Name: Rekonstytucja rekombinowanej Drosophila Atlastin w liposomach wspomagana detergentami do testów mieszających lipidy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Poznaj metodę rekonstytucji białka atlastin z Drosophila w liposomy przy użyciu detergentów i test mieszający lipidy oparty na FRET. Technika ta umożliwia badanie fuzji błon komórkowych bez konieczności stosowania barwników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Michaelowi Sternowi i jego laboratorium za ich spostrzeżenia i opinie na temat projektów związanych z atlastyną. Prace te były wspierane przez Narodowy Instytut Ogólnych Nauk Medycznych [R01GM101377] oraz Narodowy Instytut Zaburzeń Neurologicznych i Udaru Mózgu [R01NS102676].

1. Oczyszczanie białka GST-DAtl-His8
<ol>
	<li>Ekspresja białka i przygotowanie lizatu
	<ol>
		<li>Przekształć szczep BL21 (DE3) E. coli konstruktem GST-DAtl-His8 w wektorze pGEX4-T32 i wyselekcjonuj kolonie na płytce z ampicyliną.</li>
		<li>Wybierz pojedynczy transformant i zaszczep 5 mL LB + ampicylina (5 µL ampicyliny 100 mg/mL) w probówce do hodowli o pojemności 14 mL, a następnie inkubuj w temperaturze 25 °C przy wytrząsaniu z prędkością 200 rpm przez 6-8 h. 
		UWAGA: Ze względu na nieszczelną ekspresję (leaky expression) nie zaleca się inkubacji w wyższych temperaturach. Wzrost w temperaturze 25 °C ogranicza agregację białka w tym okresie wzrostu.</li>
		<li>Zaszczep 200 mL LB + ampicylina za pomocą 1 mL hodowli wstępnej (5 mL) i inkubuj przez noc (~15–18 h) w temperaturze 25 °C.</li>
		<li>Następnego dnia rano zbierz komórki przez wirowanie (2,000 x g przez 10 min) i resuspenduj w 5 mL LB.</li>
		<li>Zaszczep 4 L LB + ampicylina i zmierz OD600 (0.05–0.15). Inkubuj w temperaturze 25 °C z wytrząsaniem. 
		UWAGA: Odstaw niewielką ilość pożywki do wykorzystania jako wzorca (blank) podczas pomiarów OD600 przed dodaniem bakterii.</li>
		<li>Mierz OD600 co godzinę, aż osiągnie wartość w zakresie 0.4–0.5. W tym momencie obniż temperaturę do 16 °C.</li>
		<li>Indukuj ekspresję za pomocą 0.2 mM IPTG (800 µL roztworu stokowego 1 M), 10 min po tym, jak inkubator osiągnie 16 °C. Inkubuj przez noc (~15–18 h) w temperaturze 16 °C. 
		UWAGA: Niższa temperatura zwiększa wydajność funkcjonalnego białka poprzez ograniczenie agregacji atlastyny.</li>
		<li>Następnego dnia rano zbierz komórki przez wirowanie przy 7,500 x g w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Resuspenduj komórki w 200 mL buforu A200 (25 mM HEPES (pH 7.4) i 200 mM KCl).</li>
		<li>Wiruj komórki przy 11,000 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Resuspenduj osad w 40 mL buforu do lizy (A200 plus 10% glicerolu, 2 mM 2-merkaptoetanolu, 4% Triton X-100 (TX100), 40 mM imidazolu oraz jednej tabletki koktajlu inhibitorów proteaz bez EDTA). 
		UWAGA: Dodaj TX-100 po resuspensji, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza i piany.</li>
		<li>Przepuść zawiesinę przez igłę 18 G, a następnie trzykrotnie przepuść komórki przez homogenizator wysokociśnieniowy przy ciśnieniu ~10,000 psi.</li>
		<li>Wiruj ekstrakt przy 125,000 x g przez 1 h. 
		UWAGA: Opcjonalnie rozpuść osad w stosunku 1:2 (w:v) w 8 M mocznika i inkubuj na rotatorze w temperaturze pokojowej przez noc. Mocznik jako denaturant powoli rozpuści wszelkie nierozpuszczalne białka w osadzie do analizy SDS-PAGE. Odstaw 1 μL do analizy SDS-PAGE i barwienia Coomassie.</li>
		<li>Przefiltruj ekstrakt przez sterylną membranę z azotanu celulozy o porach 0.45 µm, aby usunąć bakterie i duże fragmenty komórkowe. 
		UWAGA: Opcjonalnie odstaw 1 μL do analizy SDS-PAGE i barwienia Coomassie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie białka za pomocą chromatografii powinowactwa
	<ol>
		<li>Nałóż przefiltrowany lizat na kolumnę z żywicą do chromatografii powinowactwa do jonów metali (IMAC) naładowaną Ni2+, uprzednio ekwilibrowaną buforem z niską zawartością imidazolu (A100 plus 10% glicerolu, 2 mM 2-merkaptoetanolu, 1% TX-100, 40 mM imidazolu) z prędkością 1 mL/min w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przemyj kolumnę 25 mL buforu A100 plus 10% glicerolu, 2 mM 2-merkaptoetanolu, 0.1% Anapoe X-100, 40 mM imidazolu z prędkością 1 mL/min w temperaturze 4 °C. Eluuj białko gradientem liniowym imidazolu od 40 mM do 500 mM w objętości 30 mL, a następnie wykonaj końcowe przemywanie 5 mL buforu 500 mM.</li>
		<li>Połącz frakcje szczytowe i inkubuj przez 1 h w temperaturze 4 °C z napęczniałymi ziarnami GSH-Agarose, uprzednio napęcznianymi w wodzie i ekwilibrowanymi w buforze A100 z 10% glicerolem, 2 mM 2-merkaptoetanolem, 0.1% Anapoe X-100 i 1 mM EDTA. 
		UWAGA: Ziarna GSH-Agarose można napęcznieć w 50 mL wody dzień wcześniej i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 1 h w temperaturze pokojowej. Aby usunąć wodę i bufor ekwilibrujący, wiruj w rotorze z koszyczkami wahadłowymi przy 500 x g przez 1 min bez hamowania. Odessij nadsącz za pomocą igły 26 G.</li>
		<li>Zwiruj ziarna GSH-Agarose w rotorze z koszyczkami wahadłowymi przy 500 x g bez hamowania i usuń nadsącz lizatu poprzez aspirację igłą 26 G.</li>
		<li>Przenieś ziarna do kolumny polyprep 10 mL i przemyj pięciokrotnie 5 mL buforu ekwilibrującego (A100 z 10% glicerolem, 2 mM 2-merkaptoetanolem, 0.1% Anapoe X-100 i 1 mM EDTA), wirując przy 500 x g.</li>
		<li>Eluuj białko za pomocą 1–1.5 mL buforu ekwilibrującego uzupełnionego o 10 mM zredukowanego glutationu. Rozdziel eluat na alikwoty i zamroź gwałtownie w ciekłym azocie. Białko można przechowywać w temperaturze -80 °C w nieokreślonym czasie. 
		UWAGA: Dostosuj pH buforu elucyjnego do 7.4.</li>
