Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy
24 czerwca 2019
Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.
Mikroskopia przyżyciowa błony śluzowej jelita cienkiego może dostarczyć informacji na temat czasoprzestrzennej dynamiki interakcji komórkowych w nabłonku między różnymi typami komórek odpornościowych lub między tymi dwoma przedziałami. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona pozyskiwanie obrazów o dużej szybkości i wysokiej rozdzielczości w obrębie błony śluzowej jelit w czasie rzeczywistym. Obrazowanie jelita na żywo może dostarczyć dodatkowych informacji na temat interakcji komórkowych lub sygnalizacji komórkowej zaangażowanych w odporność błony śluzowej, biologię nabłonka lub biologię raka.
Jest to wymagająca metoda, która wymaga praktyki w technice chirurgicznej, a także cierpliwości i optymalnego ustawienia myszy do akwizycji obrazu. Po potwierdzeniu braku odpowiedzi na uszczypnięcie palca u znieczulonej myszy transgenicznej, wykazującej ekspresję wzmocnionego białka zielonej fluorescencji lub EGFP, receptora limfocytów T gamma-delta, użyj strzykawki tuberkulinowej do powolnego wstrzyknięcia 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu barwnika Hoechst 33342 do zatoki żylnej zaoczodołowej. Godzinę do dwóch po wstrzyknięciu należy nałożyć maść na oczy zwierzęcia, aby zapobiec ich wysuszeniu.
Następnie wykonaj pionowe nacięcie o średnicy 2 cm przez skórę i otrzewną, wzdłuż linii środkowej dolnej części brzucha i za pomocą kątowych kleszczy ostrożnie wyciągnij kątnicę z jamy otrzewnej. Zidentyfikuj obszar jelita cienkiego o długości 2-3 cm, który zawiera minimalną zawartość kału, uważając, aby nie rozerwać naczyń krwionośnych krezki, i ostrożnie zwróć kątnicę i pozostałe jelito cienkie do jamy otrzewnej, pozostawiając interesujący nas segment na zewnątrz. Umieszczając dwie pary kleszczy po obu stronach krezki podkreślonej między naczyniami krwionośnymi, delikatnie pocieraj końcówki kleszczy o siebie, aby utworzyć otwór w błonie.
Za pomocą kątowych kleszczy i zakrzywionej igły stożkowej przymocowanej do szwu 5 cm, przeniknij jedną stronę otrzewnej przez otwór w błonie i w górę przez drugą stronę wyściółki otrzewnej, umieszczając jeden szew u górze, a drugi w pobliżu dolnej części nacięcia, aby zamknąć nacięcie, utrzymując pętlę jelita na zewnątrz. Aby zwiększyć prawdopodobieństwo sukcesu, nie wiąż ani nie rozrywaj żadnych naczyń krwionośnych podczas zakładania szwu brzusznego i ogranicz wszelkie obce obchodzenie się z jelitem. Następnie w ten sam sposób zamknij skórę pod pętlą jelitową, umieszczając jeden szew na środku nacięcia między poprzednimi szwami w otrzewnej pod linią.
Za pomocą elektrokoagulacji wykonaj linię perforacji wzdłuż granicy antykrezkowej i natychmiast nałóż kilka kropel wody na powierzchnię jelita, aby zapobiec dodatkowemu uszkodzeniu tkanek wywołanemu ciepłem. Osusz chusteczką kimch, aby usunąć resztki wody. Użyj nożyczek vanna, aby wyciąć poziomą szczelinę o długości około 1,5 cm na dystalnej krawędzi kauteryzowanej tkanki, wzdłuż długości kauteryzowanej linii, w kierunku bliższego końca zewnętrznego segmentu tkanki.
Kiedy powierzchnia błony śluzowej zostanie odsłonięta, przykryj brzuch wilgotną chusteczką kimch, aby utrzymać nawilżenie tkanki. W przypadku obrazowania mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem przenieś mysz do mikroskopu w zakrytym naczyniu. Uruchom oprogramowanie do obrazowania i odchyl głowicę mikroskopu do tyłu, a następnie dodaj 150 mikrolitrów 1 mikromolowego barwnika Alexa Fluor Fle i buforowanego roztworu soli fizjologicznej Hanka na wsunięte dno szklanej pokrywy.
