Name: Identyfikacja białek oddziałujących z fosforanem inozytolu lub fosfoinozytylem za pomocą chromatografii powinowactwa sprzężonej ze spektrometrią Western Blot lub spektrometrią mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji białek oddziałujących z fosforanem inozytolu lub fosfoinozytlem przy użyciu chromatografii powinowactwa. Technika ta wykorzystuje Western blot lub spektrometrię mas do analizy białek izolowanych z komórek T. brucei.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Kanadyjską Radę ds. Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC, RGPIN-2019-04658); Suplement wprowadzający NSERC Discovery dla naukowców na wczesnym etapie kariery (DGECR-2019-00081) oraz przez Uniwersytet McGill.

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Identyfikacja białek, które wiążą się z IP lub PI, ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia funkcji komórkowej tych metabolitów. Chromatografia powinowactwa sprzężona ze spektrometrią Western blot lub spektrometrią mas daje możliwość identyfikacji białek oddziałujących z IP lub PI, a tym samym uzyskania wglądu w ich funkcję regulacyjną. IP lub PI chemicznie znakowane [np. Ins(1,4,5)P3 chemicznie połączone z biotyną] i usieciowane z kulkami agarozy za pomocą streptawidyny lub wychwycone przez paciorkowce magnetyczne streptaw...

