Indukowanie i charakterystyka stłuszczenia pęcherzykowego w zróżnicowanych komórkach HepaRG

Protokół ten opisuje, w jaki sposób indukować stłuszczenie pęcherzykowe wątroby w zróżnicowanych komórkach HepaRG oraz metody wykrywania i ilościowego oznaczania akumulacji lipidów. Ten model komórek ludzkich in vitro stanowi cenną alternatywę dla modeli in vivo myszy i pierwotnych ludzkich hepatocytów. Rozmrozić kriokonserwowaną partię komórek HepaRG o niskim pasażu azotu, zanurzając je w kąpieli o temperaturze 37 stopni Celsjusza do momentu rozmrożenia.

Szybko przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki zawierającej 10 mililitrów proliferującego podłoża. Po odwirowaniu przez pięć minut wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w pięciu mililitrach pożywki proliferującej. Policz komórki i rozcieńcz, aby uzyskać 250 000 komórek na centymetr kwadratowy.

Umieść komórki na 100-milimetrowych szalkach do hodowli komórkowych i odnawiaj pożywkę co dwa lub trzy dni. Komórki namnażają się w czasie podwajania wynoszącym około 24 godzin. Gdy komórki HepaRG osiągną 80% konfluencji, odłącz je przez trzy- do pięciu minut inkubacji z 0,05% roztworem trypsyny.

Zbierz komórki w proliferującej pożywce i wiruj przez pięć minut, tak jak poprzednio. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki pięcioma mililitrami pożywki proliferującej. Ponownie policz komórki i rozcieńcz, aby uzyskać 250 000 komórek na centymetr kwadratowy.

Na tym etapie amplifikuj komórki, powtarzając te kroki, aby osiągnąć odpowiednią liczbę komórek, aby rozpocząć eksperymenty. Aby dokonać kriokonserwacji komórek HepaRG, odłącz je 24 godziny po posianiu przez trzy- do pięciu minut inkubacji z 0,05% roztworem trypsyny. Zbierz komórki w proliferującej pożywce i wiruj przez pięć minut, tak jak poprzednio.

Wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze na partię pożywki zamrażającej i zakonserwować partie w ciekłym azocie. W dniu zerowym wysiewaj komórki HepaRG w ilości 250 000 komórek na centymetr kwadratowy do szalek poddanych działaniu kultur z odpowiednią objętością pożywki proliferacyjnej. Do każdego testu należy posiać dwie szalki, jedną dla komórek kontrolnych i jedną dla komórek poddanych działaniu oleinianu.

W drugim i czwartym dniu zmień pożywkę na odpowiednią objętość pożywki proliferacyjnej i pozwól komórkom rosnąć, aż osiągną zbieg. Siódmego dnia komórki muszą być w 100% zlewne. Umyj komórki raz za pomocą 1X PBS.

Następnie usuń 1X PBS i dodaj odpowiednią objętość pożywki różnicującej. W ósmym, dziewiątym, dwunastym, dwunastym i osiemnastym dniu przemyj komórki raz 1X PBS przed dodaniem odpowiedniej objętości pożywki różnicującej. W 21 dniu obserwuj komórki HepaRG pod mikroskopem i upewnij się, że komórki są zlewającymi się kulturami zróżnicowanymi.

Jako kontrolę, zbierz jedno naczynie kontrolne, aby przeprowadzić analizę ekspresji genów markerów różnicowania. W 21 dniu zróżnicowane komórki HepaRG można kriokonserwować w ciekłym azocie. W dniu 21 rozcieńczyć oleinian sodu odpowiednią objętością pożywki do całkowitego różnicowania do końcowego stężenia 250 mikromolów.

Dodać 99% metanolu w stosunku od 1 do 400 do innej podwielokrotności pożywki różnicującej, aby przeprowadzić obróbkę kontrolną pojazdu. Umyj komórki raz za pomocą 1X PBS i dodaj nośnik lub pożywkę z oleinianem sodu. W 23 i 25 dniu zmienić podłoże na odpowiednią objętość świeżo przygotowanego podłoża.

W 26 dniu obserwuj komórki za pomocą mikroskopii optycznej. Kropelki lipidów gromadzą się w komórkach traktowanych oleinianem sodu i są łatwo widoczne jako półprzezroczyste kropelki w cytoplazmie. Aby wykonać barwienie czerwienią olejową O, najpierw umyj komórki raz 1X PBS i całkowicie usuń 1X PBS.

