Name: Charakterystyka ładunku mutacyjnego i składu klonalnego krwi ludzkiej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Poznaj metodę analizy somatycznych mutacji w pojedynczych komórkach macierzystych krwi, która unika amplifikacji całogenomowej poprzez klonowanie in vitro. Technika ta umożliwia precyzyjne określenie obciążenia mutacyjnego i zrozumienie relacji klonalnych w hematopoezie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało wsparte grantem VIDI Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO) (nr 016.Vidi.171.023) dla R. v. B.

<ol><li>Osorio, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+Mutations+Reveal+Lineage+Relationships+and+Age-Related+Mutagenesis+in+Human+Hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis.</a> Cell Reports. 25, 2308-2316 (2018).</li>
<li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+Hematopoiesis+and+Blood-Cancer+Risk+Inferred+from+Blood+DNA+Sequence%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clonal Hematopoiesis and Blood-Cancer Risk Inferred from Blood DNA Sequence.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2477-2487 (2014).</li>
<li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Related+Clonal+Hematopoiesis+Associated+with+Adverse+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Age-Related Clonal Hematopoiesis Associated with Adverse Outcomes.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2488-2498 (2014).</li>
<li>Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+haematopoiesis+harbouring+AML-associated+mutations+is+ubiquitous+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Clonal haematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults.</a> Nature Communications. 7, 1-7 (2016).</li>
<li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., Wedge, D. C., Campbell, P. J., Stratton, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+Signatures+of+Mutational+Processes+Operative+in+Human+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Deciphering Signatures of Mutational Processes Operative in Human Cancer.</a> Cell Reports. 3, 246-259 (2013).</li>
<li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500, 415-421 (2013).</li>
<li>Alexandrov, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Repertoire+of+Mutational+Signatures+in+Human+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The Repertoire of Mutational Signatures in Human Cancer.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
<li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. 513, 422-425 (2014).</li>
<li>Blokzijl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+mutation+accumulation+in+human+adult+stem+cells+during+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life.</a> Nature. 538, 260-264 (2016).</li>
<li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genome+sequencing%3A+Current+state+of+the+science%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell genome sequencing: Current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17, 175-188 (2016).</li>
<li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+single-nucleotide+variants+in+whole-genome-amplified+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of single-nucleotide variants in whole-genome-amplified single cells.</a> Nature Methods. 14, 491-493 (2017).</li>
<li>Welch, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+evolution+of+mutations+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.</a> Cell. 150, (2012).</li>
<li>Jager, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mutation+accumulation+in+single+human+adult+stem+cells+by+whole-genome+sequencing+of+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring mutation accumulation in single human adult stem cells by whole-genome sequencing of organoid cultures.</a> Nature Protocols. 13, 59-78 (2018).</li>
<li>Boeva, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control-FREEC%3A+A+tool+for+assessing+copy+number+and+allelic+content+using+next-generation+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Control-FREEC: A tool for assessing copy number and allelic content using next-generation sequencing data.</a> Bioinformatics. 28, 423-425 (2012).</li>
<li>Blokzijl, F., Janssen, R., van Boxtel, R., Cuppen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MutationalPatterns%3A+Comprehensive+genome-wide+analysis+of+mutational+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">MutationalPatterns: Comprehensive genome-wide analysis of mutational processes.</a> Genome Medicine. 10, 1-11 (2018).</li>
<li>Thorvaldsdóttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Genomics+Viewer+%28IGV%29%3A+High-performance+genomics+data+visualization+and+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Integrative Genomics Viewer (IGV): High-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in Bioinformatics. 14, 178-192 (2013).</li>
<li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+single+human+hematopoietic+stem+cells+capable+of+long-term+multilineage+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment.</a> Science. , (2011).</li>
<li>Lee-Six, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+dynamics+of+normal+human+blood+inferred+from+somatic+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations.</a> Nature. 561, 473-478 (2018).</li>
<li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. , (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiono metodę wykrywania mutacji, które nagromadziły się w ciągu życia u poszczególnych HSPC i skonstruowania wczesnego drzewa linii rozwojowej na podstawie tych danych o mutacjach.
Aby pomyślnie przeprowadzić te testy, należy spełnić kilka krytycznych wymagań. Po pierwsze, należy zapewnić żywotność próbki. Szybkie obchodzenie się z próbką ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia skuteczności procedury. Po drugie, utrata siły działania czynnika wzrostu negatywnie wpłynie na ekspansję klonalną HSPC. Aby zapewnić wysoką moc czynnika wzrostu, ważne jest, aby unikać cykli zamrażania i rozmrażania i przygotowywać jednorazowe porcje. Po trzecie, po wykonaniu WGS, wywoływania mutacji i filtrowania, kluczowe znaczenie ma walidacja klonalności hodowli klonalnej. Aby potwierdzić klonalność hodowli, VAF mutacji powinien skupiać się wokół 0,5 w kariotypowo normalnej próbce (ryc. 3). W komórkach o niskim obciążeniu mutacjami, takich jak HSPC krwi pępowinowej, trudniej jest określić klonalność ze względu na niską liczbę mutacji.
Nasze podejście opiera się na ekspansji in vitro pojedynczych komórek, aby umożliwić WGS. Dlatego nasze podejście jest ograniczone do komórek, które mają potencjał replikacyjny do klonalnej ekspansji, takich jak HSPC. W naszych rękach około 5%-30% wszystkich posortowanych komórek jest w stanie odpowiednio się rozwijać. Zmniejszone tempo wzrostu może potencjalnie skutkować błędem selekcji. Jak omówiono wcześniej, metody wykorzystujące WGA mogą przezwyciężyć to odchylenie selekcyjne, ponieważ technika ta nie opiera się na ekspansji komórek. Jednak WGA ma swoje własne wady, a amplifikacja klonalna pozostaje jedyną metodą dokładnego określenia liczby mutacji w całym genomie bez alleli i równego pokrycia wzdłuż genomu, szczególnie w próbkach o niskiej prawdziwej liczbie mutacji somatycznych.
Dane wygenerowane przy użyciu tego podejścia można wykorzystać do określenia filogenezy układu krwiotwórczego, ponieważ mutacje wykryte w pojedynczych komórkach można wykorzystać do analizy linii komórkowych, jak pokazano na rycinie 6. Zazwyczaj jedna lub dwie mutacje mogą zdefiniować każdą gałąź u zdrowego dawcy1. Ponieważ linie rozgałęziają się wcześnie po zapłodnieniu, mutacje definiujące te pierwsze gałęzie będą również obecne z niskim VAF w dopasowanej normalnej próbce, która została użyta do filtrowania wariantów linii zarodkowej 1,18,19. W takim przypadku preferowane jest stosowanie komórek niehematopoetycznych, takich jak MSC, ponieważ oczekuje się, że oddzielą się one bardzo wcześnie w trakcie rozwoju od układu krwiotwórczego. Ponieważ limfocyty T są pochodzenia krwiotwórczego, użycie tych komórek jako dopasowanej normalnej próbki do filtrowania wariantów linii zarodkowej może zatem zakłócić konstrukcję najwcześniejszego rozgałęzienia drzewa linii rozwojowej. Subklonalna obecność mutacji specyficznych dla gałęzi w niektórych dojrzałych populacjach krwi, które można zmierzyć za pomocą ukierunkowanego głębokiego sekwencjonowania, wskaże, że potomstwo tej gałęzi może dać początek temu dojrzałemu typowi komórek. Ponadto nasze podejście pozwala ocenić konsekwencje mutatywne ekspozycji na mutageny in vivo i ostatecznie, w jaki sposób może to przyczynić się do rozwoju białaczki.

Narażenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) na endogenne lub zewnętrzne źródła mutagenne przyczynia się do stopniowej akumulacji mutacji w DNA w ciągu całego życia1. Stopniowa akumulacja mutacji w HSPCs1 może skutkować hematopoezą klonalną (ARCH) związaną z wiekiem (ARCH)2,3, która jest bezobjawowym stanem napędzanym przez HSPC przenoszące mutacje powodujące białaczkę. Początkowo sądzono, że osoby z ARCH mają zwiększone ryzyko zachorowania na białaczkę2,3. Jednak ostatnie badania wykazały częstość występowania 95% ARCH u osób starszych4, co sprawia, że związek z nowotworami złośliwymi jest mniej jasny i rodzi pytanie, dlaczego u niektórych osób z ARCH ostatecznie rozwijają się lub nie rozwijają nowotwory złośliwe. Niemniej jednak mutacje somatyczne w HSPC mogą stanowić poważne zagrożenie dla zdrowia, ponieważ zaburzenia mielodysplastyczne i białaczka charakteryzują się obecnością specyficznych mutacji powodujących raka.
Aby zidentyfikować procesy mutacyjne i zbadać klonalność krwi, należy scharakteryzować akumulację mutacji w poszczególnych HSPC. Procesy mutacyjne pozostawiają charakterystyczne wzorce w genomie, tak zwane sygnatury mutacyjne, które można zidentyfikować i określić ilościowo w zbiorach mutacji obejmujących cały genom5. Na przykład ekspozycja na światło UV, czynniki alkilujące i defekty w szlakach naprawy DNA były związane z inną sygnaturą mutacji6,7. Ponadto, ze względu na stochastyczny charakter akumulacji mutacji, większość (jeśli nie wszystkie) nabytych mutacji jest unikalna między komórkami. Jeśli mutacje są wspólne dla wielu komórek tego samego osobnika, oznacza to, że komórki te mają wspólnego przodka8. W związku z tym, oceniając wspólne mutacje, można określić relacje rodowe między komórkami i zbudować drzewo linii rozwojowej gałąź po gałęzi. Jednak katalogowanie rzadkich mutacji somatycznych w fizjologicznie prawidłowych komórkach jest technicznie trudne ze względu na poliklonalny charakter zdrowych tkanek.
Przedstawiona tutaj jest metoda dokładnej identyfikacji i określenia mutacji somatycznych w genomach poszczególnych HSPC. Wiąże się to z izolacją i ekspansją klonalną HSPC in vitro. Te hodowle klonalne odzwierciedlają skład genetyczny oryginalnej komórki (tj. mutacje w oryginalnej komórce będą wspólne dla wszystkich innych komórek w hodowli). Takie podejście pozwala nam uzyskać wystarczającą ilość DNA do sekwencjonowania całego genomu (WGS). Wcześniej wykazaliśmy, że mutacje nagromadzone in vitro podczas hodowli klonalnej będą wspólne dla podzbioru komórek. Umożliwia to filtrowanie wszystkich mutacji in vitro, ponieważ będą one obecne w mniejszym ułamku odczytów w porównaniu z mutacjami nabytymi in vivo9. Poprzednie metody pozwoliły uzyskać wystarczającą ilość DNA z pojedynczej komórki dla WGS przy użyciu amplifikacji całego genomu (WGA)10. Jednak główną wadą WGA jest stosunkowo podatna na błędy i niezrównoważona amplifikacja genomu, co może skutkować wypadaniem alleli11. Niemniej jednak, ponieważ podejście to opiera się na ekspansji pojedynczych komórek in vitro, jest ono ograniczone do komórek krwi o wystarczającym potencjale replikacyjnym, co nie ma miejsca w przypadku metod zależnych od WGA. Wcześniejsze próby sekwencjonowania kultur klonalnych opierały się na użyciu warstw zasilających, aby zapewnić klonalną amplifikację pojedynczych HSPCs12. Jednak DNA z warstw zasilających może potencjalnie zanieczyścić DNA kultur klonalnych, zakłócając późniejsze wywoływanie mutacji i filtrowanie. Przedstawiona tutaj metoda opiera się wyłącznie na określonym pożywce do klonalnej ekspansji pojedynczych HSPC, a zatem pozwala uniknąć problemu zanieczyszczenia DNA. Do tej pory z powodzeniem stosowaliśmy tę metodę na ludzkim szpiku kostnym, krwi pępowinowej, żywotnie zamrożonym szpiku kostnym i krwi obwodowej.

