Name: Ocena zachowań fotosyntetycznych poprzez jednoczesne pomiary współczynnika odbicia liści i analizy fluorescencji chlorofilu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Poznaj metodę jednoczesnego pomiaru fluorescencji chlorofilu i odbicia liści u Arabidopsis. Technika umożliwia monitorowanie zachowań fotosyntetycznych roślin w czasie rzeczywistym w naturalnych warunkach środowiskowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni dr Kouki Hikosaka (Uniwersytet Tohoku) za stymulowanie dyskusji, pomoc w tworzeniu miejsca pracy i instrumenty do eksperymentów. Prace były częściowo wspierane przez KAKENHI [numery grantów 18K05592, 18J40098] i Fundację Naito.

1. Uprawa rzodkiewnika
<ol>
	<li>Namocz nasiona Arabidopsis thaliana w wysterylizowanej wodzie dejonizowanej w mikroprobówce i inkubuj przez 2 dni w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Umieść około czterech wchłoniętych, poddanych działaniu zimna nasion na powierzchni gleby za pomocą mikropipety. Inkubować posadzone doniczki w komorze wzrostowej o 16 godzin światła (120 μmol fotonów m–2 s–1) i 8 godzinach ciemności odpowiednio w temperaturze 22 °C i 20 °C.</li>
	<li>Wyhoduj jedną roślinę w doniczce, przerzedzając inne sadzonki po wykiełkowaniu. Przygotuj co najmniej pięć doniczek. Inkubuj rośliny w komorze wzrostowej przez dodatkowe 4 tygodnie. Do eksperymentów wykorzystywane są trzy rośliny.</li>
	<li>Użyj najmłodszego, w pełni otwartego dojrzałego liścia do pomiarów fotosyntezy.</li>
</ol>
2. Ustawianie stolika na próbki, instrumentów fotosyntetycznych i źródła światła
UWAGA: Dla tego protokołu, użyto specjalnie zbudowanego stolika próbki do mocowania liści i sond detekcyjnych (Rysunek 1).
<ol>
	<li>Przymocuj stalową płytkę o średnicy 10 cm2 z otworem o średnicy 1 cm do wykonanego na zamówienie stolika na próbki. Rozmiar otworu w tej płycie można zmienić, aby pomieścić różne próbki liści lub gatunki roślin. Stolik posiada klips do mocowania sond detekcyjnych oraz regulator do regulacji odległości między sondami a próbką liściową.</li>
	<li>Przygotuj sondy cienkowłóknowe do pomiaru fluorescencji chlorofilu i współczynnika odbicia liści. Te sondy z cienkich włókien zostaną umieszczone blisko siebie, tak aby mierzyły sygnały z tej samej pozycji skrzydła. 
	UWAGA: Fluorometr chlorofilu PAM i radiometr spektralny zostały przystosowane do wykrywania sygnałów odpowiednio fluorescencji chlorofilu A i odbicia liści. Oba instrumenty wykorzystują sondy cienkowłóknowe o średnicach odpowiednio 1 mm i 2 mm.</li>
	<li>Dopasuj te dwie sondy ściśle do siebie i owiń je plastikową taśmą.</li>
	<li>Przypnij zaklejone taśmą sondy do stolika na próbkę za pomocą współosiowego uchwytu soczewki (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1) i ustaw je pionowo do powierzchni liścia. 
	UWAGA: Pole widzenia światłowodowego w radiometrze spektralnym wynosi α = 25°. W tej metodzie odległość między końcówkami sondy światłowodowej a powierzchnią liścia jest krótsza niż 1 cm. Dlatego mierzona powierzchnia liścia jest prawie taka sama jak powierzchnia włókna.</li>
	<li>Przymocować dwuwidełkowy światłowód wykonany z włókien szklanych do halogenowego źródła światła i naświetlić stolik na próbkę z obu kierunków pod kątem około 45°. 
	UWAGA: Lampa halogenowa, która jest zbliżona do rozkładu długości fal naturalnego światła słonecznego, jest używana jako światło aktyniczne do indukowania fotosyntezy. Halogenowe źródło światła zostało przystosowane do wbudowanego zimnego filtra, który usuwa długie fale z bliskiej podczerwieni, aby zapobiec wzrostowi temperatury powierzchni liści (λ = 400 do 800 nm).</li>
	<li>Wyreguluj źródło światła tak, aby światło równomiernie oświetlało stolik na próbkę bez rzucania cieni.</li>
</ol>
3. Ustawianie jednoczesnych pomiarów współczynnika odbicia liści i fluorescencji chlorofilu
UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane w ciemnym pomieszczeniu, aby uniknąć wykrycia światła innego niż aktyniczne. Słabo zielone światło (np. zielone światło celofanowe) powinno zostać wyłączone przed właściwymi pomiarami.
<ol>
	<li>Pomiar odległości między próbką liścia a sondami na stoliku na próbkę.
	<ol>
		<li>Umieścić liść testowy na uchwycie liścia stolika na próbkę w ciemności. Dociśnij liść do stalowej płyty na scenie (kwadrat w <silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
		<li>Włącz PAM i naświetl próbkę liści lampą pomiarową. Wartości intensywności fluorescencji chlorofilu potwierdzane są za pomocą oprogramowania sterującego PAM (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Przesuń regulator tak, aby intensywność fluorescencji wynosiła około 100. Zmierz odległość między sondą a liśćmi. Zamocuj regulator i zapisz wartość odległości na regulatorze.</li>
		<li>Wyłącz lampkę pomiarową. Usuń liść testowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar natężenia promieniowania światła aktynicznego 
	UWAGA: Aby zaobserwować zależne od światła zachowania fotosyntetyczne, do naświetlania próbki liści stosuje się światło słoneczne o różnym natężeniu.
	<ol>
		<li>Ustaw światłomierz kwantowy w miejscu, w którym zostanie umieszczony liść próbki.</li>
		<li>Naświetlić światło z halogenowego źródła światła i zmierzyć jego natężenie.</li>
		<li>Określ, które pozycje tarczy źródła światła generowałyby intensywności fotonów 30, 60, 120, 240 i 480 μmol m–2 s–1, 
