Name: Wspomagana ultradźwiękami pierwotna izolacja fibroblastów dorosłych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Poznaj szybką metodę izolacji pierwotnych fibroblastów dorosłych z użyciem fal ultradźwiękowych i trawienia enzymatycznego. Protokół minimalizuje ryzyko zakażenia bakteryjnego i jest dostępny dla początkujących badaczy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Pani Romy Kempe i Pani Annett Opitz za fachowe wsparcie techniczne. Dziękujemy również Panu Bjoernowi Binnewergowi za wsparcie informatyczne. Prace te były wspierane przez granty a) Förderkreis Dresdner Herz-Kreislauf-Tage e.V., b) "Habilitationsförderprogramm für Frauen", Wydział Lekarski Carl Gustav Carus Dresden oraz c) Else Kröner-Forschungskolleg (EKFK) Wydział Lekarski Carl Gustav Carus Dresden. Jesteśmy wdzięczni za dofinansowanie i wsparcie.

Poniższy protokół jest zgodny z wytycznymi Technische Universität Dresden, Niemcy (numer pliku: T 2014/4), jak również międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami (FELASA)17. Rysunek 1 przedstawia proces izolacji komórek.
1. Przygotowanie zestawu, materiału i nośnika
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych, roztwór PBS, roztwór podstawowy mieszanki kolagenazy (rozpuść 50 mg liofilizowanej mieszanki kolagenazy w 12 ml sterylnej ultraczystej wody) i 0,25% roztwór trypsyny.</li>
	<li>Podgrzać pożywkę, PBS i roztwór trypsyny do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Podgrzej ultradźwiękową łaźnię wodną do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Zdezynfekuj kleszcze, szpatułkę ze stali nierdzewnej, skalpele (2x skalpele na narząd) i 2 szklane zlewki z 70% etanolem i umieść te materiały pod kapturem do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Napełnij jedną zlewkę 70% etanolem, a drugą sterylną wodą lub roztworem PBS. Zlewki te są zobowiązane do dezynfekcji i mycia instrumentu po każdej procesji organowej.</li>
	<li>Umieść sterylne plastikowe probówki o pojemności 15 ml zawierające zimny PBS na mokrym lodzie. Liczba probówek zależy od liczby narządów, z których chcesz wyizolować fibroblasty.</li>
</ol>
2. Sekcja myszy i usuwanie organów
<ol>
	<li>Noś dwie pary rękawiczek jedna nad drugą, tak aby pierwszą parę można było zdjąć, gdy tylko zwierzę zostanie wypreparowane. 
	UWAGA: Ta procedura zapobiega rozprzestrzenianiu się bakterii z sierści i skóry zwierzęcia po narządach.</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji (np. zwichnięcie szyjki macicy) i przypnij tuszę igłami do każdej kończyny do podkładki styropianowej.</li>
	<li>Zdezynfekuj tuszę myszy za pomocą sprayu 70% etanolu. Upewnij się, że futro jest nasączone etanolem, aby włosy nie wirowały.</li>
	<li>Obetnij futro tuż nad drogami moczowo-płciowymi za pomocą kleszczy chirurgicznych i atraumatycznych nożyczek. Przeciąć skórę wzdłuż środkowej linii od miejsca początkowego nacięcia do szyi (3 - 4 cm) i dodać reliefowe nacięcia na kończynach. 
	UWAGA: Na tym etapie nie należy perforować warstwy mięśniowej, aby uniknąć zanieczyszczenia bakteryjnego!</li>
	<li>Przypnij skórę do podkładki z pianki polistyrenowej, aby mieć optymalny dostęp do mięśni pokrywających jamę brzuszną.</li>
	<li>Dwukrotnie zdezynfekuj mięśnie brzucha przy użyciu 70% etanolu. Poczekaj, aż etanol wyschnie, zanim przejdziesz do następnego kroku.</li>
