Name: In Vesiculo Synteza prekursorów błony peptydowej do autonomicznego wzrostu pęcherzyków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Poznaj metodę syntezy peptydowych pęcherzyków SUV z wykorzystaniem systemu transkrypcji-translacji. Technika umożliwia włączanie wrażliwych próbek biologicznych do autonomicznie rosnących kompartmentów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie finansowe za pośrednictwem DFG TRR 235 (Emergence of Life, projekt P15), Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (umowa o grant nr 694410 AEDNA) oraz TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (projekt nr 9.05). Dziękujemy E. Falgenhauer za pomoc w przygotowaniu próbki. Dziękujemy A. Dupinowi i M. Schwarzowi-Schillingowi za pomoc przy systemie TX-TL i przydatne dyskusje. Dziękujemy N. B. Hollandowi za użyteczne dyskusje.

1. Ekspresja polipeptydów podobnych do elastyny
<ol>
	<li>Dzień 1: Przygotowanie kultury starterowej i materiałów do ekspresji peptydów
	<ol>
		<li>Przygotować i poddać autoklawu kolby hodowlane (4 x 2,5 l) i 3 l pożywki LB. Na 1 l podłoża LB dodaj 25 g proszku LB do 1 l ultraczystej wody.</li>
		<li>Przygotuj kulturę starterową ze 100 ml pożywki LB, 50 μl sterylnie przefiltrowanego (filtr 0,22 μm) roztworu chloramfenikolu (25 mg/ml w EtOH) i 50 μl sterylnie przefiltrowanego (filtr 0,22 μm) roztworu karbenicyliny (100 mg/ml w 50% EtOH i 50% ultraczystej wodzie).</li>
		<li>Dodać niewielką smugę z gotowego bulionu bakteryjnego zawierającego szczep E. coli BL21(DE3)pLysS z wektorem ekspresyjnym pET20b(+) kodującym sekwencję polipeptydową MGHGVGVP((GEGVP)4(GVGVP))4((GFGVP))3(GFGVP)3(GFGVP)4GWP (w skrócie EF) do wstępnie podgrzanej 100 ml kultury starterowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 16 godzin z prędkością 250 obr./min w inkubatorze z wytrząsaniem (szczepy i wektory E. coli są dostępne na życzenie).</li>
		<li>Kolby do sporządzania ekspresji i pożywkę LB należy wstępnie ogrzać w temperaturze 37 °C przez noc, aby były przygotowane na następny dzień.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2: Ekspresja białka
	<ol>
		<li>Dodać 750 ml pożywki LB do każdej kolby hodowlanej, 375 μl sterylnie przefiltrowanego (filtr 0,22 μm) chloramfenikolu (25 mg/ml w EtOH) i 375 μl sterylnie przefiltrowanego (filtr 0,22 μm) bulionu karbenicyliny (100 mg/ml w 50% EtOH i 50% ultraczystej wodzie).</li>
		<li>Po wymieszaniu w celu rozprowadzenia antybiotyków należy pobrać 2 ml pożywki jako próbkę referencyjną do pomiaru gęstości optycznej przy długości fali 600 nm (OD600).</li>
		<li>Dodać 7,5 ml kultury wyjściowej do kolby ekspresyjnej i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z prędkością 250 obr./min.</li>
		<li>Po tym kroku OD600 każdej kolby będzie sprawdzany co 20 minut.</li>
		<li>Gdy gęstość optyczna osiągnie około 0,8, należy obniżyć temperaturę do 16 °C i indukować ekspresję peptydu poprzez dodanie 750 μl 1 M sterylnie przefiltrowanego β-izopropylotiogalaktozydu (IPTG) w ultraczystej wodzie do każdej kolby ekspresyjnej.</li>
		<li>Inkubować kolbę ekspresyjną z indukowanymi bakteriami w temperaturze 16 °C przez 16 godzin z prędkością 250 obr./min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 3: Ekstrakcja wyrażonego polipeptydu
	<ol>
		<li>Wstępnie zważyć kolbę wirówkową, aby umożliwić określenie masy osadu komórkowego po zbiorach.</li>
		<li>Zebrać wszystkie bakterie z kolb ekspresyjnych przez odwirowanie przez 20 minut przy użyciu wstępnie schłodzonej wirówki o sile 4 000 x g i temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wylej supernatant i osusz butelki wirówki na sterylnym ręczniku papierowym.</li>
		<li>Zważyć kolby wirówkowe i obliczyć masę osadu komórkowego.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki, które są granulowane z 750 ml oryginalnej hodowli komórkowej, w 15 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,4) przez pipetowanie i odwirowywać przy 4 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Wylać sklarowany osad i osuszyć butelki wirówki na sterylnym ręczniku papierowym.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy na etapie lizy w 2 ml buforu na 1 gram osadu komórkowego przy użyciu PBS (pH 7,4) uzupełnionego lizozymem (1 mg / ml), 1 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF), 1 mM benzamidyny i 0,5 M DNazy I.</li>
		<li>Sonikować komórki do dalszej lizy na lodzie za pomocą sonikatora o mocy 8 W przez 9 minut z naprzemiennymi 10-sekundowymi krokami sonikacji i 20-sekundowej przerwy, po której następuje 9-minutowa przerwa, podczas której próbka powinna być schładzana na lodzie. Powtórz 9-minutowy krok sonikacji jeszcze raz.</li>
		<li>Dodać 2 ml 10% (w/v) polietylenoiminy (PEI) na 1 l oryginalnej hodowli komórkowej w celu wytrącenia kwasów nukleinowych.</li>
