt na igłę Micro Castroviejo (9 cm, prosty)</td><td>World Precision Instruments</td><td>503376</td><td>Do przypinania łuków aorty.</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>Corning</td><td>MCT-175-C</td><td>Mikroprobówki polipropylenowe z nasadką zatrzaskową.</td></tr><tr><td>Microlance 3 igły, rozmiar 23</td><td>BD</td><td>300800</td><td>Do pobierania krwi.</td></tr><tr><td>Microlance 3 igły, 27 gauge</td><td>BD</td><td>302200</td><td>Do perfuzji myszy.</td></tr><tr><td>Mikrovette 500 i mikro; L, K3 EDTA</td><td>Sarstedt</td><td>20.1341.100</td><td>Do pobierania krwi.</td></tr><tr><td>Mikrovette 500 i mikro; L, Heparyna litowa</td><td>Sarstedt</td><td>20.1345.100</td><td>Do pobierania krwi.</td></tr><tr><td>Szpilki do owadów Minutien, 0,10 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>Do przypinania łuków aorty.</td></tr><tr><td>Olej Red O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td>Nie klasyfikowany jako substancja lub mieszanina stwarzająca zagrożenie.</td></tr><tr><td>Optymalna temperatura cięcia (OCT) cryomount</td><td>Histolab</td><td>45830</td><td>Do zatapiania tkanki.</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis</td><td>PM992</td><td>Folia parafinowa stosowana do tworzenia łożysk pinowych dla łuków aorty.</td></tr><tr><td>Szalki Petriego (100 mm x 20 mm)</td><td>Dowolny dostawca kultur komórkowych</td> <td>-</td> <td>Proponowany jako pojemnik do przechowywania upiętych aort.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td> <td>-</td><td></td> <td>sterylny i wolny od RNaz roztwór jest wymagany do perfuzji myszy.</td></tr><tr><td>Jakościowa bibuła filtracyjna (klasa 1001)</td><td>Munktell</td><td>120006</td><td>Do filtrowania roztworu roboczego Oil Red O (typowa retencja 2-3 &mikro; m).</td></tr><tr><td>Odczynnik stabilizujący RNAlater RNA</td><td>Qiagen</td><td>76106</td><td>Do stabilizacji RNA w próbkach tkanek</td></tr><tr><td>RNaseZap Roztwór do dekontaminacji RNazy</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td>Roztwór do dekontaminacji powierzchni, który niszczy RNazy w kontakcie.</td></tr><tr><td>Rękojeść do skalpela #3 (13 cm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td>Do wycinania serc w ramach przygotowań do kriomontażu korzeni aorty.</td></tr><tr><td>Standardowe ostrze skalpela #10</td><td>World Precision Instruments</td><td>500239</td><td>Do wycinania serc w przygotowaniu do kriomontażu korzeni aorty.</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ6</td><td>Do preparacji i dokumentacji en face</td></tr><tr><td>Sudan IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4261</td><td>Nie klasyfikowany jako substancja lub mieszanina niebezpieczna.</td></tr><tr><td>Preparaty mikroskopowe Superfrost Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td>Do pobierania odcinków korzenia aorty.</td></tr><tr><td>Kleszczyki do tkanek (15 cm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>501741-G</td><td>Do ogólnego preparowania.</td></tr><tr><td>Krioformy Tissue-Tek (10 mm x 10 mm x 5 mm)</td><td>Sakura</td><td>4565</td><td>Do osadzania korzeni aorty w OCT.</td></tr><tr><td>Nożyczki Vannas (8 cm, proste)</td><td>World Precision Instruments</td><td>503378</td><td>Do mikrodysekcji aorty.</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja miażdżycy u myszy

Quantification of Atherosclerosis in Mice

Choroby układu krążenia są główną przyczyną zgonów na świecie. Podstawową przyczyną w większości przypadków jest miażdżyca, która jest częściowo przewlekłą chorobą zapalną. Eksperymentalne badania miażdżycy wyjaśniły rolę cholesterolu i stanu zapalnego w procesie chorobowym. Doprowadziło to do udanych badań klinicznych nad środkami farmaceutycznymi, które zmniejszają objawy kliniczne miażdżycy. Staranne i dobrze kontrolowane eksperymenty na mysich modelach choroby mogą dokładniej wyjaśnić patogenezę choroby, która nie jest w pełni poznana. Standaryzowana analiza zmian chorobowych jest ważna dla zmniejszenia zmienności eksperymentalnej i zwiększenia odtwarzalności. Określenie wielkości zmiany w korzeniu aorty, łuku aorty i tętnicy ramienno-głowowej jest częstym punktem końcowym w eksperymentalnej miażdżycy. Protokół ten zawiera opis techniczny do oceny miażdżycy we wszystkich tych miejscach za pomocą jednej myszy. Protokół jest szczególnie przydatny, gdy materiał jest ograniczony, jak to często ma miejsce w przypadku charakteryzowania zwierząt modyfikowanych genetycznie.