	<li>Zdejmij pierwszą parę rękawiczek. Użyj nowego, sterylnego zestawu kleszczy i nożyczek.</li>
	<li>Otwórz jamę brzuszną i klatkę piersiową, nacinając warstwę mięśniową nożyczkami chirurgicznymi, aby delikatnie usunąć wybrane narządy. Dlatego należy delikatnie przytrzymać narząd kleszczami chirurgicznymi (nie przekłuwać narządu, stosować minimalny nacisk) i przeciąć nożyczkami naczynia krwionośne w pobliżu punktu wejścia do narządu.</li>
	<li>Umieścić narządy w sterylnych probówkach zawierających zimny PBS. Zamknij szczelnie rurki. Umieść probówki na mokrym lodzie, aż przejdziesz do kroku 3.1.</li>
</ol>
3. Rozdrabnianie tkanek, trawienie i ekstrakcja komórek
<ol>
	<li>Przenieść probówki pod sterylny kaptur do hodowli komórek. 
	UWAGA: Załóż nową parę rękawiczek i zdezynfekuj probówki 70% etanolem przed przeniesieniem ich pod maskę!</li>
	<li>Wyjąć narząd z probówki o pojemności 15 ml za pomocą sterylnych kleszczy. Umieścić narząd na jednej połowie sterylnej szalki Petriego o średnicy 6 cm i krótko umyć narząd PBS w celu usunięcia nadmiaru krwi. Przenieś narząd do drugiej połowy szalki Petriego, usuń nadmiar PBS.</li>
	<li>Zmiel tkankę za pomocą dwóch sterylnych skalpeli. Pozostałe fragmenty tkanki nie powinny być większe niż 1 - 2 mm.</li>
	<li>Przenieś zmieloną tkankę do nowej sterylnej probówki o pojemności 15 ml za pomocą sterylnej szpatułki i dodaj 2 ml 0,25% roztworu trypsyny. Umieścić probówkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C na 5 minut.</li>
	<li>Delikatnie obracaj rurkę (około 1400/min) przez 10 s.</li>
	<li>Zatrzymać reakcję trypsyny pod kapturem hodowli komórkowej, dodając 4 ml pożywki do hodowli komórkowych zawierającej FCS (np. zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM) firmy Dulbecco).</li>
	<li>Dodać 250 μl roztworu mieszanki kolagenazy do każdej probówki zawierającej tkankę serca lub płuc i 100 μl odpowiednio dla nerek lub wątroby.</li>
	<li>Umieścić probówki w ultradźwiękowej łaźni wodnej (37 °C) i aktywować ultradźwiękowy sonograf na 10 min. 
	UWAGA: Ultradźwiękowa łaźnia wodna stosowana w tym protokole ma częstotliwość pracy 35 kHz i maksymalną moc 320 W.</li>
	<li>Delikatnie wirować rurki (około 1400/min) przez 10 s.</li>
	<li>Umieść probówki ponownie w ultradźwiękowej łaźni wodnej na 10 minut.</li>
	<li>Wiruj delikatnie (około 1400/min) przez 10 s.</li>
	<li>Zdezynfekuj probówki 70% etanolem i przenieś je pod sterylny kaptur do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Przefiltrować roztwór z siatką 40 μm do nowej sterylnej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować probówkę o sile 500 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml świeżej pożywki.</li>
	<li>Przenieść komórki do odpowiedniego naczynia do hodowli komórkowej (np. płytki 6-dołkowej) i umieścić naczynie w inkubatorze do hodowli komórkowych na noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Następnego dnia usuń pożywkę, przemyj 3 razy PBS, a następnie dodaj świeżą pożywkę (dodana objętość zależy od wybranego naczynia do hodowli komórkowej, 2 ml na dołek płytki 6-dołkowej itp.).</li>
	<li>Zmieniaj podłoże co drugi dzień. 
	UWAGA: Fibroblasty mogą ulec rozszczepieniu po osiągnięciu zbieżności optycznej 90% (zwykle po 5-7 dniach).</li>
</ol>

