Charakterystyka ładunku mutacyjnego i składu klonalnego krwi ludzkiej

Dzięki tej metodzie możemy dokładnie określić liczbę mutacji w pojedynczej krwiotwórczej komórce macierzystej. Mutacje te można wykorzystać do rozszyfrowania procesów mutacyjnych i analizy linii krwiotwórczych. Nasza metoda pozwala uniknąć stosowania technik amplifikacji całego genomu poprzez klonowanie hematopoetycznych komórek macierzystych in vitro, co skutkuje niższymi wskaźnikami błędów i przynosi korzyści w dalszej analizie.

Wzorce mutacji obecne w genomach hematopoetycznych komórek macierzystych mogą ujawnić procesy mutagenne i naprawy DNA, na które były narażone. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania materiału próbki i barwienia zgodnie z opisem w protokole tekstowym, a następnie przygotuj 25 mililitrów hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych lub pożywki hodowlanej HSPC. Wypełnić płytkę 384-dołkową do hodowli komórkowej 75 mikrolitrami pożywki hodowlanej HSPC w każdym dołku.

Aby zapobiec parowaniu pożywki w dołkach zewnętrznych, należy napełnić zewnętrzne studzienki 75 mikrolitrami sterylnej wody lub PBS i nie używać tych studzienek do sortowania komórek. Prawidłowe sortowanie żywotnych sygnałowych HSPC jest najbardziej krytycznym krokiem w tym protokole. Ustaw bramki do sortowania HSPC na podstawie niebarwionej kontroli w 10 000 komórek z barwionej próbki.

Bramkowanie pojedynczych komórek, rysując bramkę wokół liniowej wysokości rozproszenia do przodu w stosunku do frakcji obszaru rozproszenia do przodu. Użyj niebarwionej frakcji kontrolnej, aby narysować bramkę dla frakcji rodowodu. Narysuj bramki dla komórek CD34 dodatnich i dalej scharakteryzuj ten podzbiór, ustawiając specyficzną bramkę dla komórek CD38 ujemnych, CD45RA.

Załaduj płytkę 384-dołkową do faksu i posortuj pojedyncze komórki. Jeśli ma to zastosowanie do faksu, włącz opcję zachowania danych sortowania indeksów, aby umożliwić ponowne śledzenie posortowanych komórek. Aby wyhodować pojedynczo posortowane HSC, owinąć 384-dołkową płytkę hodowlaną z pokrywką w przezroczystą folię polietylenową.

Przenieś 384-dołkową płytkę do nawilżonego inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i trzymaj go w inkubatorze przez trzy do czterech tygodni, aż pojawią się widoczne klony. Po czterech tygodniach hodowli określ, które studnie mają zbieg 30% lub więcej. Dla każdego stożka napełnij 1,5 mililitra mikroprobówek jednym mililitrem 1% BSA i PBS i oznacz probówkę zgodnie z odpowiednim dołkiem.

Wstępnie zwilż końcówkę pipety za pomocą 1% BSA i PBS, aby zminimalizować liczbę komórek przyklejających się do końcówki pipety. Energicznie pipetować pożywkę w górę iw dół co najmniej pięć razy, jednocześnie skrobając dno studzienki pipetą o pojemności 200 mikrolitrów ustawioną na 75 mikrolitrów. Zbierz zawiesinę komórkową w oznakowanej mikroprobówce, która odpowiada studzience.

Powtórz pipetowanie w studzience z maksymalnie 75 mikrolitrami świeżych 1% BSA i PBS, aby zapewnić maksymalny pobór komórek. Komórki hodowane klonalnie mogą przyklejać się do dna studni. Sprawdź studzienki za pomocą standardowego mikroskopu ze światłem odwróconym, aby upewnić się, czy wszystkie komórki zostały zebrane.

Jeśli wszystkie studzienki o konfluencji większej niż 30% zostały zebrane, umieść 384-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze. Kultury klonalne mogą rozmnażać się do pięciu tygodni. Wirować zawiesinę komórek przez pięć minut w temperaturze 350 g.