W modelach mysich miażdżycy najbardziej wyraźne zmiany mają tendencję do rozwijania się w pierścieniu aorty oraz łuku aorty. Niniejszy protokół opisuje kwantyfikację miażdżycy w pierścieniu aorty, łuku aorty oraz tętnicy szyjnej wspólnej u jednej myszy. Mierzalne zmiany w zstępującej części aorty piersiowej i aorcie brzusznej występują jedynie u zwierząt w zaawansowanym stadium choroby. W tym protokole części te nie są analizowane pod kątem obciążenia miażdżycowego, lecz są zachowywane do późniejszej analizy poziomów mRNA lub innych badań. Przekroje seryjne zmian miażdżycowych w pierścieniu aorty są zazwyczaj przedstawiane na wykresie, gdzie na osi y znajduje się wielkość zmiany, a na osi x odległość od zatoki aorty28. Przekroje prostopadłe są kluczowe dla kwantyfikacji wielkości zmian. Przekroje skośne mogą prowadzić do zawyżenia wielkości zmian, a nachylenie wynoszące zaledwie 20° może zawyżyć absolutną powierzchnię zmiany o 15%29. Jednak obliczenie frakcji zmiany w stosunku do całkowitej powierzchni naczynia sprawia, że wynik jest mniej wrażliwy na ewentualne różnice w kącie cięcia (Rycina 4A). Odpowiednią metodą statystyczną do wykrywania różnic między grupami jest zazwyczaj standardowa dwuczynnikowa analiza wariancji (ANOVA). Następnie przeprowadza się testy post-hoc Bonferroniego w celu wykrycia różnic na określonych poziomach. Jako test uzupełniający do ANOVA można również zastosować test najmniejszej istotnej różnicy Fishera. Zmniejsza on prawdopodobieństwo wystąpienia błędu statystycznego typu II, ale nie uwzględnia wielokrotnych porównań. Ponadto pomocne może być obliczenie pola pod krzywą lub średniej wielkości zmiany na mysz i przedstawienie danych na wykresie punktowym w celu dalszej wizualizacji zmienności indywidualnej w obrębie grup (Rycina 4B).
Oil Red O to rozpuszczalny w tłuszczach, jaskrawoczerwony barwnik diazo, który barwi lipidy obojętne. Lipidy polarne w błonach komórkowych nie ulegają zabarwieniu. Barwienie Oil Red O można przeprowadzić na próbkach świeżych, zamrożonych lub utrwalonych formaliną, ale nie na próbkach zatopionych w parafinie, ze względu na usuwanie lipidów podczas wymaganego procesu deparafinizacji. Ilościowe oznaczenie akumulacji lipidów w zmianie chorobowej można przeprowadzić poprzez wyznaczenie progu kolorystycznego dla obszaru pozytywnego pod kątem Oil Red O w stosunku do całkowitego obszaru zmiany (Rycina 4C). Hematoksylina barwi jądra komórkowe na niebiesko, co ułatwia wizualizację morfologii blaszki miażdżycowej. Prawa i lewa tętnica wieńcowa zazwyczaj odchodzą od aorty w odległości około 250 µm od zatoki aorty27, co często pokrywa się z miejscami występowania największych zmian. Przekroje poprzeczne z tego regionu są często prezentowane jako wyniki reprezentatywne (Rycina 4D).
<img alt="Wykres analizy miażdżycy; wielkość zmiany, procent korzenia; obrazy histologiczne; model mysi Cd4-Cre." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59828/59828fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Zmiany miażdżycowe w pierścieniu aorty. (AOceniono dwudziestoośmiotygodniowe samce chimer szpiku kostnego, karmione dietą zachodnią przez osiem tygodni, aby określić wpływ Smad7wpływ niedoboru limfocytów T na rozwój miażdżycy. Badania eksperymentalne Ldlr-/- otrzymane chimery Cd4-Cre+Smad7fl/fl otrzymano szpik kostny i kontrole Cd4-Cre+Smad7fl/+ szpik kostny. Wykres przedstawia ilościowe określenie powierzchni zmian miażdżycowych z ośmiu kolejnych przekrojów, 100 - 800 µm z zatoki aorty, przedstawione jako ułamek zmiany w stosunku do całkowitej powierzchni naczynia (Cd4-Cre+Smad7fl/+/Ldlr-/- n=6, Cd4-Cre+Smad7fl/fl/Ldlr-/- n = 9, dwuczynnikowa analiza wariancji (ANOVA) z testem post hoc Bonferroniego; wykres przedstawia średnią ± błąd standardowy średniej (SEM), klamry wskazują poziom istotności dla porównania szczepów). (B) Połączony wykres punktowy i słupkowy przedstawia średnią powierzchnię zmian miażdżycowych w przekrojach nasady aorty (Cd4-Cre+Smad7fl/+/Ldlr-/- n=6, Cd4-Cre+Smad7fl/fl/Ldlr-/- n = 9, test t Studenta t-test) (C) Odsetek obszaru wybarwionego Oil Red O w zmianach chorobowych (Cd4-Cre+Smad7fl/+/Ldlr-/- n = 4, Cd4-Cre+Smad7fl/fl/Ldlr-/- n = 6, test t Studenta t-test, ns=nieistotne statystycznie) (B-C) Kropki reprezentują poszczególne myszy, a słupki przedstawiają średnią ±SEM. (D) Reprezentatywne mikrofotografie przedstawiające barwienie Oil Red O (kolor czerwony) lipidów obojętnych w pierścieniu aorty 300 µm z zatoki aorty (powiększenie 50x), Pasek skali = 500 µm. *p ≤ 0.05, ***p ≤ 0,001. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie opracowania Gisterå i wsp.31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/59828fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Do barwienia aorty przygotowanej metodą en face można by użyć Oil Red O, jednak w niniejszym protokole zastosowano Sudan IV, który jest innym wygodnym, rozpuszczalnym w tłuszczach barwnikiem diazo. Sudan IV wyraźnie wizualizuje blaszki miażdżycowe w kolorze pomarańczowo-czerwonym poprzez barwienie lipidów, triglicerydów i lipoprotein. Usunięcie ciemnego tła na reprezentatywnych obrazach łuków aorty en face może poprawić prezentację wizualną (Rysunek 5A). Zazwyczaj wielkość zmian ma rozkład normalny w obrębie grup, co umożliwia przeprowadzenie testów statystycznych za pomocą testu t Studenta pomiędzy grupami. Wykres punktowy, który pokazuje zarówno poszczególne myszy, jak i średnią porównywaną między grupami, jest informacyjnym sposobem prezentacji wyników (Rysunek 5B-C). Ponieważ zmienność wewnątrz grup jest zazwyczaj różna w zależności od lokalizacji w drzewie naczyniowym, zazwyczaj konieczne są oddzielne obliczenia mocy statystycznej. Niepotrzebną zmienność można uniknąć dzięki biegłości w metodzie i standaryzacji protokołu. Uzyskanie wyników istotnych statystycznie jest ważne, ale zawsze należy wziąć pod uwagę również znaczenie biologiczne zaobserwowanych różnic.
<img alt="Porównanie zmian tętniczych w grupie HuBL vs BT1xHuBL; wykresy słupkowe procentowego udziału zmian." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59828/59828fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Zmiany miażdżycowe w łuku aorty i tętnicy szyjno-głowowej. (A) Reprezentatywne mikrografie en face łuków aorty z blaszkami lipidowymi barwionymi Sudanem IV (kolor pomarańczowy) u 20-tygodniowych myszy karmionych dietą typu Western przez dziesięć tygodni, przedstawione wspólnie. Pasek skali = 2 mm. Myszy ludzkie APOB100-transgeniczne Ldlr-/- (HuBL) posłużyły jako grupa kontrolna, a grupę eksperymentalną stanowiły myszy TCR-transgeniczne z limfocytami T reaktywnymi na LDL (BT1) skrzyżowane z myszami HuBL. (B) Zmiany miażdżycowe w łuku aorty (HuBL n = 10, BT1xHuBL n = 12; test t Studenta). (C) Zmiany miażdżycowe w tętnicy szyjno-głowowej (HuBL n = 8, BT1xHuBL n = 9, test t Studenta). (B-C) Kropki reprezentują poszczególne myszy, słupki przedstawiają średnią ±SEM. *p ≤ 0.05. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Gisterå i wsp.32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/59828fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rycina dodatkowa 1: Alternatywna organizacja szkiełek dla seryjnych przekrojów pierścienia aorty. Uproszczona systematyczna organizacja szkiełek dla zbioru przekrojów z pierścienia aorty. Zbiór ten umożliwia barwienie lipidów Oil Red O oraz barwienie immunohistochemiczne lub immunofluorescencyjne. Pominięto dedykowane szkiełka do barwienia kolagenu czerwienią Picrosirius. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/2019-JoVE-Figure-S1.eps">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Mysie modele miażdżycy są użytecznymi narzędziami do badania szlaków patogennych na poziomie molekularnym, ale wymagają standaryzowanej kwantyfikacji rozwoju zmian. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę określania wielkości zmiany w głównych naczyniach tętniczych, w tym w korzeniu aorty, łuku aortalnym i tętnicy ramienno-głowowej.