<ol><li>Baum, J., Duffy, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+and+myofibroblasts%3A+what+are+we+talking+about%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).</li>
<li>Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+the+identity+of+cardiac+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Redefining the identity of cardiac fibroblasts.</a> Nature Reviews. Cardiology. 14 (8), 484-491 (2017).</li>
<li>Weissman-Shomer, P., Fry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo+fibroblasts+senscence+in+vitro%3A+pattern+of+cell+division+and+life+span+as+a+function+of+cell+density%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 4 (2), 159-166 (1975).</li>
<li>Angello, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+potential+and+the+duration+of+the+cell+cycle+in+human+fibroblasts%3A+coordinate+stimulation+by+epidermal+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 62 (1), 1-12 (1992).</li>
<li>Serra, V., von Zglinicki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fibroblasts+in+vitro+senesce+with+a+donor-specific+telomere+length%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length.</a> FEBS Letters. 516 (1), 71-74 (2002).</li>
<li>Mateu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+differences+between+neonatal+and+adult+fibroblasts+and+keratinocytes%3A+Donor+age+affects+epithelial-mesenchymal+crosstalk+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro.</a> International Journal of Molecular Medicine. 38 (4), 1063-1074 (2016).</li>
<li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+Cardiac+Fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Journal%3A+Official+Journal+of+the+Japanese+Circulation+Society%22%5BJournal%5D)">Defining the Cardiac Fibroblast.</a> Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li>
<li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260(2016).</li>
<li>Kuenzel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+epigenetic+silencing+of+polo-like+kinase+2+promotes+fibrosis+in+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation.</a> bioRxiv. , 445098(2018).</li>
<li>Van Linthout, S., Miteva, K., Tschöpe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+fibroblasts+and+inflammatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 258-269 (2014).</li>
<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+function+of+fibroblasts+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The biology and function of fibroblasts in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).</li>
<li>Poulet, C., Künzel, S., Büttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+physiological+functions+and+ion+currents+in+atrial+fibroblasts+from+patients+with+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation.</a> Physiological Reports. 4 (2), (2016).</li>
<li>Gündüz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Isolation+of+High+Quality+Cardiomyocytes%2C+Endothelial+Cells%2C+and+Fibroblasts+from+an+Adult+Rat+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55601(2017).</li>
<li>Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+for+the+isolation+of+postnatal+murine+cardiac+myocyte+and+fibroblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).</li>
<li>Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+enzymatic+isolation+of+fibroblasts+for+the+creation+of+autologous+skin+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 40 (8-9), 268-277 (2004).</li>
<li>El-Armouche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase+inhibitor-1-deficient+mice+are+protected+from+catecholamine-induced+arrhythmias+and+myocardial+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy.</a> Cardiovascular Research. 80 (3), 396-406 (2008).</li>
<li>Guillen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FELASA+Guidelines+and+Recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">FELASA Guidelines and Recommendations.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51 (3), 311-321 (2012).</li>
<li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), 2033(2010).</li>
<li>Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblasts+differentiate+from+fibroblasts+when+plated+at+low+density%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (9), 4219-4223 (1996).</li>
<li>Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+fibroblasts+in+cell+culture+systems%3A+myofibroblasts+all+along%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 389-399 (2011).</li>
<li>Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed - NCBI. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484</a> (2019).</li>
<li>Coppé, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+in+aging+and+age-related+disease%3A+from+mechanisms+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).</li>
<li>Singh, M., Sharma, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outgrowth+of+fibroblast+cells+from+goat+skin+explants+in+three+different+culture+media+and+the+establishment+of+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 47 (2), 83-88 (2011).</li>
<li>Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+removal+of+fibroblasts+from+human+tissue+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems.</a> Experimental Cell Research. 185 (2), 519-528 (1989).</li>
</ol>

Nie ma żadnych konfliktów interesów, które można by zadeklarować.

W porównaniu z unieśmiertelnionymi liniami komórkowymi fibroblastów, pierwotne fibroblasty mają kilka zalet. Można je izolować w sposób ekonomiczny w wysokiej jakości i ilości. Co więcej, hodowle pierwotne oferują możliwość badania komórek pochodzących od wielu osobników, co zwiększa wiarygodność uzyskanych wyników i zmniejsza prawdopodobieństwo samego badania artefaktów hodowli komórkowych. Ciągłe wytwarzanie nowych kultur pierwotnych zapobiega zmianom genetycznym, które często występują po wielokrotnym pasażowaniu<sup ...