		UWAGA: Rośliny Arabidopsis są uprawiane pod fotonami 120 μmol m–2 s–1; Dlatego natężenia promieniowania światła aktynicznego są dobrane tak, aby zapewnić zakres małych i dużych natężeń.</li>
		<li>Zaznacz każdą intensywność natężenia promieniowania na tarczy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz normę odbicia. 
	UWAGA: Do obliczenia współczynnika odbicia liści przy każdej intensywności natężenia promieniowania wymagany jest wzorzec odbicia.
	<ol>
		<li>Umieść białą tabliczkę jako wzorzec współczynnika odbicia w miejscu, w którym znajduje się próbka liścia.</li>
		<li>Włącz radiometr spektralny. Sygnał odbicia jest pokazywany przez oprogramowanie sterujące radiometrem spektralnym. W tej chwili nie ma danych spektralnych, ponieważ nie ma światła napromieniującego.</li>
		<li>Włączyć lampę halogenową, aby naświetlić fotonami o natężeniu 480 μmol m–2 s–1, co stanowi najwyższą intensywność napromieniowania w tym teście.</li>
		<li>Dostosuj siłę wykrywania radiometru, aby uniknąć nasycenia.</li>
		<li>Rejestruj odbicie spektralne w zakresie 450–850 nm w odstępach 1 nm w oświetleniu za pomocą fotonów 30, 60, 120, 240 i 480 μmol m–2 s–1, 
		UWAGA: Podstawowy sygnał elektryczny (prąd ciemny) jest korygowany i odejmowany przy każdym pomiarze spektralnym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Równoczesne pomiary współczynnika odbicia liści i fluorescencji chlorofilu a oraz obliczanie parametrów fotosyntezy
<ol>
	<li>Ustaw roślinę w pozycji próbki liści.
	<ol>
		<li>Przenieś roślinę Arabidopsis z komory hodowlanej do kontrolowanego ciemnego pomieszczenia o tej samej temperaturze i wilgotności, jakie ma miejsce w komorze wzrostowej.</li>
		<li>Inkubować roślinę przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze 22 °C w celu rozproszenia elektronów z centrum reakcji PSII i rozluźnienia po niefotochemicznym wygaszaniu.</li>
		<li>Umieść całą przystosowaną do ciemności roślinę na podnośniku laboratoryjnym pod stolikiem próbki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
		<li>Przymocuj liść próbki do uchwytu skrzydła tak, aby powierzchnia skrzydła była prostopadła do sond detekcyjnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar maksymalnej wydajności kwantowej PSII.
	<ol>
		<li>Włącz PAM i rozpocznij nagrywanie krzywej. Ta wartość jest nazywana 0.</li>
		<li>Włącz lampkę pomiarową i poczekaj około 30 sekund, aż krzywa zareaguje. Ta wartość nazywa się F0.</li>
		<li>Daj nasycony impuls 4000 μmol fotonów m–2 s–1 przez 0,8 s od PAM.</li>
		<li>Uzyskaj najwyższą wartość skoku na krzywej przy zwiększonej intensywności fluorescencji. Ta wartość nazywa się FM.</li>
		<li>Oblicz maksymalną wydajność kwantową PSII w ciemności (FV/FM), używając następującego równania. 
		FV/FM = (FM – F0) / FM</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar zachowań fotosyntetycznych w stanie ustalonym.
	<ol>
		<li>Włączyć lampę halogenową jako zewnętrzne źródło światła przy włączonej lampce pomiarowej po zarejestrowaniu FM (patrz 4.2.4). Najpierw należy napromienić próbkę liścia najsłabszym światłem (30 μmol fotonów m–2 s–1).</li>
		<li>W tym samym czasie włącz radiometr spektralny, aby monitorować współczynnik odbicia liści.</li>
		<li>Poczekaj 20 minut lub dłużej, aż reakcja fotosyntetyczna osiągnie stan ustalony w warunkach oświetleniowych. Intensywność fluorescencji w stanie ustalonym nazywana jest Fs.</li>
		<li>Dostarczaj impuls nasycający w odstępach 1 minuty podczas oświetlenia światłem aktynicznym. Maksymalna wartość fluorescencji osiągana w świetle pulsacyjnym nazywana jest FM′.</li>
		<li>Zapisz dane FM′ po 20 minutach od włączenia światła aktynicznego.</li>
		<li>Weź dane dotyczące odbicia liści, uśredniając 10 skanów w zoptymalizowanym czasie integracji, z odejmowaniem ciemnego prądu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczanie parametrów fotosyntezy w stanie ustalonym.
	<ol>
		<li>Oblicz wydajność kwantową fotochemii PSII (ΦPSII), którą można oszacować, napromieniując nasyconymi impulsami w świetle aktynicznym, używając następującego równania. 
		ΦPSII = (FM′- FS) / FM′</li>
		<li>Oszacuj liniowy strumień elektronów (LEF) z centrum reakcji PSII w następujący sposób 4. 
		LEF = natężenie promieniowania światła aktynicznego × ΦPSII × 0,5 × 0,84</li>
		<li>Oblicz NPQ, które można wyrazić rozpraszaniem ciepła, używając następującego równania. 
		NPQ = (FM - FM′) / FM′ 
		UWAGA: Energia świetlna jest zużywana głównie w reakcjach fotosyntezy. Jednakże, gdy rośliny pochłaniają więcej energii świetlnej niż energia zużywana w procesie fotosyntezy, mechanizmy rozpraszania ciepła są indukowane, aby uniknąć nadmiaru energii.</li>
		<li>Korzystając z danych spektralnych uzyskanych za pomocą radiometru w tych samych warunkach oświetleniowych, oblicz współczynnik odbicia liści w następujący sposób. 
		Współczynnik odbicia =liść R /norma R</li>
		<li>Oblicz PRI od 531 nm i 570 nm w następujący sposób. Te dwie długości fal są wyodrębniane ze współczynnika odbicia. 
		PRI = (R531–R570) / (R531+R570) 
		UWAGA: R oznacza współczynnik odbicia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar kinetyki relaksacji wygaszania niefotochemicznego.
	<ol>
		<li>Wyłącz światło aktyniczne po uzyskaniu Fs i współczynnika odbicia liści.</li>
