Name: Test bez przeciwciał do analizy aktywności metylotransferazy RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Poznaj test bez przeciwciał do analizy aktywności metylotransferazy RNA z wykorzystaniem trytyowanego S-adenozylometioniny. Ta metoda umożliwia ilościową i jakościową ocenę metylacji RNA bez artefaktów przeciwciałowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Turja Kanti Debnath za pomoc w tworzeniu ChemDraw. Badania w laboratorium Xhemalçe są wspierane przez Departament Obrony - Kongresionally Directed Medical Research Program - Breast Cancer Breakthrough Award (W81XWH-16-1-0352), NIH Grant R01 GM127802 oraz fundusze startowe z Instytutu Biologii Komórkowej i Molekularnej oraz College of Natural Sciences na University of Texas w Austin, USA.

1. Transkrypcja in vitro i żelowe oczyszczanie docelowego RNA
<ol>
	<li>Sklonuj interesującą sekwencję do plazmidów zawierających promotory T7 i/lub SP6 przy użyciu uznanych technik klonowania molekularnego12 lub zestawów.</li>
	<li>Linearyzacja matrycy DNA do transkrypcji in vitro
	<ol>
		<li>Amplifikuj sekwencję zainteresowania plazmidu metodą PCR za pomocą starterów zaprojektowanych tak, aby obejmowały region promotora T7 przez insert, +20-30 bp przed i za nim, jak opisano wcześniej13.</li>
		<li>Alternatywnie, trawić 5 μg plazmidu za pomocą enzymu restrykcyjnego (RE) dostępnego za wkładką zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez dostawcę RE. 
		UWAGA: Należy pamiętać o dwukrotnym sprawdzeniu, czy płytka nie została nacięta przez wybrany RE. Wybór RE użytego na tym etapie może znacząco wpłynąć na wydajność transkrypcji. Preferencyjnie linearyzuj z lub zwisającym 5' końcem, wytwarzając RE, aby uniknąć przełączania matrycy polimerazy RNA T7 na przeciwległą nić nici DNA14. Wypróbuj inną RE, jeśli początkowe plony są niewystarczające.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyść powstałe DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji i oczyszczania żelu agarozowego DNA. Odeluj DNA za pomocą 30 μl wody.</li>
	<li>Dobrze wymieszać przez wirowanie, odpipetować 1,5 μl i zmierzyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.</li>
	<li>Użyj 250 ng DNA, aby sprawdzić jakość i wielkość oczyszczonego DNA na 1% elektroforezie w żelu agarozowym w buforze 1x TBE migrowanym przez 1 godzinę przy 4 V/cm.</li>
	<li>Rozmrozić zamrożone odczynniki z zestawu do transkrypcji in vitro. Umieść mieszaninę polimerazy RNA T7 na lodzie, a pozostałe odczynniki na nutatorze w temperaturze pokojowej. Natychmiast po całkowitym rozmrożeniu szybko obracaj probówki rNTP przez 5 sekund, aby zebrać roztwór na dnie probówek i umieścić na lodzie. Utrzymuj 10x bufor reakcyjny w temperaturze pokojowej, aby uniknąć wytrącania się.</li>
	<li>Odpipetować do probówki o pojemności 1,5 ml następujące składniki 20 μl reakcji transkrypcji w temperaturze pokojowej we wskazanej kolejności: 6 μl wody, 2 μl (0,1 - 1 μg) liniowej matrycy DNA, 2 μl 75 mM roztworu ATP, 2 μl 75 mM roztworu GTP, 2 μL 75 mM roztworu CTP, 2 μL 75 mM roztworu UTP, 2 μL 10x buforu reakcyjnego i 2 μL mieszanki polimerazy RNA T7. 
	UWAGA: W przypadku matrycy DNA wygenerowanej metodą PCR należy użyć 100 - 200 ng DNA; dla matrycy DNA generowanej przez trawienie enzymu restrykcyjnego plazmidu należy użyć ~1 μg. Aktywna rekombinowana polimeraza RNA T7 znakowana przez 6 może być oczyszczona w E. coli15.</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj tubkę. Szybkie wirowanie przez 5 sekund w celu zebrania roztworu reakcyjnego na dnie probówki, następnie inkubacja w temperaturze 37 °C przez 2-4 godziny 
	UWAGA: Każdy transkrypt będzie zachowywał się inaczej w zależności od matrycy DNA, jej długości, sekwencji lub struktury. Zoptymalizuj warunki transkrypcji in vitro, testując różne czasy inkubacji do 6 godzin; różne stężenia matrycy DNA, polimerazy RNA T7 lub NTP; lub dodanie uzupełniającego MgCl2 do tego, co jest obecne w mieszaninie polimeraz RNA T7.</li>
	<li>Pod koniec okresu inkubacji dodać 1 μl DNazy I na 20 μl reakcji i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 min. 
	UWAGA: Reakcję transkrypcji można tymczasowo utrzymać na lodzie, dopóki żel poliakrylamidowy nie będzie gotowy.</li>
	<li>Kontynuuj oczyszczanie za pomocą żelu poliakrylamidowego. 
	UWAGA: Ponieważ RNA jest wrażliwe na zanieczyszczenie pH i RNazą, należy używać dedykowanego sprzętu RNA i odczynników wolnych od RNaz.</li>
	<li>Określić procentową zawartość poliakrylamidu w żelu w zależności od wielkości interesującego nas transkryptu: 3,5% dla 100-2000 nt (XC: 460 nt ; BB: 100 nt), 5% dla 80-500 nt (XC: 260 nt ; BB: 65 nt), 8% dla 60-400 nt (XC: 160 nt ; BB: 45 nt), 12% dla 40-200 nt (XC: 70 nt ; BB: 20 nt), 15% dla 25-150 nt (XC: 60 nt ; BB: 15 nt) i 20% dla 6-100 nt (XC: 45 nt ; BB: 12 nt).</li>
	<li>Przygotować żel poliakrylamidowy denaturujący mocznik, łącząc następujące odczynniki w stożkowej probówce o pojemności 50 ml: 9,6 g mocznika o czystości cząsteczkowej, 2 ml 10x TBE, x ml 40% mieszaniny akrylamidu: bis-akryloamidu (29:1) i wody do oznaczenia 20 ml na probówce, gdzie x = 20 ml / (40% / procent żelu %). 
	UWAGA: Żele poliakryloamidowe często zawierają niespolimeryzowany akrylamid, który jest materiałem toksycznym, który może stanowić zagrożenie po wprowadzeniu do środowiska. Żele poliakrylamidowe należy utylizować w ramach programu odpadów chemicznych instytucji.</li>
	<li>Kuchenka mikrofalowa przez 15 s przy 30% mocy. Umieścić na nutatorze na 10 minut w temperaturze pokojowej lub do całkowitego rozpuszczenia mocznika.</li>
	<li>Gdy mieszanina żelu się obraca, wyjmij kasetę z żelem (18-dołkową, o grubości 1 mm; 13,3 x 8,7 cm (szer. x dł.)), wyjmij grzebień i ustaw kasetę do odlewania żelu.</li>
	<li>Szybko obracaj probówkę o pojemności 50 ml przez 5 sekund, aby zebrać roztwór żelu na dnie probówki. Dodać 125 μl 10% roztworu nadsiarczanu amonu (APS). Umieść na nutatorze na ~ 1 min. Szybkie wirowanie ponownie przez 5 s.</li>
	<li>Dodać 25 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) i ostrożnie wymieszać, pipetując 5 razy w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 25 ml, unikając pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Odpipetuj do odlewu żelowego i ostrożnie włóż grzebień żelowy, unikając pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Dokręć uszczelkę, dodając duży klips do segregatora na górze kasety.</li>
	<li>Pozostaw żel do polimeryzacji na 1 godzinę.</li>
	<li>Gdy żel zastygnie, usuń spinacz do segregatora. Włóż kasetę do pudełka do elektroforezy. Dodaj 1x bufor TBE do górnego i dolnego zbiornika.</li>
	<li>Odzyskaj reakcję transkrypcji. Dodaj wodę do 100 μL, a następnie dodaj 100 μL 2x Gel Loading Buffer. Przygotuj drabinkę, mieszając zalecaną ilość z wodą do 10 μl i 10 μl 2x buforu ładującego żel do oddzielnej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Inkubować zarówno drabinkę, jak i reakcję transkrypcji in vitro w termomikserze w temperaturze 70 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Podczas denaturacji próbek w temperaturze 70 °C ostrożnie wyjąć grzebień, oczyścić studzienki, pipetując w górę i w dół każdego dołka za pomocą pipety P1000 i natychmiast uruchomić wstępnie przez 10 minut przy napięciu 100 V.</li>
	<li>Po zakończeniu 15-minutowej denaturacji próbek w temperaturze 70 °C wyjąć probówki z termomiksera i natychmiast umieścić je na lodzie.</li>
