In Vesiculo Synteza prekursorów błony peptydowej do autonomicznego wzrostu pęcherzyków
28 czerwca 2019
Przedstawione tutaj są protokoły tworzenia małych jednopłytkowych pęcherzyków opartych na peptydach, zdolnych do wzrostu. Aby ułatwić produkcję pęcherzyków peptydu błonowego, pęcherzyki te są wyposażone w system transkrypcyjno-translacyjny i plazmid kodujący peptydy.
W naszym protokole stosujemy rehydratację filmu z małych kulek szklanych w celu utworzenia przedziałów reakcyjnych wykonanych z peptydów. W eksperymentach korzystamy z prostoty i solidności protokołu. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wprowadzania nawet wrażliwych próbek, takich jak użyty surowy ekstrakt komórkowy.
Kontakt z rozpuszczalnikami organicznymi znacząco wpłynie na próbkę. Aby rozpocząć tę procedurę, użyj odśrodkowego koncentratora próżni, aby stężyć roztwór ELP do 1,1 milimola. Zmieszać 200 mikrolitrów tego stężonego roztworu z 1 250 mikrolitrami mieszaniny chloroformu i metanolu dwa do jednego.
Zmieszaj roztwór, aby dokładnie wymieszać. Następnie dodaj 1,5 grama kulistych szklanych kulek do dziesięciomililitrowej kolby okrągłodennej. Dodać ELP i roztwór metanolu chloroformu do kolby okrągłodennej i delikatnie wstrząsnąć, aby wymieszać.
Podłączyć kolbę do wyparki obrotowej. Dostosuj prędkość do 150 obr./min i reguluj ciśnienie do 20 000 paskali przez około cztery minuty, aż ciecz odparuje w temperaturze pokojowej. Ważne jest, aby zachować ostrożność podczas korzystania z parownika obrotowego ze względu na możliwe opóźnienie wrzenia.
Następnie luźno owinąć folię aluminiową wokół otworu kolby z okrągłym dnem, aby zapobiec utracie szklanych kulek i umieścić kolbę w eksykatorze na co najmniej jedną godzinę, aby zapewnić odparowanie pozostałego chloroformu i metanolu. W pojedynczym eksperymencie wymieszaj 100 miligramów szklanych kulek pokrytych peptydami z 60 mikrolitrami roztworu pęczniejącego. Inkubować tę próbkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez pięć minut.
Użyj wirówki stołowej, aby szybko odwirować próbki i osadzić szklane kulki. Następnie za pomocą pipety zebrać supernatant, który zawiera pęcherzyki. Najpierw wymieszaj 100 mikrolitrów wstępnie oczyszczonego plazmidowego DNA ze 100 mikrolitrami Roti-fenolu, chloroformu lub alkoholu izoamylowego w mikroprobówce wirówkowej, aby umożliwić lepszą separację faz.
Delikatnie odwróć probówkę do sześciu razy i odwiruj przy 16 000 g i temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie dodaj 200 mikrolitrów chloroformu do górnej fazy i odwróć probówkę do sześciu razy. Odwirować próbkę w temperaturze 16 000 g i temperaturze pokojowej przez pięć minut.
Następnie odpipetować supernatant do osobnej probówki i dodać 10 mikrolitrów trzymolowego octanu sodu w celu wytrącenia etanolu. Dodaj jeden mililitr zimnego etanolu w temperaturze 80 stopni Celsjusza i przechowuj próbkę w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie odwirować próbkę w temperaturze 16 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut.
Zdekantować supernatant i dodać jeden mililitr zimnego 70% etanolu w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Wirować w temperaturze 16 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Następnie usuń płyn przez pipetowanie, uważając, aby nie naruszyć osadu DNA.
Próbkę należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez około 15 minut w celu odparowania pozostałego etanolu. Następnie dodaj ultra czystą wodę do próbki, aby dostosować stężenie próbki do około 300 nanomolowców, które mierzy się przez absorpcję na 260 nanometrach. Aby przygotować reakcję transkrypcji-translacji, należy postępować zgodnie z przygotowaną surową ekstrakcją komórek i buforem reakcyjnym na lodzie.
Aby uzyskać mieszaninę reakcyjną o objętości 60 mikrolitrów, dodaj DNA osocza do 37,5 mikrolitra buforu reakcyjnego, dodaj 28,7 mikrolitra surowego ekstraktu komórkowego i napełnij ultra czystą wodą do końcowej objętości 58,8 mikrolitrów. Tuż przed rozpoczęciem reakcji dodaj 1,2 mikrolitra roztworu polimerazy T7RNA i pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać. Inkubować próbkę i pęczniejący roztwór w temperaturze 29 stopni Celsjusza przez czas trwania eksperymentu, który zwykle wynosi od czterech do ośmiu godzin.