Fosforany inozytolu (IPS) i fosfoinozytydy (PI) odgrywają kluczową rolę w biologii eukariontów poprzez regulację procesów komórkowych, takich jak kontrola ekspresji genów1,2,3, transport pęcherzyków4, transdukcja sygnału5,6, metabolizm7,8,9, oraz development8,10. Funkcja regulacyjna tych metabolitów wynika z ich zdolności do interakcji z białkami, a tym samym regulowania funkcji białek. Po związaniu przez białka, IP i PI mogą zmieniać konformację białka11, aktywność katalityczna12, lub interakcje13, a tym samym wpływać na funkcję komórkową. IP i PI są rozmieszczone w wielu subkomórkowych przedziałach, takich jak nucleus2,3,14,15, retikulum endoplazmatyczne16,17, plasma membrane1 i cytozol18, albo związane z białkami3,19 lub z RNAs20.
Rozszczepienie związanego z błoną PI(4,5)P2 przez fosfolipazę C powoduje uwolnienie Ins(1,4,5)P3, który może być fosforylowany lub defosforylowany odpowiednio przez kinazy IP i fosfatazy. IP to rozpuszczalne cząsteczki, które mogą wiązać się z białkami i pełnić funkcje regulacyjne. Na przykład Ins(1,4,5)P3 w metazoanie może działać jako drugi przekaźnik, wiążąc się z receptorami IP3, co indukuje zmiany konformacyjne receptora, a tym samym uwalnianie Ca2+ z magazynów wewnątrzkomórkowych11. Ins(1,3,4,5)P4 wiąże się z kompleksem deacetylazy histonowej i reguluje tworzenie i aktywność kompleksu białkowego13. Inne przykłady funkcji regulacyjnych IP obejmują kontrolę organizacji chromatyny21, transport RNA22,23, RNA editing24, oraz transkrypcja1,2,3. W przeciwieństwie do tego, PI są często związane z rekrutacją białek do błony plazmatycznej lub błon organelli25. Jednak nową właściwością PI jest zdolność do kojarzenia się z białkami w środowisku niebłoniastym3,15,19,26. Tak jest w przypadku steroidogennego czynnika receptora jądrowego, którego funkcja kontroli transkrypcji jest regulowana przez PI(3,4,5)P319, oraz polimerazy poli-A, której aktywność enzymatyczna jest regulowana przez jądrową PI(4,5)P226. Rola regulacyjna IP i PI została wykazana w wielu organizmach, w tym w drożdżach22,27, komórkach ssaków19,23, Drosophila10 i worms28. Istotna jest rola tych metabolitów w trypanosomach, które wcześnie oddzieliły się od linii eukariotycznej. Metabolity te odgrywają istotną rolę w kontroli transkrypcji Trypanosoma brucei1,3, development8, biogeneza organelli i ruch białek29,30,31,32, a także biorą udział w kontrolowaniu rozwoju i infekcji patogenów T. cruzi33,34,35, Toxoplasma36 i Plasmodium5,37. W związku z tym zrozumienie roli IP i PI w trypanosomach może pomóc w wyjaśnieniu nowej funkcji biologicznej tych cząsteczek i zidentyfikowaniu nowych celów leków.
Specyficzność wiązania białka i IP lub PI zależy od domen oddziałujących z białkami i stanu fosforylacji inozytolu13,38, chociaż interakcje z lipidową częścią PI również występują19. Różnorodność IP i PI oraz ich modyfikujących kinazy i fosfatazy zapewnia elastyczny mechanizm komórkowy do kontrolowania funkcji białka, na który wpływ ma dostępność i obfitość metabolitów, stan fosforylacji inozytolu i powinowactwo białek do interakcji1,3,13,38. Chociaż niektóre domeny białkowe są dobrze scharakteryzowane39,40,41, np. domena homologii pleckstrin 42 i SPX (SYG1/Pho81/XPR1) domeny43,44,45niektóre białka oddziałują z IP lub PI za pomocą mechanizmów, które pozostają nieznane. Na przykład białko represorowo-aktywatorowe 1 (RAP1) T. brucei nie ma kanonicznych domen wiążących PI, ale oddziałuje z PI(3,4,5)P3 i transkrypcją kontrolną genów zaangażowanych w zmienność antygenową3. Chromatografia powinowactwa i analiza spektrometrii mas białek oddziałujących IP lub PI z komórek trypanosomów, drożdży lub ssaków zidentyfikowały kilka białek bez znanych domen wiążących IP lub PI8,46,47. Dane sugerują dodatkowe niescharakteryzowane domeny białkowe, które wiążą się z tymi metabolitami. W związku z tym identyfikacja białek, które oddziałują z IP lub PI, może ujawnić nowe mechanizmy interakcji białko-metabolit i nowe komórkowe funkcje regulacyjne dla tych małych cząsteczek.
Opisana tutaj metoda wykorzystuje chromatografię powinowactwa sprzężoną z Western blotting lub spektrometrią mas w celu identyfikacji białek, które wiążą się z IP lub PI. Wykorzystuje biotynylowane adresy IP lub PI, które są albo usieciowane ze streptawidyną sprzężoną z kulkami agarozy, albo alternatywnie, wychwycone za pomocą kulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Metoda zapewnia prosty przepływ pracy, który jest czuły, nieradioaktywny, wolny od liposomów i nadaje się do wykrywania wiązania białek z lizatów komórkowych lub oczyszczonych białek3 (Rysunek 2). Metoda może być stosowana w bez<znacznikowej klasie sup = "xref" >8,< klasie sup = "xref">46 lub w połączeniu z ilościową spektrometrią mas znakowaną aminokwasami 47 w celu identyfikacji białek wiążących IP lub PI ze złożonych próbek biologicznych. W związku z tym metoda ta jest alternatywą dla kilku dostępnych metod badania interakcji IP lub PI z białkami komórkowymi i pomoże w zrozumieniu funkcji regulacyjnej tych metabolitów w trypanosomach i być może innych eukariontach.

