Name: Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Poznaj metodę obrazowania przyżyciowego limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy za pomocą odwróconej konfokalnej mikroskopii spinning disk. Technika umożliwia śledzenie żywych komórek immunologicznych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez NIH R21 AI143892, New Jersey Health Foundation Grant, Busch Biomedical Grant (KLE). Dziękujemy Madeleine Hu za pomoc w redagowaniu manuskryptu i udostępnieniu danych zawartych w reprezentatywnych wynikach.

Wszystkie badania zostały przeprowadzone w akredytowanym przez Association of the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AALAC) obiekcie zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Rutgers New Jersey Medical School Comparative Medicine Resources.
1. Przygotowanie myszy
UWAGA: Poniższa procedura, obejmująca przygotowanie zwierzęcia i operację, zajmie 30-40 minut. Przed zabiegiem włącz mikroskop i rozgrzej dołączony inkubator na mikroskopie do 37 °C.
<ol>
	<li>Wykonaj eksperymenty na 8-10 tygodniowych myszach TcrdEGFP na tle C57BL / 6, które uzyskano od Bernarda Malissena (INSERM, Paryż, Francja). Zgodnie z procedurą zatwierdzoną przez IACUC, znieczulij mysz poprzez wstrzyknięcie dożylnie ketaminy (120 mg / kg) i ksylazyny (10 mg / kg) w zależności od masy ciała zwierzęcia. Oceń poziom znieczulenia na podstawie częstości oddechów (55–65 oddechów na minutę)21, szczypanie palców u nóg i odruch powiekowy.</li>
	<li>Po osiągnięciu znieczulenia w płaszczyźnie operacyjnej przymocuj tylne nogi myszy za pomocą taśmy do poduszki grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała, którą można monitorować za pomocą termometru doodbytniczego. Jeśli pojawią się oznaki, że znieczulenie słabnie (np. przyspieszone oddychanie, mruganie i/lub drganie mięśni oka w odpowiedzi na odruch powiekowy), należy ponownie podawać 50 μl ketaminy/ksylazyny na raz, aż mysz zostanie całkowicie uspokojona.</li>
	<li>Przygotować barwnik jądrowy, rozcieńczając 50 μl Hoechst 33342 (10 mg/ml) 315 μl 0,9% soli fizjologicznej; końcowe stężenie wynosi 37,5 mg/kg w przeliczeniu na masę myszy (przybliżona objętość 200 μl). Po znieczuleniu myszy powoli wstrzyknąć Hoechst za pomocą strzykawki tuberkulinowej przez zatokę żylną zadoczodołową. 
	nuta: Odczekaj 1-2 minuty przed przejściem do następnego kroku, aby umożliwić myszy przyzwyczajenie się do zmiany objętości krążącej po wstrzyknięciu retroorbitalnym.</li>
	<li>Nałóż niewielką ilość lubrykantu na oczy, aby zapobiec ich wysuszeniu.</li>
</ol>
2. Chirurgia na myszach: laparotomia w celu odsłonięcia błony śluzowej jelit
<ol>
	<li>Wykonaj pionowe nacięcie o długości 2 cm przez skórę i otrzewną wzdłuż linii środkowej dolnej części brzucha, aby uzewnętrznić obszar jelita, który ma być zobrazowany.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy pod kątem ostrożnie wyciągnij jelito ślepe z jamy otrzewnej i zidentyfikuj obszar jelita cienkiego, który ma zostać zobrazowany. Uważaj, aby podczas tego procesu nie rozerwać naczyń krwionośnych krezki. Aby zminimalizować potencjalne uszkodzenia lub krwawienie, unikaj chwytania lub szczypania jelita kleszczami.</li>
	<li>Zlokalizuj odpowiedni obszar jelita cienkiego (2–3 cm) do obrazowania, który zawiera minimalną zawartość kału. Ostrożnie włóż jelito ślepe i pozostałe jelito cienkie do jamy otrzewnej, pozostawiając interesujący nas segment uzewnętrzniony. 
	nuta: Na tym etapie należy unikać nakłuwania jelita ślepego lub przerywania naczyń krwionośnych krezki.</li>
	<li>Umieść dwie pary kleszczyków po obu stronach leżącej poniżej krezki między naczyniami krwionośnymi i delikatnie pocieraj końcówki kleszczy o siebie, aby utworzyć otwór w błonie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)22. Umożliwi to przejście igły przez krezkę podczas zamykania jamy otrzewnej pod jelitem.</li>
	<li>Zamknij nacięcie, zachowując uzewnętrznienie pętli jelita. Za pomocą kleszczy kątowych i zakrzywionej, stożkowej igły przymocowanej do 5-centymetrowego szwu wbij się z jednej strony otrzewnej, przejdź przez otwór wykonany w poprzednim kroku i w górę przez drugą stronę wyściółki otrzewnej. Umieść jeden szew u górze, a drugi w pobliżu dolnej części nacięcia. 
	nuta: Na tym etapie unikaj uszkodzenia naczyń krwionośnych.</li>
	<li>Powtórz ten proces, aby zamknąć skórę pod pętlą jelitową, umieszczając jeden szew w środku nacięcia, między poprzednimi szwami w leżącej poniżej otrzewnej. 
	nuta: Ważne jest, aby uzewnętrzniać tylko obszar, który ma być obrazowany; Zmniejszy to obcy ruch podczas obrazowania. Pamiętaj, aby unikać wiązania tętnic krezkowych.</li>
	<li>Użyj elektrokoagulacji, aby wykonać linię perforacji wzdłuż granicy antykrezkowej. Natychmiast po kauteryzacji nałóż kilka kropel wody na powierzchnię jelita, aby zapobiec dodatkowemu uszkodzeniu tkanek wywołanemu ciepłem. Osusz chusteczką Kimwiste, aby usunąć resztki wody.</li>
	<li>Wytnij małą poziomą szczelinę na dystalnej krawędzi kauteryzowanej tkanki za pomocą nożyczek Vannas i przystąp do cięcia wzdłuż kauteryzowanej linii w kierunku bliższego końca zewnętrzizowanego segmentu tkanki (około 1,5 cm długości), aby odsłonić powierzchnię błony śluzowej. 
