Name: Rurociąg bioinformatyczny do dokładnej i wydajnej analizy transkryptomów mikroRNA w roślinach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Poznaj pipeline bioinformatyczny miRDeep-P2 do analizy transkryptomów mikroRNA w roślinach. Zwiększa dokładność i skraca czas przetwarzania dla dużych genomów, eliminując fałszywe pozytywy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez Pekińską Akademię Nauk Rolniczych i Leśnych (KJCX201917, KJCX20180425 i KJCX20180204) dla XY oraz Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31621001) dla LL.

1. Instalacja i testowanie
<ol>
	<li>Pobierz wymagane zależności: Bowtie222 i RNAfold23. Zalecane są skompilowane pakiety.
	<ol>
		<li>Pobierz Bowtie2, narzędzie do mapowania odczytu, ze swojej strony głównej (<a href="http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml" target="_blank">http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</a>).</li>
		<li>Pobierz RNAfold, narzędzie z pakietu wiedeńskiego służące do przewidywania struktury drugorzędowej RNA, z <a href="http://www.tbi.univie.ac.at/~ivo/RNA/" target="_blank">http://www.tbi.univie.ac.at/~ivo/RNA/</a>.</li>
		<li>Przed zainstalowaniem miRDP2 upewnij się, że te dwie zależności są poprawnie zainstalowane i dostosuj plik środowiska bash (np. .bashrc), aby ustawić poprawną ŚCIEŻKĘ dla tych dwóch zależności. 
		UWAGA: Inne narzędzia do mapowania, takie jak Bowtie24 są również odpowiednie dla miRDP2; zarówno Bowtie, jak i Bowtie2 mogą być używane po wersji 1.1.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby pobrać pakiet miRDP2, przejdź do <a href="https://sourceforge.net/projects/mirdp2/files/latest_version/" target="_blank">https://sourceforge.net/projects/mirdp2/files/latest_version/</a> i pobierz pliki archiwum.</li>
	<li>Przed zainstalowaniem miRDP2 upewnij się, że Perl znajduje się w PATH. Aby zainstalować miRDP2, rozpakuj całą zawartość pobranego pliku tarball do jednego folderu (wiersze poleceń jak w 1.4.2), a następnie ustaw ścieżkę folderu na PATH. 
	UWAGA: Do uruchomienia protokołu miRDP2 zalecany jest komputer lub węzeł obliczeniowy z co najmniej 8 GB pamięci RAM i 100 GB pamięci masowej.</li>
	<li>Przetestuj potok MiRDP2.
	<ol>
		<li>Aby sprawdzić, czy miRDP2 został poprawnie zainstalowany, użyj danych testowych i oczekiwanych danych wyjściowych znalezionych w <a href="https://sourceforge.net/projects/mirdp2/files/TestData/" target="_blank">https://sourceforge.net/projects/mirdp2/files/TestData/</a>. Dane testowe zawierają jeden sformatowany plik sekwencjonowania GSM i jeden plik genomu Arabidopsis thaliana.</li>
		<li>Przenieś wszystkie pobrane pliki do bieżącego katalogu roboczego: 
		mv miRDP2-v*.tar.gz TestData.tar.gz ncRNA_rfam.tar.gz <user_selected_folder> 
		Płyta CD <user_selected_folder></li>
		<li>Rozpakuj skompresowane pliki archiwum tar: 
		tar –xvzf miRDP2-v*.tar.gz 
		tar –xvzf TestData.tar.gz 
		tar –xvzf ncRNA_rfam.tar.gz</li>
		<li>Zbuduj indeks referencyjny genomu rzodkiewnika: 
		bowtie2-build -f ./TestData/TAIR10_genome.fa ./TestData/TAIR10_genome</li>
		<li>Zbuduj indeks referencyjny ncRNA: 
		bowtie2-build -f ./ncRNA_rfam.fa ./1.1.3/script/index/rfam_index</li>
		<li>Uruchom potok miRDP2: 
		bash ./1.1.3/miRDP2-v1.1.3_pipeline.bash –g ./TestData/TAIR10_genome.fa -i ./ TestData/TAIR 10_genome –f ./TestData/GSM2094927.fa –o . 
		UWAGA: Używane polecenia systemu Linux są napisane pogrubioną czcionką i kursywą, a opcje wiersza poleceń są napisane kursywą. *wskazuje wersję miRDP2 (bieżąca wersja to 1.1.3). Polecenie bowtie2-build powinno zająć około 10 minut, a potok miRDP2 powinien zakończyć się w ciągu kilku minut</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdź wyniki testów.
	<ol>
		<li>Zauważ, że folder o nazwie "GSM2094927-15-0-10" jest generowany automatycznie w <user_selected_folder>, zawierający wszystkie pliki pośrednie i wyniki.</li>
		<li>Sprawdź, czy plik wyjściowy rozdzielany tabulatorami GSM2094927-15-0-10_filter_P_prediction, końcowy wynik przewidywanych miRNA, zawiera kolumny wskazujące identyfikator chromosomu, kierunek nici, reprezentatywne odczyty id, identyfikator prekursora, lokalizację dojrzałego miRNA, lokalizację prekursora, dojrzałą sekwencję i sekwencję prekursorową. Zwróć uwagę na dodatkowy plik łóżka pochodzący z tego pliku, aby ułatwić dalszą analizę.</li>
		<li>Sprawdź plik "progress_log", który zawiera informacje o zakończonych krokach, oraz pliki "script_log" i "script_err", które zawierają dane wyjściowe programu i ostrzeżenia. 
		UWAGA: Obecnie przetestowaliśmy miRDP2 na dwóch platformach Linux, w tym CentOS release 6.5 na serwerze klastrowym i Cygwin 2.6.0 na PC z systemem Windows, a miRDP2 powinien działać na podobnych systemach obsługujących Perla.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Identyfikacja nowych miRNA
<ol>
	<li>Przed uruchomieniem potoku upewnij się, że odczyty wejściowe są wstępnie przetworzone do odpowiedniego formatu. 
	UWAGA: Nowa wersja 1.1.3 miRDP2 może akceptować oryginalne pliki w formacie FASTQ jako dane wejściowe, chociaż proces formatowania odczytów odbywa się jak w poprzednich wersjach.
	<ol>
		<li>Najpierw usuń adaptery z końcówek 5' i 3' odczytów głębokiego sekwencjonowania (jeśli są obecne).</li>
		<li>Po drugie, przeanalizuj odczyty głębokiego sekwencjonowania w formacie FASTA.</li>
		<li>Po trzecie, usuń nadmiarowość tak, aby odczyty z identyczną sekwencją były reprezentowane przez pojedynczy i niepowtarzalny wpis FAPSA.</li>
		<li>Na koniec upewnij się, że wszystkie identyfikatory FASTA są unikatowe. Każdy identyfikator sekwencji musi kończyć się znakiem "_x" i liczbą całkowitą, wskazującą numer kopii dokładnej sekwencji, która została pobrana w zestawach danych głębokiego sekwencjonowania. Jednym ze sposobów zapewnienia unikalnego identyfikatora FASTA jest dołączenie do niego numeru bieżącego. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz plik GSM2094927.fa w danych testowych (<a href="https://sourceforge.net/projects/mirdp2/files/TestData/" target="_blank">https://sourceforge.net/projects/mirdp2/files/TestData/</a>).</li>
		<li>Poniżej znajdują się przykłady poprawnie sformatowanych odczytów: 
		 