		<li>Monitoruj fluorescencję chlorofilu za pomocą PAM przez 10 minut po wyłączeniu światła.</li>
		<li>Zapewnij puls nasycający w odstępach 1 minuty podczas ciemnego relaksu. Maksymalna wartość fluorescencji indukowana impulsem nasycenia w ciemności nazywa się FM′′. Uzyskaj dziesięć FM′′ w jednym teście.</li>
		<li>Zapisz dane FM′′ po 2 minutach i 10 minutach po wyłączeniu światła aktynicznego.</li>
		<li>Włącz światło aktyniczne, ustaw na następne natężenie promieniowania, 60 μ mol fotonów m–2 s–1.</li>
		<li>Powtarzaj adaptację światła przez 20 minut i ciemne relaksowanie przez 10 minut z pulsującym światłem nasycenia w odstępach 1 minut. Zapisz wszystkie dane zgodnie z powyższym opisem. Powtórz wszystkie kroki i pomiary, stosując napromieniowanie o natężeniu 120, 240 i 480 μ mol fotonów m–2 s–1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczanie parametrów niefotochemicznego wygaszania na podstawie kinetyki relaksacji. 
	UWAGA: Zależna od światła indukcja NPQ jest łagodzona przez wyłączenie źródła światła13. Możliwe jest frakcjonowanie każdej funkcji NPQ poprzez dostosowanie skal czasowych relaksacji.
	<ol>
		<li>Oszacuj frakcję qE (hartowanie zależne od energii) za pomocą FM′′ po 2-minutowej adaptacji do ciemności. 
		qE = (FM2m′′–FM′) / FM′ 
		UWAGA: Frakcja qE ulega szybkiemu odwróceniu w ciągu 1–2 minut. Frakcja ta obejmuje głównie protonację PsbS i część konwersji ksantofilu, które zależą od indukowanego światłem ΔpH przez błonę tylakoidów13. Oba są odwracalne po przełamaniu gradientu.</li>
		<li>Obliczyć frakcję qZ (hartowanie zależne od zeaksantyny) za pomocą FM′′ po 10-minutowej adaptacji do ciemności. 
		qZ = (FM10m′′–FM′) / FM′ 
		UWAGA: Kinetyka relaksacji NPQ po około 10 minutach od wyłączenia światła aktynicznego odzwierciedla cykl ksantofilu14. Większość konwersji ksantofilu ulega odwróceniu w dłuższych skalach czasowych wynoszących około 10 minut (qZ), ponieważ konwersja wymaga reakcji enzymatycznej VDE (de-epoksydazy wiolaksantyny). Frakcja jest również rozluźniana przez rozkład ΔpH przez błonę tylakoidów.</li>
		<li>Oblicz qI (stan fotohamujący) w następujący sposób. 
		qI = (FM–F M10m′′) / FM′ 
		UWAGA: Uważa się, że najwolniejszy odzysk wśród frakcji NPQ to fotouszkodzenie PSII (wskazujące na obrót D1). Jest to część stanu fotohamującego (qI), która nie wraca do normy o 10 min15.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Xue, J., Su, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+remote+sensing+vegetation+indices%3A+A+review+of+developments+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Sensors%22%5BJournal%5D)">Significant remote sensing vegetation indices: A review of developments and applications.</a> Journal of Sensors. 1353691, (2017).</li>
<li>Cotrozzi, L., Townsend, P. A., Pellegrini, E., Nali, C., Couture, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflectance+spectroscopy%3A+a+novel+approach+to+better+understand+and+monitor+the+impact+of+air+pollution+on+Mediterranean+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+and+Pollution+Research%22%5BJournal%5D)">Reflectance spectroscopy: a novel approach to better understand and monitor the impact of air pollution on Mediterranean plants.</a> Environmental Science and Pollution Research. 25 (9), 8249-8267 (2018).</li>
<li>Han, L., Yang, G., Yang, H., Xu, B., Li, Z., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustering+Field-Based+Maize+Phenotyping+of+Plant-Height+Growth+and+Canopy+Spectral+Dynamics+Using+a+UAV+Remote-Sensing+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Clustering Field-Based Maize Phenotyping of Plant-Height Growth and Canopy Spectral Dynamics Using a UAV Remote-Sensing Approach.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 1638(2018).</li>
<li>Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorophyll+Fluorescence%3A+A+Probe+of+Photosynthesis+In%5BTitle%5D)+AND+%22Vivo.+Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Chlorophyll Fluorescence: A Probe of Photosynthesis In.</a> Vivo. Annual Review of Plant Biology. 59 (1), 89-113 (2008).</li>
<li>Cruz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Environmental+Photosynthetic+Imaging+Reveals+Emergent+Phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Dynamic Environmental Photosynthetic Imaging Reveals Emergent Phenotypes.</a> Cell Systems. 2 (6), 365-377 (2016).</li>
<li>Ruban, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+efficiency+of+photoprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Quantifying the efficiency of photoprotection.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1730), 20160393(2017).</li>
<li>Gamon, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+sensing+of+the+xanthophyll+cycle+and+chlorophyll+fluorescence+in+sunflower+leaves+and+canopies%5BTitle%5D)+AND+%22Oecologia%22%5BJournal%5D)">Remote sensing of the xanthophyll cycle and chlorophyll fluorescence in sunflower leaves and canopies.</a> Oecologia. 85 (1), 1-7 (1990).</li>
<li>Gamon, J. A., Peñuelas, J., Field, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+narrow-waveband+spectral+index+that+tracks+diurnal+changes+in+photosynthetic+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Remote+Sensing+of+Environment%22%5BJournal%5D)">A narrow-waveband spectral index that tracks diurnal changes in photosynthetic efficiency.</a> Remote Sensing of Environment. 41 (1), 35-44 (1992).</li>