Kwantyfikacja miażdżycy u myszy

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic ...

Choroby układu krążenia są główną przyczyną zgonów na całym świecie. Modele mysie są przydatnymi narzędziami do badania tej choroby, a nasz protokół może być wykorzystany do ilościowego określenia miażdżycy u myszy. Za pomocą tego protokołu można zmierzyć wielkość zmiany w trzech lokalizacjach naczyniowych.Korzeń aorty, łuk aorty i tętnica ramienno-głowowa. Kwantyfikacja miażdżycy u myszy może być żmudnym zadaniem. Przedstawiliśmy szczegółowe kroki, które, mamy nadzieję, mogą przyspieszyć ten proces.Niektóre z tych kroków są trudne do opisania na piśmie. Mamy nadzieję, że ten film pomoże Ci w uzyskaniu rzetelnej analizy wielkości zmian miażdżycowych. Po zebraniu serca myszy zgodnie ze standardowymi protokołami, umieść serce na łóżku korkowym, brzuszną stroną do góry pod mikroskopem preparacyjnym i użyj igły, aby przymocować serce do korka przez wierzchołek.Trzymając podstawę serca za pomocą anatomicznych kleszczy, użyj skalpela trzymanego pod kątem 20 stopni doogonowo w płaszczyźnie strzałkowej i 20 stopni czaszki w płaszczyźnie poprzecznej, aby odciąć wierzchołkowe dwie trzecie serca. Osadź korzeń aorty i podstawę serca w związku o optymalnej temperaturze cięcia lub OCT i delikatnie ściśnij serce kleszczami, aby wypełnić korzeń aorty związkiem i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Przenieść próbkę na dno kriomoldu wypełnionego OCT z korzeniem aorty prostopadłym do dolnej powierzchni i zamrozić związek na suchym lodzie.Następnie przechowuj próbkę tkanki w torbie do zamrażania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu kriosekcji. Aby przygotować łoże pinowe do analizy en face, złóż segment folii z wosku parafinowego osiem razy, aby uzyskać płaską powierzchnię 25 na 25 mm i owiń czarną taśmę izolacyjną wokół folii, aby utworzyć ciemne tło dla aorty. Umieść etykietę z tyłu łoża do przypinania i użyj ołówka, aby zapisać numer identyfikacyjny myszy.Przenieś łuk aorty na łóżko przypinające i dodaj kroplę PBS do tkanki. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego oczyść aortę z pozostałej tkanki tłuszczowej okołoprzybyszowej i za pomocą nożyczek Vannas i kleszczyków Dumonta delikatnie usuń całą otaczającą tkankę tłuszczową bez manipulowania lub uszkadzania aorty. Następnie wprowadź nożyczki Vannas do światła aorty, aby odsłonić powierzchnię błony wewnętrznej.Rozpocznij przecinanie zewnętrznej krzywizny łuku wstępującego w kierunku dystalnym, kontynuując rozcinanie gałęzi, w tym tętnicy ramienno-głowowej i oszczędzając grzbietową część zstępującego obszaru klatki piersiowej. Aby wyświetlić powierzchnię błony wewnętrznej, rozetnij mniejszą krzywiznę i złóż aortę. Za pomocą mikrouchwytu na igły Castroviejo przymocuj otwarty łuk do łoża szpilkowego końcem drobnych szpilek na owady bez rozciągania próbki, delikatnie odginając szpilki od próbki, gdy tkanka jest utrzymywana na miejscu.Następnie przechowuj przypięty łuk zadrukowany do dołu na szalce Petriego PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W przypadku barwienia Sudan IV należy płukać próbkę przez pięć minut na szalce Petriego zawierającej 70% etanol z łukiem skierowanym w dół, a