Name: Ocena długotrwałej indukcji depresji w wycinkach móżdżku u dorosłych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Poznaj metody indukcji długotrwałej depresji w komórkach Purkinjego móżdżku u zwierząt z modyfikacjami genetycznymi. Techniki elektrofizjologiczne ujawniają złożone mechanizmy plastyczności synaptycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy A. Oba za jej pomoc techniczną. Badania te były częściowo wspierane przez Grant-in-Aid for Scientific Research (C) 17K01982 dla K.Y.

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez komitet RIKEN ds. opieki i wykorzystania zwierząt w eksperymentach. Myszy trzymano w ośrodku dla zwierząt w RIKEN Center for Brain Science w dobrze kontrolowanych warunkach temperatury (23–25°C) i wilgotności (45%–65%). Użyto zarówno samców, jak i samic myszy WT (C57BL/6, 3–6 miesięcy).
1. Przygotowanie roztworów używanych w eksperymentach
UWAGA: Wszystkie roztwory powinny być wykonane w ultraczystej wodzie wolnej od metali (rezystywność > 18,2 MΩ) i innych zanieczyszczeń (całkowita zawartość węgla organicznego (TOC) < 5,0 ppb). Roboczy sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) do krojenia plastrów i rejestrowania jest wytwarzany świeżo w dniu eksperymentu z 10-krotnego (x10) zapasu ACSF. Przed użyciem bąbelkować roztwory mieszaniną 5% CO2 / 95% O2 gazów. pH ACSF dostosowuje się do 7,4 ± 0,1, a osmolarność dostosowuje się do 315 ± 5 mOsm/kg przez dodanie ultraczystej wody.
<ol>
	<li>Przygotuj 10 zapasów ACSF zawierających 1250 mM NaCl, 30 mM KCl, 12,5 mM NaH2PO4 i 260 mM NaHCO3. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować roboczy ACSF zawierający 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM Mg2SO4, 1,25 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3 i 20 mM glukozy.
	<ol>
		<li>Najpierw dodaj 1 ml 2 M roztworu CaCl2, a następnie 1 ml roztworu 1 M Mg2SO4 do około 800 ml ultraczystej wody, aby uniknąć wytrącania się. Następnie dodaj 100 ml 10x ACSF i glukozę. Na koniec uzupełnić do całkowitej objętości 1,000 ml, dodając ultraczystą wodę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 3,3% agar do pracy z mózgiem. Rozpuść 1 g agaru w 30 ml 0,9% roztworu NaCl i podgrzej w kuchence mikrofalowej aż do wrzenia. Wymieszaj, aby wymieszać, a następnie przelej do sterylnego plastikowego pudełka o wymiarach 4 cm x 10 cm i pozostaw do zestalenia. Przechowuj płytkę agarową (o grubości ~8 mm) w lodówce.</li>
	<li>Przygotuj roztwór wewnętrzny.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór wewnętrzny na bazie K+ zawierający 60 mM KCl, 60 mM K-glukonianu, 0,3 mM EGTA, 4 mM MgCl2, 4 mM ATP, 0,4 mM GTP i 30 mM HEPES (pH 7,2). 
		nuta: Niskie stężenie (0,3 mM) EGTA, powolnego chelatora Ca2 +, dodaje się do chelatu potencjalnie zanieczyszczonego Ca2 + w czystej wodzie, ale to niskie stężenie EGTA w roztworze wewnętrznym nigdy nie blokuje indukcji LTD (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3, <silna klasa = "xfig" > Rysunek 4, <silna klasa = "xfig" > Rysunek 5) podczas nagrywania całej komórki. Zmierzone ciśnienie osmotyczne wynosi 285 mOsm/kg.</li>
		<li>Przygotować roztwór wewnętrzny na bazie Cs+ zawierający 60 mM CsCl, 46 mM D-glukonianu, 27 mM chlorku tetraetyloamoniowego (TEA-Cl), 0,3 mM EGTA, 4 mM MgCl2, 4 mM ATP, 0,4 mM GTP i 30 mM HEPES (pH 7,2, dostosowane za pomocą CsOH). 
		nuta: Cs+ blokuje zależne od napięcia kanały K i poprawia warunki zacisku przestrzennego w odległych dendrytach poprzez zwiększenie stałej długości. Zmierzone ciśnienie osmotyczne wynosi 285 mOsm/kg.</li>
		<li>Przygotować 200 μl podwielokrotności roztworów i przechowywać w temperaturze -30 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Sekcja i przycinanie mózgu
<ol>
	<li>Schłodzić i natlenić dwie zlewki ACSF o pojemności 50 ml na lodzie, aż temperatura spadnie poniżej 4 °C. Dodać 50 μl tetrodotoksyny (TTX, 1 mM) do jednej z lodowatych zlewek ACSF i zachować ją do krojenia w plastry. Aby uzyskać wycinek móżdżku myszy rezerwujący zdolność indukowania LTD, konieczne jest dodanie TTX do normalnego ACSF.</li>
	<li>Ostudzić metalową tackę na próbki, wypełniając lodem obszar łaźni lodowej komory krojenia.</li>
	<li>Wlej 1 ml izofluranu do słoika znieczulającego (~1000 ml), a następnie umieść w nim mysz na 30–45 s. Upewnij się, że mysz jest głęboko znieczulona, potwierdzając jej niezdolność do reagowania na stymulację mechaniczną.</li>
	<li>Odetnij głowę myszy za pomocą nożyczek chirurgicznych. Przytrzymaj głowę i przetnij powierzchowną skórę wzdłuż linii środkowej za pomocą nożyczek okulistycznych. Pociągnij skórę, trzymając palcami, aby szeroko odsłonić powierzchnię czaszki.</li>
	<li>Przetnij czaszkę poziomo wzdłuż linii od głównego otworu rdzeniowo-móżdżkowego tuż nad uchem i okiem za pomocą nożyczek okulistycznych. Przetnij czaszkę wzdłuż linii nad oboma oczami i usuń, aby odizolować czaszkę.</li>
	<li>Przetnij mózg w środku mózgu za pomocą skalpela, a następnie odizoluj ogonową część mózgu, w tym móżdżek, od czaszki. Zanurz go w lodowatej zlewce ACSF. Zwykle całkowity czas od dekapitacji do zanurzenia bloku mózgowego w wstępnie schłodzonej zlewce ACSF powinien być krótszy niż 60 s.</li>
	<li>Położenie rurki bulgoczącej powinno być dostosowane tak, aby nie mieszać bloku mózgowego w zlewce. Uszkodzenia mechaniczne mogą spowodować pęcznienie plastra podczas nagrywania. Pozostaw go na co najmniej 7 minut i pozwól mózgowi ostygnąć.</li>
	<li>Aby przyciąć blok mózgu, wyciąć prostokątny kawałek agaru (2 cm x 2 cm) z dużej płytki agarowej (4 cm x 10 cm, przechowywany w temperaturze 4 °C) i położyć go na bibule filtracyjnej, aby wchłonąć nadmiar płynu.</li>
	<li>Odwróć kawałek agaru do góry nogami na bibule filtracyjnej, a następnie umieść kawałek agaru na bibule filtracyjnej na wstępnie schłodzonej metalowej tacy na próbki (16 cm x 20 cm). Podnieś blok mózgu za pomocą szpatułki i wchłoń nadmiar płynu wokół niego za pomocą kawałka bibuły filtracyjnej.</li>
	<li>Zamontuj blok mózgu na bloku agarowym za pomocą kleju (medyczny klej błyskawiczny cyjanoakrylowy). Upewnij się, że dolna (brzuszna strona) bloku mózgowego jest przymocowana do agaru.</li>
	<li>Wytnij prawą półkulę ostrzem. Upewnij się, że bok płaszczyzny cięcia jest jak najbardziej równoległy do płaszczyzny dendrytycznej komputera, ponieważ ta strona jest przymocowana do powierzchni tacki na próbki. Wytnij i usuń drugą stronę półkuli. Następnie przeciąć mózg między górną i dolną colliculi i odciąć rdzeń kręgowy.</li>
	<li>Przyklej prawą stronę przyciętego móżdżku z blokiem agaru do wstępnie schłodzonej tacki na próbki. Nadmiar kleju rozprowadź wokół móżdżku płaską częścią szpatułki, aby zapobiec osadzaniu się nadmiaru kleju na powierzchni móżdżku. Przechyl metalową tacę i wlej ACSF, aby utrwalić klej i zmyć nadmiar kleju.</li>
</ol>
3. Krojenie mózgu
<ol>
	<li>Ustawić próbkę w taki sposób, aby grzbietowa strona móżdżku znajdowała się po stronie przedniej. Wlać lodowaty ACSF do krojenia, zawierający 1 μM TTX, wystarczający do całkowitego zanurzenia móżdżku. Umieść rurkę gazową w ACSF i zacznij bulgotać mieszaniną gazówO2/CO2.</li>