		<li>Rozprowadzić próbkę do probówek wirówkowych o pojemności 2 ml i inkubować w temperaturze 60 °C przez 10 minut, a następnie inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odwirować roztwór o stężeniu 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant zawierający ELP.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie białek poprzez odwrotne cykle temperatury:
	<ol>
		<li>Dostosuj supernatant do pH 2, aby przełączyć hydrofilową część peptydu na hydrofobową i wywołać agregację. Aby dostosować pH, stosuje się kwas fosforowy i wodorotlenek sodu. Paski pH są wystarczające do określenia poziomu pH.</li>
		<li>Aby zwiększyć wydajność oczyszczania próbki, należy podgrzać próbkę do temperatury 60 °C i dodać chlorek sodu do 2 M.</li>
		<li>Następnie odwirować próbkę o masie 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie rozpuścić osad w PBS (ale w porównaniu z poprzednim krokiem wykorzystuje się tylko połowę początkowej objętości).</li>
		<li>Dostosuj pH do 7 za pomocą kwasu fosforowego i wodorotlenku sodu. Paski pH są wystarczająco dokładne, aby określić pH.</li>
		<li>Następnie odwirować próbkę przy masie 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zebrać sklarowany nad osadem i powtórzyć kroki 1.4.1–1.4.6 łącznie do 3 razy, z wyjątkiem tego, że w ostatnim powtórzeniu kroku 1.4.4 zamiast PBS dodaje się tylko wodę.</li>
		<li>Zmierzyć stężenie peptydów za pomocą spektrometru absorpcyjnego. Stosować współczynnik ekstynkcji 5500/M/cm przy 280 nm.</li>
		<li>Dostosować stężenie ELP do 700 μM.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Produkcja pęcherzyków metodą szklanych kulek
<ol>
	<li>Zagęścić roztwór ELP do 1,1 mM za pomocą odśrodkowego koncentratora próżni.</li>
	<li>Zmieszać 200 μl stężonego roztworu ELP z 1,250 μl mieszaniny chloroformu/metanolu w stosunku 2:1, a następnie przeprowadzić wirowanie.</li>
	<li>Dodać 1,5 g kulistych szklanych kulek (o wielkości 212–300 μm) do kolby okrągłodennej o pojemności 10 ml.</li>
	<li>Dodać roztwór zawierający ELP i mieszaninę chloroformu/metanolu do kolby okrągłodennej i wymieszać przez delikatne wstrząsanie.</li>
	<li>Podłączyć kolbę do wyparki obrotowej. Ustaw prędkość na 150 obr./min i reguluj ciśnienie na -0,2 x 105 Pa (-200 mbar) przez około 4 minuty, aż ciecz odparuje w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieścić kolbę okrągłodenną w eksykatorze na co najmniej 1 godzinę, aby upewnić się, że pozostały chloroform i metanol zostały odparowane. Aby uniknąć utraty szklanych kulek, luźno przymocowaną folię aluminiową należy owinąć wokół otworu kolby o okrągłym dnie.</li>
	<li>W pojedynczym eksperymencie wymieszaj 100 mg szklanych kulek pokrytych peptydami z 60 μl roztworu pęczniejącego, takiego jak PBS. Próbkę należy inkubować w temperaturze 25 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Szybko odwirować próbkę za pomocą wirówki stołowej w celu osadzenia szklanych kulek.</li>
	<li>Za pomocą pipety zebrać sklarowany sklarat zawierający pęcherzyki.</li>
</ol>
3. Transkrypcja RNA Aptamer dBrokuły wewnątrz pęcherzyków
<ol>
	<li>Wyczyść stół laboratoryjny chusteczkami zawierającymi roztwór do odkażania RNazy, aby stworzyć środowisko pracy wolne od RNaz.</li>
	<li>Wymieszać ssDNA (5 μM) składającego się z promotora T7 i sekwencji dBrokułów (GAGACGGGGGGGTCCATCTGAGACGGTCGGGTGTCCAGATATTCGTATCTGTCGAGAGTGTGGGCTCAGATGTGGGCTCAGATGTCGAGTAGAGTGTGGGCTC), a także nici niekodującej (5 μM) w wodzie wolnej od nukleaz uzupełnionej buforem reakcyjnym RNAPol [40 mM Tris-HCl (pH = 7,9), 6 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT) i 2 mM spermidyna], aby przygotować matrycę DNA do reakcji transkrypcji.</li>
	<li>Inkubować roztwór w temperaturze 90 °C przez 5 minut, a następnie powoli zmniejszać temperaturę do 20 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Przygotować roztwór 1 mM (5Z)-5-(3,5-difluoro-4-hydroksybenzylideno)-2,3-dimetylo-3,5-dihydro-4H-imidazol-4-onu (DFHBI), rozpuszczając 1,26 mg DFHBI w 5 ml DMSO.</li>
	<li>Przygotować reakcję transkrypcji przez zmieszanie buforu reakcyjnego RNAPol [40 mM Tris-HCl (pH = 7,9), 6 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT) i 2 mM spermidyna] ze 125 mM KCl, 15 mM MgCl2, 4 mM rNTP, 10 μM DFHBI, 200 nM matryca DNA, 0,5 U/μL mysi inhibitor RNazy, i woda.</li>
	<li>Tuż przed rozpoczęciem reakcji dodać 4 U/μL polimerazy T7.</li>
	<li>Użyć tej mieszaniny reakcyjnej jako roztworu pęczniejącego w kroku 2.7 i inkubować w temperaturze 37 °C przez czas trwania doświadczenia, który zwykle wynosi 1 godzinę.</li>
</ol>
4. Reakcja transkrypcji-tłumaczenia (TX-TL)
UWAGA: Do reakcji transkrypcji-translacji wymagany jest surowy ekstrakt komórkowy, a także bufor reakcyjny i DNA. Surowy ekstrakt komórkowy jest przygotowywany zgodnie z opisem w Sun et al.18. Do reakcji TX-TL należy użyć: 33% (v/v) surowego ekstraktu E. coli, 42% (v/v) buforu reakcyjnego i 25% (v/v) oczyszczonego fenolowo-chloroformowego DNA wraz z dodatkami. Końcowe stężenia to około 9 mg/ml białka, 50 mM HEPES (pH = 8), 1,5 mM ATP, 1,5 mM GTP, 0,9 mM CTP, 0,9 mM UTP, 0,2 mg/ml tRNA, 26 mM koenzym A, 0,33 mM NAD, 0,75 mM cAMP, 68 mM kwas folinowy, 1 mM spermidyna, 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000, 13,3 mM maltozy, 1 U polimerazy RNA T7 i 50 nM plazmidowego DNA w ultraczystej wodzie.