	nuta: W razie potrzeby użyj kleszczy, aby delikatnie usunąć nadmiar kału pozostałego na odsłoniętej powierzchni błony śluzowej.</li>
	<li>Przykryj brzuch myszy wilgotnym Kimwiste, aby zapobiec odwodnieniu tkanki. Przenieś mysz do mikroskopu w zakrytym naczyniu.</li>
</ol>
3. Akwizycja obrazu za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem
<ol>
	<li>Odpipetować 150 μl 1 μM AlexaFluor 633 w HBSS na szklany, nasunięty spód naczynia o średnicy 35 mm. Ustaw mysz tak, aby otwarta powierzchnia błony śluzowej bezpośrednio stykała się ze szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Przechyl głowicę mikroskopu do tyłu i umieść mysz na nakrytej czaszy na stoliku do obrazowania we wstępnie ogrzanym inkubatorze. Alternatywnie przykryj mysz kocem grzewczym, aby utrzymać temperaturę ciała.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie do obrazowania. Intensywność wzbudzenia i czas naświetlania dla każdego lasera nie powinny przekraczać odpowiednio 10–15 mW lub 120–150 ms, aby uniknąć fotowybielania i zminimalizować odstęp między punktami czasowymi. Ustaw średnią klatek na "2" i włącz funkcję wzmocnienia EM, aby zredukować szumy tła. Wybierz kalibrację obiektywu 63x, aby zapewnić prawidłowy pomiar rozmiaru piksela. 
	nuta: Opisane powyżej ustawienia mają na celu zapewnienie wstępnego odniesienia, ale będą się różnić w zależności od indywidualnych konfiguracji mikroskopu.</li>
	<li>Korzystając z lasera 405 nm i obiektywu pneumatycznego 20x, wizualizuj jądra, aby zlokalizować pole kosmków, które nie mają zauważalnego ruchu lub dryfują okiem. Unikaj obszarów sztucznych ruchów spowodowanych oddychaniem, perystaltyką jelit lub biciem serca.</li>
	<li>Za pomocą skanu XY zapisz współrzędną XY pola zainteresowania i przełącz się na obiektyw 63X z zanurzeniem w glicerolu.</li>
	<li>Upewnij się, że kosmki w wybranym polu są stabilne, uzyskując obraz na żywo na kanale 405 nm przez maksymalnie 1 minutę.</li>
	<li>Uzyskując obraz na żywo na kanale 405 nm, dostosuj ostrość, aby znaleźć płaszczyznę ortogonalną tuż pod końcówką kosmków. Uzyskaj stosy Z, zaczynając od nabłonka tuż pod nabłonkiem końcówki kosmka w dół kosmków, aż trudno będzie rozdzielić jądra, około 15–20 μm, stosując krok 1,5 μm. 
	nuta: W przypadku obrazowania z trzema kanałami (405, 488, 640 nm) przy użyciu opisanych powyżej czasów naświetlania, możliwe jest sekwencyjne rejestrowanie wszystkich trzech kanałów w odstępach około 20 s.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie w trybie analizy, 3–5 minut po rozpoczęciu akwizycji, aby potwierdzić stabilność obrazu i ruchliwość γδ IEL. Kontynuuj zbieranie obrazów przez 30–60 minut dla każdego pola kosmków. Zapisz 2–3 pola dla każdej myszy. Podczas obrazowania monitoruj mysz co 5 minut. 
	nuta: Jeśli znieczulenie zacznie słabnąć, użyj kleszczy, aby delikatnie podrapać szyję myszy, aby podać jednorazowo 50 μl ketaminy/ksylazyny. Kontynuuj monitorowanie poziomu znieczulenia i podawaj je ponownie w razie potrzeby.</li>
	<li>Nie zaleca się obrazowania pojedynczej myszy dłużej niż 4 godziny. Po zakończeniu akwizycji obrazu należy złożyć myszy w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy, a następnie obustronną odmę opłucnową.</li>
</ol>
4. Analiza 4D obrazów
<ol>
	<li>Bezpośrednie importowanie plików obrazowych do oprogramowania do renderowania 4D.</li>
	<li>Utwórz indywidualne powierzchnie dla IELs i lumenów, a następnie śledź powierzchnie w czasie, korzystając z parametrów opisanych w tabeli 1 jako początkowego odniesienia. W przypadku IELs włącz opcję Podziel dotykające się obiekty, używając wskazanej średnicy punktu początkowego.</li>
	<li>Użyj algorytmu śledzenia autoregresyjnego, aby określić ruchliwość IEL. Chociaż algorytm śledzenia jest stosunkowo dokładny, konieczne jest wizualne sprawdzenie ścieżek dla każdego indywidualnego IEL. Jeśli ścieżka jest nieprawidłowa, popraw ją za pomocą funkcji Rozłącz i Połącz na karcie Edytuj ścieżki.</li>
	<li>Aby określić odległość od każdego IEL do lumenu, wybierz powierzchnię strumienia świetlnego i wykonaj funkcję transformacji odległości w menu Narzędzie. Po wyświetleniu monitu wybierz opcję Powierzchnia zewnętrzna. Po obliczeniu transformacja odległości zostanie wyświetlona jako 4. kanał.</li>
	<li>Przefiltruj intensywność min 4. kanału, aby wybrać γδ IEL, które znajdują się w bocznej przestrzeni międzykomórkowej (LIS). Wartość ta powinna być bliska 15 μm, w oparciu o wysokość komórki nabłonka walcowatego. Odsetek całkowitych γδ IEL w tym zakresie jest podawany jako częstość γδ IELs w LIS.</li>
	<li>W celu dalszej analizy należy wyeksportować dane statystyczne, w tym: prędkość toru IEL, przemieszczenie toru, prostoliniowość toru i długość toru. Alternatywnie możesz analizować dane za pomocą modułu Vantage. W zależności od eksperymentu uzyskaj dodatkowe wskaźniki z uzyskanych danych, w tym czas przebywania w LIS lub interakcje IEL/nabłonek.</li>
</ol>