	<li>Usuń pajęczynówkę za pomocą cienkiej pęsety pod lornetką. Przetnij szypułkę móżdżku ostrzem i usuń pień mózgu i blok agaru. Obróć tacę o 180°, tak aby grzbietowa powierzchnia móżdżku była skierowana w stronę żyletki.</li>
	<li>Ustaw ostrze i wyreguluj pierwsze miejsce cięcia. Ustaw parametry krojenia wibratomu na następujące: amplituda na 5,5, częstotliwość na 85 Hz, prędkość na 3–4 i grubość plastra na 300 μm.</li>
	<li>Przenieś plaster móżdżku na nylonowej siatce do akrylowego inkubatora i zanurz go całkowicie w natlenionym ACSF. Inkubator należy umieścić w łaźni wodnej utrzymującej temperaturę 26 °C.</li>
	<li>Przechowuj plastry przez co najmniej 1 godzinę, aby umożliwić regenerację po uszkodzeniach podczas krojenia.</li>
</ol>
4. Nagrywanie z użyciem całego bloku krosowego
UWAGA: Zapis patch-clamp wymaga następującego sprzętu: mikroskopu pionowego z optyką kontrastu różnicowego w podczerwieni (IR-DIC), wzmacniacza patch-clamp, digitizera danych, stymulatora cyfrowego, izolatora, komputera, oprogramowania do akwizycji i analizy danych, manipulatora z napędem, platformy mikroskopowej, stołu do izolacji drgań, klatki Faradaya, systemu podgrzewania roztworu, pomp perystaltycznych i ściągacza elektrod.
<ol>
	<li>Dodaj pikrotoksynę (0,1 mM) do ACSF i rozpuść ją za pomocą ultradźwięków przez 3 minuty.</li>
	<li>Przeprowadzić fuzję komory rejestracyjnej z ACSF zawierającym pikrotoksynę, nasyconym O2-CO 2 z szybkością 2 ml/min. Utrzymać temperaturę komory zapisu na poziomie około 30 °C.</li>
	<li>Wykonaj elektrodę rejestrującą, ciągnąc kapilarnę ze szkła borokrzemianowego z żarnikiem (średnica zewnętrzna = 1,5 mm) za pomocą ściągacza z 4 stopniami. Średnica końcówki powinna wynosić około 1 μm.</li>
	<li>Wykonaj elektrodę stymulującą, pociągając tę samą kapilarnę za pomocą ściągacza w 2 krokach, a następnie przełam, aby uzyskać cienką końcówkę, uderzając końcówką o żelazny blok pod mikroskopem lornetkowym. Ostateczna średnica powinna wynosić 3–5 μm.</li>
	<li>Przenieś plasterek móżdżku do komory nagrywającej i przymocuj go za pomocą obciążnika Pt z nylonowymi nitkami. Napełnij elektrodę stymulującą ACSF.</li>
	<li>W celu stymulacji PF należy umieścić elektrodę stymulującą na powierzchni warstwy molekularnej, w odległości około 50 μm od warstwy komórek Purkinjego.</li>
	<li>W celu stymulacji mukowiscydozy należy umieścić elektrodę stymulującą na dole warstwy komórek Purkinjego (kroki 5.3, 5.4).</li>
	<li>Filtruj roztwór wewnętrzny na bazie K+ lub Cs+ za pomocą filtra 0,45 μm. Za pomocą mikroładowarki napełnić elektrodę rejestrującą 8 μl roztworu wewnętrznego.</li>
	<li>Zastosuj słabe nadciśnienie do elektrody rejestrującej przed zanurzeniem jej w ACSF. Jego rezystancja powinna wynosić 2–4 MΩ, a potencjał złączowy cieczy powinien być skorygowany.</li>
	<li>Zbliż się do zdrowego, jasnego korpusu ogniwa komputera za pomocą elektrody rejestrującej. Lekko popchnij powierzchnię komórki Purkinjego, przestań wywierać nadciśnienie, a następnie zastosuj podciśnienie, aż utworzy się uszczelka giga-omowa. Następnie ustal konfigurację całego ogniwa za pomocą podciśnienia.</li>
	<li>Utrzymuj potencjał membrany na poziomie -70 mV i zastosuj impuls -2 mV (czas trwania, 100 ms) przy 0,1 Hz, aby w sposób ciągły monitorować rezystancję wejściową, rezystancję szeregową i pojemność wejściową. Nie należy używać kompensacji rezystancji szeregowej. Odrzuć dane, gdy rezystancja szeregowa zmienia się o więcej niż 15%.</li>
</ol>
5. Indukcja LTD
<ol>
	<li>Stymuluj warstwę molekularną impulsem (czas trwania, 0,1 ms). Zidentyfikuj pobudzające prądy postsynaptyczne PF (EPSC), stosując bodziec dwuimpulsowy (interwał międzyskokowy (ISI) 50 ms). PF-EPSC powinien wykazywać ułatwienie parowania impulsów i stopniowy wzrost amplitudy w stosunku do wzrostu intensywności stymulacji.</li>
	<li>Zapisz odpowiedź testową PF-EPSC, przykładając pojedynczy impuls przy 0,1 Hz. Dostosuj intensywność bodźca tak, aby wywołana amplituda EPSC wynosiła około 200 pA. Unikaj zanieczyszczenia prądu przez kanał jonowy zależny od napięcia.</li>
	<li>Stymuluj mukowiscydozę na dole warstwy komórek Purkinjego i zidentyfikuj EPSC wywołany przez aktywację mukowiscydozy (poprzez zastosowanie bodźca dwuimpulsowego). CF-EPSC powinien wykazywać depresję parowanych impulsów i sposób "wszystko albo nic", w zależności od wzrostu intensywności stymulacji. W przypadku indukcji LTD należy użyć pojedynczego bodźca.</li>
	<li>Protokół indukujący LTD 1
	<ol>
		<li>Używając elektrody zawierającej wewnętrzny roztwór na bazie K+ w warunkach cęgów prądowych, zastosuj jednocześnie pojedynczy bodziec PF i pojedynczy bodziec CF przy 1 Hz przez 5 minut (300 impulsów) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Protokół indukujący LTD 2
	<ol>
		<li>Używając wewnętrznego roztworu na bazie elektrody na bazie K+ w warunkach cęgów prądowych, zastosuj podwójne bodźce PF (ISI 50 ms) i pojedynczy bodziec CF, ponieważ drugi bodziec PF zbiega się z bodźcami CF przy 1 Hz przez 5 minut (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Protokół indukujący LTD 3
	<ol>
		<li>Używając elektrody zawierającej wewnętrzny roztwór na bazie Cs+ w warunkach zacisku napięcia, zastosuj podwójny bodziec PF (ISI 50 ms) i pojedynczy depolaryzujący krok napięcia (-70 do 0 mV, 50 ms) do somy przy 1 Hz przez 3 minuty, tak aby drugi bodziec PF był równoważny początkowi kroku napięcia depolaryzacji (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Protokół indukujący LTD-4
	<ol>
		<li>Używając elektrody zawierającej wewnętrzny roztwór na bazie Cs+ w warunkach zacisku napięcia, zastosuj bodźce PF (5x przy 100 Hz) i pojedynczy depolaryzujący krok napięcia (-70 do 0 mV, 50 ms) do somy przy 0,5 Hz przez 3 minuty, jednocześnie (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1D).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Eccles, J. C., Ito, M., Szentagothai, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEccles%2C+JC+%22The+Cerebellum+as+a+Neuronal+Machine%22">The Cerebellum as a Neuronal Machine</a>. , Springer. New York. (1967).</li>
<li>Marr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+theory+of+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">A theory of cerebellar cortex.</a> Journal of Physiology. 202 (2), 437-470 (1969).</li>
<li>Albus, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+cerebellar+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mathematical+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Theory of cerebellar function.</a> Mathematical Biosciences. 10 (1), 25-61 (1971).</li>
<li>Maekawa, K., Simpson, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Climbing+fiber+responses+evoked+in+vestibulocerebellum+of+rabbit+from+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Climbing fiber responses evoked in vestibulocerebellum of rabbit from visual system.</a> Journal of Neurophysiology. 36 (4), 649-666 (1973).</li>
<li>Ito, M., Shiida, T., Yagi, N., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+influence+on+rabbit+horizontal+vestibulo-ocular+reflex+presumably+effected+via+the+cerebellar+flocculus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Visual influence on rabbit horizontal vestibulo-ocular reflex presumably effected via the cerebellar flocculus.</a> Brain Research. 65 (1), 170-174 (1974).</li>