		>read0_x29909 
		TTTGGATTGAAGGGAGCTCTA 
		>read1_x36974 
		TTCCACAGCTTTCTTGAACTG 
		>read2_x32635 
		TTCCACAGCTTTCTTGAACTT</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Buduj indeksy referencyjne.
	<ol>
		<li>Aby uzyskać odniesienie do genomu, aby zaoszczędzić czas, pobierz pliki indeksu Bowtie2 ze strony internetowej iGenomes (<a href="https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.html" target="_blank">https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.html</a>), jeśli sekwencje genomu interesującego gatunku zostały zindeksowane. W przeciwnym razie użytkownicy indeksują sekwencje referencyjne i przechowują plik indeksu przez jakiś czas, aż projekt zostanie zakończony, ponieważ sekwencja genomu może wymagać ponownego indeksowania. Szczegółowe informacje na temat indeksowania odniesienia do genomu znajdują się w podręczniku bowtie2 (<a href="http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml" target="_blank">http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml</a>).</li>
		<li>Inny indeks ncRNA nie-miRNA jest również potrzebny do odfiltrowania hałaśliwych sekwencji z innych niekodujących fragmentów RNA. Plik jest zbiorem głównych sekwencji ncRNA z Rfam, w tym rRNA, tRNA, snRNA i snoRNA. Aby zbudować ten indeks, zapoznaj się z częścią 1.4, ponieważ indeks powinien być umieszczony i nazwany poprawnie, tj. <miRDP2_version>/script/index/rfam_index.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom polecenie miRDP2.
	<ol>
		<li>Aby użyć miRDP2 do wykrywania nowych miRNA na podstawie danych z głębokiego sekwencjonowania, uruchom skrypt bash w pakiecie, aby uruchomić potok analizy (przykład można znaleźć w kroku 1.4): 
		<path_to_miRDP2_folder>/miRDP2-v*.*_pipeline.bash –g <genome_file> -i <path_to_index/index_prefix> -f <seq_file > -o <output_folder> 
		gdzie * wskazuje wersję skryptu powłoki bash potoku. Istnieją trzy parametry, które można modyfikować: 1) liczba różnych lokalizacji, do których można zmapować odczyt, 2) liczba niezgodności dla biegnącej muszki2 i 3) próg RPM (odczyty na milion). Zmodyfikuj je za pomocą opcji -L, -M i –R, odpowiednio. Szczegółowe wyjaśnienie znajduje się w sekcji 3.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdź wyjścia miRDP2.
	<ol>
		<li>Zauważ, że folder wyjściowy zostanie automatycznie wygenerowany pod <output_folder> i nazwany "<seq_file_name>-15-0-10"; ostatnie 3 cyfry wskazują wartości (w tym przypadku domyślnie) odpowiednio dla parametrów 1, 2 i 3. Plik zawiera <seq_file_name>_filter_P_prediction informacje o ostatecznych przewidywanych miRNA spełniających nowo zaktualizowane kryteria adnotacji miRNA roślin. Szczegółowe informacje na temat formatu pliku wyjściowego są opisane w części 1.4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Modyfikacje i ostrożność przy użyciu miRDP2
<ol>
	<li>Parametry, które można modyfikować
	<ol>
		<li>Użyj opcji '-L', aby ustawić limit lokalizacji, do których odczyt może być zmapowany (parametr 1). Mapowanie odczytu do zbyt wielu miejsc jest prawdopodobnie związane z powtarzającymi się sekwencjami i prawdopodobnie nie ma wpływu na miRNA. Ustawienie domyślne to 15. W przypadku określonych gatunków, jeśli istnieją rodziny miRNA z wieloma członkami, pierwszy parametr można zwiększyć ręcznie, aby dostosować się do krajobrazu genomu.</li>
		<li>Użyj opcji '-M', aby ustawić dozwolone niezgodności dla muszki (parametr 2). Ustawienie domyślne to 0.</li>
		<li>Użyj opcji "-R", aby ustawić próg dla odczytów potencjalnie odpowiadających dojrzałym miRNA (parametr 3). Aby zmniejszyć zużycie czasu i wyniki fałszywie dodatnie, filtruj odczyty według prędkości obrotowej. Tylko odczyty przekraczające pewien próg RPM mogą reprezentować dojrzałe sekwencje miRNA, a nie szum tła i zostaną zachowane do dalszej analizy. Ustawienie domyślne to 10 obr./min.</li>
		<li>Należy pamiętać, że zmiana tych parametrów może potencjalnie wpłynąć na wydajność i zużycie czasu. Ogólnie rzecz biorąc, zwiększenie parametru 1 i 2 oraz zmniejszenie parametru 3 skutkowałoby mniej rygorystycznym wynikiem i dłuższym czasem działania i odwrotnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Redundancja i miRNA*
	<ol>
		<li>Należy pamiętać, że wyjściowe miRNA z miRDP2 mogą różnić się od znanych miRNA. Odkryliśmy, że wynika to głównie z jednego z dwóch powodów: niejednorodności dojrzałych miRNA lub względnej obfitości miRNA i miRNA*. Odkryliśmy, że nie ma to wpływu na optymalny dobór długości prekursorów i profilowanie znanych genów miRNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+silencing+RNAs%3A+an+expanding+universe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (2), 94-108 (2009).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136 (2), 215-233 (2009).</li>
<li>Moran, Y., Agron, M., Praher, D., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionary+origin+of+plant+and+animal+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+Evolution%22%5BJournal%5D)">The evolutionary origin of plant and animal microRNAs.</a> Nature Ecology Evolution. 1 (3), 27(2017).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Arabidopsis+MIRNA+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Expression of Arabidopsis MIRNA genes.</a> Plant Physiology. 138 (4), 2145-2154 (2005).</li>
