Identyfikacja białek oddziałujących z fosforanem inozytolu lub fosfoinozytylem za pomocą chromatografii powinowactwa sprzężonej ze spektrometrią Western Blot lub spektrometrią mas

Fosforan inozytolu i fosfoinozytydy to metabolity, które pełnią kilka funkcji regulacyjnych u eukariontów, w tym kontrolę ekspresji genów, transport białek, transdukcję sygnału i rozwój komórek. Pełnią te funkcje regulacyjne poprzez wiązanie się z białkami, zmieniając w ten sposób konformację białka, aktywność katalityczną lub interakcje białek. Identyfikacja białek, które wiążą się z fosforanem inozytolu lub fosfoinozytydami, jest niezbędna do zrozumienia, w jaki sposób te metabolity pełnią swoją funkcję regulacyjną.

Ten protokół ma prosty przepływ pracy, który jest czuły, nieradioaktywny, wolny od liposomów i wykorzystuje odczynniki, które są dostępne na rynku. W tej metodzie do wyizolowania oddziałujących białek stosuje się gotową chromatografię z biotynylowanym fosforanem inozytolu lub fosfoinozytydami, a następnie identyfikuje się je za pomocą western blot lub spektrometrii mas. W przypadku form krwiobiegu hoduj komórki T.brucei do połowy fazy logarytmicznej w pożywce HMI-9, uzupełnionej 10% FBS, w temperaturze 37 stopni Celsjusza, z 5% dwutlenkiem węgla.

Utrzymuj gęstość komórek między 800 000 a 1,6 miliona komórek na mililitr. Gdy będą gotowe, odwiruj komórki w temperaturze 1600 razy G i w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić osad w 10 mililitrach PBS-G podgrzanego w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu przepłukania komórek.

Odwirować komórki w temperaturze 1600 razy G i w temperaturze pokojowej przez pięć minut, aby zakończyć mycie. Powtórz tę procedurę prania jeszcze dwa razy. Następnie ponownie zawiesić granulki w jednym mililitrze PBS-G.

Przenieś tę zawiesinę do jednopunktowej probówki o pojemności pięciu mililitrów, a następnie odwiruj w temperaturze 1600 razy G przez pięć minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w punkcie zerowym pięciu mililitrów buforu do lizy, uzupełnionego jednym koktajlem inhibitorów proteazy X i jednym koktajlem inhibitora fosfatazy X, który został wstępnie schłodzony na lodzie w celu lizy komórek. Odwirować lizat w temperaturze 1400 razy G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.

Następnie zebrać supernatant, który zawiera wyekstrahowane białka pasożyta, do nowej jednopunktowej pięciomililitrowej probówki do testów wiązania. Odłóż 5% całkowitego lizatu do analizy western blot. Zbierz 50 mikrolitrów fosforanów inozytolu lub fosfoinozytydów sprzężonych z kulkami agarozy i dodaj do nich 500 mililitrów buforu wiążącego.

Wirować przy 1000 razy G przez jedną minutę. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 50 mikrolitrach buforu wiążącego w celu zrównoważenia kulek. Użyj niesprzężonych kulek jako kontroli i użyj kulek o różnych konfiguracjach fosforanowych, w tym form niefosforylowanych, aby kontrolować niespecyficzne interakcje.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów kulek IP lub PI do lizatu komórkowego lub oczyszczonych białek. Utrzymuj objętość kulek w granicach 10% całkowitego lizatu. W razie potrzeby użyj buforu wiążącego, aby dostosować objętość reakcji wiązania.

Inkubuj reakcję przez godzinę lub noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, obracając się z prędkością 50 obr./min. Następnie odwiruj mieszaninę w temperaturze 1000 razy G i w czterech stopniach Celsjusza przez jedną minutę. Usunąć supernatant i zachować osad, upewniając się, że zachowano 5% supernatantu do analizy western blot.

Następnie dodaj jeden mililitr buforu myjącego i postukaj lub zakręć rurką, aby ponownie zawiesić żywicę. Odwirować reakcję w temperaturze 1000 razy G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną minutę i wyrzucić supernatant. Powtórz ten proces, w sumie pięć prań.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów buforu 2X Laemmli uzupełnionego 710 milimolowym 2-merkaptoetanolem do kulek. Dotknij lub odwiruj, aby wymieszać i rozcieńczyć białka. Następnie podgrzewaj w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut i odwiruj w temperaturze 10 000 razy G przez jedną minutę.