<ol><li>Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light+and+dark+sides+of+intestinal+intraepithelial+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (7), 445-456 (2011).</li>
<li>Hu, M. D., Edelblum, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sentinels+at+the+frontline%3A+the+role+of+intraepithelial+lymphocytes+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmacology+Reports%22%5BJournal%5D)">Sentinels at the frontline: the role of intraepithelial lymphocytes in inflammatory bowel disease.</a> Current Pharmacology Reports. 3 (6), 321-334 (2017).</li>
<li>Chen, Y., Chou, K., Fuchs, E., Havran, W. L., Boismenu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+the+intestinal+mucosa+by+intraepithelial+gamma+delta+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protection of the intestinal mucosa by intraepithelial gamma delta T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (22), 14338-14343 (2002).</li>
<li>Swamy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+intraepithelial+lymphocyte+activation+promotes+innate+antiviral+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Intestinal intraepithelial lymphocyte activation promotes innate antiviral resistance.</a> Nature Communications. 6, 7090(2015).</li>
<li>Dalton, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraepithelial+gammadelta%2B+lymphocytes+maintain+the+integrity+of+intestinal+epithelial+tight+junctions+in+response+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intraepithelial gammadelta+ lymphocytes maintain the integrity of intestinal epithelial tight junctions in response to infection.</a> Gastroenterology. 131 (3), 818-829 (2006).</li>
<li>Mombaerts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+development+of+inflammatory+bowel+disease+in+T+cell+receptor+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice.</a> Cell. 75 (2), 274-282 (1993).</li>
<li>Willcox, B. E., Willcox, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammadelta+TCR+ligands%3A+the+quest+to+solve+a+500-million-year-old+mystery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">gammadelta TCR ligands: the quest to solve a 500-million-year-old mystery.</a> Nature Immunology. 20 (2), 121-128 (2019).</li>
<li>Marchiando, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial+barrier+is+maintained+by+in+vivo+tight+junction+expansion+during+pathologic+intestinal+epithelial+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding.</a> Gastroenterology. 140 (4), e1201-e1202 (2011).</li>
<li>Marchiando, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolin-1-dependent+occludin+endocytosis+is+required+for+TNF-induced+tight+junction+regulation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Caveolin-1-dependent occludin endocytosis is required for TNF-induced tight junction regulation in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 189 (1), 111-126 (2010).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLCK-dependent+exchange+and+actin+binding+region-dependent+anchoring+of+ZO-1+regulate+tight+junction+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MLCK-dependent exchange and actin binding region-dependent anchoring of ZO-1 regulate tight junction barrier function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107 (18), 8237-8241 (2010).</li>
<li>Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+dendritic+cell+extension+into+the+small+bowel+lumen+in+response+to+epithelial+cell+TLR+engagement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement.</a> Journal of Experimental Medicine. 203 (13), 2841-2852 (2006).</li>
<li>McDole, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goblet+cells+deliver+luminal+antigen+to+CD103%2B+dendritic+cells+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine.</a> Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).</li>
<li>Edelblum, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+migration+of+gammadelta+intraepithelial+lymphocytes+requires+occludin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamic migration of gammadelta intraepithelial lymphocytes requires occludin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (18), 7097-7102 (2012).</li>
<li>Edelblum, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammadelta+Intraepithelial+Lymphocyte+Migration+Limits+Transepithelial+Pathogen+Invasion+and+Systemic+Disease+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Migration Limits Transepithelial Pathogen Invasion and Systemic Disease in Mice.</a> Gastroenterology. 148 (7), 1417-1426 (2015).</li>
<li>Hu, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+IL-15+Is+a+Critical+Regulator+of+gammadelta+Intraepithelial+Lymphocyte+Motility+within+the+Intestinal+Mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa.</a> Journal of Immunology. 201 (2), 747-756 (2018).</li>
<li>Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+Epithelial+and+Intraepithelial+T+Cell+Crosstalk+Mediates+a+Dynamic+Response+to+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection.</a> Cell. 171 (4), 783-794 (2017).</li>
<li>Prinz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+earliest+steps+of+gammadelta+T+cell+development+in+the+adult+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus.</a> Nature Immunology. 7 (9), 995-1003 (2006).</li>
<li>Sandrock, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+reveal+origin%2C+persistence+and+non-redundant+functions+of+IL-17-producing+gammadelta+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genetic models reveal origin, persistence and non-redundant functions of IL-17-producing gammadelta T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (12), 3006-3018 (2018).</li>
<li>Wang, X., Sumida, H., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR18+is+required+for+a+normal+CD8alphaalpha+intestinal+intraepithelial+lymphocyte+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">GPR18 is required for a normal CD8alphaalpha intestinal intraepithelial lymphocyte compartment.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (12), 2351-2359 (2014).</li>
<li>Sumida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR55+regulates+intraepithelial+lymphocyte+migration+dynamics+and+susceptibility+to+intestinal+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">GPR55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage.</a> Sci Immunol. 2 (18), (2017).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), (2011).</li>
<li>Watson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+barrier+function+in+vivo+is+sustained+despite+gaps+in+epithelial+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers.</a> Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).</li>
<li>Lodolce, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-15+receptor+maintains+lymphoid+homeostasis+by+supporting+lymphocyte+homing+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation.</a> Immunity. 9 (5), 669-676 (1998).</li>
<li>Ma, L. J., Acero, L. F., Zal, T., Schluns, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-presentation+of+IL-15+by+intestinal+epithelial+cells+drives+development+of+CD8alphaalpha+IELs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trans-presentation of IL-15 by intestinal epithelial cells drives development of CD8alphaalpha IELs.</a> Journal of Immunology. 183 (2), 1044-1054 (2009).</li>
<li>Knoop, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotics+promote+the+sampling+of+luminal+antigens+and+bacteria+via+colonic+goblet+cell+associated+antigen+passages%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Antibiotics promote the sampling of luminal antigens and bacteria via colonic goblet cell associated antigen passages.</a> Gut Microbes. 8 (4), 400-411 (2017).</li>
<li>Sujino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+adaptation+of+regulatory+and+intraepithelial+CD4%28%2B%29+T+cells+controls+gut+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue adaptation of regulatory and intraepithelial CD4(+) T cells controls gut inflammation.</a> Science. 352 (6293), 1581-1586 (2016).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Requirements+of+TCR+Signaling+in+Homeostatic+Maintenance+and+Function+of+Dendritic+Epidermal+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differential Requirements of TCR Signaling in Homeostatic Maintenance and Function of Dendritic Epidermal T Cells.</a> Journal of Immunology. 195 (9), 4282-4291 (2015).</li>
<li>Chennupati, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+intercompartmental+movement+of+gammadelta+T+cells%3A+intestinal+intraepithelial+and+peripheral+gammadelta+T+cells+represent+exclusive+nonoverlapping+populations+with+distinct+migration+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intra- and intercompartmental movement of gammadelta T cells: intestinal intraepithelial and peripheral gammadelta T cells represent exclusive nonoverlapping populations with distinct migration characteristics.</a> Journal of Immunology. 185 (9), 5160-5168 (2010).</li>
<li>Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+two-photon+imaging+of+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract.</a> Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Rozwój technik mikroskopii przyżyciowej stworzył bezprecedensową okazję do obserwacji reorganizacji struktur subkomórkowych 8,9,22, interakcji komórka-komórka12,25 i zachowań migracyjnych komórek 13,14,15,16,26</sup...

