Name: Przygotowanie próbki osocza do spektrometrii mas przy użyciu zautomatyzowanej stacji roboczej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną metodę trawienia białek osocza do spektrometrii masowej analizy proteomicznej. Protokół umożliwia przygotowanie 96 próbek w około pięć godzin z powtarzalnością CV poniżej 20%.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Reproducible+Automated+Proteomics+Sample+Preparation+Workflow+for+Quantitative+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation Workflow for Quantitative Mass Spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).</li>
<li>Lehmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+mass+spectrometry+proteomics+%28cMSP%29+for+medical+laboratory%3A+What+does+the+future+hold%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Clinical mass spectrometry proteomics (cMSP) for medical laboratory: What does the future hold?</a> Clinica Chimica Acta. 467, 51-58 (2017).</li>
<li>Abbatiello, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Interlaboratory+Study+to+Develop%2C+Analytically+Validate+and+Apply+Highly+Multiplexed%2C+Quantitative+Peptide+Assays+to+Measure+Cancer-Relevant+Proteins+in+Plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Interlaboratory Study to Develop, Analytically Validate and Apply Highly Multiplexed, Quantitative Peptide Assays to Measure Cancer-Relevant Proteins in Plasma.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2357-2374 (2015).</li>
<li>Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scoring+proteomes+with+proteotypic+peptide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Scoring proteomes with proteotypic peptide probes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (7), 577-583 (2005).</li>
<li>Carr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+peptide+measurements+in+biology+and+medicine%3A+best+practices+for+mass+spectrometry-based+assay+development+using+a+fit-for-purpose+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).</li>
<li>Yates, J. R. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pivotal+role+of+computers+and+software+in+mass+spectrometry+-+SEQUEST+and+20+years+of+tandem+MS+database+searching%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Pivotal role of computers and software in mass spectrometry - SEQUEST and 20 years of tandem MS database searching.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1804-1813 (2015).</li>
<li>Nilsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+in+high-throughput+proteomics%3A+ready+for+the+big+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry in high-throughput proteomics: ready for the big time.</a> Nature Methods. 7 (9), 681-685 (2010).</li>
<li>Van Eyk, J. E., Sobhani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Precision Medicine.</a> Circulation. 138 (20), 2172-2174 (2018).</li>
<li>Hoofnagle, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+Generation%2C+Quantification%2C+Storage%2C+and+Handling+of+Peptides+Used+for+Mass+Spectrometry-Based+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the Generation, Quantification, Storage, and Handling of Peptides Used for Mass Spectrometry-Based Assays.</a> Clinical Chemistry. 62 (1), 48-69 (2016).</li>
<li>Wijayawardena, B., Fu, Q., Johnson, C., Van Eyk, J. E., Kowalski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Reproducible+Automated+Proteomics+Sample+Preparation+on+Biomek+i-Series%5BTitle%5D)+AND+%22Technical+note%2C+Beckman+Coulter+Life+Science.+Document+%23+AAG-4890APP02%22%5BJournal%5D)">Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation on Biomek i-Series.</a> Technical note, Beckman Coulter Life Science. Document # AAG-4890APP02. 19, (2019).</li>
</ol>