<table><tbody><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650501</td><td>Keton</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004</td><td>Rozpuszczalnik&nbsp;</td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6141</td><td>Wirówka do soli nieorganicznych</td></tr><tr><td>Avanti J6-MI</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J6-MI</td><td>Wirówka do dużych objętości (np. 1L)</td></tr><tr><td>Butelki wirówki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1408</td><td>Butelki do odwirowania 1L kultury</td></tr><tr><td>Koraliki kontrolne</td><td>Echelon</td><td>P-B000-1ml</td><td>Odczynnik do chromatografii powinowactwa - kontrola</td></tr><tr><td>Cukier D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>, dodany do PBS w celu utrzymania żywotności komórek</td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610610</td><td>Środek redukujący</td></tr><tr><td>Dynabeads M-270 Streptawidyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65305</td><td>Kulki streptawidyny do wiązania z ligandami biotyny</td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy wolny od EDTA Koktajl</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>Inhibitory proteazy</td></tr><tr><td>Bufor do elektroforezy</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>25 mM Tris, 192 mM glicyna, 0,1% SDS, pH 8,3</td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 15 ml</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430052</td><td>Do odwirowania 10 ml kultur</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>106526</td><td>Kwas</td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td>Aminokwasowa</td></tr><tr><td>pożywka do hodowli komórkowych HMI-9</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ME110145P1</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych T. brucei krwioobiegu</td></tr><tr><td>Imperial Protein Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>24615</td><td>Barwienie Coomassie do wykrywania białek w SDS/PAGE</td></tr><tr><td>Ins(1,4,5)P3 Beads</td><td>Echelon</td><td>Q-B0145-1ml</td><td>Odczynnik do chromatografii powinowactwa&nbsp;</td></tr><tr><td>Natychmiastowy&nbsp; Beztłuszczowe&nbsp; Suchy&nbsp; Milk</td><td>Thomas Scientific</td><td>C837M64</td><td>Odczynnik blokujący do Western blot</td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6125</td><td>Odczynnik alkilujący do białek lub peptydów cysteinowych</td></tr><tr><td>Lab&nbsp; Rotator</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159Z92</td><td>Do oznaczania wiązań</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek LoBind</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-698-793</td><td>Rurki wiążące niskobiałkowe do spektrometrii</td></tr><tr><td>mas Nonidet&nbsp; P-40 (Igepal CA-630)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21-3277</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010031</td><td>Bufor fizjologiczny</td></tr><tr><td>Podłoże peroksydazy do chemiluminescencji</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>32106</td><td>Podłoże do wykrywania białek</td></tr> Western Bloch <tr><td>Inhibitor fosfatazy PhosSTOP Tabletki koktajlowe Fosfataza</td><td>4906845001</td><td></td><td>Roche inhibitory</td></tr><tr><td>PI(3)P Beads</td><td>Echelon</td><td>P-B003a-1ml</td><td>Odczynnik do chromatografii powinowactwa&nbsp;</td></tr><tr><td>PI(3,4)P2 Beads</td><td>Echelon</td><td>P-B034a-1ml</td><td>Odczynnik do chromatografii powinowactwa&nbsp;</td></tr><tr><td>PI(3,4,5)P3 diC8</td><td>Echelon</td><td>P-3908-1mg</td><td>Odczynnik do chromatografii powinowactwa&nbsp;</td></tr><tr><td>PI(3,4,5)P3 Beads</td><td>Echelon</td><td>P-B345a-1ml</td><td>Odczynnik do chromatografii powinowactwa&nbsp;</td></tr><tr><td>PI(3,5)P2 Beads</td><td>Echelon</td><td>P-B035a-1ml</td><td>Odczynnik do chromatografii powinowactwa&nbsp;</td></tr><tr><td>PI(4)P Beads</td><td>Echelon</td><td>P-B004a-1ml</td><td>Odczynnik do chromatografii powinowactwa&nbsp;</td></tr><tr><td>PI(4,5)P2 diC8</td><td>Echelon</td><td>P-4508-1mg</td><td>Odczynnik do chromatografii powinowactwa&nbsp;</td></tr><tr><td>PI(4,5)P2 Beads</td><td>Echelon</td><td>P-B045a-1ml</td><td>Odczynnik do chromatografii powinowactwa&nbsp;</td></tr><tr><td>PI(5)P Beads</td><td>Echelon</td><td>P-B005a-1ml</td><td>Odczynnik do chromatografii powinowactwa&nbsp;</td></tr><tr><td>Ponceau S roztwór</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td>Barwienie białek (0,1% [w/v] w 5% kwasie octowym)</td></tr><tr><td>Heksacyjanożelazian(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>702587</td><td>Sól potasowa&nbsp;</td></tr><tr><td>PtdIns Beads</td><td>Echelon</td><td>P-B001-1ml</td><td>Odczynnik do chromatografii powinowactwa&nbsp;</td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td>do Western blotting&nbsp;</td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem</td><td>Eppendorf</td><td>5910 R</td><td>Mikrowirówka do małych objętości (np. 1,5 ml)</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>862010</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>Tiosiarczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72049</td><td>Chemiczny&nbsp;</td></tr><tr><td>Koncentratory próżniowe SpeedVac</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SPD120-115</td><td>Stężenie próbki (np. do spektrometrii mas)</td></tr><tr><td>Kolby T175 do hodowli komórkowych&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>159910</td><td>Do uprawy 50 ml kultury T. brucei</td></tr><tr><td>Trypsyna, klasa spektrometrii mas</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td>Trypsyna do trawienia białek</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td>Odczynnik denaturujący</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-418</td><td>Do mieszania reakcji</td></tr><tr><td>Bufor transferowy Western blotting</td><td>Bio-Rad</td><td>1610734</td><td>25 mM Tris, 192 mM glicyna, pH 8,3 z 20% metanolem</td></tr><tr><td>Whatman&nbsp; Papier 3 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA3030861</td><td>Papier do transferu Wester</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol (14,2 M)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710</td><td>Środek redukujący</td></tr><tr><td>2x Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td>Bufor ładujący białko</td></tr><tr><td>4&ndash; 20% Mini-PROTEAN&nbsp; TGX Prefabrykowane żele białkowe</td><td>Bio-Rad</td><td>4561094</td><td>Żel do elektroforezy białek</td></tr><tr><td>4x Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0747</td><td>Bufor ładujący białko</td></tr></tbody></table>