<li>Ghelarducci, B., Ito, M., Yagi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impulse+discharge+from+flocculus+Purkinje+cells+of+alert+rabbits+during+visual+stimulation+combined+with+horizontal+head+rotation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Impulse discharge from flocculus Purkinje cells of alert rabbits during visual stimulation combined with horizontal head rotation.</a> Brain Research. 87 (1), 66-72 (1975).</li>
<li>Robinson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+gain+control+of+vestibulo-ocular+reflex+by+the+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Adaptive gain control of vestibulo-ocular reflex by the cerebellum.</a> Journal of Neurophysiology. 39 (5), 954-969 (1976).</li>
<li>Gilbert, P. F. C., Thach, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cell+activity+during+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Purkinje cell activity during motor learning.</a> Brain Research. 128 (2), 309-328 (1977).</li>
<li>Ito, M., Sakurai, M., Tongroach, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Climbing+fibre+induced+depression+of+both+mossy+fibre+responsiveness+and+glutamate+sensitivity+of+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Climbing fibre induced depression of both mossy fibre responsiveness and glutamate sensitivity of cerebellar Purkinje cells.</a> Journal of Physiology. 324, 113-134 (1982).</li>
<li>Ito, M., Kano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+depression+of+parallel+fiber-Purkinje+cell+transmission+induced+by+conjunctive+stimulation+of+parallel+fibers+and+climbing+fibers+in+the+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Long-lasting depression of parallel fiber-Purkinje cell transmission induced by conjunctive stimulation of parallel fibers and climbing fibers in the cerebellar cortex.</a> Neuroscience Letters. 33 (3), 253-258 (1982).</li>
<li>Ekerot, C. F., Kano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+depression+of+parallel+fibre+synapses+following+stimulation+of+climbing+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Long-term depression of parallel fibre synapses following stimulation of climbing fibres.</a> Brain Research. 342 (2), 357-360 (1985).</li>
<li>Sakurai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+modification+of+parallel+fibre-Purkinje+cell+transmission+in+in+vitro+guinea-pig+cerebellar+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Synaptic modification of parallel fibre-Purkinje cell transmission in in vitro guinea-pig cerebellar slices.</a> Journal of Physiology. 394, 462-480 (1987).</li>
<li>Hirano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depression+and+potentiation+of+the+synaptic+transmission+between+a+granule+cell+and+a+Purkinje+cell+in+rat+cerebellar+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Depression and potentiation of the synaptic transmission between a granule cell and a Purkinje cell in rat cerebellar culture.</a> Neuroscience Letters. 119 (2), 141-144 (1990).</li>
<li>Linden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long-term+depression+of+AMPA+currents+in+cultured+cerebellar+purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A long-term depression of AMPA currents in cultured cerebellar purkinje neurons.</a> Neuron. 7 (1), 81-89 (1991).</li>
<li>Linden, D. J., Connor, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Participation+of+postsynaptic+PKC+in+cerebellar+long-term+depression+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Participation of postsynaptic PKC in cerebellar long-term depression in culture.</a> Science. 254 (5038), 1656-1659 (1991).</li>
<li>Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+long-term+depression%3A+characterization%2C+signal+transduction+and+functional+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cerebellar long-term depression: characterization, signal transduction and functional roles.</a> Physiological Reviews. 81 (3), 1143-1195 (2001).</li>
<li>Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+organization+of+cerebellar+long-term+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The molecular organization of cerebellar long-term depression.</a> Nature Reviews Neuroscience. 3, 896-902 (2002).</li>
<li>Ito, M., Jastreboff, P. J., Miyashita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+effects+of+unilateral+lesions+in+the+flocculus+upon+eye+movements+in+albino+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Specific effects of unilateral lesions in the flocculus upon eye movements in albino rabbits.</a> Experimental Brain Research. 45 (1-2), 233-242 (1982).</li>
<li>Nagao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+vestibulocerebellar+lesion+upon+dynamic+characteristics+and+adaptation+of+vestibulo-ocular+and+optokinetic+responses+in+pigmented+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of vestibulocerebellar lesion upon dynamic characteristics and adaptation of vestibulo-ocular and optokinetic responses in pigmented rabbits.</a> Experimental Brain Research. 53 (1), 36-46 (1983).</li>
<li>Watanabe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+events+correlated+with+long-term+adaptation+of+the+horizontal+vestibulo-ocular+reflex+in+the+primate+flocculus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Neuronal events correlated with long-term adaptation of the horizontal vestibulo-ocular reflex in the primate flocculus.</a> Brain Research. 297 (1), 169-174 (1984).</li>
<li>van Neerven, J., Pompeiano, O., Collewijn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+GABAergic+and+noradrenergic+injections+into+the+cerebellar+flocculus+on+vestibulo-ocular+reflexes+in+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of GABAergic and noradrenergic injections into the cerebellar flocculus on vestibulo-ocular reflexes in the rabbit.</a> Progress in Brain Research. 88, 485-497 (1991).</li>
<li>Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+motor+learning+in+the+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanism of motor learning in the cerebellum.</a> Brain Research. 886, 237-245 (2000).</li>
<li>De Schutter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+long-term+depression+might+normalize+excitation+of+Purkinje+cells%3A+a+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Cerebellar long-term depression might normalize excitation of Purkinje cells: a hypothesis.</a> Trends in Neurosciences. 18 (7), 291-295 (1995).</li>
<li>Hansel, C., Linden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+depression+of+the+cerebellar+climbing+fiber-Purkinje+neuron+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Long-term depression of the cerebellar climbing fiber-Purkinje neuron synapse.</a> Neuron. 26 (2), 473-482 (2000).</li>
<li>Safo, P., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+dependence+of+the+induction+of+cerebellar+LTD%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Timing dependence of the induction of cerebellar LTD.</a> Neuropharmacology. 54 (1), 213-218 (2007).</li>