Fibroblasty to płaskie, wrzecionowate komórki z wieloma wyrostkami gwiaździstymi i rozległą, szorstką retikulum endoplazmatycznego1,2. Przeciętny fibroblast mierzy 30 - 100 μm i ma żywotność 57 ± 3 dni1,3. Średni czas trwania cyklu komórkowego ludzkich fibroblastów waha się od 16 do 48 godzin w zależności od warunków hodowli4. Istnieją dowody na to, że zdolność replikacyjna i jakość funkcjonalna hodowanych fibroblastów pierwotnych ujemnie koreluje z wiekiem dawcy, co sugeruje, że młodsi dawcy (zwierzęta lub pacjenci) powinni być preferowani, jeśli to możliwe5,6.
Fibroblasty stanowią dominujący typ komórek w tkankach większości ssaków. Pomimo ich wszechobecności, identyfikacja molekularna fibroblastów nadal stanowi wyzwanie7. Fibroblasty migrują do rozwijających się tkanek i narządów z różnych źródeł podczas rozwoju embrionalnego8. Z tego powodu istnieje mnóstwo białek markerowych, które można znaleźć w fibroblastach, podczas gdy nadal brakuje unikalnych białek markerowych, które są obecne w każdej populacji fibroblastów i są wyłączne dla fibroblastów. Tak więc wzorce ekspresji kilku uznanych markerów są zwykle używane do identyfikacji fibroblastów. Do najbardziej rozpoznawalnych markerów należą wimentyna, białko powierzchniowe ludzkiego fibroblastu (hFSP), receptor domeny dyskoidyny 2 (DDR2) i aktyna alfa mięśni gładkich (αSMA).
Fibroblasty są głównym typem komórek wytwarzających macierz zewnątrzkomórkową (ECM). W ten sposób fibroblasty utrzymują uporządkowaną architekturę tkanek i zapewniają mechaniczne wsparcie dla sąsiednich komórek1. Równowaga między syntezą a degradacją ECM jest dobrze uregulowanym procesem. Przesunięcia w kierunku syntezy oznaczają początek nadmiernego odkładania się ECM, które, jeśli nie zostanie zakończone, prowadzi do zwłóknienia. W zwłóknieniu pośredniczą miofibroblasty, które wywodzą się z aktywowanych fibroblastów ulegających zmianom molekularnym i fenotypowym. Jedną z cech charakterystycznych miofibroblastów jest zwiększone wydzielanie ECM i cytokin oraz ekspresja uporządkowanych mikrofilamentów αSMA9.
Pierwotne fibroblasty znalazły się w centrum uwagi ostatnich badań skupiających się na zwłóknieniu, stanach zapalnych tkanek i interakcjach fibroblast-rak-komórka10,11. Jednak, aby skutecznie badać właściwości fibroblastów w zdrowiu i chorobie, konieczne jest regularne izolowanie żywotnych pierwotnych dorosłych fibroblastów. Dostępnych jest kilka metod izolacji fibroblastów12,13,14. Trzy główne metody izolacji fibroblastów to wyrastanie z fragmentów tkanki12, enzymatyczne trawienie tkanek15 oraz enzymatyczna perfuzja pustych narządów9,13,16. Zaletą przerostu jest łagodny proces izolacji bez enzymatycznej degradacji komórek. Z drugiej strony, kultury wyrostkowe zwykle wymagają przedłużonych okresów hodowli, dopóki komórki nie będą mogły być wykorzystane do eksperymentów. Powszechne trawienie enzymatyczne jest szybkie, ale niesie ze sobą ryzyko zanieczyszczenia innymi typami komórek (np. komórkami śródbłonka) lub bakteriami w procesie mieszania, co jest niezbędne do mechanicznego rozpuszczenia tkanki. Co więcej, metody te są często skomplikowane i wymagają czasu i umiejętności do nauczenia się.
Jeśli chodzi o znaczenie pierwotnych fibroblastów w badaniach, nadal istnieje potrzeba optymalizacji istniejących metod izolacji komórek pod względem szybkości, prostoty i niezawodności. W tym przypadku zapewniona jest nowatorska metoda izolacji enzymatycznych fibroblastów oparta na ultradźwiękach, zapewniająca wysoką jakość komórek.