Przetwarzanie próbek do spektrometrii mas wymaga denaturacji, redukcji i alkilowania białek w celu zablokowania cystein oraz trawienia trypsyny w celu rozszczepienia białek na peptydy. Każda reakcja chemiczna lub enzymatyczna musi zostać zainicjowana w określonym czasie i przeprowadzona w kontrolowanej temperaturze, a każdy etap procesu obejmuje wiele etapów przenoszenia cieczy, w których można wprowadzić eksperymentalne zmiany. Rozwiązaniem tego dylematu jest zautomatyzowane przetwarzanie próbek. Obecnie dostępne systemy obsługi cieczy mają możliwość przenoszenia odczynników do płytek 96-dołkowych z dokładnością i precyzją mniejszą niż 5%, w zależności od zastosowanego typu głowicy i końcówki, a także inkubacji próbek, w razie potrzeby z wstrząsaniem, w kontrolowanych temperaturach w zakresie od 14 °C do 70 °C. Użyliśmy zautomatyzowanej maszyny do obsługi cieczy do przetwarzania osocza do testów SRM w formacie 96-dołkowym.
W złożonych mieszaninach białek w surowicy, osoczu i innych próbkach biologicznych znajduje się wiele tysięcy miejsc rozszczepienia proteazy; Każde z tych białek ma unikalne właściwości wpływające na dostępność miejsca rozszczepienia i stabilność powstałych peptydów. W związku z tym niemożliwe jest zaprojektowanie procedury przetwarzania próbki, która byłaby optymalna dla każdego białka. Najlepszą alternatywą jest bycie tak konsekwentnym, jak to tylko możliwe.
Aby osiągnąć spójność, zoptymalizowaliśmy każdy etap pipetowania wykonywany przez automatyczną centralę do obsługi cieczy. Najpierw rozważyliśmy wymaganą objętość i ograniczenia wynikające z rodzaju cieczy (plazmowa, wodna lub organiczna) i odpowiadających im właściwości (lepkość, spójność i lotność), sprzętu (głowica pipetująca na stanowisku roboczym i ramiona chwytające płytkę) oraz sprzętu laboratoryjnego. Następnie zmienialiśmy prędkość i ciągnącą szczelinę powietrzną do zasysania, prędkość i objętość wydmuchu do dozowania oraz siłę i czas mieszania, jednocześnie włączając dotyk końcówki po zasysaniu i/lub dozowaniu, jeśli to konieczne, aby wyeliminować przywieranie cieczy do zewnętrznej strony końcówek (Rysunek 13, Tabela uzupełniająca 1). Unikalny peptyd SIL, wstępnie przebadany pod kątem stabilności, został dodany do każdego odczynnika, aby umożliwić monitorowanie precyzji każdego etapu obchodzenia się z cieczą. Po optymalizacji, CV procesu dla większości przejść wynosiło mniej niż 10%, co świadczy o dobrej odtwarzalności ze zautomatyzowaną stacją roboczą (Rysunek 9, Rysunek 10, Rysunek 11 i Rysunek 12).
Przedstawiony tutaj zautomatyzowany przepływ pracy zapewnia spójne trawienie enzymatyczne z lepszą odtwarzalnością i przepustowością w porównaniu z metodami ręcznymi (Rysunek 9, Rysunek 10). Podejście to daje nadzieję na poprawę dokładności i niezawodności odkrywania i walidacji biomarkerów za pomocą spektrometrii mas.

