In Vesiculo Synteza prekursorów błony peptydowej do autonomicznego wzrostu pęcherzyków

Przedstawione tutaj są protokoły tworzenia małych jednopłytkowych pęcherzyków opartych na peptydach, zdolnych do wzrostu. Aby ułatwić produkcję pęcherzyków peptydu błonowego, pęcherzyki te są wyposażone w system transkrypcyjno-translacyjny i plazmid kodujący peptydy.

W naszym protokole stosujemy rehydratację filmu z małych kulek szklanych w celu utworzenia przedziałów reakcyjnych wykonanych z peptydów. W eksperymentach korzystamy z prostoty i solidności protokołu. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wprowadzania nawet wrażliwych próbek, takich jak użyty surowy ekstrakt komórkowy.

Kontakt z rozpuszczalnikami organicznymi znacząco wpłynie na próbkę. Aby rozpocząć tę procedurę, użyj odśrodkowego koncentratora próżni, aby stężyć roztwór ELP do 1,1 milimola. Zmieszać 200 mikrolitrów tego stężonego roztworu z 1 250 mikrolitrami mieszaniny chloroformu i metanolu dwa do jednego.

Zmieszaj roztwór, aby dokładnie wymieszać. Następnie dodaj 1,5 grama kulistych szklanych kulek do dziesięciomililitrowej kolby okrągłodennej. Dodać ELP i roztwór metanolu chloroformu do kolby okrągłodennej i delikatnie wstrząsnąć, aby wymieszać.

Podłączyć kolbę do wyparki obrotowej. Dostosuj prędkość do 150 obr./min i reguluj ciśnienie do 20 000 paskali przez około cztery minuty, aż ciecz odparuje w temperaturze pokojowej. Ważne jest, aby zachować ostrożność podczas korzystania z parownika obrotowego ze względu na możliwe opóźnienie wrzenia.

Następnie luźno owinąć folię aluminiową wokół otworu kolby z okrągłym dnem, aby zapobiec utracie szklanych kulek i umieścić kolbę w eksykatorze na co najmniej jedną godzinę, aby zapewnić odparowanie pozostałego chloroformu i metanolu. W pojedynczym eksperymencie wymieszaj 100 miligramów szklanych kulek pokrytych peptydami z 60 mikrolitrami roztworu pęczniejącego. Inkubować tę próbkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Użyj wirówki stołowej, aby szybko odwirować próbki i osadzić szklane kulki. Następnie za pomocą pipety zebrać supernatant, który zawiera pęcherzyki. Najpierw wymieszaj 100 mikrolitrów wstępnie oczyszczonego plazmidowego DNA ze 100 mikrolitrami Roti-fenolu, chloroformu lub alkoholu izoamylowego w mikroprobówce wirówkowej, aby umożliwić lepszą separację faz.

Delikatnie odwróć probówkę do sześciu razy i odwiruj przy 16 000 g i temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie dodaj 200 mikrolitrów chloroformu do górnej fazy i odwróć probówkę do sześciu razy. Odwirować próbkę w temperaturze 16 000 g i temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Następnie odpipetować supernatant do osobnej probówki i dodać 10 mikrolitrów trzymolowego octanu sodu w celu wytrącenia etanolu. Dodaj jeden mililitr zimnego etanolu w temperaturze 80 stopni Celsjusza i przechowuj próbkę w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie odwirować próbkę w temperaturze 16 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut.

Zdekantować supernatant i dodać jeden mililitr zimnego 70% etanolu w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Wirować w temperaturze 16 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Następnie usuń płyn przez pipetowanie, uważając, aby nie naruszyć osadu DNA.

Próbkę należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez około 15 minut w celu odparowania pozostałego etanolu. Następnie dodaj ultra czystą wodę do próbki, aby dostosować stężenie próbki do około 300 nanomolowców, które mierzy się przez absorpcję na 260 nanometrach. Aby przygotować reakcję transkrypcji-translacji, należy postępować zgodnie z przygotowaną surową ekstrakcją komórek i buforem reakcyjnym na lodzie.

Aby uzyskać mieszaninę reakcyjną o objętości 60 mikrolitrów, dodaj DNA osocza do 37,5 mikrolitra buforu reakcyjnego, dodaj 28,7 mikrolitra surowego ekstraktu komórkowego i napełnij ultra czystą wodą do końcowej objętości 58,8 mikrolitrów. Tuż przed rozpoczęciem reakcji dodaj 1,2 mikrolitra roztworu polimerazy T7RNA i pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać. Inkubować próbkę i pęczniejący roztwór w temperaturze 29 stopni Celsjusza przez czas trwania eksperymentu, który zwykle wynosi od czterech do ośmiu godzin.

Obrazy pęcherzyków z transmisyjnej mikroskopii elektronowej pokazują, że do tworzenia pęcherzyków można stosować różne roztwory pęczniejące, takie jak TX/TL lub nawet tylko PBS. W przypadku obu rozwiązań określenie rozmiaru jest prostym krokiem. Dynamiczne rozpraszanie światła pokazuje, że pęcherzyki przygotowane bez metody kulek szklanych mają średnicę 134 nanometrów, przy polidyspersyjności 25%W przypadku zastosowania kulek szklanych średnica wynosi 168 nanometrów, przy polidyspersyjności 21%Intensywność fluorescencji dwóch białek fluorescencyjnych, które ulegają ekspresji wewnątrz pęcherzyków ELP, jest następnie mierzona za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych.

Ważne jest, aby pamiętać, że po utworzeniu pęcherzyków zawartość pęcherzyków i roztwór zewnętrzny są takie same, dlatego antybiotyk Kanamycyna jest dodawany do roztworu zewnętrznego w celu zahamowania ekspresji białka. Jako kontrola, Kanamycyna jest również dodawana do roztworu pęczniejącego, w którym to przypadku ekspresja białka wewnątrz pęcherzyka jest zahamowana. Oznacza to, że kanamycyna nie dyfunduje przez błonę i tłumi wewnętrzną ekspresję stale, przez cały czas.

Następnie przeprowadza się test FRET, aby wykazać włączenie ELP do membrany. Po ekspresji ELP błony dodatkowe peptydy włączają się do błony, co zwiększa średnią odległość między parami FRET, a co z kolei powoduje wzrost sygnału donorowego. Przedstawiona technika może być wykorzystana do produkcji prostych pojemników reakcyjnych lub do tworzenia sztucznych komórek z błonami opartymi na peptydach.

Zawartość w środku można wybrać według potrzeb. Korzystając z tych pęcherzyków peptydowych, możemy teraz oczekiwać bardziej złożonych reakcji syntezy w ich obrębie.