identyfikacja białek oddziałujących z fosforanem inozytolu lub fosfoinozytylem za pomocą chromatografii powinowactwa sprzężonej ze spektrometrią western blot lub spektrometrią mas

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Fosforany inozytolu i fosfoinozytydy regulują kilka procesów komórkowych u eukariontów, w tym ekspresję genów, transport pęcherzyków, transdukcję sygnału, metabolizm i rozwój. Metabolity te wykonują tę aktywność regulacyjną poprzez wiązanie się z białkami, zmieniając w ten sposób konformację białka, aktywność katalityczną i/lub interakcje. Opisana tutaj metoda wykorzystuje chromatografię powinowactwa sprzężoną ze spektrometrią mas lub Western blot w celu identyfikacji białek, które oddziałują z fosforanami inozytolu lub fosfoinozytydami. Fosforany inozytolu lub fosfoinozytydy są chemicznie znakowane biotyną, która jest następnie wychwytywana przez streptawidynę sprzężoną z agarozą lub kulkami magnetycznymi. Białka są izolowane przez ich powinowactwo wiązania do metabolitu, a następnie eluowane i identyfikowane za pomocą spektrometrii mas lub Western blot. Metoda ma prosty przepływ pracy, który jest czuły, nieradioaktywny, wolny od liposomów i konfigurowalny, wspierając precyzyjną analizę interakcji białek i metabolitów. Podejście to może być stosowane w metodach ilościowej spektrometrii mas bez znakowania lub znakowanych aminokwasami w celu identyfikacji interakcji białko-metabolit w złożonych próbkach biologicznych lub przy użyciu oczyszczonych białek. Protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem analizy białek z Trypanosoma brucei, ale można go dostosować do pokrewnych pasożytów pierwotniaków, drożdży lub komórek ssaków.