	<li>Ponownie wyczyść każdą studzienkę żelu za pomocą pipety P1000. Załaduj 20 μl drabinki na pierwszą studzienkę po lewej stronie, 20 μl próbki RNA do 10 oddzielnych studzienek i 20 μl 1x buforu ładującego żel do niewykorzystanych studzienek.</li>
	<li>Uruchom żel pod napięciem 100 V przez 60 -240 minut, w zależności od % poliakrylamidu w żelu. 
	UWAGA: Barwniki w buforze ładującym żel rozdzielą się na dwa pasma podczas przechodzenia przez żel, wolno migrujący niebieski pasek błękitu bromofenolowego (BB) i szybko migrujący błękit ksylenowy (XC) cyjan pasek. Przybliżona migracja tych prążków w różnych % żelach poliakryloamidowych jest dobrze znana (patrz krok 1.11) i może być wykorzystana do oszacowania migracji RNA w żelu.</li>
	<li>Po zatrzymaniu żelu ostrożnie wyjmij żel z kasety.</li>
	<li>Umieść żel w czystym pudełku zawierającym roztwór 50 ml 1x buforu TBE z 50 μl barwnika żelowego z kwasem nukleinowym i inkubuj przez 5 minut na kołysce w celu wybarwienia RNA.</li>
	<li>Zrób zdjęcie żelu przed i po wycięciu pasma w systemie obrazowania żelu, najlepiej przy użyciu światła niebieskiego zamiast transoświetlenia UV.</li>
	<li>Wytnij każdy interesujący nas pasmo za pomocą jednorazowej końcówki do cięcia żelu bez nukleazy. Po każdym dołku przenieś końcówkę zawierającą plasterek żelu do probówki o pojemności 1,5 ml i krótko zakręć, aby zebrać plasterek żelu. Powtarzaj, aż wszystkie prążki zostaną zebrane w tej samej probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Po zebraniu wszystkich plastrów żelu dodaj 100 μl wody wolnej od nukleaz lub buforu TE do probówki o pojemności 1,5 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez ~48 godzin. Dzięki temu RNA może opuścić plastry żelu do roztworu.</li>
	<li>Po 48 godzinach odpipetować wodę lub bufor TE do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml. Wyrzuć pozostałe plastry żelu. Oczyść RNA za pomocą zestawu do czyszczenia w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Utrzymuj kolumnę wirową w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut.</li>
		<li>Do 100 μl roztworu RNA w nowej probówce o pojemności 1,5 ml z kroku 1.32 dodaj 350 μl buforu RLT i dobrze mieszaj przez 2 minuty na nutatorze. Wirować przez 1 s przy 200 x g, aby zebrać roztwór na dnie probówki.</li>
		<li>Dodaj 675 μl 100% EtOH i dobrze mieszaj przez 2 minuty na nutatorze. Wirować przez 1 s przy 200 x g i natychmiast przejść do następnego kroku.</li>
		<li>Przenieść 565 μl mieszaniny na kolumnę wirową i wirować przez 1 minutę w temperaturze 15 000 x g. Opróżnij probówkę zbiorczą przez aspirację.</li>
		<li>Powtórzyć poprzedni krok z drugą połową próbki.</li>
		<li>Dodać 500 μl buforu RPE do kolumny i wirować przez 1 minutę w temperaturze 15 000 x g. Opróżnij probówkę zbiorczą przez aspirację.</li>
		<li>Dodaj 750 μl 80% etanolu do kolumny i wiruj przez 1 minutę w temperaturze 15 000 x g. Opróżnij probówkę zbiorczą przez aspirację.</li>
		<li>Umieścić kolumnę w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml z otwartą pokrywką i wirować z prędkością 15 000 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Przenieść kolumnę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Dodaj 17 μl wody na środek kolumny i wiruj z prędkością 15 000 x g przez 1 minutę do elucji. Ponownie eluować za pomocą kolejnych 17 μl wody. Całkowita odzyskana objętość powinna wynosić 32 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dobrze wymieszać przez wirowanie, odpipetować 1,5 μl i zmierzyć stężenie RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.</li>
	<li>Sprawdź jakość oczyszczania RNA za pomocą żelu poliakryloamidowego denaturującego mocznik, jak w krokach 1.11-1.29.</li>
</ol>
2. Test metylotransferazy RNA in vitro
<ol>
	<li>Ustawić test metylotransferazy RNA 100 μl w probówce o pojemności 1,5 ml na lodzie w następujący sposób: 23 μL wody, 10 μL 10x TBS (500 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1,5 M NaCl), 2 μL 0,05 M EDTA, 5 μL 100 mM DTT, 40 μL 50% glicerolu, 4 μL 58 μM 3H-SAM, 5 μL 20x koktajlu inhibitorów proteazy, 1 μL RNaseOUT (opcjonalnie), 5 μL RNA i 5 μL metylotransferazy. 
	UWAGA: Radioaktywny materiał trytytowany jest niebezpieczny i należy się z nim obchodzić wyłącznie w rękawicach, fartuchu laboratoryjnym i innych niezbędnych środkach ochrony osobistej. Wszystkie końcówki i rurki do pipet mające kontakt z materiałem promieniotwórczym są uważane za stałe odpady promieniotwórcze. Wszystkie stałe i ciekłe odpady promieniotwórcze należy utylizować zgodnie z zatwierdzonym przez laboratorium protokołem dotyczącym odpadów promieniotwórczych. 
	UWAGA: Uwzględnij próbki kontrolne bez metylotransferazy i bez RNA. Stężenia odczynników mogą wymagać optymalizacji i/lub włączenia dwuwartościowych soli kationowych, takich jak MgCl2 lub nieznakowany SAM. Optymalny zakres końcowego stężenia RNA wynosi od 50 nM do 1 μM, natomiast stężenie metylotransferazy wynosi od 25 nM do 300 nM.</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj, delikatnie obracając rurkę. Wirować 5 s przy 200 x g, aby zebrać roztwór na dnie probówki. Inkubować probówkę (probówki) w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.</li>
	<li>Oczyść reakcję, stosując oczyszczanie kolumny, jak w kroku 1.32. 
	UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność, aby prawidłowo zutylizować wszelkie materiały radioaktywne, szczególnie podczas mycia kolumny (pipetowanie zamiast zasysania odpadów z probówek).</li>
	<li>Przeprowadzanie zliczania scyntylacji cieczy
	<ol>
		<li>Ustaw stojak do zliczania scyntylacji z jedną fiolką na próbkę, jedną fiolką do pomiaru tła i jedną fiolką do testu machnięcia. Napełnić fiolki 5 ml roztworu do liczenia scyntylacji.</li>
		<li>Dodać 10 μl każdej eluowanej próbki radioaktywnego RNA do 1 fiolki, dokręcić pokrywkę i delikatnie wymieszać.</li>
		<li>Przygotuj fiolki testowe z przeciągnięciem. Dokładnie przetrzyj wacikami wszystkie powierzchnie i sprzęt używany podczas protokołu. Dodaj waciki do fiolek wypełnionych 5 ml roztworu scyntylacyjnego i dokręć pokrywkę.</li>
		<li>Uruchomić próbki na liczniku scyntylacyjnym w następujący sposób. Otwórz pokrywę licznika, włóż stojak do maszyny i zamknij pokrywę. Wybierz opcję Policz pojedynczy stojak. Wybierz opcję Wybierz program użytkownika. Wybierz lub utwórz program, który mierzy tryt (3H) przez 60 s. Uderz w stojak hrabiowski. Powtórz liczenie scyntylacji trzy razy. 
		UWAGA: Urządzenie zmierzy liczbę scyntylacji każdej próbki i wyśle ją zarówno na ekran, jak i na wydruk. W razie potrzeby protokół można w tym miejscu wstrzymać. Pozostałe próbki RNA z kroku 2.3 należy zamrozić w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontynuuj autoradiogram
	<ol>
		<li>Przygotować i wstępnie uruchomić żel poliakrylamidowy denaturujący mocznik, jak w krokach 1.11-1.20.</li>
		<li>Odpipetować 20 μl radioaktywnego materiału RNA do nowej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 20 μl 2x buforu ładującego żel. Dobrze wymieszaj. Przygotuj drabinę jak w kroku 1.21. Inkubować próbki w temperaturze 70 °C przez 15 minut.</li>
		<li>Umyć dołki żelu jeszcze raz bezpośrednio przed załadowaniem próbki. Na pozostałe pasy załadować 20 μl przygotowanej drabinki, 20 μl próbek i 20 μl 1x żelowego buforu ładującego. Uruchom żel pod napięciem 100 V przez 60-180 minut, w zależności od procentowej zawartości poliakrylamidu.</li>