<li>Rahimzadeh-Bajgiran, P., Munehiro, M., Omasa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+the+photochemical+reflectance+index+%28PRI%29+and+chlorophyll+fluorescence+parameters+and+plant+pigment+indices+at+different+leaf+growth+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynthesis+Research%22%5BJournal%5D)">Relationships between the photochemical reflectance index (PRI) and chlorophyll fluorescence parameters and plant pigment indices at different leaf growth stages.</a> Photosynthesis Research. 113 (1-3), 261-271 (2012).</li>
<li>Niyogi, K. K., Grossman, A. R., Björkman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mutants+define+a+central+role+for+the+xanthophyll+cycle+in+the+regulation+of+photosynthetic+energy+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mutants define a central role for the xanthophyll cycle in the regulation of photosynthetic energy conversion.</a> Plant Cell. 10 (7), 1121-1134 (1998).</li>
<li>Kohzuma, K., Hikosaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+validation+of+photochemical+reflectance+index+%28PRI%29+as+a+photosynthetic+parameter+using+Arabidopsis+thaliana+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Physiological validation of photochemical reflectance index (PRI) as a photosynthetic parameter using Arabidopsis thaliana mutants.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 498, 52-57 (2018).</li>
<li>Hikosaka, K., Noda, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+leaf+CO2+assimilation+and+Photosystem+II+photochemistry+from+chlorophyll+fluorescence+and+the+photochemical+reflectance+index%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+and+Environment%22%5BJournal%5D)">Modeling leaf CO2 assimilation and Photosystem II photochemistry from chlorophyll fluorescence and the photochemical reflectance index.</a> Plant, Cell and Environment. 42 (2), 730-739 (2019).</li>
<li>Brooks, M. D., Sylak-Glassman, E. J., Fleming, G. R., Niyogi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thioredoxin-like%2F%CE%B2-propeller+protein+maintains+the+efficiency+of+light+harvesting+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A thioredoxin-like/β-propeller protein maintains the efficiency of light harvesting in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), E2733-E2740 (2013).</li>
<li>Nilkens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+slowly+inducible+zeaxanthin-dependent+component+of+non-photochemical+quenching+of+chlorophyll+fluorescence+generated+under+steady-state+conditions+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Identification of a slowly inducible zeaxanthin-dependent component of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence generated under steady-state conditions in Arabidopsis.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1797 (4), 466-475 (2010).</li>
<li>Davis, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+to+photosynthesis+by+proton+motive+force-induced+photosystem+II+photodamage%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Limitations to photosynthesis by proton motive force-induced photosystem II photodamage.</a> Elife. 5, 16921(2016).</li>
<li>Wong, C. Y. S., Gamon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photochemical+reflectance+index+provides+an+optical+indicator+of+spring+photosynthetic+activation+in+evergreen+conifers%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The photochemical reflectance index provides an optical indicator of spring photosynthetic activation in evergreen conifers.</a> New Phytologist. 206 (1), 196-208 (2015).</li>
<li>Miyake, C., Amako, K., Shiraishi, N., Sugimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acclimation+of+Tobacco+Leaves+to+High+Light+Intensity+Drives+the+Plastoquinone+Oxidation+System%E2%80%94Relationship+Among+the+Fraction+of+Open+PSII+Centers%2C+Non-Photochemical+Quenching+of+Chl+Fluorescence+and+the+Maximum+Quantum+Yield+of+PSII+in+the+Dark%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Acclimation of Tobacco Leaves to High Light Intensity Drives the Plastoquinone Oxidation System—Relationship Among the Fraction of Open PSII Centers, Non-Photochemical Quenching of Chl Fluorescence and the Maximum Quantum Yield of PSII in the Dark.</a> Plant and Cell Physiology. 50 (4), 730-743 (2009).</li>
<li>Munekage, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+electron+flow+around+photosystem+I+is+essential+for+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cyclic electron flow around photosystem I is essential for photosynthesis.</a> Nature. 429 (6991), 579-582 (2004).</li>
<li>Tubuxin, B., Rahimzadeh-Bajgiran, P., Ginnan, Y., Hosoi, F., Omasa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+chlorophyll+content+and+photochemical+yield+of+photosystem+II+%28%CE%A6PSII%29+using+solar-induced+chlorophyll+fluorescence+measurements+at+different+growing+stages+of+attached+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Estimating chlorophyll content and photochemical yield of photosystem II (ΦPSII) using solar-induced chlorophyll fluorescence measurements at different growing stages of attached leaves.</a> Journal of Experimental Botany. 66 (18), 5595-5603 (2015).</li>
</ol>