<table><tbody><tr><td>0,20 &mikro; m filtr strzykawkowy</td><td>Corning</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Strzykawka, Luer lock</td><td>BD</td><td>613-3925</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-50G</td><td></td></tr><tr><td>CD11c FITC</td><td>BioLegend</td><td>301603</td><td>Clone 3.9</td></tr><tr><td>CD16 FITC</td><td>BioLegend</td><td>302005</td><td>Clone 3G8</td></tr><tr><td>CD3 BV650</td><td>Biolegend</td><td>300467</td><td>Clone UCHT1</td></tr><tr><td>CD34 BV421</td><td>BioLegend</td><td>343609</td><td>561</td></tr><tr><td>CD38 PE</td><td>BioLegend</td><td>303505</td><td>Clone HIT2</td></tr><tr><td>CD45RA PerCP/Cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>304121</td><td>Clone HI100</td></tr><tr><td>CD49f PE/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>313621</td><td>Clone GoH3</td></tr><tr><td>CD90 APC</td><td>BioLegend</td><td>328113</td><td>Clone 5E10</td></tr><tr><td>Sitko do komórek 5 ml</td><td>Corning</td><td></td><td></td>352235</tr><tr><td>Płyta CELLSTAR, 384w, 130 &micro; L, F-bottom, TC, pokrywa</td><td>Greiner</td><td>781182</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka kriogeniczna</td><td>Corning</td><td>430487</td><td></td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>61965059</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884-500G</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>ThermoFisher</td><td>10500</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Human Flt3-Ligand, premium</td><td>klasy Miltenyi Biotech</td><td>130-096-479</td><td>Rekonstytut w jednorazowych podwielokrotnościach (25 &mu; L) przy 100 &mu; g/ml w 0,1% BSA w PBS</td></tr><tr><td>Ludzka rekombinowana IL-3 (z ekspresją E. coli)</td> <td>Stem Cell Technologies</td><td>78040.1</td><td>Rekonstytuta w podwielokrotnościach jednorazowego użytku (2,5 &mu; L) przy 100 &mu; g/ml w 0,1% BSA w PBS</td></tr><tr><td>Ludzka rekombinowana IL-6 (z ekspresją E. coli)</td> <td>Technologie komórek macierzystych</td><td>78050.1</td><td>Rekonstytucja w podwielokrotnościach jednorazowego użytku (5 &mu; L) przy 100 &mu; g / ml w 0,1% BSA w PBS</td></tr><tr><td>Human SCF, premium klasa</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-096-695</td><td>Rekonstytut w podwielokrotnościach jednorazowego użytku (25 &mu; L) przy 100 &mu; g / ml w 0,1% BSA w PBS</td></tr><tr><td>Human TPO, premium klasy</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-095-752</td><td>Rekonstytut w jednorazowych podwielokrotnościach (12,5 &mu; L) przy 100 &mu; g / ml w 0,1% BSA w PBS</td></tr><tr><td>Integrative Genomics Viewer 2.4</td><td>Broad Institute</td><td></td><td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/download</td></tr><tr>Zmodyfikowana linia <td>ThermoFisher</td><td>12440061</td><td></td><td>Iscove'a Eagle's Medium</td></tr><tr><td>(CD3/14/19/20/56) Klony FITC</td><td>BioLegend</td><td>348701</td><td>: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56</td></tr><tr><td>Technologie komórek macierzystych</td> <td>Lymphoprep</td><td>#07861</td><td>Używany do separacji gradientu gęstości</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>Wykonany w zakładzie Instytutu. Komercyjnie dostępny PBS może być również stosowany</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>Preparat antybiotykowy</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometr Qubit 2.0</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw testowy Qubit dsDNA HS</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>RNAzywa A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>SH800S Sorter komórek</td><td>Sony</td><td>SH800S</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM, 500 mL</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>9650</td><td></td></tr><tr><td>TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA</td><td>G-Biosciences</td><td>786-151</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>ThermoFisher</td><td>12605-10</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka ładunku mutacyjnego i składu klonalnego krwi ludzkiej

Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood

Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) stopniowo gromadzą mutacje DNA w ciągu życia, co może przyczyniać się do chorób związanych z wiekiem, takich jak białaczka. Scharakteryzowanie akumulacji mutacji może poprawić zrozumienie etiologii chorób związanych z wiekiem. Przedstawiono metodę katalogowania mutacji somatycznych w poszczególnych HSPC, która opiera się na sekwencjonowaniu całego genomu (WGS) klonalnych pierwotnych kultur komórkowych. Mutacje, które są obecne w oryginalnej komórce, są wspólne dla wszystkich komórek w hodowli klonalnej, podczas gdy mutacje nabyte in vitro po sortowaniu komórek są obecne w podzbiorze komórek. W związku z tym metoda ta pozwala na dokładne wykrycie mutacji somatycznych obecnych w genomach poszczególnych HSPC, które kumulują się w ciągu życia. Te katalogi mutacji somatycznych mogą dostarczyć cennych informacji na temat procesów mutacyjnych aktywnych w tkance krwiotwórczej oraz tego, jak procesy te przyczyniają się do białaczki. Ponadto, oceniając mutacje somatyczne, które są wspólne dla wielu HSPC tego samego osobnika, można określić pokrewieństwo linii klonalnej i dynamikę populacji krwi. Ponieważ podejście to opiera się na ekspansji pojedynczych komórek in vitro, metoda ogranicza się do komórek krwiotwórczych o wystarczającym potencjale replikacyjnym.