Limfocyty śródnabłonkowe (IEL) znajdują się w nabłonku jelitowym i znajdują się zarówno wzdłuż błony podstawnej, jak i między sąsiednimi komórkami nabłonkowymi w bocznej przestrzeni międzykomórkowej1. Na każde 5-10 komórek nabłonka przypada około jeden IEL; te IEL służą jako strażnicy zapewniający nadzór immunologiczny nad dużą przestrzenią bariery nabłonkowej jelit2. IEL wyrażające receptor limfocytów T γδ (TCR) stanowią do 60% całkowitej populacji IEL w jelicie cienkim myszy. Badania na myszach z niedoborem limfocytów T γδ wykazują w dużej mierze ochronną rolę tych komórek w odpowiedzi na uszkodzenie jelit, stan zapalny i infekcję3,4,5. Pomimo wygenerowania klasy nokautu Tcrd mouse<sup="xref">6, nasze zrozumienie biologii γδ IEL pozostaje ograniczone, częściowo ze względu na fakt, że ligandy rozpoznawane przez γδ TCR nie zostały jeszcze zidentyfikowane7. W rezultacie, brak narzędzi do badania tej populacji komórek utrudnił zbadanie roli aktywacji i funkcji γδ TCR w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Aby wypełnić tę lukę, opracowaliśmy techniki obrazowania na żywo w celu wizualizacji zachowań migracyjnych γδ IEL i interakcji z sąsiednimi enterocytami, aby zapewnić dodatkowy wgląd w funkcję γδ IEL i reakcję na bodźce zewnętrzne in vivo.
W ciągu ostatniej dekady, obrazowanie przyżyciowe znacznie poszerzyło nasze zrozumienie zdarzeń molekularnych związanych z wieloma aspektami biologii jelit, w tym z wydalaniem komórek nabłonkowych8, regulacja funkcji bariery nabłonkowej9,10, pobieranie próbek komórek szpikowych zawartości luminalnej11,12 oraz interakcje gospodarz-mikroorganizm11,13,14,15,16. W kontekście biologii IEL, zastosowanie mikroskopii przyżyciowej rzuciło światło na czasoprzestrzenną dynamikę ruchliwości IEL i czynniki pośredniczące w ich zachowaniu nadzoru13,14,15,16. Opracowanie myszy reporterowych TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP), które oznaczają γδ IELs za pomocą ekspresji jądrowej GFP17, ujawniło, że γδ IELs są wysoce ruchliwe w nabłonku i wykazują unikalne zachowanie nadzoru, które reaguje na infekcję mikrobiologiczną17,13,14. Niedawno opracowano kolejną mysz reporterową γδ z limfocytów T (Tcrd-GDL), która wyraża GFP w cytoplazmie, aby umożliwić wizualizację całej komórki18. Podobną metodologię zastosowano do zbadania wymagań specyficznych receptorów chemokin, takich jak receptor sprzężony z białkiem G (GPCR)-18 i -55, na dynamikę ruchliwości IEL19,20. W przypadku braku reportera specyficznego dla komórki, fluorescencyjne sprzężone przeciwciała przeciwko CD8α użyto do wizualizacji i śledzenia ruchliwości IEL in vivo19,20. Chociaż dwufotonowa laserowa mikroskopia skaningowa jest powszechnie stosowana do obrazowania przyżyciowego, zastosowanie konfokalnej mikroskopii laserowej z wirującym dyskiem zapewnia wyjątkowe korzyści w rejestrowaniu szybkich i wielokanałowych obrazów o wysokiej rozdzielczości przy minimalnym szumie tła. Technologia ta idealnie nadaje się do wyjaśnienia czasoprzestrzennej dynamiki interakcji immunologicznych/nabłonkowych w złożonym mikrośrodowisku błony śluzowej jelit. Ponadto, dzięki zastosowaniu różnych transgenicznych i/lub nokautujących modeli myszy, badania te mogą dostarczyć informacji na temat molekularnej regulacji funkcji jelitowych komórek immunologicznych i/lub nabłonkowych.