<li>Schonewille, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reevaluating+the+role+of+LTD+in+cerebellar+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Reevaluating the role of LTD in cerebellar motor learning.</a> Neuron. 70 (1), 43-500 (2011).</li>
<li>Karachot, L., Kado, T. R., Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus+parameters+for+induction+of+long-term+depression+in+in+vitro+rat+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Stimulus parameters for induction of long-term depression in in vitro rat Purkinje cells.</a> Neuroscience Research. 21 (2), 161-168 (1994).</li>
<li>Hartell, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cerebellar+long-term+depression+requires+activation+of+glutamate+metabotropic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Induction of cerebellar long-term depression requires activation of glutamate metabotropic receptors.</a> Neuroreport. 5, 913-916 (1994).</li>
<li>Aiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+cerebellar+long-term+depression+and+impaired+motor+learning+in+mGluR1+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mGluR1 mutant mice.</a> Cell. 79, 377-388 (1994).</li>
<li>Steinberg, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+in+vivo+mutations+of+the+AMPA+receptor+subunit+GluR2+and+its+interacting+protein+PICK1+eliminate+cerebellar+long-term+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted in vivo mutations of the AMPA receptor subunit GluR2 and its interacting protein PICK1 eliminate cerebellar long-term depression.</a> Neuron. 46 (6), 845-860 (2006).</li>
<li>Koekkoek, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+FMR1+in+Purkinje+cells+enhances+parallel+fiber+LTD%2C+enlarges+spines%2C+and+attenuates+cerebellar+eyelid+conditioning+in+Fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Deletion of FMR1 in Purkinje cells enhances parallel fiber LTD, enlarges spines, and attenuates cerebellar eyelid conditioning in Fragile X syndrome.</a> Neuron. 47 (3), 339-352 (2005).</li>
<li>Yamaguchi, K., Itohara, S., Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessment+of+long-term+depression+in+cerebellar+Purkinje+cells+in+mice+carrying+mutated+GluA2+C+terminus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reassessment of long-term depression in cerebellar Purkinje cells in mice carrying mutated GluA2 C terminus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 10192-10197 (2016).</li>
<li>De Schutter, E., Bower, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+active+membrane+model+of+the+cerebellar+Purkinje+cell+II.+Simulation+of+synaptic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">An active membrane model of the cerebellar Purkinje cell II. Simulation of synaptic responses.</a> Journal of Neurophysiology. 71 (1), 401-419 (1994).</li>
<li>Swensen, A. M., Bean, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+mechanisms+of+burst+firing+in+dissociated+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ionic mechanisms of burst firing in dissociated Purkinje neurons.</a> Journal of Neuroscience. 23 (29), 9650-9663 (2003).</li>
<li>Fukuda, J., Kameyama, M., Yamaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakdown+of+cytoskeletal+filaments+selectively+reduces+Na+and+Ca+spikes+in+cultured+mammal+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Breakdown of cytoskeletal filaments selectively reduces Na and Ca spikes in cultured mammal neurones.</a> Nature. 294 (5836), 82-85 (1981).</li>
<li>Arancillo, M., White, J. J., Lin, T., Stay, T. L., Silltoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+Purkinje+cell+firing+properties+during+postnatal+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of Purkinje cell firing properties during postnatal mouse development.</a> Journal of Neurophysiology. 113, 578-591 (2015).</li>
<li>Ishikawa, T., Shimuta, M., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+sensory+integration+in+single+cerebellar+granule+cell+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Multimodal sensory integration in single cerebellar granule cell in vivo.</a> eLife. 4, e12916(2015).</li>
<li>Tempia, F., Minlaci, M. C., Anchisi, D., Strata, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+current+mediated+by+metabotropic+glutamate+receptors+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic current mediated by metabotropic glutamate receptors in cerebellar Purkinje cells.</a> Journal of Neurophysiology. 80, 520-528 (1998).</li>
<li>Wang, S. S., Denk, W., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coincidence+detection+in+single+dendritic+spines+mediated+by+calcium+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Coincidence detection in single dendritic spines mediated by calcium release.</a> Nature Neuroscience. 3, 1266-1273 (2000).</li>
<li>Kuroda, S., Schweighofer, N., Kawato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+signal+transduction+pathways+in+cerebellar+long-term+depression+by+kinetic+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Exploration of signal transduction pathways in cerebellar long-term depression by kinetic simulation.</a> Journal of Neuroscience. 21 (15), 5693-5702 (2001).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+cerebellar+engrams+in+short-term+and+long-term+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distinct cerebellar engrams in short-term and long-term motor learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), E188-E193 (2014).</li>
<li>Inoshita, T., Hirano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+long-term+depression+in+the+cerebellar+flocculus+during+adaptation+of+optokinetic+response%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Occurrence of long-term depression in the cerebellar flocculus during adaptation of optokinetic response.</a> eLife. 27, 36209(2018).</li>
<li>Belmeguenai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+plasticity+complements+long-term+potentiation+in+parallel+fiber+input+gain+control+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intrinsic plasticity complements long-term potentiation in parallel fiber input gain control in cerebellar Purkinje cells.</a> Journal of Neuroscience. 30 (41), 13630-13643 (2010).</li>
<li>Ohtsuki, G., Piochon, C., Adelman, J. P., Hansel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SK2+channel+modulation+contributes+to+compartment+specific+dendritic+plasticity+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SK2 channel modulation contributes to compartment specific dendritic plasticity in cerebellar Purkinje cells.</a> Neuron. 75, 108-120 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Różnice między czterema protokołami
W protokołach indukujących LTD 1 i 2, Cjs 300 razy przy 1 Hz jest wystarczający do wywołania móżdżku LTD. Częstotliwość stymulacji mukowiscydozy wydawała się być w zakresie fizjologicznym, ponieważ złożona szybkość wystrzeliwania kolców u czujnych dorosłych myszy (P60) wynosiła 1,25 Hz36. Jednak sama stymulacja mukowiscydozy nie powodowała długotrwałej plastyczności w synapsie PF-CF, jak zastosowano w protokołach 1 i 2 (<strong class="x...