		<li>Gdy żel skończy działać, wyjmij żel z kasety i umieść go w pudełku zawierającym 50 ml 1x buforu TBE z 5 μl ultraczułego barwnika żelowego kwasu nukleinowego.</li>
		<li>Inkubuj przez 5 minut na kołysce, aby wybarwić RNA.</li>
		<li>Ostrożnie wyjmij żel z pudełka i umieść go na transiluminatorze UV systemu obrazowania żelu z dołami do góry i drabinką po lewej stronie.</li>
		<li>Ustaw ostrość aparatu na żelu, włącz światło UV, a następnie zrób zdjęcie żelu, naświetlając go od 50 ms do 1 s w zależności od intensywności sygnału.</li>
		<li>Wyłącz ekspozycję UV i zapisz obraz jako plik TIFF.</li>
		<li>Umieść żel z powrotem w pudełku. Usunąć KZM. Utrwal żel za pomocą 50 ml roztworu utrwalającego (50% metanolu, 10% kwasu octowego, 40% ultraczystej wody) przez 30 minut w temperaturze pokojowej na bujaku.</li>
		<li>Delikatnie przenieś żel ponownie do świeżego czarnego pudełka zawierającego 25 ml roztworu wzmacniającego autoradiografię. W przypadku braku czarnego pudełka przykryj je folią aluminiową, aby chronić roztwór przed światłem.</li>
		<li>Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na bujaku.</li>
		<li>Delikatnie podnieś żel i połóż go ekranem do dołu na arkuszu folii z dołkami do góry i drabiną po prawej stronie. Umieścić dwa arkusze bibuły chromatograficznej na odwrocie żelu. Delikatnie odwróć cały stos.</li>
		<li>Rozgrzej suszarkę do żelu do 80 °C. Odsuń plastikową osłonę suszarki do żelu. Włóż folię, żel i stos papieru chromatograficznego pod plastikową pokrywę i przesuń plastikową osłonę z powrotem w dół, aby utworzyć uszczelnienie.</li>
		<li>Suszyć przez 1 godzinę w temperaturze 80 °C w suszarce do żelu.</li>
		<li>Wyłącz suszarkę do żelu i delikatnie wyjmij stos. Zdjąć folię i drugą bibułę chromatograficzną. Zaklej pozostałą bibułę chromatograficzną wysuszonym żelem w kasecie z autoradiogramem.</li>
		<li>Dodaj 1 arkusz filmu autoradiograficznego w ciemnym pokoju.</li>
		<li>Umieść kasetę w temperaturze -80 °C i wywołaj film po 1 godzinie do 4 tygodni w zależności od intensywności sygnału, którą można ocenić na podstawie wcześniej zmierzonej liczby scyntylacji: 1-4 tygodnie dla 250-1 000 cpm, 24 h do 1 tydzień dla 1 000-10 000 cpm i 1 h do 24 h dla >10 000 cpm.</li>
		<li>Po wywołaniu filmu umieść go na kasecie i ostrożnie zaznacz markerem laboratoryjnym 4 krawędzie żelu, każdą studzienkę oraz położenie barwników XC i BB.</li>
		<li>Zeskanuj film w rozdzielczości 300 lub 600 pikseli na cal i zapisz obraz jako plik TIFF.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+histones+to+RNA%3A+role+of+methylation+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">From histones to RNA: role of methylation in cancer.</a> Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).</li>
<li>Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Who+Watches+the+Watchmen%3A+Roles+of+RNA+Modifications+in+the+RNA+Interference+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006139(2016).</li>
<li>Mauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+methylation+of+m%286%29Am+in+the+5%27+cap+controls+mRNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability.</a> Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyladenosine-dependent+regulation+of+messenger+RNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.</a> Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).</li>
<li>Pendleton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+U6+snRNA+m%286%29A+Methyltransferase+METTL16+Regulates+SAM+Synthetase+Intron+Retention%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention.</a> Cell. 169 (5), 824-835 (2017).</li>
<li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27+UTR+m%286%29A+Promotes+Cap-Independent+Translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation.</a> Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N%286%29-methyladenosine+Modulates+Messenger+RNA+Translation+Efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency.</a> Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).</li>
<li>Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyladenosine+marks+primary+microRNAs+for+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing.</a> Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).</li>
<li>Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+RNA+methyltransferase+BCDIN3D+regulates+microRNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing.</a> Cell. 151 (2), 278-288 (2012).</li>
<li>Jeronimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+the+protein+interaction+network+for+the+human+transcription+machinery+reveals+the+identity+of+the+7SK+capping+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme.</a> Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brd4+and+JMJD6-associated+anti-pause+enhancers+in+regulation+of+transcriptional+pause+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release.</a> Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experimentation%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visual Experimentation. , Cambridge, MA. (2019).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experimentation%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visual Experimentation. (63), e3998(2012).</li>
<li>Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template+strand+switching+by+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Template strand switching by T7 RNA polymerase.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).</li>
<li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+active+recombinant+T7+RNA+polymerase+from+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protocols%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli.</a> Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).</li>
<li>Shelton, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+the+RNA+Methylation+and+Histone-Binding+Activities+of+MePCE+Regulates+P-TEFb+Activation+on+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin.</a> Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).</li>
<li>Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+plasmids+for+producing+RNA+in+vitro+transcripts+with+homogeneous+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends.</a> Nucleic Acids Research. 31 (15), 82(2003).</li>
<li>Blazer, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Suite+of+Biochemical+Assays+for+Screening+RNA+Methyltransferase+BCDIN3D%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D.</a> SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).</li>
<li>Arango, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+Promotes+Translation+Efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency.</a> Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+NAT10+is+an+ATP-dependent+RNA+acetyltransferase+responsible+for+N4-acetylcytidine+formation+in+18+S+ribosomal+RNA+%28rRNA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA).</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiono prostą i solidną metodę weryfikacji in vitro aktywności metylotransferazy RNA w stosunku do określonych transkryptów. Test wykorzystuje fakt, że S-adenozylometionina może być trytiowana na donorze grupy metylowej (ryc. 1), co pozwala na dokładne wykrycie metylowanego RNA bez użycia przeciwciał. Należy jednak zauważyć, że test ten nie może wskazać, która reszta lub grupa chemiczna jest metylowana przez enzym. Aby zidentyfikować lub zweryfikować, czy określona reszt...