		<li>Oznacz stężenie białka za pomocą testu amido black9 i oceń czystość za pomocą SDS-PAGE i barwienia Coomassie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Rekonstytucja rekombinowanej atlastyny w liposomach
<ol>
	<li>Produkcja liposomów metodą ekstruzji10
	<ol>
		<li>Przygotować zapasy mieszanin lipidowych w chloroformie (całkowite stężenie lipidów 10 mM). Wymagane lipidy to 1-palmitoylo-2-oleoylo-glycero-3-fosfocholina (POPC), 1,2-dioleoylo-sn-glycero-3-fosfo-L-seryna (DOPS), 1,2-dioleoylo-sn-glycero-3-fosfoetanoloamina-N-(7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-ylo) (NBD-DPPE) oraz 1,2-dipalmitoylo-sn-glycero-3-fosfoetanoloamina-N-(lisamina rodamina B sulfonyl) (Rh-DPPE). Liposomy akceptorowe składają się z POPC:DOPS (stosunek molowy 85:15), a liposomy donorowe z POPC:DOPS:Rh-PE:NBD-PE (stosunek molowy 83:15:1,5:1,5). 
		UWAGA: Choć mieszaniny lipidowe POPC:DOPS są tradycyjnie stosowane w testach mieszania lipidów in vitro, dla różnych celów eksperymentalnych można zastosować alternatywne składy lipidowe. Liposomy POPC:DOPS są bardzo stabilne i trudniej ulegają fuzji, stanowiąc zatem bardzo rygorystyczny system do badań fuzji.</li>
		<li>Do mieszanin lipidowych dodać 1 μCi/mL L-α-dipalmitoylo-fosfatydylocholiny (cholina metyl-3H) w celu późniejszego oznaczenia stężeń lipidów za pomocą cieczscyntylacyjnego licznika. Odłożyć co najmniej 8 μL tego zapasu.</li>
		<li>Przenieść odpowiednią ilość mieszanin lipidowych do probówek ze szkła kwarcowego.</li>
		<li>Osuszyć mieszaniny lipidowe pod delikatnym strumieniem gazu N2 przez ok. 10 min, aż chloroform przestanie być widoczny.</li>
		<li>Dalej suszyć film lipidowy w deskrykatorze pod próżnią przez 30 min.</li>
		<li>Dodać do filmu lipidowego odpowiednią ilość roztworu wodnego A100 z 10% glicerolem, 2 mM 2-merkaptoetanolem i 1 mM EDTA, aby przywrócić stężenie do poziomu 10 mM. Resuspendować film lipidowy, lekko mieszając w wstrząsarze Vortex przez 15 min w temperaturze pokojowej. Zaleca się użycie wstrząsara Vortex przystosowanego do probówek ze szkła kwarcowego.</li>
		<li>Poddać uwodnione lipidy dziesięciokrotnemu cyklowi zamrażania i rozmrażania w ciekłym azocie. Po zamrożeniu w ciekłym azocie rozmrozić liposomy, pozostawiając roztwór w temperaturze pokojowej na 30 s, a następnie przenieść do wody w celu przyspieszenia rozmrażania. Cykle zamrażania i rozmrażania zminimalizują obecność pęcherzyków wielowarstwowych. 
		OSTROŻNIE: Probówki mogą pęknąć, jeśli zawierają objętość większą niż 0,5 mL i zostaną przeniesione bezpośrednio z ciekłego azotu do wody.</li>
		<li>Przepuścić lipidy 19 razy przez filtry z poliwęglanu o rozmiarze porów 100 nm, używając mini-ekstrudera.</li>
		<li>Oznaczanie całkowitego stężenia lipidów w liposomach za pomocą licznika scyntylacyjnego 
		UWAGA: Część lipidów może pozostać w probówkach szklanych i w mini-ekstruderze.
		<ol>
			<li>Dodać 4 μL zapasu lipidów oraz liposomów do 3 mL koktajlu scyntylacyjnego.</li>
			<li>Zmierzyć średnią liczbę zliczeń na minutę (CPMA) dla zapasu i liposomów. Następnie obliczyć stężenie liposomów według następującego wzoru: <img alt="Wzór na stężenie liposomów, stosunek CPMA; naukowa metoda obliczeniowa, równanie chemiczne." src="/files/ftp_upload/59867/59867equ01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"></li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przechowywać liposomy w temperaturze 4 °C do tygodnia. Dłuższe przechowywanie nie jest zalecane, ponieważ liposomy mogą z czasem ulegać agregacji, co obniża wydajność rekonstytucji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rekonstytucja poprzez wbudowywanie wspomagane detergentem do preformowanych liposomów
	<ol>
		<li>Obliczyć ilość buforu, białka, liposomów i dodatkowego detergentu do zmieszania:
		<ol>
			<li>Ustalić pożądaną objętość całkowitą. Objętość ta składa się z buforu A100 z 10% glicerolem, 2 mM 2-merkaptoetanolem i 1 mM EDTA. Objętości mniejsze niż 250 μL nie mieszają się dobrze w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL.</li>
			<li>Obliczyć objętość liposomów potrzebną do uzyskania końcowego stężenia lipidów na poziomie ok. 1 mM. Odejmować tę objętość od objętości buforu.</li>
			<li>Obliczyć objętość białka potrzebną do uzyskania pożądanego stosunku molowego białka do lipidów (zazwyczaj 1:400). Odpowiednio zmniejszyć objętość buforu.</li>
			<li>Ustalić, ile dodatkowego detergentu należy dodać w celu nasycenia liposomów, dążąc do efektywnego stosunku detergentu do lipidów (Reff) w zakresie 0,64–0,8. Należy pamiętać o detergencie dodawanym wraz z białkiem. Wartość (Reff) określa równanie <img alt="Wzór na efektywny współczynnik załamania, \(R_{\text{eff}} = \frac{{D_{\text{total}} - D_{\text{water}}}}{[\text{lipid}]}\)." src="/files/ftp_upload/59867/59867equ02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 2">, gdzie Dtotal to całkowite stężenie detergentu, a Dwater to stężenie monomeru detergentu (0,18 mM dla TX-100 i Anapoe X-100 w obecności detergentu)4,11.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zmieszać roztwory w probówce 0,5 mL w następującej kolejności: bufor, detergent, białko i liposomy. Dodać liposomy szybko i natychmiast zmieszać w wstrząsarze Vortex przez 5 s, aby uhomogenizować mieszaninę.</li>
		<li>Inkubować reakcję w nutatorze przez 1 h w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować „zawiesinę” niepolarnych kulek adsorbentu polistyrenowego o stężeniu 0,2 g/mL w wodzie. 
		UWAGA: „Zawiesinę” kulek adsorbentu polistyrenowego należy przygotować podczas poprzedniej 1-godzinnej inkubacji w kroku 2.2.3.</li>
		<li>Odważyć 0,2 g kulek adsorbentu polistyrenowego i przenieść je do probówki do mikrocentryfugi.</li>
		<li>Odgazować kulki, dodając do probówki 1 mL metanolu i mieszając przez 1 min. Odgazowane kulki opadną na dno.</li>