Procedura eksperymentalna 
Schemat eksperymentalny przedstawiono na Rysunku 1. W zależności od rodzaju materiału wejściowego należy postępować zgodnie z różnymi etapami. Na Rysunku 2 przedstawiono wyniki cytometrii przepływowej z sortowania komórek krwi pępowinowej. Najpierw wszystkie komórki monocytyczne są wybierane poprzez wyznaczenie szeroko określonego bramowania (gate) wokół tej populacji. Następnie izoluje się singlety, wybierając komórki o liniowym stosunku FSC-H/FSC-A, ponieważ niższy stosunek FSC-H/FSC-A obejmuje dublety lub skupiska komórek. Niebarwiona próbka kontrolna służy do zdefiniowania bramek sortowania dla lineage-, CD34+, CD38-, CD45RA-. Dodatkowo CD90 i CD49f mogą być wykorzystane do rozróżnienia komórek progenitorowych od komórek macierzystych zdolnych do samoodnowienia17 (Rysunek 2). Sortowanie indeksowane umożliwia śledzenie poszczególnych komórek, a posortowane komórki przedstawiono jako brązowe kropki. Podczas hodowli komórkowej poszczególne klony mogą rozwijać się w różnym tempie – niektóre klony powiększają się w ciągu 3 tygodni, podczas gdy inne osiągają pełną ekspansję dopiero w piątym tygodniu hodowli. Reprezentatywny wzrost kolonii przedstawiono na Rysunku 3A,B. Przedstawiono również reprezentacyjne zdjęcie niemal konfluencyjnej hodowli masowej MSC w 11. dniu po wysiewaniu (Rysunek 3C).
Kontrola jakości po sekwencjonowaniu i analiza mutacji 
Przedstawiono przykładowy wynik analizy liczby kopii wygenerowany przez Control-FreeC14 w celu sprawdzenia zmian liczby kopii (Rysunek 4). Informacje kariotypowe mogą wskazać, które chromosomy należy wykluczyć podczas uruchamiania SNVFI (krok 7.6). Wykres VAF stworzony przez SNVFI (Rysunek 5) to histogram częstości wariantowych alleli w próbce. Szczyt na wykresie gęstości przy wartości 0,5 wskazuje, że próbka jest klonalna. Aby uzyskać głębszy wgląd w biologiczne przyczyny mutacji, można je analizować przy użyciu pakietu R MutationalPatterns15. Przedstawiono tutaj typową analizę generującą wykres 96-trinukleotydowy (Rysunek 6). Oprócz kwantyfikacji różnych typów mutacji, narzędzie to umożliwia również ekstrakcję sygnatur.
Konstrukcja drzewa linii rozwojowych 
Mutacje wspólne dla klonów lub obecne w klonie (przy niskim VAF) w kontroli linii zarodkowej są walidowane przy użyciu IGV. Mutacje uznaje się za prawdziwe, gdy występują w próbce i nie wykazują wysokich poziomów VAF w linii zarodkowej (Rysunek 7A). Mutacje uznaje się za fałszywe, gdy nie są widoczne w IGV, co może zdarzyć się w regionach o słabym mapowaniu (Rysunek 7B). W innych przypadkach zdarzenia wykryte przez SNVFI są pominiętymi mutacjami linii zarodkowej (Rysunek 7C). W przypadku tych mutacji w wybranych klonach wysoce zalecane jest niezależne ponowne sekwencjonowanie metodą celowaną. Po wykryciu wspólnych mutacji somatycznych między klonami generowana jest macierz binarna (krok 10.8). Konstruowana jest mapa ciepła zawierająca komórki z i bez wspólnych mutacji A-M. Powyżej tej mapy ciepła wskazane jest drzewo linii rozwojowych (Rysunek 8).
<img alt="Schemat procesu sortowania komórek; etapy: hodowla MSC, izolacja limfocytów T, hodowla klonalna, izolacja DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat blokowy przedstawiający procedurę eksperymentalną w zależności od materiału wejściowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schematy cytometrii przepływowej przedstawiające sortowanie komórek i statystyki; markery: CD34, CD38, CD90, CD45RA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Strategia sortowania komórek. W pierwszej kolejności wykonano bramkowanie dla małych komórek mononuklearnych. Następnie wyselekcjonowano pojedyncze komórki poprzez wybór frakcji liniowej. Następnie wybrano komórki linii negatywnej. Wszystkie komórki CD34+ CD38- CD45- zostały posortowane jako pojedyncze komórki. Należy zwrócić uwagę na frakcję komórek zaznaczoną na brązowo, które są komórkami posortowanymi wyróżnionymi za pomocą opcji „index sorting”. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Etapy wzrostu hodowli komórkowej na obrazach mikroskopowych; tworzenie monowarstwy, wizualizacja w kontraście fazowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki hodowli komórkowych. Reprezentatywne klony HSPC w płytce 384-dołkowej w (A) 2 tygodnie po wysianiu oraz (B) 4 tygodnie po wysianiu. (C) Hodowla MSC po 2 tygodniach wymiany medium. Pasek skali = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres wariacji liczby kopii genów; pozycja genomiczna względem liczby kopii, porównanie zbiorcze HSPC i MSC." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Kariotypy. (A) Klonalna hodowla HSPC oraz (B) próbka zbiorcza MSC. Kariotypy określono za pomocą analizy głębokości odczytu. Oba wykresy wskazują na próbkę o prawidłowym kariotypie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Histogram częstotliwości alleli wariantowych (VAF), wykres gęstości; analiza zmienności genetycznej, wizualizacja danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Histogram częstotliwości alleli wariantowych. Histogram częstotliwości alleli wariantowych dla wariantów w klonie przed ostatnim krokiem filtrowania SNVFI (VAF &gt;0,3). Szczyt przy VAF = 0,5 wskazuje, że próbka jest klonalna. Mutacje subklonalne z niskim VAF są wykluczane podczas ostatniego kroku filtrowania SNVFI (VAF &gt;0,3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy względnego wkładu w różnych kontekstach; geny oznaczone kolorami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig6.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Reprezentatywna analiza widma mutacyjnego mutacji somatycznych w próbce HSPC. Przedstawiono względny wkład każdej zmiany trynukleotydowej (w której zmutowana jest zasada środkowa) w całkowite widmo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki sekwencjonowania genomowego, schemat, porównujący próbkę z kontrolą, wyróżniający mutacje i warianty." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig7.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Manualna inspekcja mutacji przy użyciu IGV16. (A) Mutacje uznaje się za prawdziwe, gdy występują w klonie, a nie w próbce zbiorczej. (B) Mutacje uznaje się za fałszywie dodatnie, gdy występują w regionie słabo zmapowanym. (C) Mutacje uznaje się za fałszywie dodatnie, gdy występują w kontroli linii zarodkowej. Linia pionowa wskazuje pozycję zidentyfikowanej mutacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat analizy skupień; interakcje mutacyjne; wizualizacja danych genetycznych; badanie bioinformatyczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig8.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8: Konstrukcja drzewa linii rozwojowych. Przedstawiono dendrogram wskazujący linie rozwojowe oddzielające się w trakcie rozwoju. Mapa ciepła pod dendrogramem wskazuje obecność mutacji w różnych klonach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Wzorce mutacji somatycznych w komórkach odzwierciedlają wcześniejszą ekspozycję mutagenną i mogą ujawnić pokrewieństwo linii rozwojowej. Przedstawiono metodologię katalogowania i analizy mutacji somatycznych w poszczególnych krwiotwórczych komórkach macierzystych i progenitorowych.