Autor nie ma nic do zdradzienia.

W tym badaniu uzyskaliśmy dodatkowe dowody na to, że PRI reprezentuje pigmenty ksantofilowe, jednocześnie mierząc fluorescencję chlorofilu i współczynnik odbicia liści.
Światło halogenowe, które ma długości fal podobne do światła słonecznego, zostało przystosowane do wykorzystania jako aktyniczne źródło światła do aktywacji fotosyntezy. Początkowo użyliśmy białego źródła światła LED, aby uniknąć termicznego uszkodzenia powierzchni liścia, ale spowodowało to powolną kinetykę relaksacji ciemnośc...

Współczynnik odbicia liści jest używany do zdalnego wykrywania wskaźników wegetacji, które odzwierciedlają fotosyntezę lub cechy roślin1,2. Znormalizowany różnicowy wskaźnik wegetacji (NDVI), który opiera się na sygnałach odbicia w podczerwieni, jest jednym z najbardziej znanych wskaźników wegetacji do wykrywania właściwości związanych z chlorofilem i jest używany w ekologii i naukach rolniczych jako wskaźnik reakcji środowiskowych drzew lub upraw3. W badaniach terenowych, mimo że opracowano i wykorzystano wiele parametrów (np. indeks chlorofilowy (CI), indeks wodny (WI) itp.), przeprowadzono niewiele szczegółowych weryfikacji tego, co te parametry bezpośrednio (lub pośrednio) wykrywają, przy użyciu mutantów.
Analiza modulacji amplitudy impulsu (PAM) fluorescencji chlorofilu jest skuteczną metodą pomiaru reakcji fotosyntezy i procesów zachodzących w fotosystemie II (PSII)4. Fluorescencja chlorofilu może być wykryta za pomocą kamery i wykorzystana do badań przesiewowych mutantów fotosyntezy5. Jednak wykrywanie fluorescencji chlorofilu za pomocą kamery wymaga złożonych protokołów, takich jak ciemne leczenie lub impulsy nasycenia światłem, które są trudne do wdrożenia w badaniach terenowych.
Energia światła słonecznego pochłonięta przez liście jest głównie zużywana przez reakcje fotosyntezy. Natomiast absorpcja nadmiaru energii świetlnej może generować reaktywne formy tlenu, co powoduje uszkodzenie cząsteczek fotosyntetycznych. Nadmiar energii świetlnej musi zostać rozproszony w postaci ciepła przez mechanizmy niefotochemicznego hartowania (NPQ)6. Fotochemiczny współczynnik odbicia (PRI), który odzwierciedla zależne od światła zmiany parametrów odbicia liści, jest wyprowadzany z wąskopasmowego współczynnika odbicia przy 531 i 570 nm (referencyjna długość fali)7,8. Doniesiono, że koreluje z NPQ w analizie fluorescencji chlorofilu9. Ponieważ jednak NPQ jest parametrem złożonym, który obejmuje cykl ksantofilowy, tradycję stanu i fotoinhibicję, wymagana jest szczegółowa walidacja, aby zrozumieć, co mierzy parametr PRI. Skupiliśmy się na cyklu ksantofilowym, systemie rozpraszania ciepła obejmującym deepoksydację pigmentów ksantofilowych (wiolaksantyna do antheraksantyny i zeaksantyny) i głównym składniku NPQ, ponieważ korelacje między PRI a konwersją tych pigmentów zostały zgłoszone w poprzednich badaniach8.
Wiele mutantów związanych z fotosyntezą zostało wyizolowanych i zidentyfikowanych u Arabidopsis. Mutant npq1 nie akumuluje zeaksantyny, ponieważ przenosi mutację w de-epoksydazie wiolaksantyny (VDE), która katalizuje konwersję wiolaksantyny do zeaksantyny10. Aby ustalić, czy PRI wykrywa tylko zmiany w pigmentach ksantofilu, jednocześnie zmierzyliśmy fluorescencję PRI i chlorofilu w tym samym obszarze liścia w npq1 i typie dzikim, a następnie przeprowadziliśmy sekcję NPQ w różnych skalach czasowych ciemnej relaksacji, aby wyodrębnić składnik związany z ksantofilem11. Te równoczesne pomiary stanowią cenną technikę przypisywania wskaźników wegetacji. Ponadto, ponieważ PRI koreluje z produktywnością pierwotną brutto (GPP), możliwość precyzyjnego przypisania PRI do jednego składnika ma ważne zastosowania w ekologii12.