		<li>Odssać metanol i dodać do kulek wodę. Pozostawić kulki do wymieszania z wodą przez 5 min, a następnie odessać wodę. Powtórzyć czynność cztery razy, a następnie uzupełnić „zawiesinę” kulek adsorbentu polistyrenowego wodą do objętości 1 mL, aby uzyskać końcowe stężenie 0,2 g/mL. 
		UWAGA: Kulki powinny nadal opadać na dno probówki. Jeśli tak się nie dzieje, odgazować ponownie. Do odsysania metanolu i wody z kulek używać igły 21 G lub większej.</li>
		<li>Obliczyć ilość kulek adsorbentu polistyrenowego potrzebną do zaabsorbowania całego detergentu w każdej próbce. 1 g kulek adsorbentu polistyrenowego absorbuje 70 mg TX-100. Aby obliczyć objętość zawiesiny kulek adsorbentu polistyrenowego potrzebną do każdej reakcji, podzielić całkowitą ilość detergentu w reakcji (krok 2.2.1.4) przez 70 mg, a następnie przez stężenie zawiesiny kulek (0,2 g/mL (krok 2.2.7).</li>
		<li>Przenieść obliczoną ilość zawiesiny kulek adsorbentu polistyrenowego do probówki 0,5 mL i odessać wodę. 
		UWAGA: Aby przenieść kulki, należy odciąć koniec końcówki 20–200 µL; probówkę należy zawirrować w wstrząsarze Vortex tuż przed pipetowaniem, aby resuspendować osadłe kulki.</li>
		<li>Dodać próbki do probówki 0,5 mL zawierającej kulki adsorbentu polistyrenowego i inkubować próbkę w nutatorze przez 1 h w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Powtórzyć czynność dwukrotnie, pozostawiając stare kulki i przenosząc próbkę do świeżych kulek.</li>
		<li>Przenieść próbkę do czwartej probówki ze świeżymi kulkami i inkubować przez noc (~15–18 h) w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rano oddzielić próbkę od kulek adsorbentu polistyrenowego i odwirować nierozpuszczalne agregaty białkowe, wirując przez 10 min przy 16 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zebrać nadsącz i oznaczyć końcowe stężenie lipidów za pomocą cieczscyntylacyjnego licznika (patrz krok 2.1.9.2). Opcjonalnie stężenie białka można oznaczyć za pomocą testu białek Amido Black9. 
	UWAGA: W przypadku proteoliposomów atlastyny testy enzymatyczne należy przeprowadzać na świeżych liposomach. Długie przechowywanie w temperaturze 4 °C lub zamrażanie prowadzi do znacznemu spadku aktywności atlastyny.</li>
</ol>
3. Testy mieszania lipidów
<ol>
	<li>Doprowadzić proteoliposomy donora i akceptora do stężenia 0,15 mM każdego w buforze A100 z 10% glicerolem, 2 mM β-merkaptoetanolem, 1 mM EDTA i 5 mM MgCl2. Każdą reakcję (50 μL) należy dodać do dołka płaskiej, białej płytki 96-dołkowej odpowiedniej do pomiarów fluorescencji. Przygotować co najmniej 4 reakcje, w tym próbę potrójną oraz negatywną kontrolę bez GTP.</li>
	<li>Umieścić płytkę w wstępnie podgrzanym czytniku płytek w temperaturze 37 °C. Pomiar fluorescencji NBD (wzbudzenie 460 nm i emisja 535 nm) prowadzić przez 5 min w odstępach jednominutowych.</li>
	<li>Indukować fuzję poprzez dodanie 5 mM GTP (5 μL roztworu 50 mM GTP).</li>
	<li>Pomiar fluorescencji NBD prowadzić co minutę przez 1 h.</li>
	<li>Dodać 5 μL 2,5% w/v n-dodecyl-β-D-maltosidu w celu rozpuszczenia proteoliposomów i zmierzyć maksymalną fluorescencję NBD. Pomiar fluorescencji NBD prowadzić przez 15 min w odstępach jednominutowych.</li>
</ol>
4. Flotacja liposomów w nieciągłym gradiencie Iohexolu12
<ol>
	<li>(opcjonalnie) Przeanalizować wydajność rekonstytucji za pomocą testów flotacyjnych13.</li>
	<li>Przygotować 80% i 30% (w/v) roztwór iohexolu w buforze A100 z dodatkiem 10% glicerolu, 2 mM 2-merkaptoetanolu i 1 mM EDTA. Iohexol nie rozpuszcza się łatwo, dlatego roztwór ten należy przygotować dzień wcześniej, inkubując go przez noc w mieszalniku nutacyjnym w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dokładnie zmieszać 150 μL 80% roztworu iohexolu z 150 μL próbki proteoliposomów, aby uzyskać stężenie 40% iohexolu. Przenieść mieszaninę do probówki Ultra-clear o wymiarach 5 x 41 mm2, unikając powstawania pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Powoli nanieść 250 μL 30% roztworu iohexolu na wierzch próbki, tworząc warstwę środkową. Należy unikać powstawania pęcherzyków i zaburzania warstwy dolnej. Na warstwę środkową powoli dodać 50 μL buforu A100 z 2 mM 2-merkaptoetanolem i 1 mM EDTA.</li>
	<li>Wirować gradient w rotorze z kątowo-ruchomymi koszykami przy 220,000 x g przez 4 h w temperaturze 4 °C, stosując powolne przyspieszanie i wyłączając hamowanie.</li>
	<li> Zebrać warstwy gradientu i przeanalizować je za pomocą SDS-PAGE oraz barwienia Coomassie; kwantyfikację można przeprowadzić metodą densytometrii. Rekonstytuowane białko powinno wypłynąć do górnej warstwy, natomiast agregaty białkowo-lipidowe osadzą się na dnie lub w warstwie środkowej.</li>
</ol>
5. Analiza orientacji zrekonstytuowanego białka za pomocą proteolizy trombiną
UWAGA: Opisany tutaj konstrukt atlastyny posiada miejsce cięcia trombiną pomiędzy końcem N-końcowego znacznika GST a początkiem atlastyny. Atlastyna w prawidłowej orientacji będzie miała to miejsce cięcia dostępne dla proteazy, natomiast białko w błędnej orientacji będzie chronione przez dwuwarstwę lipidową.
<ol>
	<li>Aby ocenić orientację proteoliposomów atlastyny, należy odłożyć co najmniej 8 μL świeżo zrekonstytuowanych proteoliposomów.</li>
	<li>Dodać 8 μL proteoliposomów oraz 1 μL trombiny w stężeniu 1 U/μL. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 h.</li>
	<li>Zneutralizować proteazę, dodając 1 μL koktajlu inhibitorów proteaz bez EDTA w stężeniu 5 mg/mL, a następnie inkubować przez 30 min w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Próbkę analizować za pomocą SDS-PAGE i barwienia Coomassie. Proporcję białka pociętego i niepociętego można wyznaczyć za pomocą densytometrii.</li>
</ol>