Analiza oddziaływania RAP1 i PI(3,4,5)P3 za pomocą chromatografii powinowactwa i Western blottingu 
Ten przykład ilustruje zastosowanie tej metody do analizy wiązania PI przez RAP1 z lizatu T. brucei lub przez rekombinowane białko RAP1 z T. brucei. W testach wiązania wykorzystano lizaty form krwiobieżnych T. brucei wykazujących ekspresję RAP1 z tagiem hemaglutyniny (HA). RAP1 jest białkiem zaangażowanym w kontrolę transkrypcyjną genów zmiennego glikoproteiny powierzchniowej ...

Ten protokół skupia się na identyfikacji białek, które wiążą się z fosforanami inozytolu lub fosfonozytydami. Wykorzystuje chromatografię powinowactwa z biotynylowanymi fosforanami inozytolu lub fosfoinozytydami, które są unieruchamiane przez streptawidynę do agarozy lub kulek magnetycznych. Fosforan inozytolu lub białka wiążące fosfoinozytol są identyfikowane za pomocą Western blot lub spektrometrii mas.

Identyfikacja białek oddziałujących z fosforanem inozytolu lub fosfoinozytylem za pomocą chromatografii powinowactwa sprzężonej ze spektrometrią Western Blot lub spektrometrią mas