<table><tbody><tr><td>Halogenowe źródło światła</td><td>OptoSigma</td><td>SHLA-150</td><td></td></tr><tr><td>Miernik kwantowy światła</td><td>LI-COR</td><td>LI-1000</td><td></td></tr><tr><td>PAM Fluorometr chlorofilowy</td><td>Walz</td><td>JUNIOR-PAM</td><td></td></tr><tr><td>PAM Oprogramowanie sterujące Walz</td><td></td><td>WinControl-3.27</td><td></td></tr><tr><td>Standard odbicia</td><td>Labsphere, Inc.</td><td>SRT-99-050</td><td></td></tr><tr><td>Radiometr spektralny</td><td>ADS Inc.</td><td>Field Spec3</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie sterujące radiometrem spektralnym</td><td>ADS Inc.</td><td>RS3</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena zachowań fotosyntetycznych poprzez jednoczesne pomiary współczynnika odbicia liści i analizy fluorescencji chlorofilu

Evaluation of Photosynthetic Behaviors by Simultaneous Measurements of Leaf Reflectance and Chlorophyll Fluorescence Analyses

Analiza fluorescencji chlorofilu jest szeroko stosowana do pomiaru zachowań fotosyntetycznych w nienaruszonych roślinach i doprowadziła do opracowania wielu parametrów, które skutecznie mierzą fotosyntezę. Analiza odbicia liści dostarcza kilku wskaźników wegetacji w ekologii i rolnictwie, w tym wskaźnika odbicia fotochemicznego (PRI), który może być używany jako wskaźnik rozpraszania energii cieplnej podczas fotosyntezy, ponieważ koreluje z hartowaniem niefotochemicznym (NPQ). Jednak ze względu na to, że NPQ jest parametrem złożonym, jego walidacja jest wymagana w celu zrozumienia charakteru parametru PRI. Aby uzyskać fizjologiczne dowody do oceny parametru PRI, jednocześnie zmierzyliśmy fluorescencję chlorofilu i współczynnik odbicia liści w roślinach z wadliwym mutantem cyklu ksantofylowego (npq1) i roślinami Arabidopsis typu dzikiego. Dodatkowo parametr qZ, który prawdopodobnie odzwierciedla cykl ksantofilowy, został wyekstrahowany z wyników analizy fluorescencji chlorofilu poprzez monitorowanie kinetyki relaksacji NPQ po wyłączeniu światła. Te równoczesne pomiary przeprowadzono przy użyciu fluorometru chlorofilowego z modulacją impulsu i amplitudy (PAM) oraz radiometru spektralnego. Sondy światłowodowe z obu instrumentów zostały umieszczone blisko siebie, aby wykrywać sygnały z tej samej pozycji skrzydła. Do aktywacji fotosyntezy wykorzystano zewnętrzne źródło światła, a światła pomiarowe i nasycone światło pochodziły z instrumentu PAM. Ten eksperymentalny system umożliwił nam monitorowanie zależnego od światła PRI w nienaruszonej roślinie i ujawnił, że zależne od światła zmiany w PRI różnią się znacznie między typem dzikim a mutantem npq1. Co więcej, PRI był silnie skorelowany z qZ, co oznacza, że qZ odzwierciedla cykl ksantofilu. Łącznie pomiary te wykazały, że jednoczesny pomiar współczynnika odbicia liści i fluorescencji chlorofilu jest prawidłowym podejściem do oceny parametrów.

Rysunek 1 przedstawia schematyczny rysunek układu eksperymentalnego do jednoczesnego pomiaru fluorescencji chlorofilu i refleksyjności liścia. Sondy światłowodowe PAM oraz radiometru spektralnego ustawiono prostopadle do powierzchni liścia w uchwycie na liść na specjalnie wykonanym stoliku z próbkami, a do naświetlania światłem aktynicznym z obu kierunków (lewego i prawego), bez rzucania cieni, użyto lampy halogenowej. Sygnały PAM i refleksyjności liścia były...

Opisujemy nowe techniczne podejście do badania reakcji fotosyntezy u wyższych roślin, obejmujące jednoczesne pomiary fluorescencji chlorofilu a i reflektancji liści za pomocą PAM i radiometru spektralnego do wykrywania sygnałów z tego samego obszaru liści u Arabidopsis.

Ocena zachowań fotosyntetycznych poprzez jednoczesne pomiary współczynnika odbicia liści i analizy fluorescencji chlorofilu

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many ...