DNA, RNA i białka podlegają modyfikacjom, które ściśle regulują ekspresję genów1. Wśród tych modyfikacji metylacje zachodzą na wszystkich trzech biopolimerach. Metylacja DNA i białek została bardzo dobrze przebadana w ciągu ostatnich trzech dekad. W przeciwieństwie do tego, zainteresowanie metylacją RNA zostało ponownie rozbudzone dopiero niedawno w świetle ważnej roli, jaką białka zapisujące, usuwające lub wiążące metylacje RNA odgrywają w rozwoju i chorobie2. Oprócz lepiej znanych funkcji w licznych rybosomalnych i transferowych RNA, szlaki metylacji RNA regulują specyficzną stabilność informacyjnego RNA3,4, splicing5 i translacja6,7, przetwarzanie miRNA8,9 oraz transkrypcja wstrzymywanie i zwalnianie10, 11.
Tutaj przedstawiono prostą i solidną metodę weryfikacji in vitro aktywności metylotransferazy RNA w warunkach laboratorium biologii molekularnej (podsumowane w <silna klasa="xfig">Rysunek 1). W wielu badaniach oceniane jest działanie metylotransferazy RNA poprzez dot-blot z przeciwciałem przeciwko modyfikacji RNA, która jest przedmiotem zainteresowania. Jednak dot-blot nie weryfikuje integralności RNA po inkubacji z metylotransferazą RNA. Jest to ważne, ponieważ nawet niewielkie zanieczyszczenia rekombinowanych białek nukleazami mogą prowadzić do częściowej degradacji RNA i mylących wyników. Co więcej, nawet wysoce specyficzne przeciwciała modyfikujące RNA mogą rozpoznawać niezmodyfikowane RNA o określonych sekwencjach lub strukturach. Opisany tutaj test metylotransferazy RNA in vitro wykorzystuje fakt, że S-adenozylometionina może być tritiowana na donorze grupy metylowej (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1), co pozwala na dokładne wykrycie metylowanego RNA bez użycia przeciwciał. Znajdują się w nich instrukcje dotyczące transkrypcji in vitro i oczyszczania transkryptu będącego przedmiotem zainteresowania oraz badania metylacji wspomnianego transkryptu przez enzym będący przedmiotem zainteresowania. Ta metoda jest elastyczna i solidna i można ją dostosować do potrzeb danego projektu. Na przykład można stosować RNA transkrybowane i oczyszczane in vitro, chemicznie syntetyzowane RNA, ale także komórkowe RNA. Test ten dostarcza informacji ilościowych w postaci liczby scyntylacji, a także informacji jakościowych, pokazując, gdzie dokładnie przebiega metylowany RNA na żelu. Może to zapewnić unikalny wgląd w funkcję metylotransferazy RNA, szczególnie w przypadku wykorzystania komórkowego RNA jako substratu, ponieważ zapewnia metodę bezpośredniej obserwacji wielkości RNA lub RNA, które są przeznaczone do metylacji.