Organizacja synaptyczna skomplikowanych sieci neuronalnych kory móżdżku, składającej się z PC, interneuronów warstwy molekularnej (komórki koszyczkowe i gwiaździste), komórek Golgiego, PF z komórek ziarnistych, włókien mszystych i włókien pnących (CF), została wyjaśniona pod względem wzbudzenia/hamowania i dywergencji/konwergencji, a dobrze zorganizowany diagram obwodów sugeruje, że móżdżek jest "maszyną neuronalną"1, choć wcześniej nie było pojęcia o przeznaczeniu tej "maszyny". Później Marr zaproponował, że dane wejściowe PF do komputerów PC tworzą trójwarstwową sieć uczenia asocjacyjnego2. Zasugerował również, że każdy mukowiscydoza przekazuje instrukcję mózgową dla ruchu elementarnego2. Zakładał, że jednoczesna aktywacja PF i CF zwiększy aktywność synaps PF-PC i spowoduje długotrwałe wzmocnienie (LTP) synapsy PF-PC. Z drugiej strony, Albus założył, że synchroniczna aktywacja PF i CF skutkuje LTD w synapsach PF-PC3. Oba powyższe badania interpretują móżdżek jako unikalne urządzenie pamięciowe, którego włączenie do sieci kory móżdżku prowadzi do powstania modelu Marra-Albusa uczącego się modelu maszynowego.
Zgodnie z tymi teoretycznymi przewidywaniami, dwie linie dowodowe sugerują obecność plastyczności synaptycznej w móżdżku. Pierwszą linię dowodową sugerowała anatomiczna organizacja kłaczka; tutaj szlaki MF pochodzenia narządowego i szlaki mukowiscydozy pochodzenia siatkówkowego zbiegają się w PCs4. Ten unikalny wzorzec konwergencji sugeruje, że plastyczność synaptyczna występująca w kłaczku powoduje niezwykłą zdolność adaptacyjną odruchu przedsionkowo-ocznego. Po drugie, zapis reakcji BG w kłaczku i uszkodzenia kłaczka również potwierdziły powyższą hipotezę5,6,7. Co więcej, wzorzec rozładowania PC podczas adaptacji ruchu ręki małpy8 wspierał hipotezę plastyczności synaptycznej, zwłaszcza hipotezę LTD Albusa3.
Aby bezpośrednio określić naturę plastyczności synaptycznej, wykazano, że powtarzająca się stymulacja koniunkcyjna (Cjs) wiązki PF i CF, która specyficznie unerwia PC in vivo, indukuje LTD dla skuteczności transmisji synaps PF-PC9,10,11. W kolejnych badaniach in vitro z użyciem plastra móżdżku12 i hodowanych PC, połączenie stymulacji współhodowanych komórek ziarnistych i stymulacji komórek oliwek 13 lub połączenie jontoforetycznie zastosowanego glutaminianu i depolaryz<acji somatycznej sup class="xref">14,15 spowodowało LTD. Mechanizm transdukcji sygnału leżący u podstaw indukcji LTD był również intensywnie badany przy użyciu preparatów in vitro16,17.
Adaptacje VOR i OKR były często wykorzystywane do ilościowej oceny wpływu manipulacji genami na uczenie się motoryczne móżdżku, ponieważ udowodniono, że kora przedsionkowo-móżdżkowa jest podstawowym początkiem adaptacyjnego uczenia się klasy VOR<sup="xref">18,19,20 i OKR19,21 Korelacja między niepowodzeniem indukcji LTD a upośledzeniem behawioralno-motorycznego uczenia się została uznana za dowód na to, że LTD odgrywa istotną rolę w mechanizmach uczenia się motorycznego22. Poglądy te są zbiorczo określane jako hipoteza LTD uczenia się motorycznego lub hipoteza Marr-Albus-Ito23,24,25,26.
Adaptacyjne uczenie się ruchu gałek ocznych zostało zmierzone przy użyciu podobnych protokołów, podczas gdy różne warunki eksperymentalne zostały wykorzystane do wywołania LTD w przygotowaniu plasterków27,28,29,30,31. Niedawno, Schonewille et al.26 donieśli, że niektóre myszy manipulowane genami wykazywały normalne uczenie się motoryczne, ale wycinki móżdżku nie wykazywały LTD, a tym samym doszli do wniosku, że LTD nie jest niezbędne do uczenia się motorycznego. Jednak indukcję LTD próbowano przeprowadzić tylko przy użyciu jednego rodzaju protokołu w temperaturze pokojowej. W związku z tym użyliśmy kilku rodzajów protokołów indukujących LTD w warunkach rejestracji w temperaturze około 30 °C i potwierdziliśmy, że LTD było niezawodnie indukowane u myszy manipulowanych genami, używając tych protokołów w temperaturach bliskich fizjologicznym32.
Pozostaje jednak kilka pytań dotyczących podstawowych właściwości stymulacji koniunkcyjnej. Pierwszym z nich jest zależność między kształtem zespolonego kolca a amplitudą LTD. Po drugie, w połączeniu ze stymulacją PF i depolaryzacją somatyczną, to, czy liczba użytych bodźców była konieczna, czy nie, było nieuchwytne. W niniejszym badaniu pytania te zostały zbadane na myszach typu dzikiego (WT).