Kwantyfikacja białek i peptydów oparta na spektrometrii mas (MS) jest coraz częściej stosowana jako narzędzie bioanalityczne do analizy osocza w podstawowych laboratoriach badawczych i klinicznych2,3. Niezbędne oprzyrządowanie i informatyka szybko się rozwinęły, ponieważ MS stała się metodą z wyboru do ilościowego oznaczania białek lub zmodyfikowanych białek poprzez ukierunkowanie na określone sekwencje peptydów ze względu na jej zdolność do ilościowego oznaczania setek peptydów w jednym przebiegu MS4. Przygotowanie próbki służy jako podstawa każdej analizy proteomicznej. Przed analizą MS białka w próbce biologicznej są zazwyczaj denaturowane, redukowane, alkilowane, trawione do peptydów tryptycznych i odsalane5. Alkilacja blokuje cysteiny, aby zapobiec niekontrolowanym modyfikacjom i zapewnić, że wszystkie cysteiny mają tę samą masę. Następnie dodaje się trypsynę w celu trawienia białek do peptydów. Każdy z tych kroków wymaga optymalizacji, a cały proces tradycyjnie wykonywany jest ręcznie, co pozwala na wprowadzenie błędów analitycznych.
Tradycyjny proces rozwoju biomarkerów składa się z dwóch głównych procesów: proteomiki shotgun do globalnego odkrycia białek w celu stworzenia dogłębnego inwentarza białek6 oraz ukierunkowanej proteomiki do weryfikacji i walidacji mającej na celu precyzyjne i wysokoprzepustowe oznaczanie ilościowe białek7. Niezależnie od podejścia MS, przygotowanie próbki jest takie samo i koncentruje się na enzymatycznym rozszczepieniu białek do mieszaniny peptydów. Zgodnie z propozycją Van Eyka i Sobhani8, posiadanie metody, która pozwala na dokładną, precyzyjną i powtarzalną analizę zarówno dla testów odkrywczych, jak i celowanych, jest pożądane, aby skutecznie przenieść odkryte biomarkery do testów klinicznych. W tym celu pomocna będzie automatyzacja przygotowywania próbek, która zapewni możliwość zwiększenia wydajności analizy o wysokiej przepustowości. Metody ręczne zazwyczaj wprowadzają błędy analityczne wykraczające poza dopuszczalne limity określone przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) w zmienionych wytycznych dotyczących walidacji metod bioanalitycznych, które obejmują biomarkery i diagnostykę2,9. Opracowanie szybkiego, bardzo dokładnego i bezobsługowego procesu przygotowywania próbek białek MS będzie konieczne, aby ułatwić badania nad biomarkerami, które wymagają przygotowania i analizy tysięcy próbek biologicznych. Przygotowanie próbki SM składa się z wielu etapów, w których mogą zostać wprowadzone błędy, a proces ten jest żmudny i czasochłonny.
W naszej ulepszonej metodzie, zautomatyzowana stacja robocza została zaprogramowana do wykonywania wszystkich niezbędnych procedur przygotowania próbki plazmy w sumie 6 kroków (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), aby zapewnić: 1) dokładne transfery cieczy; 2) reakcja jest inicjowana i zatrzymywana w określonym czasie; 3) reakcja odbywa się w kontrolowanej temperaturze (tj. w inkubatorze); i 4) reakcja ma równomierne mieszanie dla wszystkich reakcji. Wdrożyliśmy również dodawanie egzogennych białek kontroli jakości i wzorców wewnętrznych (wzorce peptydów znakowanych stabilnymi izotopami), aby zapewnić jakość i powtarzalną przepustowość kwantyfikacji białek i peptydów na bazie LC-MS w formacie 96-dołkowym. Łącznie z przygotowaniem odczynników, godzinami pracy i łącznie 1 000 000 etapów pipetowania wymagałoby przetworzenia 96 próbek w pojedynczych probówkach. Automatyzacja skraca czas pracy i zmniejsza liczbę interakcji międzyludzkich.