<table><tbody><tr><td>10 bp DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10821-015</td><td>10 bp Zestaw drabinek DNA.</td></tr><tr><td>10% nadsiarczan amonu (APS)&nbsp;</td><td>Nie</td> dotyczy <td>Nie dotyczy</td><td>Do żelu poliakryloamidowego denaturującego mocznik (Na 10 ml rozpuść 1 g w 8 ml wody miliQ; dostosuj objętość do 10 ml wodą miliQ; przefiltruj roztwór za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml wyposażonej w 0,45 &mikro; m filtra).</td></tr><tr><td>10X Bufor TBE</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Do żelu poliakrylamidowego denaturującego mocznik (Dla 1L dodaj 108 g zasady Tris, 55 g kwasu borowego do cylindra z mieszadłem; dodaj 800 ml wody destylowanej i pozwól się rozpuścić; dodać 40 ml 0,5 M Na2EDTA (pH 8,0); dostosuj objętość do 1 l za pomocą wody miliQ; przefiltruj roztwór za pomocą 0,22&Micro; m filtra).</td></tr><tr><td>10X TBS</td><td>N/A</td><td>N/D</td><td>Dla 1L dodać 60,5 g Tris Base, 87,6 g NaCl do cylindra z mieszadłem; dodać 800 ml wody destylowanej i pozostawić do rozpuszczenia; dostosować pH do 7,5 za pomocą stężonego HCl; dostosować objętość do 1 l za pomocą wody miliQ; przefiltrować roztwór za pomocą 0,22 &mikro; Filtr M.&nbsp;</td></tr><tr><td>Akrylamid: Bis-Akrylamid 29:1 (40% roztwór/elektroforeza), Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP1408-1</td><td>Do żelu poliakryloamidowego denaturującego mocznik.</td></tr><tr><td>ADENOZYLO-L-METIONINA, S-[METYLO-3H]; (SAM[3H])</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET155V250UC</td><td>Do metylacji RNA in vitro; Stężenie = 1,0 mCi/ml; Aktywność właściwa = 17,1 Ci/mmol; Molarność= (1,0 Ci/L)/(83,2 Ci/mmol) = 0,0584 mmol/L = 58,4 &mikro;M.&nbsp; &nbsp; Po otrzymaniu zamrożonej rurki 3H-SAM rozmrozić ją w temperaturze 4&deg; C, zrób 20 i mikro; L i zamrozić je w temperaturze -30&deg;C. Nigdy nie zamrażaj ponownie i nie używaj ponownie częściowo wykorzystanej podwielokrotności.</td></tr><tr><td>Kasety autoradiograficzne Amersham Hypercassette</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN11649</td><td>Do ekspozycji żelu autoradiogramowego.</td></tr><tr><td>Amersham Hyperfilm MP</td><td>GE Healthcare</td><td>28906846</td><td>Do naświetlania żelem autoradiogramowym.</td></tr><tr><td>Licznik scyntylacyjny</td><td>Beckman</td><td>LS6500</td><td>Do zliczania płynów.</td></tr><tr><td>Biorad Mini System Elektroforezy Poziomej</td><td>Biorad</td><td>1704466</td><td>Mini System Elektroforezy Poziomej.</td></tr><tr><td>cOmplete Mini Tabletki koktajlowe z inhibitorem proteazy bez EDTA Roche</td><td>Applied Science</td><td>4693159001</td><td>Aby uzyskać roztwór 20X, rozpuść 1 tabletkę w 0,525 ml wody wolnej od nukleaz.</td></tr><tr><td>Criterion Cell</td><td>Biorad</td><td>345-9902</td><td>Pusta kaseta wolna od RNaz do żelu poliakrylamidowego.</td></tr><tr><td>Kryterium puste Kasety</td><td>Biorad</td><td>1656001</td><td>Pionowe ogniwo do elektroforezy w formacie midi.</td></tr><tr><td>Spektrofotometr mikroobjętościowy DeNovix DS-11 Spektrofotometr mikroobjętościowy</td><td>DeNovix</td><td>DS-11-S</td><td>do pomiaru stężenia DNA i RNA.</td></tr><tr><td>Ecoscint Original</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-271</td><td>Do zliczania cieczy.</td></tr><tr><td>Fiolki scyntylacyjne Fisherbrand 7 ml HDPE</td><td>Fisher</td><td>03-337-1</td><td>Do zliczania płynów.</td></tr><tr><td>Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer</td><td>RPI CORP</td><td>112600</td><td>Do wstępnej obróbki żelem autoradiogramowym.</td></tr><tr><td>Suszarka do żelu</td><td>Biorad</td><td>1651745</td><td>Do suszenia żelu.</td></tr><tr><td>Gel Loading Buffer II</td><td>Ambion</td><td>AM8547</td><td>Do ładowania RNA w denaturującym żelu mocznikowym z poliakrylamidu (skład: 95% Formamid, 18 mM EDTA i 0,025% SDS, Xylene Cyanol i Bromophenol Blue).</td></tr><tr><td>GeneCatcher jednorazowe końcówki do wycinania żelu</td><td>Firma Gel NC9431993</td><td></td><td>Do usuwania pasków z żeli agarozowych i poliakrylamidowych.</td></tr><tr><td>Zestaw Megascript</td><td></td><td>Ambion AM1333</td><td>Do transkrypcji in vitro polimerazą RNA T7.&nbsp;</td></tr><tr><td>Perfectwestern Extralarge Container</td><td>Genhunter Corporation</td><td>NC9226382 (przezroczysty) / NC9965364 ()</td> <td>Żelowe pudełko do barwienia.</td></tr><tr><td>pRZ</td><td>Addgene</td><td>#27663</td><td>Plazmid do wytwarzania transkryptów in vitro z jednorodnymi końcami</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy MinElute Cleanup</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Do oczyszczania RNA należy użyć zmodyfikowanego protokołu zawartego w protokole.</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Zestaw do ekstrakcji żelu i oczyszczania fragmentu dsDNA używanego do transkrypcji in vitro.</td></tr><tr><td>Saran Premium Plastic Wrap</td><td>Saran Wrap</td><td>Amazon Do</td><td>suszenia żelu.</td></tr><tr><td>SYBR Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td>Ultra czuła barwnik żelowa z kwasem nukleinowym.</td></tr><tr><td>SYBR Safe</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>Barwnik w żelu z kwasem nukleinowym.</td></tr><tr><td>TE</td><td>Sigma</td><td>93283-100ML</td><td>10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA disodowy, pH 8,0</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher</td><td>110-18-9</td><td>Do żelu poliakrylamidowego denaturującego mocznik.</td></tr><tr><td>Termomikser z probówkami SMARTBLOCK 24X 1,5 ml</td><td>eppendorf</td><td>5382000023/5361000038</td><td>Do inkubacji probówek o pojemności 1,5 ml w kontrolowanej temperaturze.</td></tr><tr><td>TOPO TA Cloning Kit</td><td>life technologies</td><td></td><td>Zestawy do szybkiego klonowania polimerazy Taq&ndash; amplifikowane produkty PCR do wektorów zawierających promotory T7 i/lub SP6 do transkrypcji RNA in vitro.</td></tr><tr><td>TURBO DNaza (2 U&frasl; &mikro; L)</td> <td>Ambion</td><td>AM2238</td><td>Do usuwania DNA z reakcji transkrypcji in vitro.</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma</td><td>51456-500G</td><td>Do żelu poliakrylamidowego denaturującego mocznik.</td></tr><tr><td>Papier Whatman 3MM</td><td>GE Healthcare</td><td>3030-154</td><td>Bibuła chromatograficzna do suszenia żelu.</td></tr></tbody></table>

