Kwantyfikacja miażdżycy u myszy

Choroby układu krążenia są główną przyczyną zgonów na całym świecie. Modele mysie są przydatnymi narzędziami do badania tej choroby, a nasz protokół może być wykorzystany do ilościowego określenia miażdżycy u myszy. Za pomocą tego protokołu można zmierzyć wielkość zmiany w trzech lokalizacjach naczyniowych.

Korzeń aorty, łuk aorty i tętnica ramienno-głowowa. Kwantyfikacja miażdżycy u myszy może być żmudnym zadaniem. Przedstawiliśmy szczegółowe kroki, które, mamy nadzieję, mogą przyspieszyć ten proces.

Niektóre z tych kroków są trudne do opisania na piśmie. Mamy nadzieję, że ten film pomoże Ci w uzyskaniu rzetelnej analizy wielkości zmian miażdżycowych. Po zebraniu serca myszy zgodnie ze standardowymi protokołami, umieść serce na łóżku korkowym, brzuszną stroną do góry pod mikroskopem preparacyjnym i użyj igły, aby przymocować serce do korka przez wierzchołek.

Trzymając podstawę serca za pomocą anatomicznych kleszczy, użyj skalpela trzymanego pod kątem 20 stopni doogonowo w płaszczyźnie strzałkowej i 20 stopni czaszki w płaszczyźnie poprzecznej, aby odciąć wierzchołkowe dwie trzecie serca. Osadź korzeń aorty i podstawę serca w związku o optymalnej temperaturze cięcia lub OCT i delikatnie ściśnij serce kleszczami, aby wypełnić korzeń aorty związkiem i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Przenieść próbkę na dno kriomoldu wypełnionego OCT z korzeniem aorty prostopadłym do dolnej powierzchni i zamrozić związek na suchym lodzie.

Następnie przechowuj próbkę tkanki w torbie do zamrażania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu kriosekcji. Aby przygotować łoże pinowe do analizy en face, złóż segment folii z wosku parafinowego osiem razy, aby uzyskać płaską powierzchnię 25 na 25 mm i owiń czarną taśmę izolacyjną wokół folii, aby utworzyć ciemne tło dla aorty. Umieść etykietę z tyłu łoża do przypinania i użyj ołówka, aby zapisać numer identyfikacyjny myszy.

Przenieś łuk aorty na łóżko przypinające i dodaj kroplę PBS do tkanki. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego oczyść aortę z pozostałej tkanki tłuszczowej okołoprzybyszowej i za pomocą nożyczek Vannas i kleszczyków Dumonta delikatnie usuń całą otaczającą tkankę tłuszczową bez manipulowania lub uszkadzania aorty. Następnie wprowadź nożyczki Vannas do światła aorty, aby odsłonić powierzchnię błony wewnętrznej.

Rozpocznij przecinanie zewnętrznej krzywizny łuku wstępującego w kierunku dystalnym, kontynuując rozcinanie gałęzi, w tym tętnicy ramienno-głowowej i oszczędzając grzbietową część zstępującego obszaru klatki piersiowej. Aby wyświetlić powierzchnię błony wewnętrznej, rozetnij mniejszą krzywiznę i złóż aortę. Za pomocą mikrouchwytu na igły Castroviejo przymocuj otwarty łuk do łoża szpilkowego końcem drobnych szpilek na owady bez rozciągania próbki, delikatnie odginając szpilki od próbki, gdy tkanka jest utrzymywana na miejscu.

Następnie przechowuj przypięty łuk zadrukowany do dołu na szalce Petriego PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W przypadku barwienia Sudan IV należy płukać próbkę przez pięć minut na szalce Petriego zawierającej 70% etanol z łukiem skierowanym w dół, a następnie przenieść próbkę do naczynia z roztworem roboczym Sudan IV na siedem minut. Pod koniec inkubacji przepłukać próbkę dwoma trzyminutowymi płukaniami w 80% etanolu w celu odbarwienia normalnej powierzchni błony wewnętrznej, a następnie wykonać końcowe płukanie w PBS przed powrotem tkanki na oryginalną szalkę Petriego.

Następnie uzyskaj mikrofotografie pod mikroskopem stereoskopowym podłączonym do kamery cyfrowej pod 10-krotnym powiększeniem, uzyskując obrazy przypiętego łuku zanurzonego w PBS, używając małych metalowych ciężarków do przytrzymania łoża pinowego do dna szalki Petriego. Aby uzyskać kriosekcje osadzonego korzenia aorty, należy ustawić temperaturę kriostatu na minus 20 stopni Celsjusza, a grubość przekroju na 10 mikrometrów. Zamontuj blok OCT zawierający korzeń aorty na uchwycie próbki z tkanką komorową skierowaną na zewnątrz.

W razie potrzeby zabezpiecz pozycję dodatkowym OCT. Korzeń aorty powinien być teraz ustawiony prostopadle do ostrza noża. Pobrać początkowe skrawki kontrolne zawierające tkankę mięśnia sercowego na zwykłych szkiełkach mikroskopowych, sprawdzając postęp w tkance co 200 mikrometrów pod mikroskopem świetlnym.

Kiedy pojawi się pierwszy guzek aorty, przechyl próbkę w kierunku guzka punktu zero, aby wyrównać płaszczyznę przekroju z dwoma pozostałymi guzkami i policz każdy odcinek o długości 10 mikrometrów, który jest cięty od punktu zero. Rozpocznij pobieranie skrawków do analizy od 90 mikrometrów i więcej zgodnie z planowanym szkiełkiem, aż do osiągnięcia 800 mikrometrów od punktu zero. Obliczanie frakcji zmiany chorobowej całkowitej powierzchni naczynia korzenia aorty sprawia, że dane są mniej wrażliwe na ewentualne różnice kątów podczas cięcia.

Ponadto ilustracją może być obliczenie obszaru pod krzywą lub wielkości uszkodzenia miażdżycy na mysz i przedstawienie danych na wykresie kropkowym w celu dalszej wizualizacji indywidualnych różnic w grupach. Akumulację lipidów w zmianach chorobowych można określić ilościowo za pomocą progów kolorystycznych czerwonych obszarów O dodatnich w całym obszarze zmiany. Prawa i lewa tętnica wieńcowa zwykle odbiegają od aorty w odległości około 250 mikrometrów od zatoki aortalnej, co często pokrywa się z najbardziej widocznymi rozmiarami zmian.

Usunięcie ciemnego tła na reprezentatywnych obrazach łuków aorty en face może poprawić jakość obrazu. Wielkość zmiany jest zwykle rozłożona w grupach, co umożliwia analizę statystyczną za pomocą testu t-Studenta między grupami. Zalecamy ćwiczenie z materiałem testowym, dopóki nie zdobędziesz wystarczających umiejętności do przetwarzania próbek eksperymentalnych.

Jeśli wielkość zmiany różni się w zależności od grupy, należy określić mechanizm, ponieważ analiza składu zmiany jest zwykle kolejnym krokiem, który należy przeprowadzić.