<table><tbody><tr><td>0,25% Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyki</td><td>Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA</td><td>Gibco LS15140148&nbsp;</td><td>Penicylina/ Streptomycyna (10 000 U/ml)</td></tr><tr><td>Kaptur do hodowli komórkowych</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stany Zjednoczone</td><td>51023608</td><td>HeraSafe KSP15</td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli komórkowych</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>50049176</td><td>BBD 6220</td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>w zależności od naczynia</td><td>6-, 12-, 24-dołkowego Powierzchnia nunclon</td></tr><tr><td>Odsysanie kultur komórkowych</td><td>VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Niemcy</td><td>20727400</td><td>BVC profesjonalny</td></tr><tr><td>sitko do komórek ssących (siatka)</td><td>Corning, Tewksbury, USA</td><td>431750</td><td>40 & mikro; m Wirówka nylonowa</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stany</td><td>Zjednoczone 75007213</td><td>Megafuge 8R</td></tr><tr><td>Bezprzewodowy kontroler pipetowania</td><td>Hirschmann, Eberstadt, Niemcy</td><td>9907200</td><td>Pipetus</td></tr><tr><td>Jednorazowe końcówki do pipet</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>w zależności od objętości</td><td>Końcówki SafeSeal do pipet (10 &mikro; L, 20 i mikro; L, 100 i mikro; L, 200 i mikro; L, 1000 i mikro; L)</td></tr> <tr><td>Jednorazowe pipety plastikowe</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>w zależności od objętości</td><td>5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 ml</td></tr><tr><td>Jednorazowy sterylny skalpel</td><td>Myco Medical, Cary, USA</td><td>n.a.Techno</td> <td>cut</td></tr><tr><td>Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>41965-062</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Eppendorfa</td> o wysokiej zawartości glukozy <td>Eppendorf, Hamburg, Niemcy&nbsp;</td><td>w zależności od objętości</td><td>50 i mikro; L, 500 i mikro; L, 1.500&mikro; L, 2.000 &mikro; L</td></tr><tr><td>Płodowa surowica cielęca (FCS)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>F2442-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka kolagenazy</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>5401020001</td><td>Liberase TL Research</td></tr><tr><td>Grade szalka Petriego 6 cm</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>P5481-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>D8537-500ML</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Zestaw do wykrywania starzenia</td><td>Abcam, Cambridge, Wielka Brytania</td><td>ab65351</td><td></td></tr><tr><td>Shaker/ Vortex</td><td>IKA, Staufen im Breisgau, Niemcy</td><td>n.a.MS2</td> <td>Minishaker (kolejny model: Ident-Nr.: 0020016017)</td></tr><tr><td>Sterylne probówki z tworzywa sztucznego</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>Probówki Falcon 352095</td><td>BD Falcon (15 mL, 50 mL)</td></tr><tr><td>Ultradźwiękowa kąpiel wodna</td><td>BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Niemcy</td><td>312</td> Nożyczki chirurgiczne <td>Sonorex RK100H</td></tr><tr><td>(atraumatyczne)</td><td>Aesculap AG, Tuttlingen, Niemcy</td><td>NR 82</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne&nbsp;</td><td>Aesculap AG, Tuttlingen, Niemcy</td><td>eq 1060.09</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze chirurgiczne</td><td>Aesculap AG, Tuttlingen, Niemcy</td><td>BD577</td><td></td></tr></tbody></table>

wspomagana ultradźwiękami pierwotna izolacja fibroblastów dorosłych

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Pierwotne dorosłe fibroblasty stały się ważnym narzędziem do badania zwłóknień, interakcji fibroblastów i stanów zapalnych we wszystkich tkankach ciała. Ponieważ pierwotne fibroblasty nie mogą dzielić się w nieskończoność z powodu różnicowania miofibroblastów lub indukcji starzenia, należy regularnie zakładać nowe kultury. Istnieje jednak kilka przeszkód do pokonania podczas procesów opracowywania niezawodnego protokołu izolacji i samej pierwotnej izolacji fibroblastów: stopień trudności metody (szczególnie dla początkujących), ryzyko zanieczyszczenia bakteryjnego, wymagany czas do wykorzystania pierwotnych fibroblastów do eksperymentów oraz późniejsza jakość i żywotność komórek. W tym badaniu przedstawiono szybki, niezawodny i łatwy do nauczenia się protokół izolacji i hodowli pierwotnych dorosłych fibroblastów z serca, płuc, wątroby i nerek myszy, łączący trawienie enzymatyczne i mieszanie ultradźwiękowe.