<table><tbody><tr><td>Wzmacniacz</td><td>Urządzenia molekularne-Axon</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Kapilara ze szkła borokrzemianowego</td><td>Sutter</td><td>BF150-110-10</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Urządzenia molekularne-Axon</td><td>Digidata1322A</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz elektrod</td><td>Sutter</td><td>Model P-97</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>Izolator</td><td>A.M.P.I.</td><td>ISOflex</td><td></td></tr><tr><td>Krajalnica liniowa</td><td>Dosaka EM</td><td>PRO7N</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>NIKON</td><td>Eclipse E600FN</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Gilson</td><td>MP1 Pompa</td><td></td>jednokanałowa</tr><tr><td>Piprotoksyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>Ekspres do czystej wody</td><td>Merck-Millipore</td><td>MilliQ 7000</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do eksperymentów</td><td>Sonda molekularna-Axon</td><td>pClamp 10</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do statystyk</td><td>KyensLab</td><td>KyPlot 5.0</td><td></td></tr><tr><td>Stymulator</td><td>WPI</td><td>DS8000</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury</td><td>Warner</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoksyna</td><td>Tocris</td><td>1078</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena długotrwałej indukcji depresji w wycinkach móżdżku u dorosłych

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Plastyczność synaptyczna dostarcza mechanizmu uczenia się i pamięci. W przypadku uczenia się motorycznego móżdżku, długotrwała depresja (LTD) transmisji synaptycznych z włókien równoległych (PF) do komórek Purkinjego (PC) jest uważana za podstawę uczenia się motorycznego, a niedobory zarówno LTD, jak i uczenia się motorycznego obserwuje się u różnych zwierząt manipulowanych genami. Do oceny zdolności uczenia się motorycznego wykorzystano wspólne zestawy do uczenia się motorycznego, takie jak adaptacja odruchu optokinetycznego (OKR), odruch przedsionkowo-oczny (VOR) i test rotarod. Jednak wyniki uzyskane na myszach knock-in zmodyfikowanych na końcu karboksynowym GluA2 wykazały normalną adaptację VOR i OKR, pomimo braku PF-LTD. W tym raporcie próbowano indukować LTD tylko przy użyciu jednego rodzaju protokołu stymulacji w temperaturze pokojowej. W związku z tym warunki do indukcji móżdżku LTD badano w tych samych mutantach knock-in przy użyciu różnych protokołów w temperaturze bliskiej fizjologicznej. Wreszcie znaleźliśmy protokoły stymulacji, za pomocą których LTD może być indukowane u tych myszy manipulowanych genami. W tym badaniu zaproponowano zestaw protokołów do oceny indukcji LTD, które dokładniej pozwolą na zbadanie związku przyczynowego między LTD a uczeniem się motorycznym. Podsumowując, warunki eksperymentalne mają kluczowe znaczenie przy ocenie LTD u myszy manipulowanych genami.

