Różnicowanie szpikowe ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej

Protokół ten może być wykorzystany do badania zmian molekularnych i komórkowych, które zachodzą podczas normalnego różnicowania szpiku ludzkich CD34-dodatnich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych. Główną zaletą tego protokołu jest to, że umożliwia różnicowanie komórek CD34 dodatnich wzdłuż wszystkich czterech linii szpikowych, w tym megakariocytów, erytrocytów, granulocytów i monocytów. Procedurę zademonstruje Aditi Bapat, post-doc z mojego laboratorium.

W celu izolacji komórek jednojądrzastych z ludzkiej próbki krwi pępowinowej, należy wysterylizować zewnętrzną powierzchnię worka z krwią pępowinową 70% etanolem przed przeniesieniem zawartości worka do sterylnej plastikowej butelki o pojemności 250 mililitrów w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Rozcieńczyć krew równą objętością buforowanego roztworu soli fizjologicznej Hanka o temperaturze pokojowej i dodać 15 mililitrów pożywki do frakcjonowania komórek jednojądrzastych do każdej z pięciu sterylnych 50-mililitrowych stożkowych probówek. Po delikatnym wymieszaniu ostrożnie wlej 30 mililitrów rozcieńczonej krwi pępowinowej na jednojądrzaste podłoże frakcjonujące w każdej probówce, trzymając 50-mililitrowe probówki pod kątem, aby uniknąć mieszania warstw.

Oddziel komórki przez wirowanie w gradionym gradimencie gęstości i usuń górne 15 do 20 mililitrów osocza powyżej warstwy komórki jednojądrowej. Za pomocą pipety ostrożnie przenieś odsłoniętą warstwę komórek jednojądrzastych do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów, łącząc komórki jednojądrzaste z dwóch do trzech probówek razem i doprowadź końcową objętość w każdej probówce do 50 mililitrów za pomocą zimnego buforu PBE. Próbki komórek jednojądrzastych należy osadzać przez odwirowanie i odessać supernatanty.

Delikatnie postukaj w każdą tubkę, aby poluzować granulki komórek, i rozcieńcz granulki w pięciu mililitrach lodowatego bufora PBE. Połącz ogniwa z trzech do czterech probówek w jedną stożkową probówkę o pojemności 50 mililitrów i umyj wszystkie probówki pięcioma mililitrami świeżego buforu PBE, aby zebrać pozostałe komórki. Po zliczeniu doprowadź końcową objętość w probówce do 50 mililitrów za pomocą świeżego, lodowatego buforu PBE i zbierz komórki przez odwirowanie.

Aby wyizolować komórki jednojądrzaste CD34 dodatnie, ponownie zawiesić osad w 50 mililitrach świeżego buforu PBE przed zebraniem komórek za pomocą kolejnego wirowania. Po odrzuceniu supernatantu delikatnie postukaj, aby poluzować osad i ponownie zawiesić ogniwa w tempie od 10 do ośmiu komórek jednojądrzastych na 300 mikrolitrów lodowatego stężenia buforowego PBE. Zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania za pomocą 100 mikrolitrów odczynnika blokującego receptor Fc, delikatnie wymieszaj, a następnie dodaj 100 mikrolitrów mikrogranulek CD34 z magnetycznie aktywowanego zestawu ludzkich mikrokulek CD34 do sortowania komórek przez jeden razy 10 do ośmiu komórek z delikatnym mieszaniem i inkubuj komórki przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Podczas inkubacji komórek umieść kolumnę LS i filtr wstępnej separacji w polu magnetycznym separatora MACS. Zrównoważyć kolumnę dwoma mililitrami lodowatego buforu PBE, a filtr wstępnej separacji jednym mililitrem buforu. Pozwól, aby kolumna opróżniła się do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i wyrzuć przepływ.

Pod koniec inkubacji doprowadzić końcową objętość próbki komórki jednojądrowej do 15 mililitrów za pomocą świeżego, lodowatego buforu PBE i osadzać komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić granulat w jednym mililitrze lodowatego bufora PBE i załadować ogniwa do filtra wstępnej separacji na kolumnie. Przepłucz probówkę trzema mililitrami świeżego, lodowatego buforu PBE i dodaj bufor do filtra wstępnej separacji.

Umyj kolumnę cztery razy dodatkowymi trzema mililitrami lodowatego bufora PBE na mycie bez filtra, pozwalając kolumnie całkowicie opróżnić się między każdym myciem. Po ostatnim umyciu przenieś kolumnę do nowej 15-mililitrowej rurki i zanurz pięć mililitrów świeżego, lodowatego PBE przez kolumnę do rury. Aby określić frakcje populacji macierzystych i progenitorowych w świeżo wyizolowanych krwiotwórczych komórkach macierzystych i progenitorowych CD34 dodatnich, należy zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w ilości od 10 do sześciu komórek na 50 mikrolitrów stężenia buforowego cytometrii przepływowej.