<ol>
	<li>Oczyszczanie fenolowo-chloroformowe matrycy DNA
	<ol>
		<li>Przygotuj sześć nocnych kultur z 5 ml pożywki LB i 5 μl sterylnie przefiltrowanego (filtr 0,22 μm) roztworu karbenicyliny (100 mg/ml w 50% EtOH i 50% ultraczystej wodzie).</li>
		<li>Dodać małą smugę z gotowego bulionu bakteryjnego zawierającego DH5α E. coli z wektorem ekspresyjnym pET20b(+) do każdej wstępnie podgrzanej 5 ml kultury przez noc i inkubować w temperaturze 37 °C przez 16 godzin z prędkością 250 obr./min. W zależności od tego, który peptyd (EF) lub białko (YPet lub mVenus) ma ulec ekspresji, stosuje się specyficzny plazmid kodujący.</li>
		<li>Wyodrębnij plazmid za pomocą mini-zestawu przygotowawczego, zgodnie z opisem w instrukcji obsługi lub postępując zgodnie z protokołem dostarczonym przez Zhang et al.24.</li>
		<li>Przygotuj 100 μl wstępnie oczyszczonego plazmidowego DNA (stężenie może wahać się od 200–600 ng/μl) i wymieszaj ze 100 μl roti-fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (pH = 7,5–8,0) w probówce mikrowirówkowej, aby umożliwić lepszą separację faz.</li>
		<li>Delikatnie odwróć probówkę do 6x i odwiruj przez 5 minut przy 16 000 x g przy wilgotności względnej.</li>
		<li>Dodać 200 μl chloroformu do górnej fazy probówki i odwrócić probówkę do 6x.</li>
		<li>Odwirować próbkę o masie 16 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odpipetować supernatant do oddzielnej probówki i dodać 10 μl 3 M octanu sodu w celu wytrącenia etanolu.</li>
		<li>Dodać 1 ml zimnego etanolu o temperaturze -80 °C i przechowywać próbkę w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Odwirować próbkę o masie 16 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zdekantować supernatant i dodać 1 ml zimnego 70% (v/v) etanolu o temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Wirować przy 16 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Usunąć płyn przez pipetowanie. Uważaj, aby nie naruszyć osadu DNA.</li>
		<li>Przechowywać próbkę w temperaturze pokojowej przez około 15 minut w celu odparowania pozostałego etanolu.</li>
		<li>Dodać ultraczystą wodę do próbki, aby dostosować stężenie próbki do około 300 nM, które mierzy się przez absorpcję przy 260 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie reakcji TX-TL
	<ol>
		<li>Przygotowany surowy ekstrakt komórkowy i bufor reakcyjny rozmrozić na lodzie.</li>
		<li>W przypadku mieszaniny reakcyjnej o objętości 60 μl należy dodać plazmidowe DNA (oczyszczone z fenolu i chloroformu) do 37,5 μl buforu reakcyjnego [50 mM HEPES (pH = 8), 1,5 mM ATP, 1,5 mM GTP, 0,9 mM CTP, 0,9 mM UTP, 0,2 mg/ml tRNA, 26 mM koenzymu A, 0,33 mM NAD, 0,75 mM cAMP, 68 mM kwasu folinowego, 1 mM spermidyny, 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000 i 13,3 mM maltozy), a następnie dodano 28,7 μl surowego ekstraktu komórkowego. Napełnij do końcowej objętości ultraczystą wodą do 58,8 μl.</li>
		<li>Tuż przed rozpoczęciem reakcji dodać 1,2 μl roztworu polimerazy RNA T7 i wymieszać próbkę, pipetując w górę iw dół.</li>
		<li>Użyć tej mieszaniny reakcyjnej jako roztworu pęczniejącego w kroku 2.7 i inkubować w temperaturze 29 °C przez czas trwania eksperymentu, który zwykle wynosi 4–8 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Koniugacja elastynopodobnych polipeptydów z fluoroforami za pomocą katalizowanej miedzią cykloaddycji azydowo-alkinowej Huisgen
<ol>
	<li>Przygotować 20 mM roztwór łącznika azydku NHS (ester N-hydroksysukcynimidu kwasu γ azydomasłowego) o stężeniu 20 mM w DMSO.</li>
	<li>Zmieszać 250 μl roztworu ELP (600 μM) z PBS (8 g/l NaCl, 0,2 g/l KCl, 1,42 g/l Na2HPO4, 0,27 g/L K2HPO4, pH = 7,2) i azydkiem NHS (1,2 mM) i inkubować przez 12 godzin w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Załadować próbkę do kasety dializacyjnej o natężeniu 10 kDa i przechowywać ją w temperaturze 4 °C przez 12 godzin w 1 litrze ultraczystej wody w celu usunięcia soli i pozostałości azydku NHS.</li>
	<li>Zmieszać aktywowany ELP (500 μM) z barwnikiem sprzężonym z alkinami (500 μM), Cy5-alkinem lub Cy3-alkinem.</li>
	<li>Zmieszać tę próbkę z 1 mM TBTA (tris(benzylotriazolylometylometylo)aminy), 10 mM TCEP (chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)-fosfiny) i 10 mMCuSO4 i inkubować w temperaturze 4 °C przez 12 godzin.</li>
	<li>Załadować próbkę do kasety dializacyjnej o natężeniu 10 kDa i przechowywać ją w temperaturze 4 °C przez 12 godzin w 1 litrze ultraczystej wody, w celu usunięcia soli i pozostałości barwników sprzężonych z alkinami.</li>
	<li>Te zmodyfikowane barwnikiem ELP są stosowane w mieszaninie 1:1 ELP znakowanych Cy3 i ELP znakowanych Cy5 analogicznie do peptydów w części drugiej.</li>
</ol>