Zebrać supernatant i albo zamrozić eluat w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, albo przejść do analizy western blot. Przedstawiona tutaj metoda służy do analizy wiązania PI przez białko represorowo-aktywatorowe 1 z lizatu T.brucei lub przez rekombinowane białko represorowo-aktywujące T.brucei białko 1. Ponieważ RAP1 nie ma kanonicznych domen wiążących PI, testy wiązania przeprowadza się z PI, które nie są fosforylowane lub które są fosforylowane w różnych pozycjach pierścienia inozytolu oraz z niesprzężonymi kulkami agarozy.

Zachodnia analiza pokazuje, że RAP1 wiąże się preferencyjnie z koralikami PI(3, 4, 5)P3, ale w mniejszym stopniu wiąże się również z koralikami PI(4, 5)P2. Nie wiązał się jednak z żadnymi innymi PI ani kulkami agarozy. Aby sprawdzić, czy RAP1 wiąże się bezpośrednio z PI, rekombinowane białko RAP1 6XHis znakowane końcowo C ulega ekspresji i oczyszcza się do jednorodności z E.Coli.

Western blot pokazuje, że zwiększenie stężenia PI(3, 4, 5)P3, ale nie PI(4, 5)P2, hamuje oddziaływanie rekombinowanego RAP1 z kulkami PI(3, 4, 5)P3. Dodanie T.brucei oczyszczonego enzymu PIP5Pase do reakcji przywróciło wiązanie PI(3, 4, 5)P3 przez rekombinowany RAP1. Wynika to z defosforylacji PIP5Pase wolnych PI(3, 4, 5)P3, a zatem wskazuje, że wzorzec fosforylacji tego metabolitu jest niezbędny do naszego wiązania RAP1.

Białka T.brucei, które wiążą się z Ins(1, 4, 5)P3, są następnie identyfikowane za pomocą chromatografii powinowactwa, a następnie spektrometrii mas. Analiza SDS-PAGE wykazuje wzbogacenie w białka eluowane z kulek Ins(1, 4, 5)P3 w porównaniu z białkami eluowanymi z kontrolnych kulek agarozy. Analiza spektrometrii mas eluowanych białek zidentyfikowała ponad 250 białek, z których 84 zostały wzbogacone kulkami Ins(1, 4, 5)P3, w porównaniu z kulkami kontrolnymi.

Wzbogacenie białek związanych z Ins(1, 4, 5)P3, w porównaniu z kulkami kontrolnymi, koreluje z sygnałem białkowym wykrytym przez SDS-PAGE. Krytycznym krokiem w tym protokole jest użycie odpowiednich kontroli, aby odróżnić specyficzne interakcje od niespecyficznych. Zalecamy stosowanie niesprzężonych kulek agarozy oraz kulek sprzężonych z fosforanem inozytolu lub fosfoinozytydami, przy użyciu różnych konfiguracji fosforanów, w tym form niefosforylowanych.

Metodę tę można zastosować do innych jednokomórkowych pasożytów pierwotniaków, takich jak Trypanosoma cruzi, leishmania lub plasmodium. Można go również łatwo przystosować do innych organizmów, w tym komórek drożdży lub ssaków. Metodę tę można połączyć z ilościową spektrometrią mas, taką jak SILAC, w celu identyfikacji dynamicznych oddziaływań białek z fosforanem inozytolu lub fosfoinostydami.

In można również łączyć z frakcjonowaniem subkomórkowym, aby zidentyfikować białka specyficzne dla organelli, które wiążą się z tymi metabolitami. Podejście to pomogło zidentyfikować białka, które wiążą się z fosforanem inozytolu i fosfoinozytydami w T. brucei, komórkach ssaków i drożdżach. Pomogło to zidentyfikować nowe domeny białkowe, które wiążą się z fosfoinozytydami.

Utorowało to drogę do zrozumienia funkcji regulacyjnej tych metabolitów, ich roli w ekspresji genów, rozwoju komórek i transdukcji sygnału u eukariontów. Niektóre odczynniki w tym protokole są toksyczne lub łatwopalne. Stosować środki ochrony osobistej, a w razie potrzeby pracować pod wyciągiem.