Charakterystyka ładunku mutacyjnego i składu klonalnego krwi ludzkiej

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) gradually accumulate DNA mutations during a lifespan, which can contribute to age-associated diseases such ...

Dzięki tej metodzie możemy dokładnie określić liczbę mutacji w pojedynczej krwiotwórczej komórce macierzystej. Mutacje te można wykorzystać do rozszyfrowania procesów mutacyjnych i analizy linii krwiotwórczych. Nasza metoda pozwala uniknąć stosowania technik amplifikacji całego genomu poprzez klonowanie hematopoetycznych komórek macierzystych in vitro, co skutkuje niższymi wskaźnikami błędów i przynosi korzyści w dalszej analizie.Wzorce mutacji obecne w genomach hematopoetycznych komórek macierzystych mogą ujawnić procesy mutagenne i naprawy DNA, na które były narażone. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania materiału próbki i barwienia zgodnie z opisem w protokole tekstowym, a następnie przygotuj 25 mililitrów hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych lub pożywki hodowlanej HSPC. Wypełnić płytkę 384-dołkową do hodowli komórkowej 75 mikrolitrami pożywki hodowlanej HSPC w każdym dołku.Aby zapobiec parowaniu pożywki w dołkach zewnętrznych, należy napełnić zewnętrzne studzienki 75 mikrolitrami sterylnej wody lub PBS i nie używać tych studzienek do sortowania komórek. Prawidłowe sortowanie żywotnych sygnałowych HSPC jest najbardziej krytycznym krokiem w tym protokole. Ustaw bramki do sortowania HSPC na podstawie niebarwionej kontroli w 10 000 komórek z barwionej próbki.Bramkowanie pojedynczych komórek, rysując bramkę wokół liniowej wysokości rozproszenia do przodu w stosunku do frakcji obszaru rozproszenia do przodu. Użyj niebarwionej frakcji kontrolnej, aby narysować bramkę dla frakcji rodowodu. Narysuj bramki dla komórek CD34 dodatnich i dalej scharakteryzuj ten podzbiór, ustawiając specyficzną bramkę dla komórek CD38 ujemnych, CD45RA.Załaduj płytkę 384-dołkową do faksu i posortuj pojedyncze komórki. Jeśli ma to zastosowanie do faksu, włącz opcję zachowania danych sortowania indeksów, aby umożliwić ponowne śledzenie posortowanych komórek. Aby wyhodować pojedynczo posortowane HSC, owinąć 384-dołkową płytkę hodowlaną z pokrywką w przezroczystą folię polietylenową.Przenieś 384-dołkową płytkę do nawilżonego inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i trzymaj go w inkubatorze przez trzy do czterech tygodni, aż pojawią się widoczne klony. Po czterech tygodniach hodowli określ, które studnie mają zbieg 30% lub więcej. Dla każdego stożka napełnij 1,5 mililitra mikroprobówek jednym mililitrem 1% BSA i PBS i oznacz probówkę zgodnie z odpowiednim dołkiem.Wstępnie zwilż końcówkę pipety za pomocą 1% BSA i PBS, aby zminimalizować liczbę komórek przyklejających się do końcówki pipety. Energicznie pipetować pożywkę w górę iw dół co najmniej pięć razy, jednocześnie skrobając dno studzienki pipetą o pojemności 200 mikrolitrów ustawioną na 75 mikrolitrów. Zbierz zawiesinę komórkową w oznakowanej mikroprobówce, która odpowiada studzience.Powtórz pipetowanie w studzience z maksymalnie 75 mikrolitrami świeżych 1% BSA i PBS, aby zapewnić maksymalny pobór komórek. Komórki hodowane klonalnie mogą przyklejać się do dna studni. Sprawdź studzienki za pomocą standardowego mikroskopu ze światłem odwróconym, aby upewnić się, czy wszystkie komórki zostały zebrane.Jeśli wszystkie studzienki o konfluencji większej niż 30% zostały zebrane, umieść 384-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze. Kultury klonalne mogą rozmnażać się do pięciu tygodni. Wirować zawiesinę komórek przez pięć minut w temperaturze 350 g.Powinna być widoczna mała granulka. Ostrożnie usunąć wszystkie z wyjątkiem około pięciu mikrolitrów supernatantu. Granulki komórkowe można zamrozić w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i