<table><tbody><tr><td>Wspólna biorekultywacja</td> <td>zdrowego osocza ludzkiego</td> Inc.<td></td><td>osocze ludzkie testowane w manuskrypcie</td></tr><tr><td>Acetonitryl, HPLC Grade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A998SK1</td><td>LC MS/MS rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>B-galaktozydaza Rekombinowana z</td><td>egzogennych białek kontrolnych</td> E.Coli <td>Sigma-Aldrich</td><td>G3153-5MG</td>.</tr><tr><td>Zautomatyzowana stacja robocza Biomek i7</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Stanowisko do przygotowywania próbek proteomicznych: Zautomatyzowane stacje robocze Biomek nie są przeznaczone ani zatwierdzone do stosowania w diagnostyce chorób lub innych schorzeń</td></tr><tr><td>Biomek i-Series Tips 230&micro; L Niesterylny</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B85903&nbsp;</td><td>Końcówki, materiały eksploatacyjne do i7</td></tr><tr><td>Końcówki Biomek i-Series 90&micro; L Niesterylny</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B85881&nbsp;</td><td>Końcówki, materiały eksploatacyjne do i7</td></tr><tr><td>FG, Zestaw Trypsyna TPCK</td><td>Sciex</td><td>4445250</td><td>Trypsyna stosowana w trawieniu</td></tr><tr><td>Hard-Shell 96-dołkowe płytki PCR, niskoprofilowe, cienkościenne, listwowe, zielone/przezroczyste&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>#hsp9641</td><td>Płytka automatycznego podajnika</td></tr><tr><td>próbek Oktyl B-D-Glukopiranozyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O9882-5G</td><td>detergent stosowany w trawieniu</td></tr><tr><td>Polipropylen, 96-okrągłe płytki głębinowe Sterylne</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>267007</td><td>Odczynnik i płytka mineralizująca</td></tr><tr><td>Wybitność System HPLC UFLCXR</td><td>Shimadzu, Japonia</td><td></td><td>System LC o wysokim przepływie</td></tr><tr><td>QTRAP 6500</td><td>SCIEX</td><td></td><td>Spektrometr masowy</td></tr><tr><td>Woda, klasa HPLC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>W54</td><td>LC MS/MS rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Xbridge BEH30 C18 2,1 mm x 100 mm</td><td>Wody</td><td>186003564</td><td>kolumna LC MSMS</td></tr></tbody></table>

przygotowanie próbki osocza do spektrometrii mas przy użyciu zautomatyzowanej stacji roboczej

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Przygotowanie próbki do analizy spektrometrii mas w proteomice wymaga enzymatycznego rozszczepienia białek do mieszaniny peptydów. Proces ten obejmuje liczne etapy inkubacji i transferu cieczy w celu osiągnięcia denaturacji, redukcji, alkilacji i rozszczepienia. Dostosowanie tego przepływu pracy do zautomatyzowanej stacji roboczej może zwiększyć wydajność i zmniejszyć współczynniki wariancji, zapewniając w ten sposób bardziej wiarygodne dane do porównań statystycznych między typami próbek. Wcześniej opisaliśmy zautomatyzowany proces przygotowania próbek proteomicznych1. W tym miejscu informujemy o rozwoju bardziej wydajnego i lepiej kontrolowanego przepływu pracy z następującymi zaletami: 1) Liczba etapów przenoszenia cieczy została zmniejszona z dziewięciu do sześciu poprzez połączenie odczynników; 2) Czas pipetowania jest skracany dzięki selektywnemu pipetowaniu końcówkami przy użyciu 96-pozycyjnej głowicy pipetującej z wieloma kanałami; 3) Potencjalna przepustowość jest zwiększona dzięki dostępności do 45 miejsc pokładowych; 4) Kompletna obudowa systemu zapewnia lepszą kontrolę temperatury i środowiska oraz zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia próbek lub odczynników; oraz 5) Dodanie stabilnych peptydów znakowanych izotopami, a także białka β-galaktozydazy do każdej próbki umożliwia monitorowanie i kontrolę jakości w całym procesie. Te ulepszenia sprzętowe i procesowe zapewniają dobrą odtwarzalność i poprawiają precyzję wewnątrz i między testami (CV poniżej 20%) dla kwantyfikacji białek i peptydów na podstawie LC-MS. Cały proces trawienia 96 próbek na 96-dołkowej płytce można zakończyć w ciągu około 5 godzin.

Tutaj prezentujemy zautomatyzowaną metodę trawienia białek osocza do ilościowej analizy proteomicznej opartej na spektrometrii mas. W tym protokole etapy przenoszenia cieczy i inkubacji w celu denaturacji, redukcji, alkilowania i trawienia trypsyny są usprawnione i zautomatyzowane. Przygotowanie płytki 96-dołkowej z pożądaną precyzją zajmuje około pięciu godzin.