Dodaj 4% paraformaldehydu i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usuń paraformaldehyd i umyj komórki dwukrotnie 1X PBS. Po usunięciu PBS inkubować komórki z 60% izopropanolem przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Usuń izopropanol i pozwól komórkom całkowicie wyschnąć w temperaturze pokojowej. Teraz dodaj roztwór roboczy Oil Red O do komórek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Objętość roztworu roboczego wymagana dla każdej próbki odpowiada objętości pożywki użytej do hodowli komórek.

Usuń roztwór czerwonej czerwieni olejowej O i natychmiast dodaj podwójnie destylowaną wodę. Po czterokrotnym umyciu komórek wodą podwójnie destylowaną, uzyskaj obrazy pod mikroskopem do analizy. Aby usunąć barwnik Oil Red O, usuń całą wodę i pozostaw do wyschnięcia.

Następnie dodaj jeden mililitr 100% izopropanolu i inkubuj przez 10 minut, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej. Odpipetować izopropanol za pomocą wymytego barwnika Oil Red O kilka razy w górę iw dół, upewniając się, że cała czerwień olejowa O znajduje się w roztworze. Przenieś roztwór do kuwety.

Zmierz gęstość optyczną przy 500 nanometrach za pomocą spektrofotometrii i użyj 100% izopropanolu jako ślepej próby. Umyj komórki raz za pomocą 1X PBS. Następnie inkubować ze 100 nanomolami Bodipy rozcieńczonymi w 1X PBS w ciemności przez 40 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Do pomiarów cytometrii przepływowej należy włączyć niebarwioną kontrolę. Usuń roztwór barwiący i umyj komórki raz 1X PBS. Następnie ponownie umyj komórki i całkowicie usuń PBS.

Dodaj 4% paraformaldehydu i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć paraformaldehyd i umyć próbki trzy razy przez pięć minut w PBS. Komórki mogą być przechowywane w 1X PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub natychmiast zobrazowane.

Do przechowywania owiń Parafilm i przykryj folią aluminiową, aby zapobiec wysychaniu komórek. Aby zweryfikować skuteczną indukcję stłuszczenia, komórki HepaRG traktowane oleinianem i kontrolne barwiono barwnikiem Oil Red O. Po zabarwieniu kropelki lipidów są łatwo widoczne jako czerwone kropelki.

Barwienie można określić ilościowo za pomocą spektrofotometrycznego pomiaru barwnika Oil R O eluowanego izopropanolem. Absorpcja eluowanego oleju Red O z komórek jest wprost proporcjonalna do akumulacji kropelek lipidów cytoplazmatycznych. Stężenie oleinianu sodu i czas ekspozycji określono za pomocą kolorymetrycznego testu żywotności komórek MTT.

Produkt Formozy jest określany ilościowo na podstawie jego absorbancji na poziomie 490 nanometrów i jest wprost proporcjonalny do liczby żywych komórek w hodowli. Leczenie oleinianem sodu porównano z leczeniem palmitynianem sodu. Jako kontrolę zastosowano lek apoptotyczny doksorubicynę.

Aby określić ilościowo wzrost zawartości lipidów komórkowych po traktowaniu oleinianem sodu, do znakowania kropelek lipidów zastosowano barwienie barwnikiem Bodipy. Za pomocą analizy cytofluorometrycznej możliwe jest ilościowe określenie zawartości trójglicerydów za pomocą średniej intensywności fluorescencji Bodipy'ego, która jest wyższa w komórkach traktowanych oleinianem w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Wskazuje to na efektywną akumulację tłuszczu po obróbce oleinianem.

Rzeczywiście, obrazy komórek barwionych Bodipy pokazują jasnozielone fluorescencyjne kropelki lipidów w komórkach traktowanych oleinianem, które nie są widoczne w komórkach kontrolnych. Aby dokładniej scharakteryzować akumulację kropelek lipidów po traktowaniu oleinianem sodu, mikroskopię CARS można przeprowadzić zgodnie z opisem w protokole tekstowym, który umożliwia ilościowe oznaczanie kropelek lipidów bez znakowania. Ten oparty na komórkach model może poszerzyć wiedzę na temat mechanizmów molekularnych związanych z nieonkotyczną stłuszczeniową chorobą wątroby i może doprowadzić do opracowania nowych markerów do wczesnej diagnozy i nowych strategii leczenia.