przechowywać przez wiele miesięcy przed izolacją DNA.Mutacje obecne w pierwszych gałęziach linii będą również subklonalnie obecne w próbce zbiorczej. Późniejsze rozgałęziające się linie są definiowane przez mutacje wspólne tylko dla HSPC. Aby zidentyfikować mutacje, które są obecne w podzbiorze klonów i subklonalnie obecne w masie, najpierw przefiltruj pod kątem mutacji somatycznych wspólnych dla klonów.W terminalu opartym na systemie Unix edytuj plik filtersomatic. ne, aby ustawić wzorce i dostosować inne parametry. Uruchom filtr somatyczny.Skrypt PI. Filtruj mutacje, które są subklonalnie obecne w masie, określając masę o niskiej wartości VAF. r w terminalu opartym na systemie Unix.Spowoduje to wygenerowanie oddzielnych plików vcf dla współdzielonych i unikalnych wariantów pojedynczego nukleotydu. Określ wszystkie mutacje wspólne dla klonów, które nie są obecne w próbce zbiorczej, nakładając na siebie wszystkie pozycje mutacji. Wyklucz wyniki fałszywie dodatnie przez ręczną inspekcję przy użyciu Integrative Genomic Viewer, w skrócie IGV.Mutacje są uważane za fałszywe, gdy nie są obecne, gdy mutacja jest obecna w linii zarodkowej we wszystkich klonach lub gdy występuje w słabo zmapowanych regionach. Prawdziwe mutacje mogą być współdzielone przez dwa klony lub być subklonalnie obecne w masie. Zsekwencjonuj wszystkie współdzielone loci niezależnie przy użyciu sekwencjonowania ukierunkowanego lub Sangera.Użyj współdzielonych mutacji, aby utworzyć binarną tabelę mutacji w porównaniu ze zsekwencjonowanymi klonami, gdzie zero oznacza, że mutacja nie jest obecna, a jeden wskazuje na obecność mutacji. Wydrukuj tabelę binarną mutacji jako mapę cieplną wraz z dendrogramem wskazującym relacje linii między komórkami za pomocą funkcji opartych na R. Mapa cieplna wskazuje stan mutacji dla każdej komórki.Pokazane jako przykładowe dane wyjściowe analizy liczby kopii wygenerowanej przez kontrolę trzy c w celu sprawdzenia zmian numeru kopii. Wykres frakcji wariantu allelu utworzony przez filtrowanie wariantów pojedynczego nukleotydu jest histogramem częstości występowania alleli wariantowych w próbce. Pik na wykresie gęstości przy 0,5 wskazuje, że próbka jest klonalna.Przedstawiono tutaj typową analizę wzorców mutacji, w wyniku której powstaje wykres 96 trinukleotydów. Oprócz kwantyfikacji różnych typów mutacji, za pomocą tego narzędzia można również przeprowadzić ekstrakcję sygnatur. Mutacje wspólne dla klonów lub obecne w klonie w kontroli linii zarodkowej są walidowane za pomocą IGV.Mutacje uważa się za prawdziwe, gdy są obecne w próbce, a nie na wysokich poziomach częstości alleli wariantów w linii zarodkowej. Mutacje są uważane za fałszywe, gdy nie występują w IGV, co może się zdarzyć w słabo zmapowanych regionach. W innych przypadkach zdarzenia wykryte przez filtrowanie wariantów pojedynczego nukleotydu są pominiętymi wariantami linii zarodkowej.Niezależna sekwencjonowanie mutacji za pomocą celowanego ponownego sekwencjonowania jest wysoce zalecane dla tych mutacji w wybranych klonach. Po wykryciu wspólnych mutacji somatycznych między klonami generowana jest macierz binarna, konstruowana jest mapa cieplna zawierająca komórki z i bez wspólnych mutacji od A do M. Wskazane jest drzewo linii rozwojowej. Kolejnym krokiem dla przedstawionej tutaj meta jest określenie procesów mutacyjnych aktywnych w hemopoetycznych komórkach macierzystych za pomocą analizy sygnatur mutacyjnych.

characterizing-mutational-load-and-clonal-composition-of-human-blood

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Tutaj opisujemy test mutagenezy in vivo dla małej liczby oczyszczonych komórek krwiotwórczych przy użyciu transgenicznego modelu myszy LacI. Gen LacI może być wyizolowany w celu określenia częstotliwości, lokalizacji i rodzaju mutantów DNA spontanicznie powstałych lub po ekspozycji na genotoksyny.