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Fosforan inozytolu i fosfoinozytydy to metabolity, które pełnią kilka funkcji regulacyjnych u eukariontów, w tym kontrolę ekspresji genów, transport białek, transdukcję sygnału i rozwój komórek. Pełnią te funkcje regulacyjne poprzez wiązanie się z białkami, zmieniając w ten sposób konformację białka, aktywność katalityczną lub interakcje białek. Identyfikacja białek, które wiążą się z fosforanem inozytolu lub fosfoinozytydami, jest niezbędna do zrozumienia, w jaki sposób te metabolity pełnią swoją funkcję regulacyjną.Ten protokół ma prosty przepływ pracy, który jest czuły, nieradioaktywny, wolny od liposomów i wykorzystuje odczynniki, które są dostępne na rynku. W tej metodzie do wyizolowania oddziałujących białek stosuje się gotową chromatografię z biotynylowanym fosforanem inozytolu lub fosfoinozytydami, a następnie identyfikuje się je za pomocą western blot lub spektrometrii mas. W przypadku form krwiobiegu hoduj komórki T.brucei do połowy fazy logarytmicznej w pożywce HMI-9, uzupełnionej 10% FBS, w temperaturze 37 stopni Celsjusza, z 5% dwutlenkiem węgla.Utrzymuj gęstość komórek między 800 000 a 1,6 miliona komórek na mililitr. Gdy będą gotowe, odwiruj komórki w temperaturze 1600 razy G i w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić osad w 10 mililitrach PBS-G podgrzanego w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu przepłukania komórek.Odwirować komórki w temperaturze 1600 razy G i w temperaturze pokojowej przez pięć minut, aby zakończyć mycie. Powtórz tę procedurę prania jeszcze dwa razy. Następnie ponownie zawiesić granulki w jednym mililitrze PBS-G.Przenieś tę zawiesinę do jednopunktowej probówki o pojemności pięciu mililitrów, a następnie odwiruj w temperaturze 1600 razy G przez pięć minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w punkcie zerowym pięciu mililitrów buforu do lizy, uzupełnionego jednym koktajlem inhibitorów proteazy X i jednym koktajlem inhibitora fosfatazy X, który został wstępnie schłodzony na lodzie w celu lizy komórek. Odwirować lizat w temperaturze 1400 razy G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.Następnie zebrać supernatant, który zawiera wyekstrahowane białka pasożyta, do nowej jednopunktowej pięciomililitrowej probówki do testów wiązania. Odłóż 5% całkowitego lizatu do analizy western blot. Zbierz 50 mikrolitrów fosforanów inozytolu lub fosfoinozytydów sprzężonych z kulkami agarozy i dodaj do nich 500 mililitrów buforu wiążącego.Wirować przy 1000 razy G przez jedną minutę. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 50 mikrolitrach buforu wiążącego w celu zrównoważenia kulek. Użyj niesprzężonych kulek jako kontroli i użyj kulek o różnych konfiguracjach fosforanowych, w tym form niefosforylowanych, aby kontrolować niespecyficzne interakcje.Następnie dodaj 50 mikrolitrów kulek IP lub PI do lizatu komórkowego lub oczyszczonych białek. Utrzymuj objętość kulek w granicach 10% całkowitego lizatu. W razie potrzeby użyj buforu wiążącego, aby dostosować objętość reakcji wiązania.Inkubuj reakcję przez godzinę lub noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, obracając się z prędkością 50 obr./min. Następnie odwiruj mieszaninę w temperaturze 1000 razy G i w czterech stopniach Celsjusza przez jedną minutę. Usunąć supernatant i zachować osad, upewniając się, że zachowano 5% supernatantu do analizy western blot.Następnie dodaj jeden mililitr buforu myjącego i postukaj lub zakręć rurką, aby ponownie zawiesić żywicę. Odwirować reakcję w temperaturze 1000 razy G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną minutę i wyrzucić supernatant. Powtórz ten proces, w sumie pięć prań.Następnie dodaj 50 mikrolitrów buforu 2X Laemmli uzupełnionego 710 milimolowym 2-merkaptoetanolem do kulek. Dotknij lub odwiruj, aby wymieszać i rozcieńczyć białka. Następnie podgrzewaj w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut i odwiruj w temperaturze 10 000 razy G przez jedną minutę.Zebrać supernatant i albo zamrozić eluat w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, albo przejść do analizy western blot. Przedstawiona tutaj metoda służy do analizy wiązania PI przez białko represorowo-aktywatorowe 1 z lizatu T.brucei lub przez rekombinowane białko represorowo-aktywujące T.brucei białko 1. Ponieważ RAP1 nie ma kanonicznych domen wiążących PI, testy wiązania przeprowadza się z PI, które nie są fosforylowane lub które są fosforylowane w różnych pozycjach pierścienia inozytolu oraz z niesprzężonymi kulkami agarozy.Zachodnia analiza pokazuje, że RAP1 wiąże się preferencyjnie z koralikami PI(3, 4, 5)P3, ale w mniejszym stopniu wiąże się również z koralikami PI(4, 5)P2. Nie wiązał się jednak z żadnymi innymi PI ani kulkami agarozy. Aby sprawdzić, czy RAP1 wiąże się bezpośrednio z PI, rekombinowane białko RAP1 6XHis znakowane końcowo C ulega ekspresji i oczyszcza się do jednorodności z E.Coli.Western blot pokazuje, że zwiększenie stężenia PI(3, 4, 5)P3, ale nie PI(4, 5)P2, hamuje oddziaływanie rekombinowanego RAP1 z kulkami PI(3, 4, 5)P3. Dodanie T.brucei oczyszczonego enzymu PIP5Pase do reakcji przywróciło wiązanie PI(3, 4, 5)P3 przez rekombinowany RAP1. Wynika to z defosforylacji PIP5Pase wolnych PI(3, 4, 5)P3, a zatem wskazuje, że wzorzec fosforylacji tego metabolitu jest niezbędny do naszego wiązania RAP1.Białka T.brucei, które wiążą się z Ins(1, 4, 5)P3, są następnie identyfikowane za pomocą chromatografii powinowactwa, a następnie spektrometrii mas. Analiza SDS-PAGE wykazuje wzbogacenie w białka eluowane z kulek Ins(1, 4, 5)P3 w porównaniu z białkami eluowanymi z kontrolnych kulek agarozy. Analiza spektrometrii mas eluowanych białek zidentyfikowała ponad 250 białek, z których 84 zostały wzbogacone kulkami Ins(1, 4, 5)P3, w porównaniu z kulkami kontrolnymi.Wzbogacenie białek związanych z Ins(1, 4, 5)P3, w porównaniu z kulkami kontrolnymi, koreluje z sygnałem białkowym wykrytym przez SDS-PAGE. Krytycznym krokiem w tym protokole jest użycie odpowiednich kontroli, aby odróżnić specyficzne interakcje od niespecyficznych. Zalecamy stosowanie niesprzężonych kulek agarozy oraz kulek sprzężonych z fosforanem inozytolu lub fosfoinozytydami, przy użyciu różnych konfiguracji fosforanów, w tym form niefosforylowanych.Metodę tę można zastosować do innych jednokomórkowych pasożytów pierwotniaków, takich jak Trypanosoma cruzi, leishmania lub plasmodium. Można go również łatwo przystosować do innych organizmów, w tym komórek drożdży lub ssaków. Metodę tę można połączyć z ilościową spektrometrią mas, taką jak SILAC, w celu identyfikacji dynamicznych oddziaływań białek z fosforanem inozytolu lub fosfoinostydami.In można również łączyć z frakcjonowaniem subkomórkowym, aby zidentyfikować białka specyficzne dla organelli, które wiążą się z tymi metabolitami. Podejście to pomogło zidentyfikować białka, które wiążą się z fosforanem inozytolu i fosfoinozytydami w T. brucei, komórkach ssaków i drożdżach. Pomogło to zidentyfikować nowe domeny białkowe, które wiążą się z fosfoinozytydami.Utorowało to drogę do zrozumienia funkcji regulacyjnej tych metabolitów, ich roli w ekspresji genów, rozwoju komórek i transdukcji sygnału u eukariontów. Niektóre odczynniki w tym protokole są toksyczne lub łatwopalne. Stosować środki ochrony osobistej, a w razie potrzeby pracować pod wyciągiem.