test bez przeciwciał do analizy aktywności metylotransferazy rna

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

Istnieje ponad 100 chemicznie odrębnych modyfikacji RNA, z których dwie trzecie składa się z metylacji. Zainteresowanie modyfikacjami RNA, a zwłaszcza metylacją, pojawiło się ponownie ze względu na ważną rolę, jaką odgrywają enzymy, które je zapisują i usuwają, w procesach biologicznych związanych z chorobami i rakiem. W tym miejscu zapewniony jest czuły test in vitro do dokładnej analizy aktywności składnika metylacji RNA na syntetycznych lub transkrybowanych in vitro RNA. W teście tym wykorzystuje się tritiowaną formę S-adenozylometioniny, co skutkuje bezpośrednim znakowaniem metylowanego RNA trytem. Niska energia promieniowania trytu sprawia, że metoda jest bezpieczna, a istniejące wcześniej metody wzmacniania sygnału trytu umożliwiają ilościowe określenie i wizualizację metylowanego RNA bez użycia przeciwciał, które są powszechnie podatne na artefakty. Chociaż ta metoda jest napisana dla metylacji RNA, kilka poprawek sprawia, że ma ona zastosowanie do badania innych modyfikacji RNA, które mogą być znakowane radioaktywnie, takich jak acetylacja RNA za pomocą 14C acetylokoenzymu A. Ogólnie rzecz biorąc, test ten pozwala szybko ocenić warunki metylacji RNA, hamowanie za pomocą inhibitorów drobnocząsteczkowych lub wpływ mutantów RNA lub enzymów, i zapewnia potężne narzędzie do walidacji i rozszerzania wyników uzyskanych w komórkach.

Reakcja transkrypcji in vitro 
Rysunek 2A przedstawia typowy przebieg reakcji transkrypcji in vitro z użyciem polimerazy RNA T7 dla snRNA 7SK, która jest stosunkowo krótkim (331 nt) i silnie ustrukturyzowanym RNA. Jak widać na surowym obrazie, obecne są liczne niepożądane prążki, zarówno krótsze, jak i dłuższe od 7SK, co prawdopodobnie wynika z przypadkowych zdarzeń inicjacji lub terminacji transkrypcji. Z tego powodu oczyszczanie żelowe po reakcji transk...