Przygotowanie próbki osocza do spektrometrii mas przy użyciu zautomatyzowanej stacji roboczej

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Ten zautomatyzowany przepływ pracy zapewnia spójne trawienie enzymatyczne białek z doskonałą odtwarzalnością i przepustowością. Poprawia to dokładność i niezawodność odkrywania, walidacji i stosowania klinicznego biomarkerów za pomocą spektrometrii mas. Zaletą tej technologii jest to, że cały proces pracy można wykonać dla 96 próbek w ciągu około pięciu godzin, przy CV wewnątrz i między testami poniżej 20% dla większości białek.To dokładne, wysokowydajne przygotowanie próbek umożliwia nam badanie proteomów chorobowych tkanek lub płynów biologicznych na większą skalę. Ponadto zautomatyzowany proces przygotowywania próbek proteomicznych stanowi solidną podstawę do analizy proteomicznej o wysokiej zawartości i ilościowej analizy proteomicznej. Procedurę zademonstrują dr Qin Fu, dyrektor Centrum Wysokiej Przepustowości w Cedar Sinai oraz pan Casey Johnson, pracownik naukowy z mojego laboratorium.Przed rozpoczęciem analizy dodaj pięć mikrolitrów zebranego zdrowego osocza ludzkiego do 96-okrągłej płytki propylenowej. Po załadowaniu wszystkich próbek otwórz oprogramowanie urządzenia do obsługi cieczy i na karcie metody wybierz położenie początkowe wszystkich osi, aby zorientować automatyczną obsługę cieczy. Upewnij się, że wszystkie strzykawki stacji roboczej nie zawierają widocznych pęcherzyków powietrza i otwórz nową metodę, a następnie kliknij przycisk Uruchom, aby zainicjować metodę.Wprowadź wartość true w monicie wprowadź wartość, która ma być używana dla automatycznego podajnika próbek, aby przygotować płytkę automatycznego podajnika próbek na końcu metody, a następnie kliknij przycisk OK. Wprowadź jeden z nich w wierszu polecenia Wprowadź wartość, która ma być używana w pierwszej kolumnie, a następnie kliknij przycisk OK. Wprowadź wartość 12 w wierszu polecenia wprowadź wartość, która ma być używana w ostatniej kolumnie, a następnie kliknij przycisk OK. Jeśli używana jest płytka z próbką o objętości co najmniej 20 mikrolitrów, wprowadź wartość true w polu wprowadź wartość, która ma być używana dla płytki próbki, a następnie kliknij przycisk OK. Postępuj zgodnie ze wskazówkami wyświetlanymi w oknie Guided Labware Setup (Konfiguracja oprogramowania laboratoryjnego z przewodnikiem) i kliknij przycisk Continue (Kontynuuj). Załaduj odpowiednie odczynniki do odpowiednich studzienek i kliknij przycisk Dalej. Kliknij ponownie przycisk Dalej, aby ułożyć pokład automatycznej obsługi cieczy, jak pokazano na ilustracji, w tym płytki odczynników, reakcji, próbek i automatycznego podajnika próbek, sześciodołkowe pudełka na końcówki o pojemności 90 mikrolitrów, puste pudełko na końcówki o pojemności 90 mikrolitrów i pełne pudełko na końcówki o pojemności 230 mikrolitrów.Następnie kliknij przycisk Zakończ, aby rozpocząć metodę. Po wyświetleniu monitu o kontynuację po odwirowaniu wyjmij płytkę reakcyjną i umieść ją w wirówce. Po zakończeniu wirowania przywróć płytkę reakcyjną do pozycji w automatycznym urządzeniu do obsługi cieczy i kliknij przycisk Kontynuuj.W przypadku chromatografii cieczowej i analizy tandemowej spektrometrii mas peptydy należy rozpuścić w kolumnie C18 o wymiarach 2,1 na 100 milimetrów i długości 3,5 mikrometra za pomocą wysokoprzepływowej wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej o natężeniu przepływu 250 mikrolitrów na minutę i przeanalizować w linii na spektrometrze masowym z potrójnym kwadrupolem. Pięć minut po załadowaniu zrównoważyć kolumnę 5% roztworem buforu B i eluować peptydy z liniowym gradientem buforu B 5-35% przez 30 minut. Pod koniec elucji przemywać kolumnę 98% buforem B przez 10 minut, a następnie przemywać 5% buforem B przez pięć minut przed załadowaniem następnej próbki.W celu przekierowania online należy użyć dwufazowego zaworu przełączającego, aby skierować eluent po kolumnie do odpadów, zanim dostanie się do źródła jonów. Gdy wszystkie próbki zostaną wymyte, można przetworzyć wiele danych z monitorowania reakcji. W tej reprezentatywnej analizie monitorowano trzy peptydy beta-gal i dwa peptydy albuminowe z wzbogaconymi białkami beta-galu i przetworzonymi białkami albuminy osocza.Precyzja procesu automatycznego przygotowywania próbek została obliczona jako procent współczynnika wariancji całkowitego przepływu pracy monitorowania wybranych reakcji proteomicznych pomniejszony o procentowy współczynnik wariancji tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej. Zgodnie z oczekiwaniami zaobserwowano dobre natężenie sygnału zarówno dla albuminy surowicy ludzkiej, jak i białek beta-gal. Aby monitorować precyzję etapów przenoszenia cieczy, można zwiększyć stabilne wzorce peptydów znakowane izotopem dla endogennej albuminy surowicy ludzkiej i egzogennego białka beta-gal w niezależnych etapach przenoszenia odczynników.Aby zweryfikować zautomatyzowany proces przygotowania próbek proteomicznych, obliczono wartości współczynnika wariancji w ciągu dnia z 21 dołków przygotowanych tego samego dnia. Średni procentowy współczynnik wariancji śróddziennej dla 40 białek wahał się od 4 do 20%Aby ocenić efekt krawędziowy zautomatyzowanego przepływu pracy opartego na płytkach, procentowy współczynnik wariancji można obliczyć na podstawie określonych dołków w wyznaczonych kolumnach i wierszach. W tym reprezentatywnym eksperymencie intensywność sygnału monitorowania wielokrotnej reakcji była podobna we wszystkich konfiguracjach kolumn i rzędów z procentowym współczynnikiem wariancji w zakresie od 3 do 22%Najważniejsze kroki to prawidłowe dodanie próbki zgodnie z żądaną mapą płytki 96-dołkowej i prawidłowe ustawienie płytki odczynnika zgodnie z instrukcją oprogramowania.Ta zautomatyzowana metoda przygotowania próbek proteomicznych pozwala naukowcom na gromadzenie wiarygodnych i ilościowych danych proteomicznych na dużą skalę.