<ol><li>Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanics of membrane fusion.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).</li>
<li>Orso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homotypic+fusion+of+ER+membranes+requires+the+dynamin-like+GTPase+Atlastin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin.</a> Nature. 460, 978-983 (2009).</li>
<li>McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP-dependent+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">GTP-dependent membrane fusion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 529-550 (2013).</li>
<li>Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%3A+application+to+energy-transducing+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).</li>
<li>Düzgüneş, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Assays+for+Liposome+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Assays for Liposome Fusion.</a> Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).</li>
<li>Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mechanism+of+membrane+fusion%3A+kinetics+of+calcium+ion+induced+fusion+of+phosphatidylserine+vesicles+followed+by+a+new+assay+for+mixing+of+aqueous+vesicle+contents%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents.</a> Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).</li>
<li>Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton-+and+calcium-induced+fusion+and+destabilization+of+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes.</a> Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).</li>
<li>Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+inner+monolayer+fusion+assays+reveal+differential+monolayer+mixing+associated+with+cation-dependent+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).</li>
<li>Schaffner, W., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+sensitive%2C+and+specific+method+for+the+determination+of+protein+in+dilute+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution.</a> Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).</li>
<li>MacDonald, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-volume+extrusion+apparatus+for+preparation+of+large%2C+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).</li>
<li>Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+membrane+protein+insertion+into+liposomes+during+reconstitution+procedures+involving+the+use+of+detergents.+1.+Solubilization+of+large+unilamellar+liposomes+%28prepared+by+reverse-phase+evaporation%29+by+Triton+X-100%2C+octyl+glucoside%2C+and+sodium+cholate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate.</a> Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).</li>
<li>Scott, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+Fusion+Assay+to+Monitor+Intracellular+Membrane+Fusion+Machines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines.</a> Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+an+orthomyxovirus+matrix+protein+reveals+mechanisms+for+self-polymerization+and+membrane+association%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association.</a> PNAS. 114, 8550-8555 (2017).</li>
<li>Parlati, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+fusion+of+phospholipid+vesicles+by+the+%CE%B1-helical+core+of+a+SNARE+complex+in+the+absence+of+an+N-terminal+regulatory+domain%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the α-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain.</a> PNAS. 96, 12565-12570 (1999).</li>
<li>Sugiura, S., Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+lipid+composition+is+vital+for+homotypic+ER+membrane+fusion+mediated+by+the+dynamin-related+GTPase+Sey1p%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p.</a> Scientific Reports. 6, 20407(2016).</li>
<li>Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+tubular+endoplasmic+reticulum+network+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components.</a> Nature. 543, 257-260 (2017).</li>
<li>Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atlastin+membrane+anchor+forms+an+intramembrane+hairpin+that+does+not+span+the+phospholipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer.</a> Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawione tu metody określają skuteczną metodę oczyszczania, odtwarzania i pomiaru aktywności fuzji rekombinowanej atlastyny. Aby zapewnić wysokie plony funkcjonalnego atlastinu, należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych kroków. Ekspresja atlastyny musi odbywać się w niskich temperaturach (16 °C), aby uniknąć agregacji i należy dążyć do uzyskania końcowego stężenia między 0,4–1,5 mg/ml. Bardzo rozcieńczone białko nie zostanie optymalnie odtworzone w stosunku białka do lipidów wynoszącym 1:400. Skuteczność rekonstytucj...