Tutaj opisany jest test in vitro bez przeciwciał do bezpośredniej analizy aktywności metylotransferazy na syntetycznym lub transkrybowanym in vitro RNA.

Test bez przeciwciał do analizy aktywności metylotransferazy RNA

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Istnieje ponad 100 różnych modyfikacji RNA, z których dwie trzecie to metylacje. Protokół ten zapewnia metodę czułej i dokładnej analizy aktywności składnika zapisującego metylację RNA. Ta łatwa w użyciu technika pozwala nam na ilościowe określenie i wizualizację metylowanego RNA bez użycia przeciwciał, które są powszechnie podatne na artefakty.Procedurę zademonstruje Samantha Shelton, doktorantka z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, ustaw 100-mikrolitrowy test metylotransferazy RNA w 1,5-mililitrowej probówce na lodzie, jak opisano w protokole tekstowym. Obracaj probówkę, aby dokładnie wymieszać, i odwiruj z prędkością 200 razy g przez pięć sekund, aby zebrać roztwór na dnie probówki.Inkubować probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Następnie należy oczyścić reakcję za pomocą oczyszczania kolumnowego, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby wykonać zliczanie scyntylacyjne cieczy, należy skonfigurować stojak do zliczania scyntylacji z jedną fiolką na próbkę, jedną fiolką do pomiaru tła i jedną fiolką do testu swijakowego.Napełnij fiolki pięcioma mililitrami roztworu do liczenia scyntylacyjnego. Dodaj 10 mikrolitrów każdej eluowanej radioaktywnej próbki RNA do jednej fiolki. Dokręć pokrywkę i delikatnie wymieszaj.Aby przygotować fiolki z testem magnetycznym, należy dokładnie przetrzeć bawełnianymi wacikami wszystkie powierzchnie i sprzęt używany podczas zabiegu. Dodaj te waciki do fiolek wypełnionych roztworem scyntylacyjnym i dokręć pokrywkę. Aby uruchomić próbki na ladzie scyntylacyjnej, otwórz pokrywę licznika, włóż stojak do urządzenia i zamknij pokrywę.Wybierz opcję Policz pojedynczy stojak. Wybierz opcję Wybierz program użytkownika. Wybierz lub utwórz program, który mierzy tryt przez 60 sekund i naciśnij Count Rack.Powtórz liczenie scyntylacji trzy razy. Następnie należy przygotować i ponownie uruchomić żel poliakrylamidowy denaturujący mocznik, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przenieś 20 mikrolitrów radioaktywnego materiału RNA do nowej 1,5-mililitrowej probówki zawierającej 20 mikrolitrów buforu ładującego żel 2X.Po przygotowaniu drabinki inkubować próbki w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 15 minut. Bezpośrednio przed załadowaniem próbki należy ponownie przemyć dołki żelu, pipetując bufor ze zbiorników żelu do zagłębień żelu. Następnie załaduj 20 mikrolitrów przygotowanej drabiny, 20 mikrolitrów próbek i 20 mikrolitrów bufora ładującego żel 1X do pasów żelu.Uruchom żel pod napięciem 100 woltów przez 60 do 180 minut, w zależności od procentowej zawartości poliakrylamidu. Gdy żel zakończy działanie, wyjmij żel z kasety i umieść go w pudełku zawierającym 50 mililitrów buforu 1X TBE z pięcioma mikrolitrami ultraczułego barwnika żelowego kwasu nukleinowego. Inkubuj na bujaku przez pięć minut, aby wybarwić RNA.Następnie ostrożnie wyjmij żel z pudełka i umieść go na transiluminatorze UV systemu obrazowania żelu z dołkami do góry i drabiną po lewej stronie. Ustaw ostrość aparatu na żelu, włącz światło UV i zrób zdjęcie żelu. Następnie wyłącz ekspozycję na promieniowanie UV i zapisz obraz jako plik TIFF.Umieść żel z powrotem w pudełku, usuń KZM i utrwal żel za pomocą 50 mililitrów roztworu utrwalającego na kołysce w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie delikatnie przenieś żel do świeżego czarnego pudełka zawierającego 25 mililitrów roztworu wzmacniającego autoradiografię. Inkubować na bujaku w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Delikatnie podnieś żel i połóż go ekranem do dołu na arkuszu folii z dołamkami do góry i drabiną po prawej stronie. Umieść dwa arkusze bibuły chromatograficznej na odwrocie żelu i odwróć cały stos. Rozgrzej suszarkę do żelu do 80 stopni Celsjusza.Przesuń plastikową osłonę suszarki do żelu z powrotem. Włóż cały stos pod plastikową osłonę i przesuń plastikową osłonę z powrotem w dół, aby utworzyć uszczelnienie. Suszyć żel w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez godzinę.Następnie wyłącz suszarkę do żelu i delikatnie wyjmij stos. Zdjąć folię i drugą bibułę chromatograficzną. Pozostałą bibułę chromatograficzną okleić taśmą z wysuszonym żelem w kasecie z autoradiogramem.W ciemnym pomieszczeniu dodaj jeden arkusz filmu autoradiograficznego. Przechowuj kasetę w ujemnej temperaturze 80 stopni Celsjusza i wywołuj film w odpowiednim czasie, w zależności od intensywności sygnału. Po wywołaniu filmu umieść go na kasecie i za pomocą markera laboratoryjnego dokładnie zaznacz cztery krawędzie żelu, każdą studzienkę oraz położenie barwników XC i BB.Zeskanuj film w rozdzielczości 300 lub 600 pikseli na cal i zapisz obraz jako plik TIFF. W tym badaniu wykazano, że test wolny od przeciwciał analizuje aktywność metylotransferazy RNA. Typowy przebieg reakcji transkrypcji in vitro z polimerazą T7 RNA małego jądrowego RNA 7SK wykazuje stosunkowo krótki i wysoce ustrukturyzowany RNA.Istnieje wiele niepożądanych prążków, zarówno krótszych, jak i dłuższych niż 7SK, prawdopodobnie wynikających z losowych zdarzeń inicjacji lub zakończenia transkrypcji. Z tego powodu oczyszczanie żelu po reakcji transkrypcji in vitro jest ważne w celu uzyskania czystej próbki RNA. W tym momencie interesujący RNA można zidentyfikować na podstawie jego położenia względem drabiny i oczyścić przez oczyszczanie żelem.Reprezentatywny test metylotransferazy RNA przy użyciu dolnej granicy zalecanych stężeń RNA i białka przedstawiono tutaj. Test ten pozwala na uzyskanie zarówno wyników ilościowych ze zliczeń scyntylacyjnych, jak i wyników jakościowych z autoradiogramu. W tym przypadku wykazano, że metylotransferaza RNA, o której wiadomo, że metylan 7SK jest w stanie również metylować U6. Ponadto, jak ostatnio wykazano dla 7SK, wiązanie histonu H4 z MePCE również hamuje metylację U6.Można to zaobserwować zarówno w liczbie scyntylacji, jak i autoradiogramie, co pokazuje solidność tego protokołu. RNA jest podatne na degradację, dlatego należy upewnić się, że używasz odczynników wolnych od RNaz i dokładnie wyczyść wszystkie powierzchnie i sprzęt. Znakowany radioaktywnie RNA uzyskany z tego testu metylotransferazy może być bezpośrednio wykorzystany do oceny aktywności demetylazy RNA lub aktywności wiązania RNA, na przykład za pomocą testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej.Metoda ta pozwala naukowcom przetestować wpływ różnych czynników na aktywność metylotransferazy RNA, w tym mutacji punktowych i leczenia inhibitorami małocząsteczkowymi. Ta metoda wykorzystuje materiał radioaktywny, dlatego należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i zachować ostrożność podczas obchodzenia się z materiałami radioaktywnymi i ich usuwania.