a-plasma-sample-preparation-for-mass-spectrometry-using-an-automated

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Cyfrowa mikroprzepływność to technika polegająca na manipulowaniu pojedynczymi kroplami (~nL - mL) na macierzy elektrod poprzez przykładanie pól elektrycznych. Jest ona odpowiednia do przeprowadzania szybkich, sekwencyjnych, zminiaturyzowanych zautomatyzowanych analiz biochemicznych. W niniejszej pracy przedstawiamy platformę zdolną do automatyzacji kilku etapów przetwarzania proteomicznego.

Cyfrowa mikroprzepływowość w zautomatyzowanym przetwarzaniu proteomicznym

Ten protokół opisuje powtarzalną i niezawodną metodę opartego na sublimacji przygotowania tkanki utrwalonej formaliną przeznaczonej do obrazowania spektrometrii mas.

Optymalne przygotowanie próbek utrwalonych formaliną do obrazowania metodą spektrometrii mas wspomaganej desorpcją/jonizacją laserową na bazie peptydów

Szczegółowy protokół jest opisany do separacji, identyfikacji i charakterystyki proteoform w próbkach białek za pomocą elektroforezy strefy kapilarnej-elektrorozpylania jonizacji-tandemowej spektrometrii mas (CZE-ESI-MS/MS). Protokół może być wykorzystany do charakterystyki proteoform w prostych próbkach białkowych w wysokiej rozdzielczości oraz do identyfikacji proteoform na dużą skalę w złożonych próbkach proteomów.