identification-inositol-phosphate-or-phosphoinositide-interacting

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Pirofosforany inozytolu odgrywają istotną rolę w patologiach ludzkich, takich jak nowotwory, cukrzyca i otyłość; jednak dokładny mechanizm ich działania pozostaje kwestią sporną. Brak komercyjnie dostępnych pirofosforanów inozytolu sprawia, że szczegółowe badania są problematyczne. W niniejszej pracy opisujemy prosty protokół produkcji i izolacji miligramowych ilości pirofosforanów inozytolu.

Przygotowanie wysokiej jakości pirofosforanów inozytolu

Fosfoinozydy to lipidy sygnalizacyjne, których względna obfitość szybko zmienia się w odpowiedzi na różne bodźce. W artykule opisano metodę pomiaru obfitości fosfoinozytydów poprzez metaboliczne znakowanie komórek 3 H-mio-inozytolem, a następnie ekstrakcję i deacylację. Wyekstrahowane glicero-inozytydy są następnie rozdzielane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej i oznaczane ilościowo przez scyntylację przepływową.

Znakowanie radioaktywne i oznaczanie ilościowe poziomów komórkowych fosfoinozytydów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z przepływem

PI(4,5)P2 reguluje różne funkcje komórkowe, ale jego nanoskalowa organizacja w błonie komórkowej jest słabo poznana. Znakując PI(4,5)P2 dwukolorową sondą fluorescencyjną połączoną z domeną homologii Pleckstrin, opisujemy nowatorskie podejście do badania rozkładu przestrzennego PI(4,5)P2 w błonie plazmatycznej w skali nanometrowej.

Obrazowanie pojedynczej cząsteczki w superrozdzielczości 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu w błonie plazmatycznej za pomocą nowatorskich sond fluorescencyjnych

Tutaj prezentujemy wspieraną dwuwarstwę lipidową w kontekście platformy mikroprzepływowej do badania interakcji białko-fosfoinozytyd przy użyciu metody bezznacznikowej opartej na modulacji pH.