Obrazy pęcherzyków z transmisyjnej mikroskopii elektronowej pokazują, że do tworzenia pęcherzyków można stosować różne roztwory pęczniejące, takie jak TX/TL lub nawet tylko PBS. W przypadku obu rozwiązań określenie rozmiaru jest prostym krokiem. Dynamiczne rozpraszanie światła pokazuje, że pęcherzyki przygotowane bez metody kulek szklanych mają średnicę 134 nanometrów, przy polidyspersyjności 25%W przypadku zastosowania kulek szklanych średnica wynosi 168 nanometrów, przy polidyspersyjności 21%Intensywność fluorescencji dwóch białek fluorescencyjnych, które ulegają ekspresji wewnątrz pęcherzyków ELP, jest następnie mierzona za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych.
Ważne jest, aby pamiętać, że po utworzeniu pęcherzyków zawartość pęcherzyków i roztwór zewnętrzny są takie same, dlatego antybiotyk Kanamycyna jest dodawany do roztworu zewnętrznego w celu zahamowania ekspresji białka. Jako kontrola, Kanamycyna jest również dodawana do roztworu pęczniejącego, w którym to przypadku ekspresja białka wewnątrz pęcherzyka jest zahamowana. Oznacza to, że kanamycyna nie dyfunduje przez błonę i tłumi wewnętrzną ekspresję stale, przez cały czas.
Następnie przeprowadza się test FRET, aby wykazać włączenie ELP do membrany. Po ekspresji ELP błony dodatkowe peptydy włączają się do błony, co zwiększa średnią odległość między parami FRET, a co z kolei powoduje wzrost sygnału donorowego. Przedstawiona technika może być wykorzystana do produkcji prostych pojemników reakcyjnych lub do tworzenia sztucznych komórek z błonami opartymi na peptydach.
Zawartość w środku można wybrać według potrzeb. Korzystając z tych pęcherzyków peptydowych, możemy teraz oczekiwać bardziej złożonych reakcji syntezy w ich obrębie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono protokoły tworzenia opartych na peptydach małych pęcherzyków jednowarstwowych, które wykazują zdolność do wzrostu. Pęcherzyki te zostały zaprojektowane z systemem transkrypcji i translacji w celu ułatwienia produkcji peptydów błonowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Biofizyka
- Biologia błon komórkowych
Wstęp
- Małe pęcherzyki jednowarstwowe (SUVs) są istotne w wielu zastosowaniach biologicznych.
- Wprowadzanie peptydów do pęcherzyków może zwiększyć ich funkcjonalność.
- Tradycyjne metody mogą nie być efektywne w przypadku próbek wrażliwych.
- Celem niniejszego protokołu jest uproszczenie procesu tworzenia pęcherzyków.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody tworzenia SUV-ów na bazie peptydów.
- Umożliwienie włączenia wrażliwych materiałów biologicznych.
- Zapewnienie badaczom prostego i przejrzystego protokołu.
Zastosowane metody
- Rehydratacja filmu z małych szklanych kulek w celu utworzenia komór reakcyjnych.
- Wykorzystanie wirówki próżniowej do zagęszczenia roztworu ELP.
- Mieszanie zagęszczonych roztworów z chloroformem i metanolem.
- Wprowadzenie surowych ekstraktów komórkowych do pęcherzyków.
Główne wyniki
- Protokół wykazał prostotę i powtarzalność w procesie tworzenia pęcherzyków.
- Pomyślne włączenie wrażliwych próbek bez ich znaczącej degradacji.
- Efektywna produkcja peptydowych SUV do dalszych eksperymentów.
- Potencjalne zastosowania w różnych dziedzinach badań biologicznych.
Wnioski
- Ta metoda stanowi niezawodne podejście do tworzenia peptydowych SUV.
- Badacze mogą wykorzystać ten protokół w przypadku wrażliwych próbek biologicznych.
- Technika ta zwiększa wszechstronność zastosowań pęcherzyków w badaniach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia tworzenie pęcherzyków opartych na peptydach, które wspierają syntezę prekursorów błon wewnątrz pęcherzyków (in vesiculo), stanowiąc solidną platformę do konstruowania minimalnych systemów komórkowych. Dzięki możliwości włączenia wrażliwych komponentów biologicznych, takich jak surowe ekstrakty komórkowe, metoda ta zmniejsza ryzyko niepowodzenia eksperymentów we wczesnych fazach projektów z zakresu biologii syntetycznej. Metoda wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka w badaniach nad ekspresją białek błonowych i szlakami lipidacji, dostarczając wartości prognostycznej dla późniejszej inżynierii sztucznych komórek lub przedziałów zawierających enzymy. Jej prostota i powtarzalność sprawiają, że nadaje się ona do integracji z procesami badawczymi skoncentrowanymi na walidacji celów i screeningu fenotypowym w systemach bezkomórkowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie oddziaływań peptyd-błona oraz funkcjonalności sekwencji amfifilowych w kontrolowanym przedziale.