Ustaw mysz tak, aby otwarta powierzchnia błony śluzowej bezpośrednio stykała się ze szkiełkiem nakrywkowym. Umieść mysz i szalkę na stoliku do obrazowania we wstępnie ogrzanym inkubatorze. Ustaw intensywność wzbudzenia i czas ekspozycji dla każdego lasera odpowiednio na nie więcej niż 10-15 miliwatów i 120-150 milisekund, a średnią klatek na 2.
Włącz funkcję wzmocnienia zwielokrotniającego elektrony, aby zredukować szumy tła i wybierz kalibrację obiektywu 63X, aby zapewnić prawidłowy pomiar rozmiaru piksela. Korzystając z 405-nanometrowego lasera i obiektywu pneumatycznego 20X, ręcznie wizualizuj jądra, aby zlokalizować pole kosmków, które nie mają zauważalnego ruchu lub dryfu, unikając obszarów sztucznego ruchu spowodowanego oddychaniem, perystaltyką lub biciem serca. Korzystając ze skanowania X-Y, zapisz współrzędną X-Y pola zainteresowania i przełącz się na obiektyw 63X z zanurzeniem w glicerolu.
Uzyskaj obraz na żywo w kanale 405 nanometrów przez maksymalnie 1 minutę, aby potwierdzić, że kosmki w wybranym polu są stabilne, jednocześnie dostosowując ostrość, aby znaleźć płaszczyznę ortogonalną tuż pod końcówką kosmku. Następnie uzyskaj stosy z, zaczynając tuż pod nabłonkiem wierzchołka kosmku, około 15-20 mikrometrów w dół do kosmków, aż trudno będzie rozdzielić jądra, stosując kroki co 1,5 mikrometra. 3-5 minut po rozpoczęciu akwizycji potwierdź stabilność obrazu i ruchliwość komórek śródnabłonkowych gamma-delta i kontynuuj pozyskiwanie obrazów przez 30-60 minut dla każdego pola kosmków.
Limfocyty śródnabłonkowe gamma-delta wykazują dynamiczne zachowanie nadzoru, w którym patrolują nabłonek, migrując wzdłuż błony podstawnej i do bocznej przestrzeni międzykomórkowej w stanie badania. Na tych reprezentatywnych obrazach kolorowe ślady wskazują ścieżki migracji poszczególnych śródnabłonkowych limfocytów gamma-delta w ciągu 30 minut. Chociaż częstość występowania limfocytów śródnabłonkowych w bocznej przestrzeni międzykomórkowej wzrosła u myszy leczonych przeciwciałem beta przeciwko receptorowi interleukiny-2, ponad 30% tych śródnabłonkowych limfocytów gamma-delta wykazywało zachowanie bezczynne.
Ten fenotyp spoczynku został potwierdzony przez znaczne zmniejszenie zarówno prędkości chwilowej, jak i współczynnika uwięzienia śródnabłonkowych limfocytów gamma-delta, po blokadzie receptora interleukiny-2, w porównaniu z kontrolą. Co więcej, bezczynne śródnabłonkowe limfocyty Gamma-delta miały dłuższy czas przebywania i częściej były zlokalizowane w bocznej przestrzeni międzykomórkowej w porównaniu z ruchliwymi śródnabłonkowymi limfocytami Gamma-delta. Identyfikacja pól kosmków, które nie mają nadmiernego ruchu z powodu perystaltyki, może być trudna.