następnie przenieść próbkę do naczynia z roztworem roboczym Sudan IV na siedem minut. Pod koniec inkubacji przepłukać próbkę dwoma trzyminutowymi płukaniami w 80% etanolu w celu odbarwienia normalnej powierzchni błony wewnętrznej, a następnie wykonać końcowe płukanie w PBS przed powrotem tkanki na oryginalną szalkę Petriego.Następnie uzyskaj mikrofotografie pod mikroskopem stereoskopowym podłączonym do kamery cyfrowej pod 10-krotnym powiększeniem, uzyskując obrazy przypiętego łuku zanurzonego w PBS, używając małych metalowych ciężarków do przytrzymania łoża pinowego do dna szalki Petriego. Aby uzyskać kriosekcje osadzonego korzenia aorty, należy ustawić temperaturę kriostatu na minus 20 stopni Celsjusza, a grubość przekroju na 10 mikrometrów. Zamontuj blok OCT zawierający korzeń aorty na uchwycie próbki z tkanką komorową skierowaną na zewnątrz.W razie potrzeby zabezpiecz pozycję dodatkowym OCT. Korzeń aorty powinien być teraz ustawiony prostopadle do ostrza noża. Pobrać początkowe skrawki kontrolne zawierające tkankę mięśnia sercowego na zwykłych szkiełkach mikroskopowych, sprawdzając postęp w tkance co 200 mikrometrów pod mikroskopem świetlnym.Kiedy pojawi się pierwszy guzek aorty, przechyl próbkę w kierunku guzka punktu zero, aby wyrównać płaszczyznę przekroju z dwoma pozostałymi guzkami i policz każdy odcinek o długości 10 mikrometrów, który jest cięty od punktu zero. Rozpocznij pobieranie skrawków do analizy od 90 mikrometrów i więcej zgodnie z planowanym szkiełkiem, aż do osiągnięcia 800 mikrometrów od punktu zero. Obliczanie frakcji zmiany chorobowej całkowitej powierzchni naczynia korzenia aorty sprawia, że dane są mniej wrażliwe na ewentualne różnice kątów podczas cięcia.Ponadto ilustracją może być obliczenie obszaru pod krzywą lub wielkości uszkodzenia miażdżycy na mysz i przedstawienie danych na wykresie kropkowym w celu dalszej wizualizacji indywidualnych różnic w grupach. Akumulację lipidów w zmianach chorobowych można określić ilościowo za pomocą progów kolorystycznych czerwonych obszarów O dodatnich w całym obszarze zmiany. Prawa i lewa tętnica wieńcowa zwykle odbiegają od aorty w odległości około 250 mikrometrów od zatoki aortalnej, co często pokrywa się z najbardziej widocznymi rozmiarami zmian.Usunięcie ciemnego tła na reprezentatywnych obrazach łuków aorty en face może poprawić jakość obrazu. Wielkość zmiany jest zwykle rozłożona w grupach, co umożliwia analizę statystyczną za pomocą testu t-Studenta między grupami. Zalecamy ćwiczenie z materiałem testowym, dopóki nie zdobędziesz wystarczających umiejętności do przetwarzania próbek eksperymentalnych.Jeśli wielkość zmiany różni się w zależności od grupy, należy określić mechanizm, ponieważ analiza składu zmiany jest zwykle kolejnym krokiem, który należy przeprowadzić.

quantification-of-atherosclerosis-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Analiza ex vivo zmian w tętnicach z modeli zwierzęcych chorób sercowo-naczyniowych klasycznie opiera się na technikach histologicznych i immunohistochemicznych. Zapewniają one 2-wymiarowe pomiary w 3-wymiarowych zmianach. W artykule opisano generowanie zmian tętniczych do analizy ilościowej w 3 wymiarach z wykorzystaniem optycznej tomografii projekcyjnej.