<ol><li>Chen, I. A., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinetic+study+of+the+growth+of+fatty+acid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles.</a> Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).</li>
<li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).</li>
<li>Hardy, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-reproducing+catalyst+drives+repeated+phospholipid+synthesis+and+membrane+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).</li>
<li>Scott, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Free+Phospholipid+Biosynthesis+by+Gene-Encoded+Enzymes+Reconstituted+in+Liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes.</a> PLoS ONE. 11 (10), e0163058(2016).</li>
<li>Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+macromolecules+by+lipid+vesicles+under+simulated+prebiotic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Evolution%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions.</a> Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).</li>
<li>Adamala, K., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonenzymatic+Template-Directed+RNA+Synthesis+Inside+Model+Protocells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells.</a> Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).</li>
<li>Zhu, T. F., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+growth+and+division+of+model+protocell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Coupled growth and division of model protocell membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).</li>
<li>Kurihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-reproduction+of+supramolecular+giant+vesicles+combined+with+the+amplification+of+encapsulated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA.</a> Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).</li>
<li>Chu, H. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+an+elastin-like+polypeptide+%28ELP%29+in+a+cell-free+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme+and+Microbial+Technology%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system.</a> Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).</li>
<li>Martino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Expression%2C+Aggregation%2C+and+Triggered+Release+from+Polymersomes+as+Artificial+Cell-like+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).</li>
<li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+synthetic+cells+using+peptide-based+reaction+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments.</a> Nature Communications. 9 (1), 3862(2018).</li>
<li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).</li>
<li>McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product+purification+by+reversible+phase+transition+following+Escherichia+coli+expression+of+genes+encoding+up+to+251+repeats+of+the+elastomeric+pentapeptide+GVGVP%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP.</a> Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).</li>
<li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+chemistry+of+biological+free+energy+transduction+as+demonstrated+by+elastic+protein-based+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).</li>
<li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin%3A+a+representative+ideal+protein+elastomer%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Elastin: a representative ideal protein elastomer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).</li>
<li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li>
<li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+synthesis+of+protein-based+polymers+with+precisely+specified+molecular+weight+and+sequence+by+recursive+directional+ligation%3A+examples+from+the+elastin-like+polypeptide+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system.</a> Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).</li>
<li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+2.3+mg%2Fml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li>
<li>Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., Mückl, A., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+communication+between+bacteria+and+cell-free+gene+expression+systems+within+linear+chains+of+emulsion+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets.</a> Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).</li>
<li>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+All+E.+coli+TX-TL+Toolbox+2.0%3A+A+Platform+for+Cell-Free+Synthetic+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).</li>
<li>Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+and+polymersomes%3A+a+comparative+review+towards+cell+mimicking%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li>
<li>Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broccoli%3A+Rapid+Selection+of+an+RNA+Mimic+of+Green+Fluorescent+Protein+by+Fluorescence-Based+Selection+and+Directed+Evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).</li>
<li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purifying+Plasmid+DNA+from+Bacterial+Colonies+Using+the+Qiagen+Miniprep+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247(2007).</li>
<li>Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+light+scattering%3A+a+practical+guide+and+applications+in+biomedical+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Uwodnienie filmu jest powszechną procedurą tworzenia małych pęcherzyków jednowarstwowych. Głównym źródłem niepowodzenia jest niewłaściwe obchodzenie się z materiałami użytymi w zabiegu.