<table><tbody><tr><td>Talerz 35 mm, nr 1,5 szkiełko nakrywkowe</td><td>MatTek</td><td>P35G-1,5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 Hydrazide</td><td>Invitrogen</td><td>A30634</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Igły podskórne - 27 G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-826-48</td><td></td></tr><tr><td>BD Sterylna strzykawka z końcówką - 1 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>BD Strzykawka tuberkulinowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-829-9</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Elektrokoagulacja</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50822501</td><td></td></tr><tr><td>Zamknięta komora inkubacyjna</td> Igły do <td>mikroskopu</td><td>OKOLAB</td><td></td></tr><tr><td>, rozmiar #3; 1/2 koła, punkt stożka, długość cięciwy 12 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-7983-3</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Zrównoważony roztwór soli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55037C</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Imaris (v. 9.2.1) z modułami Start, Track, XT</td><td>Oprogramowanie</td><td>Bitplane</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop Leica</td><td></td><td></td><td></td>DMi8</tr><tr><td>IQ3 (v. 3.6.3)</td><td>Oprogramowanie Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Putney</td><td></td><td>Anestezjo</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki McPherson-Vannas 3" (7,5 cm) Długi 5 x 0,15 mm Prosty Ostry</td><td>Roboz</td><td>RS-5600</td><td></td></tr><tr><td>Niewchłanialny szew chirurgiczny, jedwabna szpula, pleciony</td><td>Kleszcze Fisher Scientific</td><td>NC0798934</td><td></td></tr><tr><td>Nugent 4,25" (11 cm) Długa, kątowa, gładka końcówka 1,2 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-5228</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Maść weterynaryjna</td><td>Dechra</td><td>Smarująca maść do oczu</td>Wirujący dysk Yokogawa CSU-W1 z obiektywem zanurzeniowym 63x 1,3 N.A. HC PLAN APO glicerol, kamerą iXon Life 888 EMCCD, laserem diodowym 405 nm, laserem DPSS 488 nm, laserem <td></td></tr><tr><td>diodowym 640 nm</td><td>System konfokalny</td><td></td> Ksylazyna <td></td></tr><tr><td></td><td>Akorn</td><td></td><td>Znieczulenie</td></tr></tbody></table>

obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Limfocyty śródnabłonkowe wyrażające receptor limfocytów T γδ (γδ IEL) odgrywają kluczową rolę w immunologicznym nadzorze nabłonka jelitowego. Częściowo ze względu na brak ostatecznego liganda dla receptora limfocytów T γδ, nasza wiedza na temat regulacji aktywacji γδ IEL i ich funkcji in vivo pozostaje ograniczona. Wymaga to opracowania alternatywnych strategii badania szlaków sygnałowych zaangażowanych w regulację funkcji γδ IEL i reakcji tych komórek na lokalne mikrośrodowisko. Chociaż powszechnie wiadomo, że γδ IEL ograniczają translokację patogenów, zastosowanie obrazowania przyżyciowego miało kluczowe znaczenie dla zrozumienia czasoprzestrzennej dynamiki interakcji IEL/nabłonek w stanie ustalonym i w odpowiedzi na inwazyjne patogeny. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół wizualizacji zachowań migracyjnych IEL w błonie śluzowej jelita cienkiego myszy reporterowej z komórek T GFP γδ za pomocą konfokalnej mikroskopii laserowej z odwróconym dyskiem. Chociaż maksymalna głębokość obrazowania w tym podejściu jest ograniczona w porównaniu z zastosowaniem dwufotonowej laserowej mikroskopii skaningowej, konfokalna mikroskopia laserowa z wirującym dyskiem zapewnia przewagę w postaci szybkiej akwizycji obrazu przy zmniejszonym fotowybielaniu i fotouszkodzeniach. Korzystając z oprogramowania do analizy obrazów 4D, zachowanie nadzoru limfocytów T i ich interakcje z sąsiednimi komórkami mogą być analizowane po manipulacji eksperymentalnej, aby zapewnić dodatkowy wgląd w aktywację i funkcję IEL w błonie śluzowej jelit.

Wykorzystując obrazowanie przyżyciowe myszy reporterowych TcrdEGFP, wykazaliśmy wcześniej, że limfocyty IEL γδ wykazują dynamiczne zachowania nadzorcze, polegające na patrolowaniu nabłonka poprzez migrację wzdłuż błony podstawnej oraz do bocznych przestrzeni międzykomórkowych (LIS) w stanie stacjonarnym (Rycina 2, Film 1).
Tę metodę można również wykorzystać do oceny, w jaki sposób hamowanie specyficznych szlaków sygnalizacyjnych komórek i/lub rec...

Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal ...