<li>Zhao, X., Zhang, H., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+the+proximal+promoters+of+microRNA+genes+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of the proximal promoters of microRNA genes in Arabidopsis.</a> Genomics. 101 (3), 187-194 (2013).</li>
<li>Bologna, N. G., Mateos, J. L., Bresso, E. G., Palatnik, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+loop-to-base+processing+mechanism+underlies+the+biogenesis+of+plant+microRNAs+miR319+and+miR159%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+JOURNAL%22%5BJournal%5D)">A loop-to-base processing mechanism underlies the biogenesis of plant microRNAs miR319 and miR159.</a> EMBO JOURNAL. 28 (23), 3646-3656 (2009).</li>
<li>Rogers, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+turnover%2C+and+mode+of+action+of+plant+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, turnover, and mode of action of plant microRNAs.</a> Plant Cell. 25 (7), 2383-2399 (2013).</li>
<li>Voinnet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin%2C+biogenesis%2C+and+activity+of+plant+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Origin, biogenesis, and activity of plant microRNAs.</a> Cell. 136 (4), 669-687 (2009).</li>
<li>Iwakawa, H. O., Tomari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Functions+of+MicroRNAs%3A+mRNA+Decay+and+Translational+Repression%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Functions of MicroRNAs: mRNA Decay and Translational Repression.</a> Trends in Cell Biology. 25 (11), 651-665 (2015).</li>
<li>Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+heterochronic+gene+lin-4+encodes+small+RNAs+with+antisense+complementarity+to+lin-14%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.</a> Cell. 75 (5), 843-854 (1993).</li>
<li>Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+regulation+of+the+heterochronic+gene+lin-14+by+lin-4+mediates+temporal+pattern+formation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans.</a> Cell. 75 (5), 855-862 (1993).</li>
<li>Friedlander, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+microRNAs+from+deep+sequencing+data+using+miRDeep%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Discovering microRNAs from deep sequencing data using miRDeep.</a> Nature Biotechnology. 26 (4), 407-415 (2008).</li>
<li>Yang, X., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRDeep-P%3A+a+computational+tool+for+analyzing+the+microRNA+transcriptome+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">miRDeep-P: a computational tool for analyzing the microRNA transcriptome in plants.</a> Bioinformatics. 27 (18), 2614-2615 (2011).</li>
<li>Meyers, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Criteria+for+annotation+of+plant+MicroRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Criteria for annotation of plant MicroRNAs.</a> Plant Cell. 20 (12), 3186-3190 (2008).</li>
<li>Yang, X., Zhang, H., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+gene-level+microRNA+expression+in+Arabidopsis+using+deep+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Global analysis of gene-level microRNA expression in Arabidopsis using deep sequencing data.</a> Genomics. 98 (1), 40-46 (2011).</li>
<li>Kuang, Z., Wang, Y., Li, L., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRDeep-P2%3A+accurate+and+fast+analysis+of+the+microRNA+transcriptome+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">miRDeep-P2: accurate and fast analysis of the microRNA transcriptome in plants.</a> Bioinformatics. , (2018).</li>
<li>Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+from+microRNA+sequences+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">miRBase: from microRNA sequences to function.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 155-162 (2019).</li>
<li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+tools+for+microRNA+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Research. 36, Database issue 154-158 (2008).</li>
<li>Axtell, M. J., Meyers, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+Criteria+for+Plant+MicroRNA+Annotation+in+the+Era+of+Big+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Revisiting Criteria for Plant MicroRNA Annotation in the Era of Big Data.</a> Plant Cell. 30 (2), 272-284 (2018).</li>
<li>Taylor, R. S., Tarver, J. E., Hiscock, S. J., Donoghue, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+history+of+plant+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Evolutionary history of plant microRNAs.</a> Trends in Plant Science. 19 (3), 175-182 (2014).</li>