Generowanie i 3-wymiarowa ocena ilościowa zmian w tętnicach u myszy za pomocą optycznej tomografii projekcyjnej

Opisujemy procedury ilościowego określania i charakteryzowania zmian miażdżycowych w modelach mysich, wykorzystując precyzyjne przekroje zatoki aortalnej aorty i aorty wstępującej w połączeniu z analizą histochemiczną i immunohistochemiczną.

Analiza ilościowa i charakterystyka zmian miażdżycowych w mysiej zatoce aortalnej

Ten film pokazuje dwa modele rozwoju blaszki miażdżycowej w tętnicach mysich i podkreśla różnice w przeroscie mięśniowo-brzuszkowym i miażdżycy.

Wywoływanie przerostu mięśniowo-wewnętrznego, a miażdżyca u myszy: wprowadzenie dwóch prawidłowych modeli

To badanie opisuje inwazyjną procedurę indukcji przyspieszonej miażdżycy u myszy. W porównaniu z innymi metodami wykorzystującymi urazy wywołane elektrycznością lub kriogenicznością, uraz wywołany mechanicznie naśladuje ludzki stan restenozy po terapiach rewaskularyzacyjnych i jest idealny do badania zaangażowanych mechanizmów molekularnych.

Indukcja przyspieszonej miażdżycy u myszy: model "urazu drutowego"

Opisujemy protokół indukowania miażdżycy w korzeniu aorty myszy ApoE-/- karmionych dietą aterogenną, poprzez ciągłe uwalnianie aldosteronu. Opisano również metody charakteryzowania składu płytki nazębnej.

Indukcja blaszek miażdżycowych poprzez aktywację receptorów mineralokortykoidowych u myszy z niedoborem apolipoproteiny E

Proponujemy ustandaryzowany protokół do scharakteryzowania składu komórkowego późnych zmian miażdżycowych u myszy, w tym systematyczne metody preparacji zwierząt, osadzania tkanek, cięcia, barwienia i analizy tętnic ramienno-głowowych od myszy śledzących linię komórek mięśni gładkich w atheroprone.

Analiza ilościowa składu komórkowego w zaawansowanych zmianach miażdżycowych myszy śledzących linię komórek mięśni gładkich

Ten protokół krok po kroku przeprowadza procedurę analizy obciążenia miażdżycowego u myszy. Badacze mogą użyć tego protokołu do porównania obfitości, lokalizacji i wielkości zmian miażdżycowych u różnych zwierząt.

Obrazowanie i analiza zmian całej aorty barwionych czerwienią olejową O w mysim modelu hiperlipidemii tętniaka

Tutaj prezentujemy zoptymalizowane protokoły oczyszczania tkanek do obrazowania mysiej aorty w trzech wymiarach (3D). Opisujemy najnowocześniejsze procedury barwienia immunologicznego, oczyszczania optycznego i obrazowania z zamiarem określenia anatomicznej bliskości obwodowego układu nerwowego z blaszkami miażdżycowymi i przydanką w miażdżycy.

Trójwymiarowe obrazowanie tkanek aorty w miażdżycy

Ten protokół dostarcza kompleksową metodologię analizy ilościowej blaszek miażdżycowych, aby ułatwić bardziej dogłębne badania nad mechanizmami i postępem miażdżycy.

Izolacja i analiza zmian łuku aorty i korzeni w mysim modelu miażdżycowym

γ-herpeswirusy (γ-HVs) ustanawiają dożywotnią persistencję w organizmie gospodarza. Zakażenie myszy wirusem γ-HV68 zapewnia genetycznie dostępny model in vivo do charakteryzacji cyklu życiowego i patogenezy γ-HVs. Niniejszy protokół opisuje wykrywanie i oznaczanie ilościowe zakażenia γHV68 w fazie ostrej i latentnej po zakażeniu, z wykorzystaniem metody tworzenia blaszek, metody ognisk zakaźnych oraz analizy qPCR.

Pomiar zakażenia $\gamma$HV68 u myszy

Poznaj zoptymalizowaną metodę kwantyfikacji miażdżycy u myszy, obejmującą analizę aorty wstępującej, łuku aorty i tętnicy ramienno-głowowej. Protokół obejmuje barwienie Sudanem IV i przygotowanie tkanki do obrazowania.

Kwantyfikacja miażdżycy u myszy

Przeglądaj więcej filmów