Mikroskopia przyżyciowa błony śluzowej jelita cienkiego może dostarczyć informacji na temat czasoprzestrzennej dynamiki interakcji komórkowych w nabłonku między różnymi typami komórek odpornościowych lub między tymi dwoma przedziałami. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona pozyskiwanie obrazów o dużej szybkości i wysokiej rozdzielczości w obrębie błony śluzowej jelit w czasie rzeczywistym. Obrazowanie jelita na żywo może dostarczyć dodatkowych informacji na temat interakcji komórkowych lub sygnalizacji komórkowej zaangażowanych w odporność błony śluzowej, biologię nabłonka lub biologię raka.Jest to wymagająca metoda, która wymaga praktyki w technice chirurgicznej, a także cierpliwości i optymalnego ustawienia myszy do akwizycji obrazu. Po potwierdzeniu braku odpowiedzi na uszczypnięcie palca u znieczulonej myszy transgenicznej, wykazującej ekspresję wzmocnionego białka zielonej fluorescencji lub EGFP, receptora limfocytów T gamma-delta, użyj strzykawki tuberkulinowej do powolnego wstrzyknięcia 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu barwnika Hoechst 33342 do zatoki żylnej zaoczodołowej. Godzinę do dwóch po wstrzyknięciu należy nałożyć maść na oczy zwierzęcia, aby zapobiec ich wysuszeniu.Następnie wykonaj pionowe nacięcie o średnicy 2 cm przez skórę i otrzewną, wzdłuż linii środkowej dolnej części brzucha i za pomocą kątowych kleszczy ostrożnie wyciągnij kątnicę z jamy otrzewnej. Zidentyfikuj obszar jelita cienkiego o długości 2-3 cm, który zawiera minimalną zawartość kału, uważając, aby nie rozerwać naczyń krwionośnych krezki, i ostrożnie zwróć kątnicę i pozostałe jelito cienkie do jamy otrzewnej, pozostawiając interesujący nas segment na zewnątrz. Umieszczając dwie pary kleszczy po obu stronach krezki podkreślonej między naczyniami krwionośnymi, delikatnie pocieraj końcówki kleszczy o siebie, aby utworzyć otwór w błonie.Za pomocą kątowych kleszczy i zakrzywionej igły stożkowej przymocowanej do szwu 5 cm, przeniknij jedną stronę otrzewnej przez otwór w błonie i w górę przez drugą stronę wyściółki otrzewnej, umieszczając jeden szew u górze, a drugi w pobliżu dolnej części nacięcia, aby zamknąć nacięcie, utrzymując pętlę jelita na zewnątrz. Aby zwiększyć prawdopodobieństwo sukcesu, nie wiąż ani nie rozrywaj żadnych naczyń krwionośnych podczas zakładania szwu brzusznego i ogranicz wszelkie obce obchodzenie się z jelitem. Następnie w ten sam sposób zamknij skórę pod pętlą jelitową, umieszczając jeden szew na środku nacięcia między poprzednimi szwami w otrzewnej pod linią.Za pomocą elektrokoagulacji wykonaj linię perforacji wzdłuż granicy antykrezkowej i natychmiast nałóż kilka kropel wody na powierzchnię jelita, aby zapobiec dodatkowemu uszkodzeniu tkanek wywołanemu ciepłem. Osusz chusteczką kimch, aby usunąć resztki wody. Użyj nożyczek vanna, aby wyciąć poziomą szczelinę o długości około 1,5 cm na dystalnej krawędzi kauteryzowanej tkanki, wzdłuż długości kauteryzowanej linii, w kierunku bliższego końca zewnętrznego segmentu tkanki.Kiedy powierzchnia błony śluzowej zostanie odsłonięta, przykryj brzuch wilgotną chusteczką kimch, aby utrzymać nawilżenie tkanki. W przypadku obrazowania mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem przenieś mysz do mikroskopu w zakrytym naczyniu. Uruchom oprogramowanie do obrazowania i odchyl głowicę mikroskopu do tyłu, a następnie dodaj 150 mikrolitrów 1 mikromolowego barwnika Alexa Fluor Fle i buforowanego roztworu soli fizjologicznej Hanka na wsunięte dno szklanej pokrywy.Ustaw mysz tak, aby otwarta powierzchnia błony śluzowej bezpośrednio stykała się ze szkiełkiem nakrywkowym. Umieść mysz i szalkę na stoliku do obrazowania we wstępnie ogrzanym inkubatorze. Ustaw intensywność wzbudzenia i czas ekspozycji dla każdego lasera odpowiednio na nie więcej niż 10-15 miliwatów i 120-150 milisekund, a średnią klatek na 2.Włącz funkcję wzmocnienia zwielokrotniającego elektrony, aby zredukować szumy tła i wybierz kalibrację obiektywu 63X, aby zapewnić prawidłowy pomiar rozmiaru piksela. Korzystając z 405-nanometrowego lasera i obiektywu pneumatycznego 20X, ręcznie wizualizuj jądra, aby zlokalizować pole kosmków, które nie mają zauważalnego ruchu lub dryfu, unikając obszarów sztucznego ruchu spowodowanego oddychaniem, perystaltyką lub biciem serca. Korzystając ze skanowania X-Y, zapisz współrzędną X-Y pola zainteresowania i przełącz się na obiektyw 63X z zanurzeniem w glicerolu.Uzyskaj obraz na żywo w kanale 405 nanometrów przez maksymalnie 1 minutę, aby potwierdzić, że kosmki w wybranym polu są stabilne, jednocześnie dostosowując ostrość, aby znaleźć płaszczyznę ortogonalną tuż pod końcówką kosmku. Następnie uzyskaj stosy z, zaczynając tuż pod nabłonkiem wierzchołka kosmku, około 15-20 mikrometrów w dół do kosmków, aż trudno będzie rozdzielić jądra, stosując kroki co 1,5 mikrometra. 3-5 minut po rozpoczęciu akwizycji potwierdź stabilność obrazu i ruchliwość komórek śródnabłonkowych gamma-delta i kontynuuj pozyskiwanie obrazów przez 30-60 minut dla każdego pola kosmków.Limfocyty śródnabłonkowe gamma-delta wykazują dynamiczne zachowanie nadzoru, w którym patrolują nabłonek, migrując wzdłuż błony podstawnej i do bocznej przestrzeni międzykomórkowej w stanie badania. Na tych reprezentatywnych obrazach kolorowe ślady wskazują ścieżki migracji poszczególnych śródnabłonkowych limfocytów gamma-delta w ciągu 30 minut. Chociaż częstość występowania limfocytów śródnabłonkowych w bocznej przestrzeni międzykomórkowej wzrosła u myszy leczonych przeciwciałem beta przeciwko receptorowi interleukiny-2, ponad 30% tych śródnabłonkowych limfocytów gamma-delta wykazywało zachowanie bezczynne.Ten fenotyp spoczynku został potwierdzony przez znaczne zmniejszenie zarówno prędkości chwilowej, jak i współczynnika uwięzienia śródnabłonkowych limfocytów gamma-delta, po blokadzie receptora interleukiny-2, w porównaniu z kontrolą. Co więcej, bezczynne śródnabłonkowe limfocyty Gamma-delta miały dłuższy czas przebywania i częściej były zlokalizowane w bocznej przestrzeni międzykomórkowej w porównaniu z ruchliwymi śródnabłonkowymi limfocytami Gamma-delta. Identyfikacja pól kosmków, które nie mają nadmiernego ruchu z powodu perystaltyki, może być trudna.Zmiana położenia myszy może pomóc w zlokalizowaniu bardziej stabilnego pola. Dalsza analiza danych śledzenia komórek może pomóc w zidentyfikowaniu określonych zachowań związanych z ruchliwością lub dostarczyć dodatkowych wskaźników do pomiaru interakcji komórkowych. Obrazowanie przyżyciowe i analiza ruchliwości IEL stały się standardowym odczytem funkcji IEL, zapewniając wgląd w to, w jaki sposób wrodzona sygnalizacja immunologiczna reguluje funkcję Gamma-delta IEL.

intravital-imaging-intraepithelial-lymphocytes-murine-small

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiono technikę wykonywania mikroskopii intravitalnej węzła chłonnego (LN) pachwinowego. Technika ta umożliwia badanie mikrokrążenia i struktury węzła chłonnego w czasie rzeczywistym, in vivo, zarówno w stanie homeostazy, jak i podczas infekcji. Metoda ta może zostać dostosowana do badań nad migracją komórek oraz do analizy innych lokalizacji węzłów chłonnych.