Początkowo ELP są wytwarzane przez komórki E. coli . Wydajność po oczyszczeniu ELP może się znacznie różnić w zależności od tego, jak starannie protokół jest przeprowadzany podczas jego kluczowych etapów. Są to etap odwróconych cykli t...

Do tworzenia syntetycznych żywych systemów komórkowych zazwyczaj podchodzi się z dwóch różnych kierunków. W metodzie odgórnej genom bakterii jest redukowany do jej podstawowych składników, co ostatecznie prowadzi do minimalnej komórki. W podejściu oddolnym sztuczne komórki są składane de novo z komponentów molekularnych lub podsystemów komórkowych, które muszą być funkcjonalnie zintegrowane w spójny system podobny do komórki.
W podejściu de novo, podział niezbędnych składników biochemicznych jest zwykle osiągany za pomocą membran wykonanych z fosfolipidów lub kwasów tłuszczowych1,2,3,4. Dzieje się tak dlatego, że "nowoczesne" błony komórkowe składają się głównie z fosfolipidów, podczas gdy kwasy tłuszczowe są uważane za prawdopodobnych kandydatów do prebiotycznych obudów błonowych5,6. W celu utworzenia nowych błon lub ułatwienia wzrostu błony, amfifilowe bloki budulcowe muszą być dostarczone z zewnątrz7 lub najlepiej poprzez produkcję w przedziale błoniastym przy użyciu odpowiednich procesów anabolicznych4,8.
Podczas gdy synteza lipidów jest stosunkowo złożonym procesem metabolicznym, peptydy mogą być wytwarzane dość łatwo za pomocą bezkomórkowych reakcji ekspresji genów9,10. W związku z tym błony peptydowe utworzone przez peptydy amfifilowe stanowią interesującą alternatywę dla błon lipidowych jako obudowy dla sztucznych mimików komórek, które są w stanie rosnąć11.
Amfifilowe kopolimery di-blokowe (ELP) podobne do elastyny są atrakcyjną klasą peptydów, które mogą służyć jako budulec dla takich membran12. Podstawowym motywem sekwencji aminokwasów ELP jest (GaGVP)n, gdzie "a" może być dowolnym aminokwasem z wyjątkiem proliny, a "n" to liczba powtórzeń motywu13,14,15,16,17. ELP zostały stworzone z bloku hydrofobowego zawierającego głównie fora fenyloalaniny oraz bloku hydrofilowego składającego się głównie z kwasu glutaminowego11. W zależności od parametrów a i roztworu, takich jak pH i stężenie soli, ELP wykazują tzw. odwrotne przejście temperatury w temperaturze Tt, gdzie peptydy przechodzą w pełni odwracalne przejście fazowe ze stanu hydrofilowego do hydrofobowego. Syntezę peptydów można łatwo zaimplementować wewnątrz pęcherzyków za pomocą ekstraktu z komórek bakteryjnych "TX-TL"11,18,19,20,21, który dostarcza wszystkie niezbędne składniki do sprzężonych reakcji transkrypcji i translacji.
System TX-TL został zamknięty razem, z matrycą DNA kodującą ELP w pęcherzykach ELP, wykorzystując odwodnienie-rehydratację z kulek szklanych jako solidnego wsparcia. Powstawanie pęcherzyków następuje poprzez ponowne uwodnienie wysuszonych peptydów z powierzchni kulki11. Inne metody22 do tworzenia pęcherzyków mogą być użyte, które potencjalnie wykazują niższą polidyspersyjność i większe rozmiary pęcherzyków (np. elektroformacja, transfer fazowy emulsji lub metody oparte na mikrofluidyce). Aby przetestować wykonalność metody enkapsulacji, alternatywnie można zastosować transkrypcję aptamera fluorogenicznego dBroccoli2311, co jest mniej skomplikowane niż ekspresja genów w systemie TX-TL.
Ze względu na ekspresję elementów budulcowych błony w pęcherzykach i ich późniejsze włączenie do błony, pęcherzyki zaczynają rosnąć11. Włączenie ELP w błonę można wykazać za pomocą testu FRET. W tym celu ELP użyte do utworzenia początkowej populacji pęcherzyków są sprzężone z barwnikami fluorescencyjnymi w równych proporcjach, tworząc parę FRET. Po ekspresji nieznakowanych ELP w pęcherzykach i ich włączeniu do błony, znakowane ELP w membranie są rozcieńczane, w wyniku czego sygnał FRET maleje11. Jako wszechstronną i powszechną metodę koniugacji stosuje się katalizowaną miedzią cykloaddycję azydkowo-alkinową. Przy użyciu liganda stabilizującego, takiego jak tris(benzyltriazolylmethyl)-amina, reakcja może być prowadzona w roztworze wodnym o fizjologicznym pH bez hydrolizy reagentów11, co jest odpowiednie dla reakcji koniugacji z udziałem peptydów.
Poniższy protokół przedstawia szczegółowy opis przygotowania do hodowli peptydosomów na bazie ELP. Opisano ekspresję peptydów i tworzenie pęcherzyków metodą kulek szklanych. Ponadto opisano sposób realizacji transkrypcji fluorogennego aptameru dBrokułów oraz reakcji transkrypcja-translacja ekspresji białek wewnątrz pęcherzyków ELP. Na koniec podano procedurę koniugacji ELP z fluoroforami, którą można wykorzystać do udowodnienia wzrostu pęcherzyków za pomocą testu FRET11.