<li>Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+annotating+high+confidence+microRNAs+using+deep+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 42, Database issue 68-73 (2014).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Lorenz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ViennaRNA+Package+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22Algorithms+for+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ViennaRNA Package 2.0.</a> Algorithms for Molecular Biology. 6, 26(2011).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10 (3), 25(2009).</li>
<li>An, J., Lai, J., Sajjanhar, A., Lehman, M. L., Nelson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRPlant%3A+an+integrated+tool+for+identification+of+plant+miRNA+from+RNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">miRPlant: an integrated tool for identification of plant miRNA from RNA sequencing data.</a> BMC Bioinformatics. 15, 275(2014).</li>
<li>Lei, J., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-PREFeR%3A+an+accurate%2C+fast+and+easy-to-use+plant+miRNA+prediction+tool+using+small+RNA-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">miR-PREFeR: an accurate, fast and easy-to-use plant miRNA prediction tool using small RNA-Seq data.</a> Bioinformatics. 30 (19), 2837-2839 (2014).</li>
<li>Evers, M., Huttner, M., Dueck, A., Meister, G., Engelmann, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRA%3A+adaptable+novel+miRNA+identification+in+plants+using+small+RNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">miRA: adaptable novel miRNA identification in plants using small RNA sequencing data.</a> BMC Bioinformatics. 16, 370(2015).</li>
<li>Mathelier, A., Carbone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIReNA%3A+finding+microRNAs+with+high+accuracy+and+no+learning+at+genome+scale+and+from+deep+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MIReNA: finding microRNAs with high accuracy and no learning at genome scale and from deep sequencing data.</a> Bioinformatics. 26 (18), 2226-2234 (2010).</li>
<li>Zhu, Q. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+diverse+set+of+microRNAs+and+microRNA-like+small+RNAs+in+developing+rice+grains%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">A diverse set of microRNAs and microRNA-like small RNAs in developing rice grains.</a> Genome Research. 18 (9), 1456-1465 (2008).</li>
<li>Fahlgren, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+gene+evolution+in+Arabidopsis+lyrata+and+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA gene evolution in Arabidopsis lyrata and Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell. 22 (4), 1074-1089 (2010).</li>
<li>Fromm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Uniform+System+for+the+Annotation+of+Vertebrate+microRNA+Genes+and+the+Evolution+of+the+Human+microRNAome%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome.</a> Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).</li>
<li>Blevins, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Pol+IV+and+RDR2-dependent+precursors+of+24+nt+siRNAs+guiding+de+novo+DNA+methylation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Identification of Pol IV and RDR2-dependent precursors of 24 nt siRNAs guiding de novo DNA methylation in Arabidopsis.</a> Elife. 4, 09591(2015).</li>
<li>Zhai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+One+Precursor+One+siRNA+Model+for+Pol+IV-Dependent+siRNA+Biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A One Precursor One siRNA Model for Pol IV-Dependent siRNA Biogenesis.</a> Cell. 163 (2), 445-455 (2015).</li>
<li>Werner, S., Wollmann, H., Schneeberger, K., Weigel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+determinants+for+accurate+processing+of+miR172a+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure determinants for accurate processing of miR172a in Arabidopsis thaliana.</a> Current Biology. 20 (1), 42-48 (2010).</li>
<li>Mateos, J. L., Bologna, N. G., Chorostecki, U., Palatnik, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+microRNA+processing+determinants+by+random+mutagenesis+of+Arabidopsis+MIR172a+precursor%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of microRNA processing determinants by random mutagenesis of Arabidopsis MIR172a precursor.</a> Current Biology. 20 (1), 49-54 (2010).</li>
<li>Vitsios, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mirnovo%3A+genome-free+prediction+of+microRNAs+from+small+RNA+sequencing+data+and+single-cells+using+decision+forests%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Mirnovo: genome-free prediction of microRNAs from small RNA sequencing data and single-cells using decision forests.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 177(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wraz z nadejściem NGS zidentyfikowano dużą liczbę loci miRNA na podstawie stale rosnącej ilości danych sekwencjonowania sRNA u różnych gatunków29,30. W scentralizowanej bazie danych społeczności miRBase21 zdeponowane pozycje miRNA wzrosły prawie 100-krotnie w ciągu ostatniej dekady. Jednak w porównaniu z miRNA u zwierząt, roślinne miRNA mają wiele unikalnych cech, które sprawiają, że identyfikacja/adnotacja jest bardziej skomplikowana<sup ...