Jednoczesny pomiar współczynnika odbicia liści z analizą fluorescencji chlorofilu z wykorzystaniem znanego już modelu zmutowanej rośliny ułatwia ustalenie nowych parametrów odbicia. Skonstruowanie przez nas nowych parametrów odbicia liści pozwala na monitorowanie w czasie rzeczywistym zmieniających się zachowań roślin w naturalnych warunkach środowiskowych. Przed rozpoczęciem eksperymentu ustaw system pomiarowy, jak pokazano na tym schemacie.Ze stolikiem na próbkę, źródłem światła, fluorometrem PAM i radiometrem spektralnym. Następnie przymocuj 10 cm kwadratową stalową płytkę z otworem o średnicy jednego cm do wykonanego na zamówienie stolika na próbki. I dopasuj dwie cienkie sondy światłowodowe ściśle do siebie.Owiń sondy plastikową taśmą. Następnie użyj uchwytu, aby przypiąć zaklejone taśmą sondy do stolika na próbkę. Ustaw sondy pionowo do stolika na próbkę.I przymocuj dwurozgałęziony światłowód wykonany z włókien szklanych do halogenowego źródła światła. Następnie napromieniuj stolik na próbkę z obu kierunków pod kątem około 45 stopni. Regulacja źródła światła tak, aby światło równomiernie oświetlało stolik na próbkę bez rzucania cieni.W celu jednoczesnego pomiaru lewego odbicia światła i analizy fluorescencji chlorofilu, w ciemnym pomieszczeniu z zielonym światłem celofanu umieść roślinę testową w uchwycie liścia stolika na próbkę i dotknij liścia o otwór w stalowej płycie na stoliku. Po wyłączeniu słabego zielonego światła włącz fluorometr PAM i naświetl próbkę liścia światłem pomiarowym. Przesuń regulator tak, aby intensywność kwitnienia wynosiła około 100 i zmierz odległość między sondą a liściem.Zamocuj regulator na miejscu i zapisz wartość odległości na regulatorze. Następnie wyłącz lampkę pomiarową i wyjmij instalację testową. W celu pomiaru natężenia światła aktynicznego należy umieścić kwantymetr światła w miejscu, w którym zostanie umieszczony liść próbki.I naświetlić światło z halogenowego źródła światła, aby zmierzyć natężenie źródła światła. Określ, które pozycje tarczy źródła światła generują intensywność 30, 60, 120, 240 i 480 mikromolowych protonów na metr kwadratowy na sekundę. Umieścić białą tabliczkę jako wzorzec odblaskowy w miejscu, w którym znajduje się próbka liścia.I włącz radiometr spektralny. Dostosuj współczynnik odbicia spektralnego w zakresie od 350 do 850 nanometrów. W tej chwili nie ma danych spektralnych, ponieważ nie ma światła napromieniującego.Włącz lampę halogenową, aby naświetlić 480 mikromolowymi fotonami na metr kwadratowy na sekundę. Najwyższa intensywność natężenia promieniowania w tym teście i dostosuj siłę wykrywania radiometru, aby uniknąć nasycenia. Następnie zapisz odbicie widmowe w oświetleniu z 30, 60, 120, 240 i 480 fotonami mikromolowymi na metr kwadratowy na sekundę.W celu jednoczesnego pomiaru współczynnika odbicia liści i analizy florescencji chlorofilu przenieś roślinę z komory wzrostowej do ciemni o tej samej temperaturze i wilgotności. Po godzinie umieść roślinę Arabidopsis w miejscu próbki liści. I przymocuj liść próbki do liścia tak, aby powierzchnia liścia była prostopadła do sond wykrywających.Włącz fluorometr PAM i rozpocznij rejestrację krzywej. Ta wartość jest nazywana zerem. Włącz lampkę pomiarową i odczekaj około 30 sekund, aż krzywa zareaguje.Wartość ta została nazwana F zero. Dostarcz nasycony impuls 4 000 mikromolowych fotonów na metr kwadratowy na sekundę przez 0,8 sekundy z PAM i uzyskaj najwyższą wartość skoku na krzywej przy zwiększonej intensywności fluorescencji. Ta wartość nazywa się Fm.Następnie użyj wzoru, aby obliczyć maksymalną wydajność kwantową drugiego systemu fotograficznego w ciemności.Aby zmierzyć zachowania fotosyntetyczne w stanie ustalonym, po zarejestrowaniu Fm należy napromienić próbkę liścia 30 mikromolowymi fotonami na metr kwadratowy na sekundę. Podczas włączania radiometru spektralnego w celu monitorowania współczynnika odbicia liści. Odczekaj co najmniej 20 minut, aż reakcja fotosyntezy osiągnie stan ustalony.W tym okresie reakcji impuls nasycenia będzie dostarczany w odstępach jednominutowych. Intensywność kwitnienia w stanie ustalonym nazywana jest Fs. Maksymalna wartość kwitnienia osiągnięta po 20 minutach pulsacyjnego światła nazywana jest liczbą pierwszą Fm. Zapisz w tym momencie odbicie spektralne.Aby obliczyć aktywność fotosyntezy w stanie ustalonym, należy obliczyć wydajność kwantową drugiego układu fotograficznego, którą można oszacować przez napromieniowanie nasyconymi impulsami w świetle aktynicznym. Oszacuj liniowy strumień elektronów z centrum reakcji dwóch układów fotograficznych. Następnie oblicz niefotochemiczne wygaszanie i oblicz fotochemiczny wskaźnik odbicia z 531 i 570 nanometrów.Po uzyskaniu Fs i współczynnika odbicia liścia wyłącz światło aktyniczne i zapewnij impuls nasycający w jednominutowych odstępach podczas ciemnej relaksacji. Maksymalna wartość kwitnienia indukowana impulsem nasycenia w ciemności nazywana jest podwójną liczbą pierwszą Fm. I zapisz dane podwójnie pierwotne Fm po dwóch i 10 minutach po wyłączeniu światła aktynicznego.Aby obliczyć parametry niefotochemicznego wygaszania z łączników relaksacyjnych, oszacuj qE za pomocą dwuminutowych danych podwójnych liczb pierwszych adaptacji do ciemności Fm. Oblicz hartowanie zależne od zantoksylum, qZ, z 10-minutowymi danymi Fm dotyczącymi adaptacji do ciemności podwójnej liczby pierwszej. Następnie oblicz stan fotohamowania.Jako następny pomiar włącz światło aktyniczne o prędkości 60 mikromolowych fotonów na metr kwadratowy na sekundę i powtórz ten sam pomiar. W tym reprezentatywnym eksperymencie porównano rośliny typu dzikiego i zmutowanego. Zmiana współczynnika odbicia fotochemicznego, PRI, obliczona na podstawie współczynnika odbicia liści, została wykreślona w stosunku do zależnego od światła liniowego przepływu elektronów z drugiego układu fotograficznego, zgodnie z oszacowaniem fluorometru PAM.W tym eksperymencie zmiana PRI była ujemnie skorelowana z liniowym przepływem elektronów w roślinach typu dzikiego, ale nie w roślinach zmutowanych. qZ, który reprezentuje cykl ksantofilu, został pofrakcjonowany z ciemnych łączników relaksacyjnych niefotochemicznego wygaszania i został również wykreślony w stosunku do zmiany PRI. W tej analizie qZ była również silnie skorelowana ze zmianą PRI dla obu szczepów roślin, co sugeruje, że PRI odzwierciedla cykl ksantofilowy.Do jednoczesnego pomiaru tej samej powierzchni skrzydła przy użyciu tego samego źródła światła lub natężenia należy użyć tego samego włókna detekcyjnego w urządzeniu mocującym, aby ustawić skrzydło w pionie. Spektroskopia refleksyjna może być wykorzystana w analizie różnych fenotypów, roślin dzikich i zmutowanych w celu wyjaśnienia mechanizmów molekularnych roślin.

evaluation-photosynthetic-behaviors-simultaneous-measurements-leaf

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Celem tej procedury jest wykazanie powtarzalności i zdolności adaptacyjnych stosowania formatu płytki do mikroglonów do badań przesiewowych. Ten szybki ekran łączy fluorometrię WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) w celu pomiaru wydajności fotosyntezy jako wskaźnika zdrowia Photosystem II (PSII) z kokulturami bakterii i glonów o małej objętości.