<table><tbody><tr><td>2xYT</td><td>MP biomedicals</td><td>3012-032</td><td></td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>5PRIME Phase Lock GelTM rurka</td><td>VWR</td><td>733-2478</td><td></td></tr><tr><td>sprzężona z alkinami Cy3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>777331</td><td></td></tr><tr><td>sprzężona alkina Cy5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>777358</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidin</td><td>Carl Roth</td><td>CN38.2</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta 2 E. coli szczep</td><td>Novagen</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>Bradford BSA Zestaw do oznaczania białek</td><td>Bio-rad</td><td>500-0201</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501</td><td></td></tr><tr><td>Karbenicylina</td><td>Carl Roth</td><td>6344.2</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Carl Roth</td><td>3886.3</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Carl Roth</td><td>4432.1</td><td></td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>USB</td><td>14121</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Carl Roth</td><td>P024.1</td><td></td></tr><tr><td>DFHBI</td><td>Lucerna Technologies</td><td>410</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Carl Roth</td><td>A994.1</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Carl Roth</td><td>9065.2</td><td></td></tr><tr><td>Kwas folinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki szklane, płukane kwasem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1277</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>USB</td><td>16800</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6147</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (&beta;-tiogalaktozyd izopropylu )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth</td><td>P017.1</td><td></td></tr><tr><td>K-glutaminian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1149</td><td></td></tr><tr><td>LB Rosół</td><td>Carl Roth</td><td>X968.2</td><td></td></tr><tr><td>Lizozym</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl Roth</td><td>82,2</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.3</td><td></td></tr><tr><td>Mg-glutaminian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny do chromatografii Micro Bio-Spin</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>NHS-azydek łącznik (ester oksysukcynimidu kwasu azydomasłowego)</td><td>Baseclick</td><td>BCL-033-5</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Carl Roth</td><td>263.2</td><td></td></tr><tr><td>Paski pH</td><td>Carl Roth</td><td>549.2</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometylosulfonylu</td><td>Carl Roth</td><td>6367.2</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>VWR</td><td>76180-684</td><td></td></tr><tr><td>Kwas</td> <td>fosforowySigma-Aldrich</td><td>W290017</td><td></td></tr><tr><td>Polietylenoimina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>Dwuzasadowy roztwór fosforanu potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8584</td><td></td></tr><tr><td>Jednozasadowy roztwór fosforanu potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8709</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Bufor reakcyjny RNAPol</td><td>NEB</td><td>B9012</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy mysi</td><td>NEB</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki RNaseZap</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9788</td><td></td></tr><tr><td>rNTP</td><td>NEB</td><td>N0466S</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol roti-fenolowy/chloroformowy/izoamylowy</td><td>Carlroth</td><td>A156.1</td><td></td></tr><tr><td>RTS Amino Acid Sampler</td><td>5 Prime</td><td>2401530</td><td></td></tr><tr><td>Kasety dializacyjne Slide-A-Lyzer, 10k MWCO (zestaw)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>66382</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Carl Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Carl Roth</td><td>8655.1</td><td></td></tr><tr><td>Spermidyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>Sterylnie filtrowany (0,22 &mikro; Filtr m)</td> <td>Carl Roth</td><td>XH76.1</td><td></td></tr><tr><td>T7 polimeraza</td><td>NEB</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>TBTA (tris(benzylotriazolylo)amina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>TCEP (chlorowodorek tris(2-karboksetylo)-fosfiny)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fischer</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>tRNA (z E. coli)</td><td>Roche Applied Skrętka</td><td>komputerowa SME MRE600</td><td></td></tr><tr><td></td><td>USB</td><td>23160</td><td></td></tr></tbody></table>

in vesiculo synteza prekursorów błony peptydowej do autonomicznego wzrostu pęcherzyków

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Podział reakcji biochemicznych na kompartmenty jest centralnym aspektem komórek syntetycznych. W tym celu przedziały reakcyjne oparte na peptydach służą jako atrakcyjna alternatywa dla liposomów lub pęcherzyków na bazie kwasów tłuszczowych. Na zewnątrz lub wewnątrz pęcherzyków peptydy mogą ulegać łatwej ekspresji i upraszczać syntezę prekursorów błonowych. Poniżej przedstawiono protokół tworzenia pęcherzyków o średnicy ~200 nm w oparciu o amfifilowe polipeptydy podobne do elastyny (ELP) wykorzystujące odwodnienie-uwodnienie z kulek szklanych. Przedstawiono również protokoły ekspresji i oczyszczania bakteryjnego ELP poprzez odwrócone cykle temperatury, a także ich kowalencyjną funkcjonalizację barwnikami fluorescencyjnymi. Ponadto w niniejszym raporcie opisano protokół umożliwiający transkrypcję aptameru RNA dBrokuły wewnątrz pęcherzyków ELP jako mniej złożony przykład reakcji biochemicznej. Na koniec dostarczany jest protokół, który umożliwia ekspresję w pęcherzykach białek fluorescencyjnych i peptydu błonowego, podczas gdy synteza tego ostatniego powoduje wzrost pęcherzyków.

Produkcja pęcherzyków 
Rycina 1 przedstawia obrazy z transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) pęcherzyków przygotowanych z użyciem różnych roztworów pęczniejących oraz metody kulek szklanych (patrz również Vogele et al.11). Dla próbki na Rycini 1A jako roztwór pęczniejący zastosowano wyłącznie PBS, aby potwierdzić tworzenie się pęcherzyków i określić ich rozmiar. Pęcherzyki utworzyły się również w przypadku zastoso...

Przedstawione tutaj są protokoły tworzenia małych jednopłytkowych pęcherzyków opartych na peptydach, zdolnych do wzrostu. Aby ułatwić produkcję pęcherzyków peptydu błonowego, pęcherzyki te są wyposażone w system transkrypcyjno-translacyjny i plazmid kodujący peptydy.