antibody-free-assay-for-rna-methyltransferase-activity-analysis

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Niniejszy protokół opisuje przygotowanie syntetycznego substratu tRNA dla homologu metylotransferazy DNA/tRNA 2 (Dnmt2) z Entamoeba histolytica, Ehmeth, oraz pomiar jego aktywności metylotransferazy. To podejście eksperymentalne może być wykorzystane do badania aktywności innych białek Dnmt2.

Analiza metylacji tRNA in vitro z użyciem enzymu DNA i tRNA metylotransferazy Dnmt2 (Ehmeth) z Entamoeba histolytica

Opisana jest zmodyfikowana metoda northern blot do pomiaru modyfikacji N 6-metylodenozyny (m6A) w RNA. Obecna metoda może wykrywać modyfikacje w różnych RNA i kontrolach w ramach różnych projektów eksperymentalnych.

Metoda pomiaru modyfikacji RNA N 6-metyloadenozyny w komórkach i tkankach

Tutaj opisujemy protokół charakterystyki biochemicznej enzymu modyfikującego RNA drożdży, Mod5, i omawiamy, jak ten protokół mógłby być zastosowany do innych enzymów modyfikujących RNA.

Test in vitro w celu wykrycia aktywności transferazy tRNA-izopentenylowej

Tutaj prezentujemy protokół zależnego od DNAzymu podziału RNA. Umożliwia to szybką i zależną od miejsca analizę 2'-O-metylacji RNA. Podejście to można wykorzystać do wstępnej lub głównej oceny aktywności snoRNA.

Zależna od DNAzymu analiza 2'-O-metylacji rRNA

Test immunoprecypitacji metylowanego RNA jest metodą opartą na przeciwciałach, używaną do wzbogacania metylowanych fragmentów RNA. W połączeniu z głębokim sekwencjonowaniem prowadzi to do identyfikacji transkryptów przenoszących modyfikację m5C.

Test immunoprecypitacji metylowanego RNA do badania modyfikacji m5C u Arabidopsis

Te protokoły dostarczają metodologii używanej do oceny aktywności enzymatycznej poszczególnych członków rodziny białkowej metylotransferazy argininowej (PRMT) w komórkach. Opisano szczegółowe wytyczne dotyczące oceny aktywności PRMT z wykorzystaniem biomarkerów endogennych i egzogennych, przeciwciał rozpoznających metylo-argininę oraz związków narzędziowych inhibitorów.

Ilościowe metody badania aktywności metylotransferazy argininy 1-9 białek w komórkach

Rola modyfikacji RNA w infekcjach wirusowych dopiero zaczyna być badana i może uwypuklić nowe mechanizmy interakcji wirus-gospodarz. W tej pracy przedstawiamy proces badania modyfikacji RNA m6A i m5C w kontekście infekcji wirusowych.

Badanie epitranskryptomów m6A i m5C po infekcji wirusowej: przykład z HIV

Metylotransferazy DNA są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny małych cząsteczek pod kątem hamowania metylotransferazy DNA. Test ten wykorzystuje endonukleazę do sprzężenia metylacji DNA z generowaniem fluorescencji i pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.

Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA

Przedstawiamy tutaj protokół półilościowej oceny globalnych poziomów M⁶A za pomocą punktowego blotu. Całkowite RNA jest ekstrahowane, denaturowane, naznaczane na nylonowej membranie, badane przeciwciałem przeciw m⁶A i wizualizowane za pomocą chemiluminescencji. Intensywność sygnału, zmierzona za pomocą analizy szarości ImageJ, odzwierciedla względną obfitość metylacji, zapewniając powtarzalny przepływ pracy w badaniach.

Test punktowy do wykrywania globalnych poziomów modyfikacji N 6-metyladenozyny RNA

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę sekwencjonowania Susieciowanych, Ligowanych i Swybranych Hybridów (SPLASH), która umożliwia mapowanie całego genomu wewnątrzcząsteczkowych i międzycząsteczkowych interakcji RNA-RNA in vivo. SPLASH może być stosowany do badania interakcji RNA w organizmach, w tym drożdżach, bakteriach i ludziach.

Mapowanie interakcji RNA-RNA na całym świecie przy użyciu biotynylowanego psoralenu

Poznaj test bez przeciwciał do analizy aktywności metylotransferazy RNA z wykorzystaniem trytyowanego S-adenozylometioniny. Ta metoda umożliwia ilościową i jakościową ocenę metylacji RNA bez artefaktów przeciwciałowych.

Test bez przeciwciał do analizy aktywności metylotransferazy RNA

Przeglądaj więcej filmów