Wykazano skuteczność niniejszego protokołu w izolowaniu dojrzałych fibroblastów z litej tkanki mysiej. Uzyskano żywe fibroblasty, które mogą być wykorzystane w dalszych eksperymentach, takich jak barwienie immunofluorescencyjne czy badania proliferacji (Rysunek 2D-F, Rysunek 5A).
Dorosłe fibroblasty są płaskimi komórkami o wrzecionowatym kształcie z licznymi wypustkami komórkowymi, które zazwyczaj ros...

Przedstawiamy protokół do izolacji pierwotnych dorosłych fibroblastów w łatwy, szybki i niezawodny sposób, możliwy do wykonania przez początkujących (np. studentów). Zabieg łączy enzymatyczne trawienie tkanek i mechaniczne mieszanie z falami ultradźwiękowymi w celu uzyskania pierwotnych fibroblastów. Protokół można łatwo dostosować do konkretnych wymagań eksperymentalnych (np. tkanki ludzkiej).

Wspomagana ultradźwiękami pierwotna izolacja fibroblastów dorosłych

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

Nasz protokół zapewnia łatwe i szybkie podejście do pierwotnej izolacji fibroblastów z wyraźnym naciskiem na unikanie zanieczyszczenia bakteryjnego, które może stanowić ogromny problem. Szczególnie dla początkujących. Główną zaletą naszej techniki jest jej prostota.Ponieważ nie wymaga dużych zdolności manualnych ani doświadczenia i może być łatwo opanowany przez każdego w krótkim okresie szkolenia. Technikę zaprezentuje Manja Newe, technik z naszego laboratorium. Przed rozpoczęciem sekcji załóż dwie pary jednorazowych rękawiczek, jedna na drugiej.I przymocuj mysz do podkładki polistyrenowej. Zdezynfekuj sierść 70% etanolem, upewniając się, że zwierzę jest przemoczone. I użyj sterylizowanych etanolem kleszczy chirurgicznych i atraumatycznych nożyczek, aby objąć skórę tuż nad drogami moczowo-płciowymi.Wytnij trzy do czterech centymetrów wzdłuż linii środkowej od początkowego nacięcia do szyi, dodając reliefowe nacięcia na kończynach. I przypnij skórę do opuszki, aby uzyskać optymalny dostęp do mięśni pokrywających jamę brzuszną. Następnie dwukrotnie zdezynfekuj mięśnie brzucha świeżym 70% etanolem.Gdy etanol wyschnie, zdejmij pierwszą parę rękawiczek. I użyj nowego sterylnego zestawu kleszczy i nożyczek, aby naciąć warstwę mięśni, aby otworzyć jamę brzuszną i klatkę piersiową. Aby usunąć interesujące nas narządy, delikatnie chwyć każdy narząd kleszczami chirurgicznymi, nie przekłuwając tkanki.I użyj nożyczek, aby ostrożnie przeciąć zaopatrujące naczynia krwionośne w pobliżu wejścia narządu. Umieść każdy narząd w probówce ze sterylnym, zimnym PBS i szczelnie zamknij probówkę. Umieszczanie każdej probówki na mokrym lodzie podczas pobierania narządów.Po pobraniu wszystkich narządów spryskaj probówki 70% etanolem przed umieszczeniem ich w sterylnym kapturze do hodowli komórkowych. Zakładając świeżą parę rękawiczek, użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść każdy narząd na jedną połówkę sterylnej sześciocentymetrowej szalki Petriego. I krótko umyj narządy świeżym PBS, aby usunąć nadmiar krwi.Przenieś opłukane narządy na drugą połowę każdej szalki Petriego i usuń nadmiar PBS. Za pomocą dwóch sterylnych skalpeli zmiel narządy na jedno- lub dwumilimetrowe fragmenty. I użyj sterylnej szpatułki, aby przenieść kawałki tkanki do nowych, indywidualnych, sterylnych probówek o pojemności 15 mililitrów.Dodaj dwa mililitry 0,25% roztworu trypsyny do każdej probówki. I umieść probówki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć minut. Pod koniec inkubacji wiruj rurki z prędkością około 1400 obrotów na minutę przez dziesięć sekund.I zatrzymaj reakcję trypsyny za pomocą czterech mililitrów odpowiedniej pożywki hodowlanej uzupełnionej surowicą cielęcą płodu na probówkę. Następnie dodaj odpowiednią objętość roztworu mieszanki kolagenazy do każdej probówki. I umieść probówki w ultradźwiękowej łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut.Pod koniec sonikacji delikatnie wirować rurki przez 10 sekund. Przed ponownym umieszczeniem probówek w ultradźwiękowej łaźni wodnej na kolejne 10 minut. Pod koniec drugiej sonikacji należy wirować rurki przez kolejne 10 sekund.I zdezynfekuj rurki 70% etanolem. W kapturze do hodowli komórkowych przefiltruj zawiesiny komórek przez indywidualne sitka o długości 40 mikrometrów do nowej, sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów. I zbierz komórki przez odwirowanie.Ponownie zawiesić granulki w jednym mililitrze świeżego podłoża na probówkę. I zobacz komórki w odpowiednich naczyniach do hodowli komórkowych o odpowiedniej gęstości posiewu. Następnie umieść komórki na noc w inkubatorze do hodowli komórkowych.Następnego ranka przemyj każdą kulturę trzykrotnie PBS przed dodaniem świeżej pożywki i powrotem komórek do inkubatora. Korzystając z tego protokołu, można uzyskać żywotne fibroblasty do wykorzystania w kolejnych eksperymentach. Takie jak barwienie aminofluorescencyjne lub eksperymenty z proliferacją.Dorosłe fibroblasty to płaskie, wrzecionowate komórki z wieloma procesami komórkowymi, które zwykle rosną w monowarstwach. Można jednak zaobserwować wyraźne różnice morfologiczne w populacjach fibroblastów z różnych narządów. Na przykład fibroblasty nerkowe są mniejsze i rosną w większej gęstości niż fibroblasty serca, płuc lub wątroby.Wyizolowane fibroblasty wykazują wysokie tempo proliferacji, osiągając konfluencję optyczną większą niż 90% po około sześciu dniach. Można tu zaobserwować zróżnicowany miofibroblast z charakterystycznymi mikrofilamentami aktyny mięśni gładkich alfa. Komórki te występują w dużych ilościach w hodowlach komórek serca, nerek, wątroby i płuc.Podczas gdy tylko około 20 do 30 procent izolowanych i hodowanych komórek wyraża uporządkowane, ułożone, alfa mikrofilamenty aktyny mięśni gładkich, praktycznie wszystkie komórki są dodatnie dla wimentyny i receptora domeny dyskoidyny 2 po siedmiu dniach w hodowli. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać, jest stosowanie odpowiedniej techniki podczas całej procedury, ponieważ należy unikać zanieczyszczenia bakteryjnego. Po pierwotnej izolacji fibroblastów komórki mogą być wykorzystywane do wszelkiego rodzaju eksperymentów psychiatrycznych i charakterystyki.Takich jak proliferacja chemii immunocytarnej lub eseje o gojeniu się ran lub oceny biologii molekularnej.