Powinna być widoczna mała granulka. Ostrożnie usunąć wszystkie z wyjątkiem około pięciu mikrolitrów supernatantu. Granulki komórkowe można zamrozić w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i przechowywać przez wiele miesięcy przed izolacją DNA.

Mutacje obecne w pierwszych gałęziach linii będą również subklonalnie obecne w próbce zbiorczej. Późniejsze rozgałęziające się linie są definiowane przez mutacje wspólne tylko dla HSPC. Aby zidentyfikować mutacje, które są obecne w podzbiorze klonów i subklonalnie obecne w masie, najpierw przefiltruj pod kątem mutacji somatycznych wspólnych dla klonów.

W terminalu opartym na systemie Unix edytuj plik filtersomatic. ne, aby ustawić wzorce i dostosować inne parametry. Uruchom filtr somatyczny.

Skrypt PI. Filtruj mutacje, które są subklonalnie obecne w masie, określając masę o niskiej wartości VAF. r w terminalu opartym na systemie Unix.

Spowoduje to wygenerowanie oddzielnych plików vcf dla współdzielonych i unikalnych wariantów pojedynczego nukleotydu. Określ wszystkie mutacje wspólne dla klonów, które nie są obecne w próbce zbiorczej, nakładając na siebie wszystkie pozycje mutacji. Wyklucz wyniki fałszywie dodatnie przez ręczną inspekcję przy użyciu Integrative Genomic Viewer, w skrócie IGV.

Mutacje są uważane za fałszywe, gdy nie są obecne, gdy mutacja jest obecna w linii zarodkowej we wszystkich klonach lub gdy występuje w słabo zmapowanych regionach. Prawdziwe mutacje mogą być współdzielone przez dwa klony lub być subklonalnie obecne w masie. Zsekwencjonuj wszystkie współdzielone loci niezależnie przy użyciu sekwencjonowania ukierunkowanego lub Sangera.

Użyj współdzielonych mutacji, aby utworzyć binarną tabelę mutacji w porównaniu ze zsekwencjonowanymi klonami, gdzie zero oznacza, że mutacja nie jest obecna, a jeden wskazuje na obecność mutacji. Wydrukuj tabelę binarną mutacji jako mapę cieplną wraz z dendrogramem wskazującym relacje linii między komórkami za pomocą funkcji opartych na R. Mapa cieplna wskazuje stan mutacji dla każdej komórki.

Pokazane jako przykładowe dane wyjściowe analizy liczby kopii wygenerowanej przez kontrolę trzy c w celu sprawdzenia zmian numeru kopii. Wykres frakcji wariantu allelu utworzony przez filtrowanie wariantów pojedynczego nukleotydu jest histogramem częstości występowania alleli wariantowych w próbce. Pik na wykresie gęstości przy 0,5 wskazuje, że próbka jest klonalna.

Przedstawiono tutaj typową analizę wzorców mutacji, w wyniku której powstaje wykres 96 trinukleotydów. Oprócz kwantyfikacji różnych typów mutacji, za pomocą tego narzędzia można również przeprowadzić ekstrakcję sygnatur. Mutacje wspólne dla klonów lub obecne w klonie w kontroli linii zarodkowej są walidowane za pomocą IGV.

Mutacje uważa się za prawdziwe, gdy są obecne w próbce, a nie na wysokich poziomach częstości alleli wariantów w linii zarodkowej. Mutacje są uważane za fałszywe, gdy nie występują w IGV, co może się zdarzyć w słabo zmapowanych regionach. W innych przypadkach zdarzenia wykryte przez filtrowanie wariantów pojedynczego nukleotydu są pominiętymi wariantami linii zarodkowej.

Niezależna sekwencjonowanie mutacji za pomocą celowanego ponownego sekwencjonowania jest wysoce zalecane dla tych mutacji w wybranych klonach. Po wykryciu wspólnych mutacji somatycznych między klonami generowana jest macierz binarna, konstruowana jest mapa cieplna zawierająca komórki z i bez wspólnych mutacji od A do M. Wskazane jest drzewo linii rozwojowej. Kolejnym krokiem dla przedstawionej tutaj meta jest określenie procesów mutacyjnych aktywnych w hemopoetycznych komórkach macierzystych za pomocą analizy sygnatur mutacyjnych.