Zmiana położenia myszy może pomóc w zlokalizowaniu bardziej stabilnego pola. Dalsza analiza danych śledzenia komórek może pomóc w zidentyfikowaniu określonych zachowań związanych z ruchliwością lub dostarczyć dodatkowych wskaźników do pomiaru interakcji komórkowych. Obrazowanie przyżyciowe i analiza ruchliwości IEL stały się standardowym odczytem funkcji IEL, zapewniając wgląd w to, w jaki sposób wrodzona sygnalizacja immunologiczna reguluje funkcję Gamma-delta IEL.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę wizualizacji GFP-oznaczonych 纬未 IELs poprzez obrazowanie in vivo małego jelita u myszy za pomocą odwróconej mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek wewnątrz błony śluzowej przez maksymalnie 4 godziny, ułatwiając badanie różnych interakcji immuno-epitelialnych w jelitach.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Immunologia
- Biologia komórki
Tło
- Mikroskopia in vivo zapewnia wgląd w interakcje komórkowe w nabłonku jelitowym.
- Technika pozwala na wysokoprężne, wysokiej rozdzielczości obrazowanie w czasie rzeczywistym.
- Żywe obrazowanie może poprawić zrozumienie immunologii błony śluzowej i biologii nabłonka.
- Wyzwania obejmują opanowanie technik chirurgicznych i optymalne pozycjonowanie myszy.
Cel badania
- Wizualizacja żywych komórek odpornościowych w błonie śluzowej jelita.
- Badanie interakcji immuno-epitelialnych w czasie rzeczywistym.
- Poprawa zrozumienia dynamiki komórek w immunologii błony śluzowej.
Stosowane metody
- Wizualizacja in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem.
- Wstrzyknięcie roztworu barwnika Hoechst 33342 do zatoki żylnej zaoczodołowej.
- Monitorowanie żywych komórek przez maksymalnie 4 godziny.
- Zastosowanie myszy transgenicznych wytwarzających ulepszoną zieloną białkową fluorescencyjną (EGFP).
Główne wyniki
- Udana wizualizacja 纬未 IELs w małym jeliciu u myszy.
- Śledzenie w czasie rzeczywistym interakcji komórkowych wewnątrz błony śluzowej.
- Wgląd w dynamikę interakcji komórek odpornościowych.
- Demonstracja potencjału techniki w badaniu immunologii błony śluzowej.
Wnioski
- Metoda zapewnia potężne narzędzie do badania interakcji żywych komórek w jelitach.
- Poprawia zrozumienie roli komórek odpornościowych w biologii błony śluzowej.
- Dalsze zastosowania mogą obejmować biologię raka i inne dziedziny.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Intravital imaging of intraepithelial lymphocytes (IELs) in the murine small intestine enables direct visualization of immune surveillance dynamics at the epithelial barrier. This capability is critical for de-risking early immunology targets and clarifying mechanistic pathways in mucosal immunity. High-resolution, real-time imaging informs predictive confidence at the target validation and assay development stages for immune-modulating therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of IEL migratory and surveillance behaviors in situ.
- Supports mechanistic de-risking by visualizing immune-epithelial interactions under experimental perturbation.
- Provides functional readouts for target validation in mucosal immunology.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated, live imaging systems for downstream immune function assays.
- Delivers quantitative cell motility and interaction metrics for assay standardization.
- Enables reproducible, high-speed acquisition suitable for comparative compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns immune cell behavior with disease-relevant epithelial models for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by linking in vivo cell dynamics to preclinical endpoints.
- Provides a platform for evaluating immune modulation in response to candidate interventions.
Pipeline & Workflow Integration
This intravital imaging protocol bridges early discovery and preclinical research by enabling real-time, quantitative analysis of immune cell dynamics in a physiologically relevant context.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on IEL activation and surveillance mechanisms.
- Screening: Provides standardized, quantitative motility and interaction outputs for assay development.
- Analytics: Generates cell tracking, speed, and confinement ratio data for robust statistical comparison.
- Translational Research: Connects immune surveillance metrics to disease models and intervention studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis workflow for diverse immunology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in immune target function and pathway engagement.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible imaging outputs with reduced photodamage.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking cell behavior to mechanistic hypotheses.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immune-modulating assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgery and live imaging techniques.
- Demands access to spinning disk confocal microscopy and advanced image analysis software.
- Necessitates cross-team standardization for imaging parameters and data interpretation.
- Adaptation may be needed for different immune cell types or tissue contexts.
- Imaging depth is limited compared to two-photon microscopy, constraining some applications.