Jednym z najciekawszych odkryć w biologii ostatnich dwóch dekad jest rosnąca rola gatunków sRNA w regulacji różnorodnych funkcji genomu1. W szczególności miRNA stanowią istotną klasę sRNA o długości od 20 do 24 nt u organizmów eukariotycznych i funkcjonują głównie na poziomie potranskrypcyjnym jako kluczowe regulatory genów w poszczególnych etapach cyklu rozwojowego, a także w odpowiedziach na bodźce i stres2,3. U roślin miRNA powstają z transkryptów pierwotnych zwanych pri-miRNA, które są zazwyczaj transkrybowane przez polimerazę RNA II jako oddzielne jednostki transkrypcyjne4,5. Dzięki przetwarzaniu przez ewolucyjnie konserwatywny aparat komórkowy (RNaza III Drosha u zwierząt, białka DICER-like u roślin), pri-miRNA są wycinane do bezpośrednich prekursorów miRNA, pre-miRNA, które zawierają sekwencje tworzące wewnątrzmolekularne struktury spinki (stem-loop)6,7. Następnie pre-miRNA są przetwarzane w dwuniciowe produkty pośrednie, mianowicie dupleksy miRNA, składające się z nici funkcjonalnej, dojrzałego miRNA, oraz rzadziej funkcjonalnego partnera, miRNA*2,8. Po wbudowaniu do kompleksu RISC (RNA-induced silencing complex), dojrzałe miRNA mogą rozpoznawać swoje docelowe mRNA na podstawie komplementarności sekwencji, co skutkuje funkcją regulacyjną o charakterze negatywnym2,8. miRNA mogą albo destabilizować transkrypty docelowe, albo zapobiegać ich translacji, jednak u roślin dominuje ten pierwszy mechanizm8,9.
Od czasu przypadkowego odkrycia pierwszego miRNA u nicia Caenorhabditis elegans10,11, ogromny wysiłek badawczy poświęcono identyfikacji miRNA oraz ich analizie funkcjonalnej, zwłaszcza po udostępnieniu metody NGS. Szerokie zastosowanie metody NGS znacznie przyspieszyło wykorzystanie narzędzi obliczeniowych zaprojektowanych do wychwytywania unikalnych cech miRNA, takich jak struktura pętli prekursorów oraz preferencyjna akumulacja odczytów sekwencji dla dojrzałych miRNA i miRNA*. W rezultacie badacze odnieśli znaczące sukcesy w identyfikacji miRNA u wielu różnych gatunków. W oparciu o wcześniej opisany model probabilistyczny12 opracowaliśmy miRDeep-P13, który był pierwszym narzędziem obliczeniowym do wykrywania roślinnych miRNA z danych NGS. miRDeep-P został stworzony specjalnie w celu pokonania trudności związanych z dekodowaniem roślinnych miRNA, które charakteryzują się bardziej zmienną długością prekursorów i dużymi rodzinami paralogicznymi13,14,15. Po udostępnieniu program ten został pobrany tysiące razy i wykorzystany do adnotacji transkryptomów miRNA u ponad 40 gatunków roślin16. Dzięki narzędziom opartym na NGS, takim jak miRDeep-P, nastąpił gwałtowny wzrost liczby zarejestrowanych miRNA w publicznym repozytorium miRNA miRBase17, w którym obecnie znajduje się ponad 38 000 wpisów miRNA (wersja 22.1) w porównaniu do zaledwie ~500 wpisów miRNA (wersja 2.0) w 2008 roku18.
Pojawiły się jednak dwa nowe wyzwania związane z adnotacją miRNA roślin. Po pierwsze, wysoki odsetek wyników fałszywie dodatnich znacząco wpłynął na jakość adnotacji miRNA roślin16,19 z następujących powodów: 1) ogromna liczba endogennych krótkich ryb interferujących (siRNA) z bibliotek sRNA NGS została błędnie adnotowana jako miRNA ze względu na brak rygorystycznych kryteriów adnotacji miRNA; 2) w przypadku gatunków bez wcześniejszych informacji o miRNA, wyniki fałszywie dodatnie przewidywane na podstawie danych NGS są trudne do wyeliminowania. Analizując miRBase, Taylor i współpracownicy20 stwierdzili, że jedna trzecia wpisów miRNA roślin w publicznym repozytorium21 (wersja 21) nie posiadała przekonujących dowodów potwierdzających, a nawet trzy czwarte rodzin miRNA roślin budziło wątpliwości. Po drugie, przewidywanie miRNA roślin o dużych i złożonych genomach staje się procesem niezwykle czasochłonnym16. Aby przezwyciężyć te trudności, zaktualizowaliśmy miRDeep-P, dodając nową strategię filtrowania, przebudowując algorytm oceny i integrując nowe kryteria adnotacji miRNA roślin, a następnie udostępniliśmy nową wersję miRDP2. Ponadto przetestowaliśmy miRDP2, wykorzystując zestawy danych sRNA NGS dla organizmów o stopniowo zwiększających się rozmiarach genomu: Arabidopsis, ryż, pomidor, kukurydza i pszenica. W porównaniu z pięcioma innymi powszechnie stosowanymi narzędziami oraz starszą wersją, miRDP2 szybciej przetwarzał te dane sRNA i analizował transkryptomy miRNA z lepszą dokładnością i czułością.
Zawartość pakietu miRDP2 
Pakiet miRDP2 składa się z sześciu udokumentowanych skryptów Perl, które powinny być uruchamiane sekwencyjnie przez przygotowany skrypt bash. Z sześciu skryptów trzy (convert_bowtie_to_blast.pl, filter_alignments.pl oraz excise_candidate.pl) zostały przejęte z miRDeep-P. Pozostałe skrypty zostały zmodyfikowane w stosunku do wersji oryginalnej. Funkcje sześciu skryptów opisano poniżej:
preprocess_reads.pl filtruje odczyty wejściowe, w tym odczyty zbyt długie lub zbyt krótkie (&#60;19 nt lub &#62;25 nt), odczyty skorelowane z sekwencjami ncRNA z bazy Rfam, a także odczyty z wartością RPM (Reads Per Million) mniejszą niż 5. Następnie skrypt wyszukuje odczyty skorelowane ze znanymi sekwencjami dojrzałych miRNA. Plikami wejściowymi są oryginalne odczyty w formacie FASTA/FASTQ oraz wyniki programu bowtie2 dla odczytów mapujących do sekwencji miRNA i ncRNA.
Wzór służący do obliczenia RPM jest następujący:
<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/59864/59864equ01.jpg" />
convert_bowtie_to_blast.pl zmienia format bowtie na format analizowany przez BLAST. Format analizowany przez BLAST to niestandardowy format tabelaryczny wywodzący się ze standardowego formatu wyjściowego NCBI BLAST.
filter_alignments.pl filtruje dopasowania odczytów z głębokiego sekwencjonowania do genomu. Program filtruje dopasowania częściowe oraz odczyty wielokrotnie dopasowane (zgodnie z określoną przez użytkownika wartością graniczną częstotliwości). Podstawowym plikiem wejściowym jest plik w formacie parsed BLAST.
excise_candidate.pl wycina potencjalne sekwencje prekursorowe z sekwencji referencyjnej, wykorzystując dopasowane odczyty jako wytyczne. Podstawowymi danymi wejściowymi są plik w formacie przetworzonym przez BLAST oraz plik FASTA. Wynikiem są wszystkie potencjalne sekwencje prekursorowe w formacie FASTA.
mod-miRDP.pl wymaga dwóch plików wejściowych: pliku sygnatur oraz pliku struktury, który został zmodyfikowany względem podstawowego algorytmu miRDeep-P poprzez zmianę systemu punktacji o parametry specyficzne dla roślin. Plikami wejściowymi są plik struktury prekursorów w zapisie kropka-nawias oraz plik sygnatury rozkładu odczytów.
mod-rm_redundant_meet_plant.pl wymaga trzech plików wejściowych: chromosome_length, precursors oraz original_prediction wygenerowanych przez mod-miRDP.pl. Program generuje dwa pliki wyjściowe: plik z nieredundantnymi przewidywaniami oraz plik z przewidywaniami przefiltrowany zgodnie z nowo zaktualizowanymi kryteriami miRNA dla roślin. Szczegóły dotyczące formatu pliku wyjściowego opisano w sekcji 1.4.