-on-a-chip: bezznacznikowe badanie interakcji białko-fosfoinozytyd

Celem tego protokołu jest etykietowanie, wzbogacanie i identyfikowanie substratów kinazy białkowej CK2 ze złożonej próbki biologicznej, takiej jak lizat komórkowy lub homogenat tkankowy. W tym celu metoda ta wykorzystuje unikalne aspekty biologii CK2.

Identyfikacja nowych substratów kinazy CK2 przy użyciu wszechstronnego podejścia biochemicznego

Scharakteryzowaliśmy nowe białko kinazy za pomocą solidnych podejść biochemicznych: analiza Western Blot z dedykowanym specyficznym przeciwciałem na różnych liniach komórkowych i tkankach, interakcje za pomocą eksperymentów z koimmunoprecypitacją, aktywność kinazy wykryta przez Western Blot przy użyciu przeciwciała specyficznego dla fosfy oraz znakowanie γ[32P] ATP.

Charakterystyka na poziomie molekularnym przy użyciu solidnych podejść biochemicznych nowego białka kinazy

Opisany jest proces proteomiki do identyfikacji partnerów interakcji białkowych z frakcji subkomórkowej jądrowej za pomocą wzbogacenia immunopowinowactwa danego białka i bezznacznikowej spektrometrii mas. Przepływ pracy obejmuje frakcjonowanie subkomórkowe, immunoprecypitację, przygotowywanie próbek wspomagane filtrem, oczyszczanie offline, spektrometrię mas i dalszy potok bioinformatyczny.

Bezznacznikowa spektrometria mas immunoprecypitacji do profilowania interaktomii jądrowej na dużą skalę

Tutaj opisujemy wysokosprawną chromatografię cieczową z silną wymianą anionów siewek znakowanych [3H]-mio-inozytolem, która jest bardzo czułą metodą wykrywania i ilościowego oznaczania polifosforanów inozytolu w roślinach.

Ekstrakcja i oznaczanie ilościowe rozpuszczalnych, znakowanych radioaktywnie polifosforanów inozytolu z różnych gatunków roślin przy użyciu SAX-HPLC

Opisano procedurę elektroforezy kapilarnej, spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania do bezwzględnego oznaczania ilościowego pirofosforanów inozytolu z ekstraktów komórkowych ssaków.

Bezwzględna ocena ilościowa pirofosforanów inozytolu za pomocą elektroforezy kapilarnej Spektrometria mas z jonizacją elektrorozpylania

Obecny protokół opisuje przygotowanie próbki i analizę danych w celu ilościowego określenia fosforylacji białek za pomocą ulepszonego testu ściągania pojedynczych cząsteczek (SiMPull).

Zoptymalizowany test typu pull-down dla pojedynczych cząsteczek do ilościowego oznaczania fosforylacji białek

Tutaj prezentujemy protokół wzbogacania endogennych fosfataz fosfoproteinowych i ich oddziałujących białek z komórek i tkanek oraz ich identyfikacji i kwantyfikacji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas.

Podejście oparte na spektrometrii mas do identyfikacji fosfataz fosfoproteinowych i ich interaktorów

Poznaj metodę identyfikacji białek oddziałujących z fosforanem inozytolu lub fosfoinozytlem przy użyciu chromatografii powinowactwa. Technika ta wykorzystuje Western blot lub spektrometrię mas do analizy białek izolowanych z komórek T. brucei.

Identyfikacja białek oddziałujących z fosforanem inozytolu lub fosfoinozytylem za pomocą chromatografii powinowactwa sprzężonej ze spektrometrią Western Blot lub spektrometrią mas (Wideo) | JoVE Journal

Identyfikacja białek oddziałujących z fosforanem inozytolu lub fosfoinozytylem za pomocą chromatografii powinowactwa sprzężonej ze spektrometrią Western Blot lub spektrometrią mas

Przeglądaj więcej filmów