Fuzja membranowa jest krytycznym procesem w wielu reakcjach biologicznych. W warunkach biologicznych fuzja błonowa nie jest spontaniczna i wymaga wyspecjalizowanych białek fuzyjnych do katalizowania takich reakcji1. Homotypowa fuzja błonowa ER jest pośredniczona u zwierząt przez atlastynę GTPazy związanej z dynaminą2. Rola Atlastyny w fuzji homotypowej ma fundamentalne znaczenie dla połączeń trójdrożnych w obwodowym ER, które stanowią dużą, wzajemnie połączoną sieć kanalików rozciągających się w całej komórce. Atlastyny mają zachowaną morfologię domeny składającą się z dużej GTPazy, środkowej domeny z trzema wiązkami helis, hydrofobowej kotwicy błonowej i krótkiego cytoplazmatycznego C-końcowego ogona3. Badania in vitro z rekombinowaną atlastyną Drosophila wykazały, że po rozpuszczeniu do liposomów zachowuje swoje właściwości fuzogenne. Inne atlastyny, w tym ludzkie homologi, nie były w stanie podsumować fuzji in vitro. Opisujemy tutaj metodologię oczyszczania rekombinowanej atlastyny Drosophila znakowanej GST i polihistydyną, odtwarzania jej do liposomów i oznaczania fuzji.
Badanie fuzji błonowej in vitro stanowi wyzwanie, ponieważ białka fuzogeniczne zazwyczaj mają kotwicę błonową. W celu ich zbadania konieczne jest odtworzenie ich do modelowych dwuwarstw lipidowych. Duże pęcherzyki jednowarstwowe (LUV) są użytecznym narzędziem do badania interakcji białek lipidowych. Przedstawiamy tutaj system do wytwarzania LUV o różnym składzie lipidowym do testów rekonstytucji białek i fuzji. Rekonstytucja integralnych białek w LUV może być osiągnięta za pomocą różnych metod, w tym rekonstytucji za pośrednictwem rozpuszczalnika organicznego, mechanizmów mechanicznych lub rekonstytucji wspomaganej detergentem4. Przedstawiamy tutaj metodę rekonstytucji atlastyny Drosophila do wstępnie uformowanych liposomów poprzez usunięcie detergentem. Zaletą tej metody rekonstytucji jest wysoka wydajność rekonstytucji i prawidłowa orientacja atlastyny w dwuwarstwie lipidowej. Dodatkowo, dzięki tej metodzie, białko nie jest suszone ani wystawiane na działanie rozpuszczalników organicznych, dzięki czemu zachowuje strukturę i funkcję. Jedną z jego wad jest obecność detergentów może nie być idealna dla wszystkich białek, a końcowe proteoliposomy mogą mieć pewien detergent wbudowany w dwuwarstwę lipidową. Można zastosować dalszą dializę w celu wyeliminowania większej ilości detergentu. Jednak dializa może trwać długo i dlatego może prowadzić do utraty aktywności białka.
Ocena aktywności fuzji atlastyny może być określona za pomocą testów mieszania lipidów, jak opisano wcześniej2. W tym miejscu przedstawiamy metodę pomiaru fuzji za pośrednictwem atlastyny przez lipidy znakowane N-(7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazolo-4-ylem (NBD)/lizzaminą rodaminę-B sulfonyl (rodamina). Ten test wymaga fuzji proteoliposomów donorowych (znakowanych) i proteoliposomów akceptorowych (nieznakowanych). Uwalnianie FRET można zmierzyć podczas reakcji jako rozcieńczenie pary donor-akceptor z "znakowanych" liposomów do "nieznakowanych" liposomów w wyniku mieszania lipidów podczas fuzji błonowej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1)5. Chociaż test ten służy jako wskaźnik zastępczy dla fuzji błonowej, jest ograniczony w rozróżnianiu między fuzją błonową a hemifuzją, stanem, w którym mieszają się tylko zewnętrzne płatki. Aby rozwiązać ten problem, alternatywą jest zewnętrzne wygaszanie NBD za pomocą ditionitu. Zgodnie z tą samą metodologią, co w przypadku testów mieszania lipidów NBD/rodaminy, po wygaszeniu zewnętrznej ulotki wszelkie uwolnienie NBD FRET przez fuzję będzie spowodowane mieszaniem wewnętrznej ulotki8.
Alternatywne testy fuzji za pomocą wewnętrznego mieszania zawartości wodnej tylko pełne połączenie 5. Przykładami tego są testy terbu (Tb)/kwasu dipikolinowego (DPA) i testy kwasu aminonaftalenotrisulfonowego (ANTS)/bromku p-ksylenu bis(pirydyny) (DPX). W testach Tb / DPA pula liposomów z enkapsulowaną Tb jest mieszana i łączona z liposomami z enkapsulowanym DPA; po fuzji fluorescencja jest zwiększana poprzez wewnętrzny transfer energii z DPA do Tb w [Tb(DPA)3]3- kompleksie chelatacyjnym6. W przeciwieństwie do tego, w przypadku testów ANTS/DPX, fluorescencja ANTS jest wygaszana przez DPX7. Podczas gdy systemy te zajmują się mieszaniem zawartości wewnętrznej, wymagane jest bardziej dogłębne przygotowanie liposomów w celu usunięcia niekapsułkowanych odczynników, a także niezamierzonej interakcji fluoroforów.