In Vesiculo Synteza prekursorów błony peptydowej do autonomicznego wzrostu pęcherzyków

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

W naszym protokole stosujemy rehydratację filmu z małych kulek szklanych w celu utworzenia przedziałów reakcyjnych wykonanych z peptydów. W eksperymentach korzystamy z prostoty i solidności protokołu. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wprowadzania nawet wrażliwych próbek, takich jak użyty surowy ekstrakt komórkowy.Kontakt z rozpuszczalnikami organicznymi znacząco wpłynie na próbkę. Aby rozpocząć tę procedurę, użyj odśrodkowego koncentratora próżni, aby stężyć roztwór ELP do 1,1 milimola. Zmieszać 200 mikrolitrów tego stężonego roztworu z 1 250 mikrolitrami mieszaniny chloroformu i metanolu dwa do jednego.Zmieszaj roztwór, aby dokładnie wymieszać. Następnie dodaj 1,5 grama kulistych szklanych kulek do dziesięciomililitrowej kolby okrągłodennej. Dodać ELP i roztwór metanolu chloroformu do kolby okrągłodennej i delikatnie wstrząsnąć, aby wymieszać.Podłączyć kolbę do wyparki obrotowej. Dostosuj prędkość do 150 obr./min i reguluj ciśnienie do 20 000 paskali przez około cztery minuty, aż ciecz odparuje w temperaturze pokojowej. Ważne jest, aby zachować ostrożność podczas korzystania z parownika obrotowego ze względu na możliwe opóźnienie wrzenia.Następnie luźno owinąć folię aluminiową wokół otworu kolby z okrągłym dnem, aby zapobiec utracie szklanych kulek i umieścić kolbę w eksykatorze na co najmniej jedną godzinę, aby zapewnić odparowanie pozostałego chloroformu i metanolu. W pojedynczym eksperymencie wymieszaj 100 miligramów szklanych kulek pokrytych peptydami z 60 mikrolitrami roztworu pęczniejącego. Inkubować tę próbkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez pięć minut.Użyj wirówki stołowej, aby szybko odwirować próbki i osadzić szklane kulki. Następnie za pomocą pipety zebrać supernatant, który zawiera pęcherzyki. Najpierw wymieszaj 100 mikrolitrów wstępnie oczyszczonego plazmidowego DNA ze 100 mikrolitrami Roti-fenolu, chloroformu lub alkoholu izoamylowego w mikroprobówce wirówkowej, aby umożliwić lepszą separację faz.Delikatnie odwróć probówkę do sześciu razy i odwiruj przy 16 000 g i temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie dodaj 200 mikrolitrów chloroformu do górnej fazy i odwróć probówkę do sześciu razy. Odwirować próbkę w temperaturze 16 000 g i temperaturze pokojowej przez pięć minut.Następnie odpipetować supernatant do osobnej probówki i dodać 10 mikrolitrów trzymolowego octanu sodu w celu wytrącenia etanolu. Dodaj jeden mililitr zimnego etanolu w temperaturze 80 stopni Celsjusza i przechowuj próbkę w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie odwirować próbkę w temperaturze 16 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut.Zdekantować supernatant i dodać jeden mililitr zimnego 70% etanolu w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Wirować w temperaturze 16 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Następnie usuń płyn przez pipetowanie, uważając, aby nie naruszyć osadu DNA.Próbkę należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez około 15 minut w celu odparowania pozostałego etanolu. Następnie dodaj ultra czystą wodę do próbki, aby dostosować stężenie próbki do około 300 nanomolowców, które mierzy się przez absorpcję na 260 nanometrach. Aby przygotować reakcję transkrypcji-translacji, należy postępować zgodnie z przygotowaną surową ekstrakcją komórek i buforem reakcyjnym na lodzie.Aby uzyskać mieszaninę reakcyjną o objętości 60 mikrolitrów, dodaj DNA osocza do 37,5 mikrolitra buforu reakcyjnego, dodaj 28,7 mikrolitra surowego ekstraktu komórkowego i napełnij ultra czystą wodą do końcowej objętości 58,8 mikrolitrów. Tuż przed rozpoczęciem reakcji dodaj 1,2 mikrolitra roztworu polimerazy T7RNA i pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać. Inkubować próbkę i pęczniejący roztwór w temperaturze 29 stopni Celsjusza przez czas trwania eksperymentu, który zwykle wynosi od czterech do ośmiu godzin.Obrazy pęcherzyków z transmisyjnej mikroskopii elektronowej pokazują, że do tworzenia pęcherzyków można stosować różne roztwory pęczniejące, takie jak TX/TL lub nawet tylko PBS. W przypadku obu rozwiązań określenie rozmiaru jest prostym krokiem. Dynamiczne rozpraszanie światła pokazuje, że pęcherzyki przygotowane bez metody kulek szklanych mają średnicę 134 nanometrów, przy polidyspersyjności 25%W przypadku zastosowania kulek szklanych średnica wynosi 168 nanometrów, przy polidyspersyjności 21%Intensywność fluorescencji dwóch białek fluorescencyjnych, które ulegają ekspresji wewnątrz pęcherzyków ELP, jest następnie mierzona za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych.Ważne jest, aby pamiętać, że po utworzeniu pęcherzyków zawartość pęcherzyków i roztwór zewnętrzny są takie same, dlatego antybiotyk Kanamycyna jest dodawany do roztworu zewnętrznego w celu zahamowania ekspresji białka. Jako kontrola, Kanamycyna jest również dodawana do roztworu pęczniejącego, w którym to przypadku ekspresja białka wewnątrz pęcherzyka jest zahamowana. Oznacza to, że kanamycyna nie dyfunduje przez błonę i tłumi wewnętrzną ekspresję stale, przez cały czas.Następnie przeprowadza się test FRET, aby wykazać włączenie ELP do membrany. Po ekspresji ELP błony dodatkowe peptydy włączają się do błony, co zwiększa średnią odległość między parami FRET, a co z kolei powoduje wzrost sygnału donorowego. Przedstawiona technika może być wykorzystana do produkcji prostych pojemników reakcyjnych lub do tworzenia sztucznych komórek z błonami opartymi na peptydach.Zawartość w środku można wybrać według potrzeb. Korzystając z tych pęcherzyków peptydowych, możemy teraz oczekiwać bardziej złożonych reakcji syntezy w ich obrębie.

in-vesiculo-synthesis-peptide-membrane-precursors-for-autonomous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje metodę ilościowego pomiaru translokacji peptydów do dużych jednowarstwowych pęcherzyków lipidowych. Metoda ta dostarcza również informacji o szybkości translokacji przez błonę i może być wykorzystana do identyfikacji peptydów, które w sposób wydajny i spontaniczny przenikają przez dwuwarstwy lipidowe.

