Przygotowanie próbki osocza do spektrometrii mas przy użyciu zautomatyzowanej stacji roboczej

Ten zautomatyzowany przepływ pracy zapewnia spójne trawienie enzymatyczne białek z doskonałą odtwarzalnością i przepustowością. Poprawia to dokładność i niezawodność odkrywania, walidacji i stosowania klinicznego biomarkerów za pomocą spektrometrii mas. Zaletą tej technologii jest to, że cały proces pracy można wykonać dla 96 próbek w ciągu około pięciu godzin, przy CV wewnątrz i między testami poniżej 20% dla większości białek.

To dokładne, wysokowydajne przygotowanie próbek umożliwia nam badanie proteomów chorobowych tkanek lub płynów biologicznych na większą skalę. Ponadto zautomatyzowany proces przygotowywania próbek proteomicznych stanowi solidną podstawę do analizy proteomicznej o wysokiej zawartości i ilościowej analizy proteomicznej. Procedurę zademonstrują dr Qin Fu, dyrektor Centrum Wysokiej Przepustowości w Cedar Sinai oraz pan Casey Johnson, pracownik naukowy z mojego laboratorium.

Przed rozpoczęciem analizy dodaj pięć mikrolitrów zebranego zdrowego osocza ludzkiego do 96-okrągłej płytki propylenowej. Po załadowaniu wszystkich próbek otwórz oprogramowanie urządzenia do obsługi cieczy i na karcie metody wybierz położenie początkowe wszystkich osi, aby zorientować automatyczną obsługę cieczy. Upewnij się, że wszystkie strzykawki stacji roboczej nie zawierają widocznych pęcherzyków powietrza i otwórz nową metodę, a następnie kliknij przycisk Uruchom, aby zainicjować metodę.

Wprowadź wartość true w monicie wprowadź wartość, która ma być używana dla automatycznego podajnika próbek, aby przygotować płytkę automatycznego podajnika próbek na końcu metody, a następnie kliknij przycisk OK. Wprowadź jeden z nich w wierszu polecenia Wprowadź wartość, która ma być używana w pierwszej kolumnie, a następnie kliknij przycisk OK. Wprowadź wartość 12 w wierszu polecenia wprowadź wartość, która ma być używana w ostatniej kolumnie, a następnie kliknij przycisk OK. Jeśli używana jest płytka z próbką o objętości co najmniej 20 mikrolitrów, wprowadź wartość true w polu wprowadź wartość, która ma być używana dla płytki próbki, a następnie kliknij przycisk OK. Postępuj zgodnie ze wskazówkami wyświetlanymi w oknie Guided Labware Setup (Konfiguracja oprogramowania laboratoryjnego z przewodnikiem) i kliknij przycisk Continue (Kontynuuj). Załaduj odpowiednie odczynniki do odpowiednich studzienek i kliknij przycisk Dalej. Kliknij ponownie przycisk Dalej, aby ułożyć pokład automatycznej obsługi cieczy, jak pokazano na ilustracji, w tym płytki odczynników, reakcji, próbek i automatycznego podajnika próbek, sześciodołkowe pudełka na końcówki o pojemności 90 mikrolitrów, puste pudełko na końcówki o pojemności 90 mikrolitrów i pełne pudełko na końcówki o pojemności 230 mikrolitrów.

Następnie kliknij przycisk Zakończ, aby rozpocząć metodę. Po wyświetleniu monitu o kontynuację po odwirowaniu wyjmij płytkę reakcyjną i umieść ją w wirówce. Po zakończeniu wirowania przywróć płytkę reakcyjną do pozycji w automatycznym urządzeniu do obsługi cieczy i kliknij przycisk Kontynuuj.

W przypadku chromatografii cieczowej i analizy tandemowej spektrometrii mas peptydy należy rozpuścić w kolumnie C18 o wymiarach 2,1 na 100 milimetrów i długości 3,5 mikrometra za pomocą wysokoprzepływowej wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej o natężeniu przepływu 250 mikrolitrów na minutę i przeanalizować w linii na spektrometrze masowym z potrójnym kwadrupolem. Pięć minut po załadowaniu zrównoważyć kolumnę 5% roztworem buforu B i eluować peptydy z liniowym gradientem buforu B 5-35% przez 30 minut. Pod koniec elucji przemywać kolumnę 98% buforem B przez 10 minut, a następnie przemywać 5% buforem B przez pięć minut przed załadowaniem następnej próbki.

W celu przekierowania online należy użyć dwufazowego zaworu przełączającego, aby skierować eluent po kolumnie do odpadów, zanim dostanie się do źródła jonów. Gdy wszystkie próbki zostaną wymyte, można przetworzyć wiele danych z monitorowania reakcji. W tej reprezentatywnej analizie monitorowano trzy peptydy beta-gal i dwa peptydy albuminowe z wzbogaconymi białkami beta-galu i przetworzonymi białkami albuminy osocza.

Precyzja procesu automatycznego przygotowywania próbek została obliczona jako procent współczynnika wariancji całkowitego przepływu pracy monitorowania wybranych reakcji proteomicznych pomniejszony o procentowy współczynnik wariancji tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej. Zgodnie z oczekiwaniami zaobserwowano dobre natężenie sygnału zarówno dla albuminy surowicy ludzkiej, jak i białek beta-gal. Aby monitorować precyzję etapów przenoszenia cieczy, można zwiększyć stabilne wzorce peptydów znakowane izotopem dla endogennej albuminy surowicy ludzkiej i egzogennego białka beta-gal w niezależnych etapach przenoszenia odczynników.

Aby zweryfikować zautomatyzowany proces przygotowania próbek proteomicznych, obliczono wartości współczynnika wariancji w ciągu dnia z 21 dołków przygotowanych tego samego dnia. Średni procentowy współczynnik wariancji śróddziennej dla 40 białek wahał się od 4 do 20%Aby ocenić efekt krawędziowy zautomatyzowanego przepływu pracy opartego na płytkach, procentowy współczynnik wariancji można obliczyć na podstawie określonych dołków w wyznaczonych kolumnach i wierszach. W tym reprezentatywnym eksperymencie intensywność sygnału monitorowania wielokrotnej reakcji była podobna we wszystkich konfiguracjach kolumn i rzędów z procentowym współczynnikiem wariancji w zakresie od 3 do 22%Najważniejsze kroki to prawidłowe dodanie próbki zgodnie z żądaną mapą płytki 96-dołkowej i prawidłowe ustawienie płytki odczynnika zgodnie z instrukcją oprogramowania.

Ta zautomatyzowana metoda przygotowania próbek proteomicznych pozwala naukowcom na gromadzenie wiarygodnych i ilościowych danych proteomicznych na dużą skalę.