<table><tbody><tr><td>Kolumny chromatograficzne poli-prep 10 ml Biored</td><td></td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>10 mm x 75 mm Rurki ze szkła krzemiennego</td><td>VWR</td><td>608225-402</td><td></td></tr><tr><td>Średnica 47 mm, 0,45 &mu; m pore Whatman sterylne filtry membranowe</td><td>Whatman</td><td>7141 104</td><td></td></tr><tr><td>96 well biała płytka</td><td>NUNC</td><td>437796</td><td></td></tr><tr><td>Anapoe X-100</td><td>Anatrace</td><td>9002-931-1</td><td></td></tr><tr><td>Zakłócacz rozwoju komórek</td><td>Avestin</td><td>Avestin Emulsiflex C3</td><td></td></tr><tr><td>DOPS (1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-phospho-L-seryna (sól sodowa))</td><td>Avanti</td><td>840035P-10mg</td><td>DOPS</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Research organics inc.</td><td>6381-92-6</td><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td></tr><tr><td>koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Kompletny inhibitor proteazy</td></tr><tr><td>Wytłaczarka</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z373400&nbsp;</td><td>Podstawowa wytłaczarka Liposofast</td></tr><tr><td>System chromatografii cieczowej GE Akta Prime</td><td>GE Pharmacia</td><td>8149-30-0006</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki agarozy glutationowej</td><td>Sigma aldrich</td><td>G4510-50ml</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>EMD</td><td>GX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>36051-31-7</td><td>Hydrat soli sodowej 5' trifosforanu guanozyny</td></tr><tr><td>HEPES, bezkwasowy</td><td>Omnipur</td><td>5330</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>fluka</td><td>5670</td><td></td></tr><tr><td>Immobilizowana chromatografia powinowactwa do metalu (IMAC) kolumna żywiczna</td><td>GE Healthcare</td><td>17040801</td><td>1 mL HiTrap Chelating HP Kolumny do chromatografii immobilizowanej powinowactwa do metali</td></tr><tr><td>Iohexol</td><td>Dokładna korporacja chemiczna i naukowa</td><td>AN 7050 BLK</td><td>Accudenz/Nycodenz</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Research products international corp.</td><td>I56000-100.0</td><td>IPTG, L-glutation bez dioksanu</td></tr><tr><td>zredukowany</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251-5g</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Fisher</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Omnisolv</td><td>MX0488-1</td><td></td></tr><tr><td>NBD-DPPE (1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-(7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-ylo) (sól amonowa))</td><td>Avanti</td><td>236495</td><td>NBD-DPPE</td></tr><tr><td>n-Dodecyl &beta;-D-maltozyd</td><td>Chem-Impex International</td><td>21950</td><td></td></tr><tr><td>Niepolarne kulki adsorbentowe z polistyrenu</td><td>BioRad</td><td>152-3920</td><td>SM2 Biokoraliki</td></tr><tr><td>Nuclepore track-etch poliwęglan 19 mm 0,1 &mu; m membrana porowa</td><td>Whatman</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>Optima LE80K Ultra wirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfatydylocholina, L-&alfa;-dipalmitoilo [cholina metylo-3H]</td><td>ARC</td><td>ART0284</td><td>Lipidy miareczkowane</td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td></td><td>TECAN TECAN infinite M200</td><td></td></tr><tr><td>POPC (1-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfocholina)</td><td>Avanti</td><td>850457C-25mg</td><td>POPC</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>MP</td><td>151944</td><td></td></tr><tr><td>Rh-DPPE (1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-(lisamina rodamina B sulfonyl) (sól amonowa))</td><td>Avanti</td><td>236495</td><td>Rh-DPPE</td></tr><tr><td>Koktajl scyntylacyjny</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-272</td><td>Ecoscint XR Roztwór scyntylacyjny do próbek wodnych lub niewodnych</td></tr><tr><td>Scyntylacja fiolki</td><td>Beckman</td><td>592928</td><td>Szybkoobrotowa nasadka Mini Poly-Q Fiolka</td></tr><tr><td>Trombin</td><td>Sigma</td><td>T1063-1kU</td><td>Trombina z ludzkiego osocza</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-przezroczyste probówki wirówkowe 5 mm x 41 mm</td><td>Beckman</td><td>344090</td><td></td></tr><tr><td>Vortex 9 do 13 mm Uchwyt na probówki</td><td>VWR</td><td>58816-138</td><td>Wkładka do wirowania rurek</td></tr> <tr><td>ze szkła krzemiennegoWorek ustalający Vortex VWR</td><td></td><td>58816-132</td><td>Ustalacz potrzebny do uchwytu rurki wirowej</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>VWR</td><td>2.235074</td><td>Vortex Genie 2 model G560</td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol klasa biologii molekularnej</td><td>Calbiochem</td><td>444203</td><td></td></tr></tbody></table>