Pomiar translokacji peptydów do dużych pęcherzyków jednowarstwowych

Prezentujemy technikę bezdotykowej mikromanipulacji pęcherzykami, wykorzystując zlokalizowane gradienty jonów wapnia. Mikroiniekcja roztworu jonów wapnia w pobliżu gigantycznego pęcherzyka lipidowego jest wykorzystywana do przebudowy błony lipidowej, w wyniku czego powstają wypukłości rurki błonowe.

Przebudowa błony gigantycznych pęcherzyków w odpowiedzi na zlokalizowane gradienty jonów wapnia

Przedstawiamy protokół do odtwarzania białek błonowych i enkapsulacji enzymów oraz innych rozpuszczalnych w wodzie składników w pęcherzykach lipidowych o rozmiarach sub-mikrometrowych i mikrometrowych.

Budowa nierównowagowych sieci metabolicznych w pęcherzykach o rozmiarach nano- i mikrometrowych

Zsyntetyzowaliśmy złote nanogwiazdy o kształcie gwiazdy, wykorzystując metodę wzrostu wspomaganego srebrnymi zarodkami. Średnica nanogwiazd wynosi od 200 do 300 nm, a liczba ramion waha się od 7 do 10. Nanocząstki wykazują szeroki mod powierzchniowego rezonansu plazmonowego z maksimum w bliskiej podczerwieni.

Synteza nanogwiazd złota metodą wzrostu sterowanego srebrnymi nasionami

W niniejszej pracy opisujemy zastosowanie samoorganizującego się rusztowania trójwymiarowego do hodowli ludzkich komórek progenitorowych neuronów. Przedstawiamy protokół uwalniania komórek z rusztowań w celu ich późniejszej analizy, np. za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół ten może zostać dostosowany do innych typów komórek w celu przeprowadzenia szczegółowych badań mechanistycznych.

Hodowla ludzkich komórek progenitorowych neuronów w trójwymiarowym samoorganizującym się hydrożelu peptydowym

Poniższy protokół dostarcza techniki kapsułkowania komórek β trzustki w hydrożelach peptydowych PEG powstałych w wyniku reakcji fotoklikania tiolowo-enowego. Ta platforma materiałowa nie tylko oferuje cytokompatybilne mikrośrodowisko do enkapsulacji komórek, ale także umożliwia kontrolowane przez użytkownika szybkie odzyskiwanie struktur komórkowych utworzonych w hydrożelach.

Wytwarzanie i odzyskiwanie sferoid β-komórkowych z hydrożeli peptydowych PEG o skokowym wzroście

Mikroprzepływowe natryskiwanie dwuwarstwy lipidowej na granicy kropelek zapewnia niezawodny sposób generowania pęcherzyków z kontrolą nad asymetrią błony, włączeniem białek transbłonowych i enkapsulacją materiału. Technika ta może być stosowana do badania różnych systemów biologicznych, w których pożądane są biomolekuły podzielone na przedziały.

Wytwarzanie dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych za pomocą natryskiwania mikroprzepływowego

Opisujemy tutaj ulepszoną metodę transferu energii rezonansu luminescencji (LRET), w której wprowadzamy miejsce rozszczepienia proteazy między miejscem fluoroforu dawcy i akceptora. Modyfikacja ta pozwala na uzyskanie specyficznych sygnałów LRET pochodzących z interesujących nas białek błonowych, co pozwala na badanie białek błonowych bez oczyszczania białek.

Transfer energii rezonansu luminescencyjnego w celu zbadania zmian konformacyjnych w białkach błonowych ulegających ekspresji w komórkach ssaków

Elektroprzędzone nanowłókna mają wysoki stosunek powierzchni do masy, doskonałą integralność mechaniczną oraz wspierają wzrost i proliferację komórek. Te nanowłókna mają szeroki zakres zastosowań biomedycznych. Tutaj wytwarzamy nanowłókna keratynowe/PCL przy użyciu techniki elektroprzędzenia i charakteryzujemy włókna pod kątem możliwych zastosowań w inżynierii tkankowej.

Synteza nanowłókien na bazie keratyny w inżynierii biomedycznej

Samoorganizujące się kompleksy polielektrolitowe (PEC) wykonane z heparyny i protaminy zostały osadzone na kulkach alginianowych, aby uwięzić i regulować uwalnianie osteogennych czynników wzrostu. Ta strategia dostarczania umożliwia 20-krotne zmniejszenie dawki BMP-2 w zastosowaniach związanych z usztywnieniem kręgosłupa. Niniejszy artykuł ilustruje korzyści płynące z zastosowania PEC i jego wytwarzanie.

Kompleks polielektrolitowy do dostarczania osteogennego czynnika wzrostu w domenie wiążącej heparynę

Poznaj metodę syntezy peptydowych pęcherzyków SUV z wykorzystaniem systemu transkrypcji-translacji. Technika umożliwia włączanie wrażliwych próbek biologicznych do autonomicznie rosnących kompartmentów.

In Vesiculo Synteza prekursorów błony peptydowej do autonomicznego wzrostu pęcherzyków

Przeglądaj więcej filmów