Test biologiczny o małej objętości do oceny wspólnej hodowli bakterii i fitoplanktonu przy użyciu fluorometrii z modulacją amplitudy WATER-Pulse-Amplitude (WATER-PAM)

Przedstawiono eksperymentalny protokół oceny systemów korzeniowych roślin uprawianych w glebie za pomocą RGB i obrazowania hiperspektralnego. Połączenie szeregów czasowych obrazu RGB z informacjami chemometrycznymi ze skanów hiperspektralnych optymalizuje wgląd w dynamikę korzeni roślin.

RGB i spektralne obrazowanie korzeni do fenotypowania roślin i badań fizjologicznych: konfiguracja eksperymentalna i protokoły obrazowania

Tutaj prezentujemy protokół do badania zachowań związanych ze wzrostem roślin, a zwłaszcza fenotypów w powtarzalny sposób. Pokazujemy, jak zapewnić zmienne, a jednocześnie stabilne warunki oświetleniowe. Prawidłowe analizy zależą od wystarczającej liczby prób i prawidłowych ocen statystycznych.

Analiza zachowania wzrostu Arabidopsis thaliana w różnych jakościach światła

Ten protokół opisuje oryginalną konfigurację łączącą pomiary czasu życia widma i fluorescencji w celu oceny transferu energii rezonansu Förstera (FRET) między sondami fluorescencyjnymi na bazie rodaminy a polimerem ligniny bezpośrednio w grubych sekcjach rośliny.

Pomiar interakcji między sondami fluorescencyjnymi a ligniną w skrawkach roślin za pomocą sFLIM w oparciu o natywną autofluorescencję

Szybki fluorometr powtarzalności (FRRf) jest korzystną metodą pomiaru fotofizjologii II fotosystemu i produktywności pierwotnej. W tym miejscu opisujemy protokół pomiaru fotofizjologii PSII alg epizoicznych, Colacium sp. na zooplanktonie substratowym za pomocą FRRf typu kuwetowego.

Pomiar fotofizjologii dołączonego stadium Colacium sp. za pomocą fluorometru kuwetowego o dużej częstotliwości powtarzania

Protokół wprowadza wysokoprzepustową metodę pomiaru relaksacji niefotochemicznego wygaszania za pomocą modulowanej amplitudą impulsów fluorometrii chlorofilu. Metodę tę stosuje się do Glycine max uprawianej na polu i można ją dostosować do innych gatunków w celu przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem różnorodności genetycznej lub populacji hodowlanych.

Wysokoprzepustowa analiza niefotochemicznego hartowania w uprawach przy użyciu fluorometrii chlorofilu z modulacją amplitudy impulsów

Opisujemy podejście do pomiaru zmian w wydajności fotosyntezy w roślinach po traktowaniu niskim poziomemCO2 za pomocą fluorescencji chlorofilu.

Ocena efektywności fotosyntezy w mutantach fotooddechowych za pomocą analizy fluorescencji chlorofilu

Obecny protokół opisuje krok po kroku obrazowanie autofluorescencyjne i ocenę zmian fikobiliproteinowych u czerwonych alg na podstawie analizy spektralnej. Jest to bezznacznikowa i nieniszcząca metoda oceny adaptacji komórkowej do ekstremalnych siedlisk, gdy dostępny jest tylko rzadki materiał, a komórki rosną powoli lub wcale w warunkach laboratoryjnych.

Obrazowanie autofluorescencyjne w celu oceny fizjologii czerwonych alg

Tutaj opisujemy zaawansowane narzędzie przeznaczone do monitorowania biosyntezy chlorofilu podczas wczesnych etapów deetiolacji siewek rzodkiewnika. Nowatorska metodologia umożliwia nieinwazyjne obrazowanie fluorescencji chlorofilu w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.

Nieinwazyjny test do oznaczania kinetyki biosyntezy chlorofilu we wczesnych stadiach deetiolacji rzodkiewnika

Niniejszy manuskrypt opisuje niedestrukcyjne, wysokoprzepustowe podejście do autonomicznych pomiarów terenowych o wydajności kwantowej fotosystemu II, odbiciu spektralnym oraz architekturze roślin, umożliwiając wielkoskalowe fenotypowanie fotosyntezy korony w próbach polowych agronomicznych i hodowlanych.

Wysokoprzepustowe, terenowe badania wydajności fotosyntetycznej roślin uprawnych z wykorzystaniem autonomicznego robota

Poznaj metodę jednoczesnego pomiaru fluorescencji chlorofilu i odbicia liści u Arabidopsis. Technika umożliwia monitorowanie zachowań fotosyntetycznych roślin w czasie rzeczywistym w naturalnych warunkach środowiskowych.

Ocena zachowań fotosyntetycznych poprzez jednoczesne pomiary współczynnika odbicia liści i analizy fluorescencji chlorofilu

Przeglądaj więcej filmów