rekonstytucja rekombinowanej drosophila atlastin w liposomach wspomagana detergentami do testów mieszających lipidy

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Fuzja błonowa jest kluczowym procesem w komórce eukariotycznej. Wyspecjalizowane białka są niezbędne do katalizowania fuzji. Atlastyny są białkami rezydującymi w retikulum endoplazmatycznym (ER) zaangażowanymi w homotypową fuzję ER. Szczegółowo opisujemy tutaj metodę oczyszczania S-transferazy glutationowej (GST) i polihistydyny znakowanej atlastyną Drosophila za pomocą dwóch rund chromatografii powinowactwa. Badanie reakcji fuzyjnych in vitro wymaga wprowadzenia oczyszczonych białek fuzyjnych do dwuwarstwy lipidowej. Liposomy są idealnymi błonami modelowymi, ponieważ skład lipidowy i wielkość mogą być regulowane. W tym celu opisujemy metodę rekonstytucji poprzez usuwanie detergentu dla atlastyny Drosophila do wstępnie uformowanych liposomów. Chociaż dostępnych jest kilka metod rekonstytucji, rekonstytucja przez usunięcie detergentu ma kilka zalet, które sprawiają, że nadaje się do atlastin i innych podobnych białek. Zaletą tej metody jest wysoka wydajność rekonstytucji i prawidłowa orientacja odtworzonego białka. Metodę tę można rozszerzyć na inne białka błonowe i do innych zastosowań, które wymagają proteoliposomów. Dodatkowo opisujemy test mieszania lipidów proteoliposomów oparty na FRET, stosowany jako pomiar fuzji błonowej.

Wydajność rekonstytucji atlastyny przedstawiono na Rysunku 2. Rekonstytuowane proteoliposomy oddzielono w nieciągłym gradiencie ioheksolu. Białko nieinkorporowane osiadło w warstwie dolnej (B) lub środkowej (M). Białko rekonstytuowane unosiło się do warstwy górnej (T). Próbki z gradientu pobrano i poddano analizie za pomocą SDS-PAGE oraz barwienia Coomassie. Ilościowa analiza żelu za pomocą densytometrii wykazuje bardzo wysoką wydajność rekonstytucji przy pomijalnych stratach; 96% całkowitej...

Biologiczna fuzja błonowa jest katalizowana przez wyspecjalizowane białka fuzyjne. Pomiar właściwości fuzogennych białek można osiągnąć za pomocą testów mieszania lipidów. Przedstawiamy metodę oczyszczania rekombinowanej atlastyny Drosophila, białka pośredniczącego w homotypowej fuzji ER, odtwarzaniu go do wstępnie uformowanych liposomów i testowaniu zdolności fuzyjnej.

Rekonstytucja rekombinowanej Drosophila Atlastin w liposomach wspomagana detergentami do testów mieszających lipidy