<table><tbody><tr><td>Komputer/węzeł</td><td>obliczeniowy Nie</td><td></td> dotyczy <td>wymaga standardu Perl; zalecane jest co najmniej 8 GB pamięci RAM i 100 GB pamięci masowej</td></tr></tbody></table>

rurociąg bioinformatyczny do dokładnej i wydajnej analizy transkryptomów mikrorna w roślinach

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

MikroRNA (miRNA) to 20- do 24-nukleotydowe (nt) endogenne małe RNA (sRNA) szeroko występujące u roślin i zwierząt, które odgrywają ważną rolę w regulacji ekspresji genów na poziomie potranskrypcyjnym. Sekwencjonowanie bibliotek sRNA metodami sekwencjonowania nowej generacji (NGS) było szeroko stosowane do identyfikacji i analizy transkryptomów miRNA w ostatniej dekadzie, co spowodowało szybki wzrost odkrywania miRNA. Jednak w adnotacji miRNA roślin pojawiają się dwa główne wyzwania ze względu na rosnącą głębokość sekwencjonowanych bibliotek sRNA, a także rozmiar i złożoność genomów roślinnych. Po pierwsze, wiele innych typów sRNA, w szczególności krótkie interferujące RNA (siRNA) z bibliotek sRNA, jest błędnie oznaczanych jako miRNA przez wiele narzędzi obliczeniowych. Po drugie, staje się niezwykle czasochłonnym procesem analizy transkryptomów miRNA u gatunków roślin o dużych i złożonych genomach. Aby sprostać tym wyzwaniom, niedawno zaktualizowaliśmy miRDeep-P (popularne narzędzie do analizy transkryptomu miRNA) do miRDeep-P2 (w skrócie miRDP2), stosując nową strategię filtrowania, zmieniając algorytm punktacji i uwzględniając nowo zaktualizowane kryteria adnotacji miRNA roślin. Przetestowaliśmy miRDP2 na sekwencjonowanych populacjach sRNA w pięciu reprezentatywnych roślinach o rosnącej złożoności genomowej, w tym Arabidopsis, ryżu, pomidora, kukurydzy i pszenicy. Wyniki wskazują, że miRDP2 przetwarzał te zadania z bardzo wysoką wydajnością. Ponadto miRDP2 przewyższyło inne narzędzia predykcyjne pod względem czułości i dokładności. Podsumowując, nasze wyniki pokazują, że miRDP2 jest szybkim i dokładnym narzędziem do analizy transkryptomów miRNA roślin, a zatem użytecznym narzędziem pomagającym społeczności w lepszym opisywaniu miRNA w roślinach.

Opisany w niniejszej pracy potok adnotacji miRNA, miRDP2, zastosowano do 10 publicznych bibliotek sRNA-seq z 5 gatunków roślin o stopniowo zwiększającej się długości genomu, w tym Arabidopsis thaliana, Oryza sativa (ryż), Solanum lycopersicum (pomidor), Zea mays (kukurydzy) i Triticum aestivum (pszenica) (Rysunek 1A). Ogólnie, dla każdego gatunku, dwie reprezentatywne biblioteki sRNA z różnych tkanek (zredukowane do unikalnych odc...