Mikroskopia wewnątrzżyciowa węzła chłonnego pachwinowego

Ostatnie postępy w mikroskopii dwufotonowej umożliwiły obrazowanie in situ żywych tkanek w modelach zwierzęcych w czasie rzeczywistym, co zwiększyło nasze możliwości badania zachowania komórek zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. W niniejszym materiale przedstawiamy przygotowania niezbędne do przeprowadzenia obrazowania przyżyciowego węzła chłonnego podkolanowego myszy.

Obrazowanie intravitalne węzła chłonnego podkolanowego myszy

Ten film demonstruje wizualizację śródnabłonkowych limfocytów γδ (IELs) u myszy transgenicznych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Zabieg chirurgiczny polega na wytworzeniu linii perforacji i wykonaniu podłużnego nacięcia w celu odsłonięcia błony śluzowej i kosmków jelitowych. Transgeniczne myszy wyrażają białka reporterowe wyłącznie w γδ IELs, umożliwiając ich śledzenie. Obrazowanie przyżyciowe rejestruje dynamiczny ruch IEL γδ znakowanych zieloną fluorescencją wzdłuż błony podstawnej komórki...

Wizualizacja śródnabłonkowych limfocytów śródnabłonkowych gamma delta

Używając transgenicznych myszy reporterowych i wstrzykiwanych znaczników fluorescencyjnych, długoterminowa mikroskopia konfokalna z wirującym dyskiem umożliwia bezpośrednią wizualizację zachowania komórek szpikowych w gruczolaku jelitowym w modelu raka jelita grubego ApcMin/+.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamiki komórek szpikowych w guzach jelita ApcMin/+ za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem

Rośnie zainteresowanie ilościową charakterystyką limfocytów jelitowych ze względu na coraz większą świadomość, że komórki te odgrywają kluczową rolę w różnych chorobach jelitowych i ogólnoustrojowych. W tym protokole opisujemy, jak izolować populacje pojedynczych komórek z różnych przedziałów jelita cienkiego w celu późniejszej charakterystyki cytometrii przepływowej.

Izolacja i charakterystyka cytometryczna mysich limfocytów jelita cienkiego

Opisujemy tutaj transgeniczny model myszy reporterowej do wizualizacji komórek wytwarzających IL-22 wewnątrz różnych tkanek myszy. Ta metoda może być wykorzystana do śledzenia lokalizacji innych cytokin lub białek wydzielniczych u myszy.

Wizualizacja limfocytów z ekspresją IL-22 przy użyciu myszy reporterowych

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji limfocytów z miejsc indukcyjnych, w tym tkanki limfatycznej związanej z jelitami, plam Peyera i drenujących węzłów chłonnych krezkowych, oraz miejsc efektorowych, w tym blaszki właściwej i nabłonka jelitowego układu odpornościowego jelita cienkiego.

Izolowanie limfocytów od układu odpornościowego myszy w jelicie cienkim

Tutaj demonstrujemy metody ilościowego oznaczania in vivo wyjścia leukocytów z naiwnej, zapalnej i złośliwej skóry myszy. Przeprowadzamy bezpośrednie porównanie dwóch modeli: transdermalnej aplikacji FITC i fotokonwersji in situ. Ponadto wykazujemy przydatność fotokonwersji do śledzenia wychodzenia leukocytów z guzów skóry.

Kwantyfikacja wychodzenia leukocytów przez naczynia limfatyczne z mysiej skóry i guzów

Korzystając z mikroskopii przyżyciowej, przedstawiona tutaj metoda umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym wydalania komórek nabłonka jelitowego u żywych zwierząt. W związku z tym miejscowo wybarwiona błona śluzowa jelit (akryflawina i rodamina B-dekstran) znieczulonych myszy jest obrazowana do rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Podejście oparte na mikroskopii przyżyciowej do oceny przepuszczalności jelit i wydajności wydalania komórek nabłonkowych

Ten protokół oferuje szczegółowe instrukcje dotyczące tworzenia mysich organoidów jelita cienkiego, izolowania wrodzonych komórek limfoidalnych typu 1 od mysiej blaszki jelita cienkiego oraz ustanawiania trójwymiarowych (3D) kokultur między oboma typami komórek w celu zbadania dwukierunkowych interakcji między komórkami nabłonka jelitowego a wrodzonymi komórkami limfoidalnymi typu 1.

Współhodowla organoidów nabłonkowych mysiego jelita cienkiego z wrodzonymi komórkami limfoidalnymi

Tutaj prezentujemy metodę uzyskiwania obrazów jelita po zranieniu wywołanym laserem. Poprzez wystawienie jelita myszy na działanie lasera wielofotonowego, utrata jednej lub wielu krypt jest indukowana lokalnie. Poprzez wielokrotne obrazowanie uszkodzonego obszaru przez miesiące, uchwycona jest dynamika regeneracji jelit w czasie rzeczywistym.

Ablacja laserowa i mikroskopia przyżyteczna w celu zbadania przebudowy jelit

Poznaj metodę obrazowania przyżyciowego limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy za pomocą odwróconej konfokalnej mikroskopii spinning disk. Technika umożliwia śledzenie żywych komórek immunologicznych w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

Przeglądaj więcej filmów