- Wartość operacyjna: Wspiera walidację funkcjonalną peptydów celujących w błony bez konieczności syntezy lipidów lub posiadania wiedzy specjalistycznej z zakresu liposomów.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia ocenę wydajności inkorporacji w błonę, pomagając w wyborze wiodących kandydatów wśród peptydów transbłonowych lub związanych obwodowo.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia standaryzowany format pęcherzyków do przesiewania wariantów peptydów wpływających na krzywiznę, stabilność lub przepuszczalność błony.
- Wartość operacyjna: Umożliwia powtarzalną produkcję pęcherzyków metodą odwodnienia-nawodnienia, co wspiera standaryzację testów w kolejnych seriach.
- Skalowalność: Metoda oparta na koralikach szklanych pozwala na przygotowanie partii jednorodnych pęcherzyków o rozmiarze ~200 nm, co zapewnia kompatybilność z wysokoprzepustowym przesiewaniem.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Pęcherzyki peptydowe służą jako systemy istotne dla przebiegu chorób do testowania terapeutyków aktywnych w błonach lub czynników zwiększających przepuszczalność.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia ocenę indukowanego przez peptydy wzrostu lub wycieku z pęcherzyków jako wskaźnika mechanizmu działania w badaniach przesiewowych peptydów przeciwdrobnoustrojowych lub cytotoksycznych.
- Zgodność z biomarkerami: Reportery fluorescencyjne ekspresowane w pęcherzykach umożliwiają monitorowanie ekspresji genów w czasie rzeczywistym jako translacyjny odczyt aktywacji szlaków.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po optymalizację związku wiodącego, w szczególności w przypadku celów związanych z błoną komórkową, gdzie ekspresja w przedziałach komórkowych zwiększa istotność fizjologiczną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących wbudowywania się peptydów w błony oraz ich oligomeryzacji w regulowanym środowisku bezkomórkowym.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowe wyniki, takie jak zmiana wielkości pęcherzyków (DLS) i zmiany sygnału FRET, umożliwiając ranking wariantów peptydów pod kątem aktywności błonowej.
- Analityka: Generuje mierzalne odczyty biofizyczne, w tym średnicę, polidyspersyjność i intensywność fluorescencji, w celu porównania warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi, umożliwiając przesiewanie peptydów modulujących integralność pęcherzyków, co jest istotne dla mechanizmów dostarczania leków lub rozrywania błon.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Ustanawia reużywalną platformę pęcherzykową do iteracyjnych cykli projektowania, budowy i testowania w ramach kampanii z zakresu biologii syntetycznej i inżynierii peptydów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną dotyczącą zachowania peptydów błonowych poprzez umożliwienie ekspresji i oceny w środowisku przypominającym naturalny przedział komórkowy.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje proces tworzenia pęcherzyków za pomocą protokołu opartego na kuleczkach, minimalizującego użycie rozpuszczalników, który jest kompatybilny z ekstraktami nieoczyszczonymi.
- Wartość strategiczna: Zmniejsza odsetek niepowodzeń na późnych etapach badań dzięki wczesnej weryfikacji hipotez dotyczących oddziaływań z błoną w fazie odkrywania.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów peptydowych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowaną inkorporację do błony oraz efekt funkcjonalny.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza z zakresu syntezy peptydów, odwróconego cyklu temperaturowego do oczyszczania ELP oraz podstawowe techniki obsługi mikropłynów lub pęcherzyków.
- Wymagany jest dostęp do wirówki rotacyjnej, wirówki, fluorescencyjnego czytnika płytek oraz aparatury do dynamicznego rozpraszania światła w celu charakterystyki pęcherzyków.
- Wymagana jest standaryzacja składu roztworu pęczniejącego oraz warunków inkubacji, aby zapewnić powtarzalność wielkości pęcherzyków i wydajności enkapsulacji między poszczególnymi partiami.
- Przy projektowaniu konstruktów fuzyjnych ELP do ekspresji błonowej należy uwzględnić rozpuszczalność peptydów oraz ich tendencję do agregacji.
- Metoda jest ograniczona do peptydów kompatybilnych z fuzją ELP i odwróconym cyklem temperaturowym; nie nadaje się do sekwencji silnie hydrofobowych lub podatnych na agregację bez uprzedniej optymalizacji.