W badaniu tym do indukcji LTD móżdżku zastosowano cztery protokoły. W dwóch pierwszych protokołach (protokół 1 i 2) jednoczesną stymulację PF i CF zastosowano w warunkach clampu prądowego. W dwóch pozostałych protokołach (protokół 3 i 4) w warunkach clampu napięciowego stymulację CF zastąpiono depolaryzacją somatyczną. Porównano zapisy napięcia lub prądu podczas stymulacji koniunkcyjnej (Rysunek 2).
Do przygotowania skrawków konwencjonalnie stosowano połączenie 1 ...

U niektórych zwierząt manipulowanych genami, użycie pojedynczego protokołu może nie wywołać LTD w komórkach Purkinjego móżdżku, a między LTD a uczeniem motorycznym może wystąpić rozbieżność. Do oceny indukcji LTD u zwierząt manipulowanych genami koniecznych jest wiele protokołów. Pokazane są standardowe protokoły.

Ocena długotrwałej indukcji depresji w wycinkach móżdżku u dorosłych

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Gdy określona funkcja białka jest modyfikowana przez manipulację genami, koordynacja niepowodzenia drażniącego i upośledzenia motorycznego jest uważana za niezbędny warunek związku przyczynowego między LTD a uczeniem się motorycznym. Tutaj pokazujemy zastosowanie wielu protokołów do oceny LTD, które mogą być indukowane przez mechanizmy kompensacyjne u zwierząt manipulowanych genami. Przed pobraniem mózgu schłodź i natlenić dwie 50-mililitrowe zlewki ACSF na lodzie.Gdy temperatura roztworu spadnie poniżej czterech stopni Celsjusza, dodaj 50 mikrolitrów jednej milimolowej tetrodotoksyny do jednej z lodowatych zlewek. Aby pobrać mózg, przytrzymaj głowę i użyj nożyczek okulistycznych, aby przeciąć powierzchowną skórę wzdłuż linii środkowej. Ręcznie cofnij skórę, aby szeroko odsłonić powierzchnię czaszki i użyj nożyczek, aby przeciąć wzdłuż czaszki poziomo od głównego otworu rdzeniowo-móżdżkowego do tuż nad oczami i uszami, zanim przetniesz czaszkę wzdłuż linii nad oboma oczami.Użyj skalpela, aby przeciąć mózg w środku mózgu i odizolować ogonową część mózgu, w tym móżdżek, od czaszki. Zanurzyć próbkę w lodowatej zlewce ACSF i wyregulować rurkę bąbelkową tak, aby nie mieszała bloku mózgowego w zlewce. Po co najmniej siedmiu minutach użyj szpatułki, aby podnieść blok mózgu i użyj kawałka bibuły filtracyjnej, aby wchłonąć nadmiar ACSF.Zamontuj tkankę brzuszną stroną do dołu na kawałku agaru o wymiarach dwa na dwa centymetry za pomocą odpowiedniego kleju medycznego. Użyj ostrza, aby wyciąć prawą półkulę tkanki mózgowej tak równolegle do płaszczyzny dendrytycznej komórek Purkinjego, jak to możliwe. Wytnij i usuń drugą stronę półkuli i przetnij mózg między górną i dolną colliculi.Odetnij rdzeń kręgowy i przyklej prawą stronę przyciętego móżdżku za pomocą bloku agarowego do wstępnie schłodzonej tacki na próbki. Następnie, przechylając tackę na próbkę, wylej ACSF na próbkę, aby utrwalić tkankę i zmyć nadmiar kleju. Aby pokroić próbkę mózgu, ustaw próbkę tak, aby grzbietowa strona móżdżku znajdowała się z przodu i wlej tyle lodowatego ACSF do cięcia na zimno uzupełnionego tetrodotoksyną, aby całkowicie zanurzyć móżdżek.Umieść rurkę gazową w roztworze tnącym i rozpocznij bulgotanie mieszaniną tlenu i dwutlenku węgla. Za pomocą cienkiej pęsety i lupy usuń pajęczynówkę i wytnij szypułkę móżdżku. Po usunięciu pnia mózgu i bloku agarowego obróć tacę o 180 stopni tak, aby grzbietowa powierzchnia móżdżku była skierowana w stronę żyletki wibratomu i wyreguluj pierwsze miejsce cięcia.Ustaw amplitudę wibratomu na 5,5 i częstotliwość na 85 Hz, prędkość na trzy do czterech, a grubość plastra na 300 mikrometrów. Po uzyskaniu wycinków móżdżku należy za pomocą nylonowej siatki przenieść skrawki do akrylowego inkubatora w łaźni wodnej o temperaturze 26 stopni Celsjusza i całkowicie zanurzyć próbki w świeżo natlenionym ACSF na co najmniej godzinę. W przypadku raportowania klamry krosowej całej komórki, rozpuść jedną mikromolową pikrotoksynę w ACSF przez ultasonizację przez trzy minuty przed perfuzją w komorze rejestracyjnej o temperaturze 30 stopni Celsjusza roztworem toksyny przy natężeniu przepływu dwóch mililitrów na minutę.Po kilku minutach przenieś plaster móżdżku do komory nagraniowej i przymocuj tkankę za pomocą platynowego ciężarka i nylonowych nici. Następnie napełnij elektrodę stymulującą świeżym ACSF. Aby stymulować równoległe włókna, umieść elektrodę stymulującą na powierzchni warstwy molekularnej około 50 mikrometrów od warstwy komórek Purkinjego.W celu stymulacji włókien pnących należy umieścić elektrodę stymulującą na dnie warstwy komórek Purkinjego i za pomocą mikroładowarki napełnić elektrodę rejestrującą ośmioma mikrolitrami 0,45 mikrometra przefiltrowanego roztworu wewnętrznego na bazie potasu lub cezu. Zastosuj słabe dodatnie ciśnienie do elektrody rejestrującej przed zanurzeniem elektrody w ACSF. Rezystancja elektrody powinna wynosić od dwóch do czterech megaomów, a potencjał złączowy cieczy powinien być skorygowany.Zbliż się do zdrowego, jasnego korpusu ogniwa Purkinjego za pomocą elektrody rejestrującej i lekko popchnij powierzchnię ogniwa Purkinjego. Następnie przestań stosować nadciśnienie i stosuj podciśnienie, aż utworzy się uszczelka gigaomowa. Następnie użyj podciśnienia, aby ustalić konfigurację całego ogniwa, utrzymując potencjał błony na poziomie minus 70 miliwoltów i stosując minus dwa miliwolty 100 milisekund impulsy przy 0,1 herca, ciągłe monitorowanie rezystancji wejściowej, rezystancji szeregowej i pojemności wejściowej.W przypadku długotrwałej indukcji depresji stymuluj warstwę molekularną impulsem 0,1 milisekundy i zastosuj bodziec podwójnego impulsu, aby zidentyfikować równoległe pobudzające włókna prądy postsynaptyczne. Należy zaobserwować sparowane ułatwienie impulsów i stopniowy wzrost amplitudy w stosunku do wzrostu intensywności stymulacji. Aby zarejestrować odpowiedź testową, należy zastosować pojedynczy impuls o częstotliwości 0,1 Hz i dostosować intensywność bodźca tak, aby wywołana amplituda wynosiła około 200 pikoamperów.Stymuluj włókna pnące na dnie warstwy komórek Purkinjego i aby zidentyfikować równoległe pobudzające prądy postsynaptyczne wywołane aktywacją włókien pnących, zastosuj bodziec dwuimpulsowy. Sparowana depresja pulsu powinna być obserwowana w sposób całkowity lub żaden w korelacji ze wzrostem intensywności stymulacji. W tym reprezentatywnym eksperymencie do przygotowania plastrów zastosowano połączenie jednej równoległej stymulacji włókien i jednej stymulacji włókien pnących w obecnych warunkach zacisku.Kształt złożonego kolca wywołanego przez stymulację koniunkcyjną był podobny do tego wywołanego przez samą stymulację włókien pnących z pierwszym stromym kłoskiem, po którym następowały dwa do trzech kłosków. Podobnie ukształtowany złożony skok zaobserwowano, gdy po jednej równoległej stymulacji włókien 50 milisekund później nastąpiła koniunkcyjna druga równoległa i wznosząca się stymulacja włókien. W tym teście w warunkach cęgów napięciowych przy użyciu wewnętrznego roztworu na bazie cezu, po równoległej stymulacji włókien 50 milisekund później nastąpiło jednoczesne zastosowanie drugiej równoległej stymulacji włókien i depolaryzacja somatyczna.Prąd wewnętrzny został wywołany w wyniku depolaryzacji somatycznej od minus 70 do zera miliwoltów, a prąd ogonowy został również wywołany po repolaryzacji. Na koniec podano pięć równoległych bodźców światłowodowych o częstotliwości 100 Hz jednocześnie z depolaryzacją somatyczną w warunkach cęgowania napięcia. Ponownie, podczas depolaryzacji wywołano powtarzające się generowanie prądów wewnętrznych, a prąd ogonowy został wywołany po repolaryzacji.Aby ocenić związek między móżdżkiem LTD a uczeniem motorycznym u zwierząt manipulowanych genami, należy zastosować wiele protokołów do wywołania LTD w przytulnych warunkach fizjologicznych. Jeśli móżdżek LTD zostanie uwidoczniony u zwierząt manipulowanych genami po uczeniu się motorycznym, związek przyczynowy między nimi może być bardziej bezpośrednio zbadany.