Proteomika na dużą skalę z wykorzystaniem tandemowej spektrometrii mas z elektroforezą strefy kapilarnej

Charakterystyka proteomu łożysk mikronaczyniowych oka jest kluczowa dla dogłębnego zrozumienia wielu patologii oczu u ludzi. Badanie to demonstruje skuteczną, szybką i solidną metodę ekstrakcji białek i przygotowania próbek z małych naczyń krwionośnych, wykorzystującą krótkie tylne tętnice rzęskowe świń jako naczynia modelowe do analiz proteomicznych opartych na spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do analizy proteomicznej mikronaczyń oka w oparciu o spektrometrię mas

Ten artykuł przedstawia metody przygotowania próbek dla unikalnej metody analitycznej w czasie rzeczywistym opartej na spektrometrii mas otoczenia. Metoda ta pozwala nam na przeprowadzanie analizy cząsteczek biologicznych in vivo w czasie rzeczywistym bez konieczności przeprowadzania specjalnych zabiegów wstępnych.

Przygotowanie próbki do spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania sondy

Sfingolipidy to bioaktywne metabolity o ugruntowanej roli w chorobach człowieka. Scharakteryzowanie zmian w tkankach za pomocą spektrometrii mas może ujawnić role w etiologii choroby lub zidentyfikować cele terapeutyczne. Jednak związek KTT stosowany do kriokonserwacji w biorepozytoriach zakłóca spektrometrię mas. Przedstawiono metody analizy sfingolipidów w tkankach ludzkich osadzonych w OCT za pomocą LC-ESI-MS/MS.

Przygotowanie tkanek ludzkich osadzonych w związku o optymalnej temperaturze skrawania do analizy metodą spektrometrii mas

Zwiększona częstotliwość analiz farmakologicznych i toksykokinetycznych metali i związków na bazie metali u danio pręgowanego może być korzystna dla środowiskowych i klinicznych badań tłumaczeniowych. Ograniczenie związane z nieznaną ekspozycją na wodę zostało przezwyciężone poprzez przeprowadzenie analizy metali śladowych na strawionej tkance danio pręgowanego przy użyciu spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie.

Absorpcja dawki ekspozycji na związki na bazie platyny i rutenu u danio pręgowanego za pomocą spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie o szerszych zastosowaniach

Tutaj tworzymy metodę proteomiczną opartą na spektrometrii mas, używając izolowanych obszarów zainteresowania w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie skrawkach tkanki. Protokół ten służy do analizy proteomu z określonych obszarów tkanek w zarchiwizowanych odcinkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie.

Uproszczone podejście do proteomiki opartej na spektrometrii mas z wykorzystaniem wybranych regionów tkanek

Protokół ten ma na celu zachowanie metabolitów komórkowych dla jednokomórkowej spektrometrii mas (SCMS) poprzez połączenie płukania lotnego roztworu soli, szybkiego hartowania ciekłym azotem, liofilizacji i przechowywania w temperaturze -8 °C. Wykazano, że hartowanie ciekłym azotem jest niezbędne do utrzymania profili metabolitów, podczas gdy długotrwałe przechowywanie w chłodni powinno być zminimalizowane, aby zapobiec zmianom metabolicznym.

Przygotowanie próbek do badań metabolomicznych spektrometrii mas pojedynczych komórek: połączone mycie, hartowanie, suszenie i przechowywanie komórek

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Poznaj zautomatyzowaną metodę trawienia białek osocza do spektrometrii masowej analizy proteomicznej. Protokół umożliwia przygotowanie 96 próbek w około pięć godzin z powtarzalnością CV poniżej 20%.

Przygotowanie próbki osocza do spektrometrii mas przy użyciu zautomatyzowanej stacji roboczej

Przeglądaj więcej filmów