Następnie przenieś komórki w 50 mikrolitrowych porcjach na pięć mililitrów probówki do sortowania komórek aktywowanej fluorescencją zgodnie z eksperymentalnym protokołem barwienia cytometrii przepływowej. Dodaj odpowiedni koktajl przeciwciał i barwienie żywe/martwe do komórek, dostosowując objętość do 100 całkowitych mikrolitrów. Po 20 minutach w ciemności, chronionych przed światłem, umyj komórki jednym mililitrem świeżego buforu cytometrii przepływowej na probówkę i ponownie zawiesij komórki w 500 mikrolitrach świeżego buforu cytometrii przepływowej na probówkę.

Następnie przeanalizuj komórki na cytometrze przepływowym zgodnie ze standardowymi protokołami cytometrii przepływowej. Aby zróżnicować wyizolowane mikrokulki CD34-dodatnie komórki macierzyste i progenitorowe w komórki linii szpikowej, najpierw pokryj studzienki sterylnej, niepowlekanej 48-dołkowej płytki 200 mikrolitrami na studzienkę rekombinowanego roztworu ludzkiej fibronektyny w PBS przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji wyrzucić roztwór fibronektyny z każdej studzienki i zatkać studzienki 200 mikrolitrami 2% albuminy surowicy bydlęcej.

Po 30 minutach w temperaturze pokojowej umyj studzienki dwa razy 500 mikrolitrami sterylnego PBS na mycie. Ponownie zawiesić świeżo wyizolowane komórki CD34 dodatnie przy stężeniu pięć razy 10 komórek na mililitr ciepłego podłoża stymulacyjnego. Następnie wysiew 200 mikrolitrów komórek do każdej studzienki płytki pokrytej fragmentem fibronektyny i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 48 godzin.

Pod koniec inkubacji zebrać komórki za pomocą delikatnego pipetowania i przemyć studzienki 500 mikrolitrami podgrzanej zmodyfikowanej pożywki Eagle firmy Dulbecco, łącząc popłuczyny z zawiesiną komórkową. Po zliczeniu ponownie zawiesić komórki w stężeniu 2,5 razy 10 do czterech komórek na jeden mililitr pożywki różnicującej szpik. Warstwa 200 mikrolitrów komórek CD34 dodatnich na studzienkę w 48-dołkowej płytce do hodowli tkankowej z komórkami zrębu MS-5 wysiewanymi 48 dołkami.

Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych, delikatnie zastępując 100 mikrolitrów supernatantu w każdym dołku 100 mikrolitrami świeżej pożywki do różnicowania szpiku 2X co trzy do czterech dni. W 21 dniu zbierz komórki do analizy ekspresji markera linii szpikowej za pomocą cytometrii przepływowej, jak właśnie pokazano. Typowy odsetek całkowitych komórek CD34 dodatnich wyizolowanych z krwi pępowinowej przez separację mikrokulek, jak wykazano, waha się od 80 do 90%Analiza immunofenotypowa ujawnia, że te komórki CD34 dodatnie zazwyczaj składają się z około 20% populacji hematopoetycznych komórek macierzystych CD34 ujemnych CD34 i 72% populacji wielu silnych komórek progenitorowych CD34 dodatnich CD34 z ujemną linią CD38

W populacji wielosilnych komórek progenitorowych około 25% komórek wyraża wspólne markery progenitorowe szpiku, około 15% wyraża markery progenitorowe monocytów granulocytów i około 56% wyraża markery progenitorowe erytrocytów megakariocytów. Immunofenotypowanie pokazuje również, że odsetek komórek CD34 dodatnich zmniejsza się z około 90% podczas izolacji do mniej niż 25% w 21 dniu. Analiza populacji CD34 ujemnej wykazuje jednoczesny wzrost odsetka komórek wykazujących ekspresję dojrzałych markerów linii szpikowej.

Co więcej, barwione komórki Wrighta-Giemsy wykazują wyraźne cechy morfologiczne w pierwszym i 21 dniu, przy czym niezróżnicowane kultury wykazują duże, okrągłe jądra i bardzo mało cytoplazmy, a zróżnicowane kultury wykazują cechy morfologiczne komórek linii, w tym monocytów, granulocytów i erytroblastów. Należy pamiętać, aby rozcieńczoną krew pępowinową wylać na pożywkę do frakcjonowania komórek jednojądrzastych bez mieszania warstw i nie naruszać komórek MS-5 i CD34 dodatnich podczas zmiany pożywki. Zgodnie z tym protokołem różnicowania, hodowle komórkowe CD34 dodatnie mogą być analizowane pod kątem zmian morfologicznych, efektów apoptozy, zmian we wzorcach cyklu komórkowego i stopnia zróżnicowania.