assessment-long-term-depression-induction-adult-cerebellar

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym artykule przedstawiono procedury przygotowywania skrawków hipokampa szczurów oraz myszy transgenicznych w celu badania zmian synaptycznych związanych ze starzeniem się mózgu i neurodegeneracyjnymi chorobami starczymi, takimi jak choroba Alzheimera.

Przygotowanie ostrych skrawków hipokampa szczurów i myszy transgenicznych do badania zmian synaptycznych podczas starzenia się i patologii amyloidowej

Niniejsza metoda opisuje generowanie organotypowych kultur móżdżku oraz wpływ określonych bodźców apoptotycznych na żywotność różnych typów komórek móżdżku.

Organotypowe hodowle móżdżku: wyzwania apoptotyczne i ich detekcja

W tym filmie wycinek mózgu móżdżku myszy został wykorzystany do zbadania interakcji synaptycznych między włóknami równoległymi, włóknami pnącymi i komórkami Purkinjego, które są niezbędne do kontroli motorycznej. Stymulacja włókien pnących się indukowała długotrwałą depresję (LTD) w komórkach Purkinjego, osłabiając siłę synaps i powodując zmniejszoną odpowiedź na stymulację włókien równoległych.

Indukcja długotrwałej depresji w neuronach móżdżku Purkinjego w wycinku mózgu myszy

Badania wykazały, że katodowa przezczaszkowa stymulacja prądem stałym może powodować efekt tłumiący napady oporne na leki. W tym badaniu opracowano konfigurację eksperymentalną in vitro, w której oceniano stymulację prądem stałym i rejestrację wieloelektrodową aktywności podobnej do napadu w przygotowaniu wycinków mózgu myszy. Ocenie poddano parametry stymulacji prądem stałym.

Stymulacja prądem stałym i wieloelektrodowa rejestracja aktywności podobnej do napadów w przygotowaniu do wycinka mózgu myszy

Ten protokół demonstruje implementację zoptymalizowanej metody ochronnego odzyskiwania N-metylo-D-glukaminy (NMDG) do przygotowania wycinków mózgu. Pojedynczy preparat podłoża jest używany do niezawodnego uzyskiwania zdrowych wycinków mózgu od zwierząt w każdym wieku i do różnych zastosowań eksperymentalnych.

Przygotowanie ostrych wycinków mózgu przy użyciu zoptymalizowanej metody odzysku ochronnego N-metylo-D-glukaminy

Ten protokół opisuje stabilizację poziomu tlenu w małej objętości buforu z recyklingu oraz metodologiczne aspekty rejestrowania plastyczności synaptycznej zależnej od aktywności w zanurzonych ostrych wycinkach hipokampa.

Rejestrowanie plastyczności synaptycznej w ostrych wycinkach hipokampa utrzymywanych w systemie komór do recyklingu, perfuzji i zanurzenia o małej objętości

Tutaj prezentujemy metodę przygotowania organotypowych kultur warstwowych z barwienia móżdżku myszy i osłonki mielinowej za pomocą immunohistochemii, odpowiednią do badania mechanizmów mielinizacji i remielinizacji w ośrodkowym układzie nerwowym.

Przygotowanie i barwienie immunologiczne mielinizujących organotypowych kultur warstwowych móżdżku

Organotypowe kultury plastrów są potężnym narzędziem do badania procesów neurorozwojowych lub degeneracyjnych/regeneracyjnych. Tutaj opisujemy protokół, który modeluje śmierć neurorozwojową komórek Purkinjego w hodowlach warstw móżdżku myszy. Metoda ta może przynieść korzyści w badaniach nad odkrywaniem leków neuroprotekcyjnych.

Przeżywalność komórek Purkiniego w organtypowych kulturach warstwowych móżdżku

To jest protokół do przygotowania ostrych plastrów z dorosłych i starzejących się hipokampów myszy, który wykorzystuje transcardialną perfuzję i cięcie plastrów za pomocą lodowatego NMDG-aCSF w celu zmniejszenia niedotlenienia tkanki. Uzyskane w ten sposób plastry pozostają zdrowe przez wiele godzin i nadają się do długotrwałych nagrań typu patch-clamp i nagrań terenowych.

Minimalizacja niedotlenienia w plastrach hipokampa od dorosłych i starzejących się myszy

Tutaj pokazano, jak model urazu głowy w stanie czuwania może być wykorzystany do zbadania wpływu powtarzających się łagodnych urazów mózgu (r-mTBI) na plastyczność synaptyczną w hipokampie. Model replikuje ważne cechy r-mTBI u pacjentów i jest stosowany w połączeniu z elektrofizjologią in vitro.

Ocena zmian plastyczności synaptycznej przy użyciu modelu łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu w stanie czuwania

Poznaj metody indukcji długotrwałej depresji w komórkach Purkinjego móżdżku u zwierząt z modyfikacjami genetycznymi. Techniki elektrofizjologiczne ujawniają złożone mechanizmy plastyczności synaptycznej.

Ocena długotrwałej indukcji depresji w wycinkach móżdżku u dorosłych

Przeglądaj więcej filmów