Identyfikacja mutacji DNA w oczyszczonych hematopoetycznych komórkach macierzystych/progenitorowych

Ten protokół opisuje podejście do badania rekombinowanych regionów VDJ łańcucha ciężkiego immunoglobuliny chłoniaków poprzez głębokie sekwencjonowanie i odzyskanie rearanżacji VDJ i statusu hipermutacji somatycznej w celu nakreślenia klonalnej architektury pojedynczego guza. Porównanie architektury klonalnej między sparowaną diagnozą a próbkami nawrotu chłoniaka ujawnia tryby ewolucji klonalnej nawrotu chłoniaka.

VDJ-Seq: Analiza głębokiego sekwencjonowania przegrupowanego genu łańcucha ciężkiego immunoglobuliny w celu ujawnienia wzorców ewolucji klonalnej chłoniaka z komórek B

Niniejszym przedstawiamy protokół, który szczegółowo opisuje aspekty techniczne i zasadnicze wymagania w celu zapewnienia solidnej analizy sekwencji genów IG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową (CLL), w oparciu o zgromadzone doświadczenie Europejskiej Inicjatywy Badawczej nad PBL (ERIC).

Analiza sekwencji genów immunoglobulin w przewlekłej białaczce limfocytowej: od materiału pacjenta do interpretacji sekwencji

Tutaj prezentujemy protokół charakteryzowania podzbiorów monocytów za pomocą cytometrii przepływu krwi pełnej. Obejmuje to nakreślenie, w jaki sposób bramkować podzbiory i oceniać ich ekspresję markerów powierzchniowych oraz podanie przykładu oceny ekspresji markerów M1 (zapalnych) i M2 (przeciwzapalnych).

Charakterystyka podzbiorów ludzkich monocytów za pomocą analizy cytometrii przepływu krwi pełnej

W artykule opisano metodę identyfikacji zmian klonalnych i subklonalnych wśród różnych próbek od danego pacjenta. Chociaż opisane tutaj eksperymenty koncentrują się na określonym typie nowotworu, podejście to ma szerokie zastosowanie do innych guzów litych.

Analiza porównawcza zmian chorobowych za pomocą ukierunkowanego podejścia sekwencjonowania

Tutaj prezentowany jest protokół do przeprowadzenia testu fluktuacji i oszacowania szybkości mutacji mikrobiologicznych za pomocą markerów fenotypowych. Protokół ten umożliwi naukowcom testowanie mutacji w różnych mikroorganizmach i środowiskach, określając, w jaki sposób genotyp i kontekst ekologiczny wpływają na tempo spontanicznych mutacji.

Pomiar szybkości mutacji drobnoustrojów za pomocą testu fluktuacji

Obecny protokół opisuje metodę izolacji DNA z próbek krwi i biopsji jelitowych, generowania bibliotek TCRβ i IGH PCR do sekwencjonowania nowej generacji, wykonywania przebiegu NGS i podstawowej analizy danych.

Analiza repertuaru immunologicznego receptorów limfocytów T i B przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji

Opisujemy trzy metody przeszczepu szpiku kostnego (BMT): BMT z napromienianiem całego ciała, BMT z napromienianiem ekranowanym oraz metoda BMT bez wstępnego kondycjonowania (adoptywna BMT) do badania hematopoezy klonalnej w modelach mysich.

Procedury przeszczepu szpiku kostnego u myszy w celu zbadania hematopoezy klonalnej

Opracowaliśmy opłacalną metodę śledzenia dynamiki alleli polimorfizmu niepojedynczego nukleotydu, którą można łatwo dostosować do eksperymentalnej ewolucji zamrożonych archiwów. Technikę tripletowej PCR połączono z automatyczną równoległą elektroforezą kapilarną w celu ilościowego określenia względnej częstości allelu insercji w trakcie ewolucji eksperymentalnej.

Śledzenie dynamiki wariantów strukturalnych w eksperymentalnie wyewoluowanych populacjach

Prezentowana tutaj jest technika oparta na cytometrii przepływowej, która pozwala na jednoczesny pomiar liczby podziałów komórkowych, fenotypu komórek powierzchniowych i pokrewieństwa komórkowego. Właściwości te można testować statystycznie przy użyciu struktury opartej na permutacjach.

Jednoczesna ocena pokrewieństwa, liczby podziału i fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej dla hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych

Poznaj metodę analizy somatycznych mutacji w pojedynczych komórkach macierzystych krwi, która unika amplifikacji całogenomowej poprzez klonowanie in vitro. Technika ta umożliwia precyzyjne określenie obciążenia mutacyjnego i zrozumienie relacji klonalnych w hematopoezie.

Charakterystyka ładunku mutacyjnego i składu klonalnego krwi ludzkiej

Przeglądaj więcej filmów