ultrasonic-augmented-primary-adult-fibroblast-isolation

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejszy artykuł opisuje protokół izolacji i hodowli pierwotnych kultur fibroblastów z tkanki skóry oraz płuc dzikich gryzoni.

Zakładanie pierwotnych kultur fibroblastów dorosłych gryzoni

Fibroblasty związane z nowotworem (CAFs) wspomagają inicjację, wzrost i progresję guza poprzez sygnalizację promującą proliferację, angiogenezę i stan zapalny. W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji czystych populacji prawidłowych fibroblastów oraz CAFs z pobranych na świeżo tkanek mysich i ludzkich za pomocą sortowania komórek, wykorzystując PDGFRα jako marker powierzchniowy.

Izolacja fibroblastów prawidłowych i związanych z nowotworem z tkanek świeżych za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)

Opisujemy metodę izolowania naiwnych multipotencjalnych komórek prekursorowych pochodzenia skórnego (SKP) z pierwotnych kultur ludzkich fibroblastów. Pokazujemy, że te SKP pochodzące z kultur fibroblastów mają podobne właściwości komórek macierzystych do tych pochodzących bezpośrednio z biopsji ludzkiej skóry. Komórki te wyrażają marker grzebienia nerwowego, nestynę, oprócz markerów multipotencjalnych, takich jak OCT4 i Nanog.