Rurociąg bioinformatyczny, a mianowicie miRDeep-P2 (w skrócie miRDP2), z aktualnymi kryteriami miRNA roślin i przebudowanym algorytmem, mógłby dokładnie i efektywnie analizować transkryptomy mikroRNA u roślin, szczególnie dla gatunków o złożonych i dużych genomach.

Rurociąg bioinformatyczny do dokładnej i wydajnej analizy transkryptomów mikroRNA w roślinach

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...

miRDeep2 może być używany do dokładnej identyfikacji roślinnych mikroRNA, które są ważnymi regulatorami transkrypcji w rozwoju roślin i mają kluczowe znaczenie w reagowaniu na wyzwania środowiskowe. miRDeep2 wymaga znacznie krótkiego czasu działania i wykazuje doskonałą wydajność zarówno pod względem czułości, jak i dokładności, szczególnie w przewidywaniu mikroRNA u roślin o dużym genomie. Fałszywe alarmy i długi czas przetwarzania to wyzwania w adnotacji mikroRNA roślin.Dodając nową strategię fieldingu, zmieniając algorytm punktacji i integrując rygorystyczne kryteria, miRDeep2 może przezwyciężyć te problemy. Adnotacja mikroRNA o wysokim poziomie ufności ma fundamentalne znaczenie dla odkrycia roli mikroRNA w regulacji różnorodnych funkcji genomu. Wskazówki krok po kroku mogą być pomocne dla początkujących anotatorów mikroRNA.Dla doświadczonych badaczy metoda ta jest przydatna do zrozumienia zalet i korzyści płynących z używania miRDeep2 w porównaniu z innymi narzędziami. Aby zainstalować pakiet miRDeep2, przejdź do strony internetowej miRDeep2 i pobierz pliki archiwum. Następnie wyodrębnij całą zawartość pobranego pliku do jednego folderu i ustaw ścieżkę folderu na path.Aby przetestować potok miRDeep2, pobierz dane testowe i oczekiwane dane wyjściowe zawierające jeden sformatowany plik sekwencjonowania GSM i jeden plik genomu Arabidopsis thaliana, a następnie przenieś wszystkie pobrane pliki do bieżącego katalogu roboczego. Po wyodrębnieniu skompresowanych plików tar zbuduj indeks referencyjny genomu Arabidopsis i indeks referencyjny niekodującego RNA. W user_selected_folder zostanie automatycznie wygenerowany folder zawierający wszystkie pliki pośrednie i wyniki.Potok miRDeep2 można następnie uruchomić przy użyciu danych testowych. Aby sprawdzić dane wyjściowe testów, wyświetl plik wyjściowy rozdzielany tabulatorami. Ostateczny wynik przewidywanych mikroRNA będzie zawierał kolumny wskazujące identyfikator chromosomu, kierunek nici, identyfikator reprezentatywnych odczytów, identyfikator prekursora, lokalizację dojrzałego miRNA, lokalizację prekursora, dojrzałą sekwencję i sekwencję prekursorową.Następnie sprawdź plik progress_log, który zawiera informacje o zakończonych krokach oraz pliki script_log i script_err, które zawierają dane wyjściowe i ostrzeżenia programu. Przed uruchomieniem potoku, aby upewnić się, że odczyty wejściowe są wstępnie przetwarzane do odpowiedniego formatu, usuń adaptery z pięciu i trzech głównych końców odczytów głębokiego sekwencjonowania i upewnij się, że wszystkie identyfikatory załogi FAST A są unikatowe. Każdy identyfikator sekwencji musi kończyć się znakiem podkreślenia x i liczbą całkowitą wskazującą numer kopii dokładnej sekwencji, która została pobrana w zestawach danych głębokiego sekwencjonowania.Aby zapewnić unikalny identyfikator FAST A, dołącz numer ciągły do ID.To zbuduj indeks referencyjny, jeśli sekwencje genomu gatunków będących przedmiotem zainteresowania zostały zindeksowane, pobierz pliki indeksu Bowtie 2 ze strony internetowej iGenomes. Następnie zbuduj niekodujący indeks RNA niekodujący mikroRNA zawierający główne niekodujące sekwencje z rodziny RNA, w tym rybosomalny RNA, transfer RNA, małe jądrowe RNA i małe jądrowe RNA, aby odfiltrować hałaśliwe sekwencje z innych niekodujących fragmentów RNA. Aby użyć miRDeep2 do wykrywania nowych mikroRNA na podstawie danych głębokiego sekwencjonowania, uruchom skrypt bash w pakiecie, aby uruchomić potok analizy.W razie potrzeby można zmodyfikować liczbę różnych lokalizacji, do których można zmapować odczyt, liczbę niezgodności dla uruchomienia Bowtie 2 oraz próg odczytów na milion. Aby sprawdzić wyjścia miRDeep2, wyświetl dane w automatycznie wygenerowanym output_folder. W tej reprezentatywnej analizie potok adnotacji mikroRNA miRDeep2 został zastosowany do 10 publicznych bibliotek sekwencji sRNA z pięciu gatunków roślin o stopniowo zwiększanym rozmiarze genomu, jak wskazano.Dla każdego gatunku dwie reprezentatywne małe biblioteki RNA z różnych tkanek i ich sekwencje indeksowe genomu są przetwarzane jako dwa dane wejściowe. Korzystając z poprzednich metod, przetwarzanie genomu mogło trwać ponad 100 godzin lub czasami zatrzymywało się w trakcie analizy ze względu na długość genomu. miRDeep2 kończy jednak te procesy przewidywania w znacznie krótszym okresie czasu, od minut do godzin.W przypadku dwóch sekwencjonowanych małych RNA Arabidopsis użytych w tym teście, miRDeep2 działał lepiej zarówno pod względem czułości, jak i dokładności w porównaniu z innymi narzędziami. Upewnij się, że indeks wejściowy programu jest poprawny. Na przykład użyj Muszki tylko z indeksem Muszki i użyj opcji dużego indeksu dla dużych genomów.Cele uzyskanego mikroRNA można przewidzieć za pomocą danych sekwencjonowania, które mogą dostarczyć informacji na temat funkcji mikroRNA. Ponieważ miRDeep2 może być używany do dokładnej i czułej identyfikacji większości mikroRNA u określonego gatunku roślin, można badać rolę funkcji mikroRNA jako całości.