Izolacja naiwnych dorosłych komórek macierzystych z pierwotnych kultur ludzkich fibroblastów

Zachowanie fibroblastów leży u podstaw całego spektrum jednostek klinicznych, ale pozostają one słabo scharakteryzowane, głównie ze względu na ich wrodzoną heterogeniczność. Tradycyjne badania nad fibroblastami opierają się na manipulacji in vitro, maskowaniu zachowania fibroblastów in vivo. Opisujemy oparty na FACS protokół izolacji fibroblastów skóry myszy, który nie wymaga hodowli komórkowej.

Izolacja fibroblastów skórnych myszy metodą FACS

Ten manuskrypt opisuje oparty na FACS protokół izolacji brodawkowatych i siateczkowatych fibroblastów z ludzkiej skóry. Omija hodowlę in vitro, która była nieunikniona w przypadku powszechnie stosowanego protokołu izolacji za pomocą kultur eksplantatów. Emanujące podzbiory fibroblastów są funkcjonalnie odrębne i wykazują zróżnicowaną ekspresję i lokalizację genów w skórze właściwej.

Izolacja fibroblastów brodawkowatych i siatkowatych ze skóry ludzkiej za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Przeprogramowanie komórek wymaga wprowadzenia kluczowych genów, które regulują i utrzymują pluripotencjalny stan komórki. Opisany protokół umożliwia tworzenie kolonii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z ludzkich fibroblastów skóry bez metod wirusowych/integrujących, ale przy użyciu niemodyfikowanych RNA (NM-RNA) w połączeniu z czynnikami unikania odporności zmniejszającymi mechanizmy obrony komórkowej.

Izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej

Uzyskanie czystej populacji fibroblastów jest kluczowe dla badania ich roli w gojeniu ran i zwłóknieniu. Opisano tutaj szczegółową metodę izolowania fibroblastów i miofibroblastów z nieuszkodzonych i uszkodzonych serc myszy, a następnie scharakteryzowanie ich czystości i funkcjonalności za pomocą immunofluorescencji, RTPCR, sortowania komórek wspomaganego fluorescencją i skurczu żelu kolagenowego.

Izolacja i charakterystyka dorosłych fibroblastów i miofibroblastów serca

Ten artykuł ma na celu dostarczenie protokołu izolacji i hodowli pierwotnych fibroblastów związanych z rakiem z syngenicznego mysiego modelu potrójnie ujemnego raka piersi oraz ich zastosowanie w badaniach przedklinicznych nowych nanocząstek zaprojektowanych do celowania w mikrośrodowisko guza.

Izolacja pierwotnych fibroblastów związanych z rakiem z syngenicznego mysiego modelu raka piersi w celu zbadania celowanych nanocząstek

Prezentowany tutaj jest protokół generowania zmodyfikowanych tkanek łącznych do równoległej hodowli 48 tkanek na wielodołkowej płytce z podwójnymi biegunami, odpowiedni do badań mechanistycznych, modelowania chorób i badań przesiewowych. Protokół jest zgodny z fibroblastami z różnych narządów i gatunków, a jego przykładem są tutaj pierwotne fibroblasty serca ludzkiego.

Tkanka łączna pochodząca z fibroblastów pochodząca od człowieka do zastosowań przesiewowych

Protokół ten zapewnia kompleksową procedurę izolacji, ekspansji i unieśmiertelnienia fibroblastów z radykalnej prostatektomii. Ponadto opisano testy opracowane w celu oceny funkcjonalnych skutków przesłuchu fibroblast-komórki nowotworowe, wykorzystujące zarówno leczenie pożywką kondycjonowaną, jak i kokulturę.

Izolacja, hodowla i charakterystyka fibroblastów związanych z rakiem prostaty

Poznaj szybką metodę izolacji pierwotnych fibroblastów dorosłych z użyciem fal ultradźwiękowych i trawienia enzymatycznego. Protokół minimalizuje ryzyko zakażenia bakteryjnego i jest dostępny dla początkujących badaczy.

Wspomagana ultradźwiękami pierwotna izolacja fibroblastów dorosłych

Przeglądaj więcej filmów