a-bioinformatics-pipeline-to-accurately-efficiently-analyze-microrna

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W tym filmie demonstrujemy northern blot, technikę hybrydyzacji do wykrywania i ilościowego oznaczania mikroRNA (miRNA) z całkowitego RNA wyekstrahowanego z tkanki roślinnej.

Northern Blot do wykrywania i ilościowego oznaczania specyficznego mikroRNA w całkowitym ekstrakcie RNA tkanki roślinnej

Analizy RNA-Seq stają się coraz ważniejsze dla identyfikacji molekularnych podstaw cech adaptacyjnych w organizmach niemodelowych. W tym miejscu opisano protokół identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji między komarami Aedes albopictus z diapauzą i bez diapauzy, od hodowli komarów po sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne danych RNA-Seq.

Eksperymentalny i bioinformatyczny protokół do analiz sekwencyjnych RNA diapauzy fotoperiodycznej u azjatyckiego komara tygrysiego, Aedes albopictus

Krążące mikroRNA pojawiły się ostatnio jako obiecujące i nowe biomarkery dla różnych nowotworów i innych chorób. Celem tego artykułu jest omówienie trzech różnych platform i metod PCR w czasie rzeczywistym opartych na sondach, które są dostępne do ilościowego określania i określania obfitości krążących mikroRNA.

Oparte na sondzie podejścia PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego pomiaru mikroRNA

Ten protokół opisuje prostą metodę ekstrakcji i frakcjonowania transkryptów z tkanek roślinnych na podstawie liczby związanych rybosomów. Pozwala na globalne oszacowanie aktywności translacyjnej i określenie statusu translacyjnego określonych mRNA.

Łatwa metoda profilowania polisomów roślin

Ten raport opisuje szybką i niezawodną metodę walidacji celów mRNA komórkowych miRNA. Metoda wykorzystuje syntetyczne biotynylowane miRNA oparte na zablokowanych kwasach nukleinowych (LNA) do wychwytywania docelowego mRNA. Następnie kulki magnetyczne pokryte streptawidyną są wykorzystywane do ściągania docelowego mRNA w celu ilościowego oznaczania w reakcji łańcuchowej polimerazy qPCR.

Test pulldown na bazie biotyny do walidacji celów mRNA komórkowych miRNA

Tutaj opisujemy metodę oceny ekspresji miRNA w płucach, które zgodnie z przewidywaniami regulują geny zapalne, używając myszy wystawionych na działanie ozonu lub przefiltrowanego powietrza na różnych etapach cyklu rujowego.

Profilowanie mikroRNA płuc w cyklu rujowym u myszy narażonych na działanie ozonu

Tutaj opisujemy krok po kroku strategię izolowania małych RNA, wzbogacania mikroRNA i przygotowywania próbek do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Następnie opisujemy, jak przetwarzać odczyty sekwencji i dopasowywać je do mikroRNA za pomocą narzędzi open source.

Kompletny potok do izolowania i sekwencjonowania mikroRNA oraz analizowania ich przy użyciu narzędzi open source

Przedstawiamy szczegółowy protokół dla systemu wyciszania mikroRNA (VbMS) opartego na wirusie ziemniaka X (PVX), aby funkcjonalnie scharakteryzować endogenne mikroRNA (miRNA) u ziemniaka. Docelowe cząsteczki mimiczne (TM) interesującego nas miRNA są integrowane z wektorem PVX i przejściowo ulegają ekspresji w ziemniakach w celu wyciszenia docelowego miRNA lub rodziny miRNA.

Wyciszanie mikroRNA na bazie wirusa ziemniaka (VbMS) w ziemniakach.

Ta metoda demonstruje użycie techniki północnej hybrydyzacji do wykrywania miRNA z całkowitego ekstraktu RNA.

Analiza plam RNA w celu wykrywania i kwantyfikacji mikroRNA roślin

Prezentujemy nowy i w pełni zautomatyzowany potok miRNA, mirMachine, który 1) może dokładniej identyfikować znane i nowe miRNA oraz 2) jest w pełni zautomatyzowany i swobodnie dostępny. Użytkownicy mogą teraz wykonać krótki skrypt przesyłania, aby uruchomić w pełni zautomatyzowany potok mirMachine.

mirMachine: punkt kompleksowej obsługi adnotacji miRNA roślin

Poznaj pipeline bioinformatyczny miRDeep-P2 do analizy transkryptomów mikroRNA w roślinach. Zwiększa dokładność i skraca czas przetwarzania dla dużych genomów, eliminując fałszywe pozytywy.

Rurociąg bioinformatyczny do dokładnej i wydajnej analizy transkryptomów mikroRNA w roślinach

Przeglądaj więcej filmów