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Opisany tutaj protokół rekonstytucji i fuzji jest skutecznym sposobem badania białek związanych z błoną w modelowej dwuwarstwie lipidowej i mieszania lipidów przez białka fuzyjne. Tutaj opisujemy wspomaganą detergentem rekonstytucję rekombinowanej atlastyny Drosophila, białka fuzyjnego ER, do wstępnie uformowanych liposomów fosfatydylocholiny. Fuzję proteoliposomów atlastyny mierzy się następnie za pomocą testu mieszania lipidów opartego na FRET.Jedną z kluczowych zalet rekonstytucji wspomaganej detergentem jest to, że białko zawarte w detergencie nie jest narażone na wysuszanie ani rozpuszczalniki. Pokazujemy tutaj również, że orientacja rekonstytucji atlastyny jest bardzo skuteczna. Kolejną zaletą testu mieszania lipidów opartego na FRET jest to, że liposomy nie muszą być ładowane żadnym barwnikiem i nie ma potrzeby wykonywania żadnych dodatkowych etapów dializy.Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować wywar z mieszaniny lipidów w chloroformie, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodaj jedną mikrokiurę na mililitr DPPC do mieszanek lipidowych, upewniając się, że zarezerwowałeś co najmniej osiem mikrolitrów tego bulionu. Przenieś żądaną ilość mieszanin lipidów do probówek ze szkła krzemiennego.Następnie wysuszyć mieszaniny lipidów pod delikatnym strumieniem azotu gazowego przez około 10 minut, aż chloroform przestanie być widoczny. Wysuszyć powstały film lipidowy w dalszym ciągu w eksykatorze, odkurzając przez 30 minut. Następnie dodaj wystarczającą ilość A100 z 10% glicerolem, dwumilimolowym 2-merkaptoetanolem i jednomilimolowym EDTA do filmu lipidowego, aby przywrócić stężenie do 10 milimolowców.Ponownie zawiesić film lipidowy, lekko wirując przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Zamrozić uwodnione lipidy w ciekłym azocie. Aby rozmrozić liposomy, pozostaw roztwór w temperaturze pokojowej na 30 sekund, a następnie przenieś je z powrotem do wody w celu szybszego rozmrożenia.Powtórz ten cykl zamrażania i rozmrażania w sumie 10 razy. Następnie użyj mini-ekstrudera, aby przepuścić lipidy przez filtry poliwęglanowe o wielkości porów 100 nanometrów, 19 razy. Aby określić całkowite stężenie lipidów w liposomach, dodaj cztery mikrolitry lipidów i lizosomów do trzech mililitrów koktajlu scyntylacyjnego.Zmierz średnią liczbę na minutę dla zapasów i liposomów oraz oblicz stężenie liposomów, jak opisano w protokole tekstowym. Przechowuj liposomy w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego tygodnia. Najpierw wymieszaj odpowiednią ilość buforu, dodatkowego detergentu i białka w 0,5-mililitrowej tubce, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Szybko dodaj liposomy i natychmiast wiruj przez pięć sekund, aby homogenizować mieszaninę. Inkubować reakcję w nutatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę. Podczas tej inkubacji odważ 0,2 grama polistyrenowych kulek adsorbcyjnych i przenieś je do probówki mikrowirówkowej.Dodaj jeden mililitr metanolu do probówki i mieszaj przez minutę, aby odgazować kulki. Następnie odessać metanol za pomocą igły o rozmiarze 21 lub wyższej. Aby rozpocząć mycie koralików, dodaj do nich wodę.Pozwól kulkom mieszać się z wodą przez pięć minut, a następnie zassaj wodę. Powtórz ten proces mycia wodą cztery razy. Następnie dodaj wodę, aby doprowadzić zawiesinę adsorbentu polistyrenowego do objętości jednego mililitra, o końcowym stężeniu 0,2 grama na mililitr.Obliczyć ilość kulek adsorpcyjnych polistyrenu potrzebną do zaadsorbowania całego detergentu w każdej próbce, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wytnij końcówkę pipety, aby zebrać zawiesinę kulek. Przenieś obliczoną ilość gnojowicy perełkowej do rurki o pojemności 0,5 mililitra i zassaj wodę.Dodaj próbki do probówki zawierającej kulki i inkubuj w nutatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Przenieś próbki do świeżej probówki zawierającej nowe koraliki, upewniając się, że pozostawiłeś stare koraliki. Ponownie wysiadywać w tych samych warunkach.Powtórz ten proces przenoszenia i inkubacji koralików dwa razy. Następnie przenieść próbkę do nowej probówki zawierającej świeże kulki i inkubować przez nutowanie przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia wyjąć próbkę z kulek i odwirować w temperaturze 16 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, aby osadzać nierozpuszczalne agregaty białkowe.Odzyskać supernatant i określić końcowe stężenie lipidów przez zliczanie scyntylacyjne cieczy, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Na początek doprowadź proteoliposomy donorowe i akceptorowe do stężenia 0,15 milimola każdy w A100 zawierającym glicerol, beta-merkaptoetanol, EDTA i chlorek magnezu. Przenieść każdą reakcję do studzienki na płaskiej 96-dołkowej płytce odpowiedniej do odczytu fluorescencji, upewniając się, że przygotowałeś co najmniej cztery reakcje, w tym potrójny i negatywną kontrolę bez GTP.Umieść płytkę w czytniku płytkowym nagrzanym do 37 stopni Celsjusza. Mierz fluorescencję NBD co minutę przez pięć minut. Następnie dodaj pięciomilimolowy GTP, aby wywołać fuzję.Mierz fluorescencję NBD co minutę przez jedną godzinę, używając tego samego wzbudzenia i emisji, co poprzednio. Następnie dodaj pięć mikrolitrów 2,5% beta-D-maltozydu 2,5% n-dodecylu beta-D-maltozydu do studzienek, aby rozpuścić proteoliposomy i mierzyć maksymalną fluorescencję NBD co minutę przez 15 minut przy użyciu tego samego wzbudzenia i emisji. W tym badaniu rekombinowana atlastyna Drosophila jest oczyszczana i odtwarzana w uformowanych liposomach.Skuteczność rekonstytucji atlastyny jest określana przez pływanie odtworzonych proteoliposomów w nieciągłym gradieniu joheksolu. Próbki górnej, środkowej i dolnej warstwy gradientu są zbierane i analizowane za pomocą barwienia SDS-PAGE i Coomassie. Kwantyfikacja żelu za pomocą densytometrii wykazuje bardzo wysoką skuteczność rekonstytucji przy znikomych stratach, przy czym 96% całkowitego białka znajduje się w postaci proteoliposomów, które unosiły się do górnej warstwy.Mniej niż 1% białka jest nieodtworzone i znajduje się w środkowej warstwie, a tylko 3% jest nieodtworzone lub zagregowane i osadzone w dolnej warstwie. Orientację atlastyny po rozpuszczeniu określa się ilościowo za pomocą testów rozszczepienia trombiny. Próbki są analizowane za pomocą barwienia SDS-PAGE i Coomassie i oznaczane ilościowo za pomocą densytometrii.Większość odtworzonego białka ulega rozszczepieniu, a tylko 7% jest chronione przed proteazą. Kinetyka i zakres fuzji proteoliposomów za pośrednictwem atlastyny są analizowane za pomocą testów mieszania lipidów. Przeprowadza się pięciominutową inkubację przed wywołaniem fuzji z GTP w punkcie zerowym.Po godzinie dodano n-dodecylowy beta-D-maltozyd w celu rozpuszczenia proteoliposomów i uzyskania maksymalnego uwolnienia rezonansu fluorescencyjnego. Maksimum fuzji w przebiegu wynosi 11% maksymalnej fluorescencji. Lipidy rozpuszczają się w chloroformie.Przygotowując mieszanki lipidowe, upewnij się, że robisz to szybko, na kapturze chemicznym i na lodzie, aby uniknąć parowania. Możliwa jest analiza proteoliposomów atlastyny za pomocą mikroskopii w celu wizualizacji wpływu kotwy błonowej na kształt i rozmiar liposomu. Metoda ta została rozszerzona o badanie innych białek zakotwiczonych w błonie i ich zachowania w modelowej dwuwarstwie lipidowej.Protokół ten wykorzystuje miareczkowane lipidy do ilościowego określania mieszanin lipidów. Należy podjąć niezbędne środki ostrożności podczas pracy z materiałami radioaktywnymi.

detergent-assisted-reconstitution-recombinant-drosophila-atlastin

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano procedury całkowitego odtworzenia prototypu kanału potasowego bramkowanego napięciem do błon lipidowych. Odtworzone kanały nadają się do testów biochemicznych, zapisów elektrycznych, badań przesiewowych ligandów i badań krystalograficznych elektronów. Metody te mogą mieć ogólne zastosowanie w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych innych białek błonowych.

Rekonstytucja kanału Kv do błon lipidowych w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych

Opisujemy test oparty na fluorescencji do pomiaru mieszania fosfolipidów w dużych liposomach jednowarstwowych odtworzonych za pomocą opsyny.

Test fluorescencyjny aktywności scramblazy fosfolipidowej

Ten artykuł opisuje metodę oceny interakcji i zespołów integralnych białek błonowych in vitro z różnymi czynnikami partnerskimi w środowisku lipidowo-proksymalnym.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Tutaj prezentujemy dwa ultraszybkie protokoły do rekonstytucji białek błonowych w fuzogenne proteoliposomy oraz fuzji takich proteoliposomów z docelowymi dwuwarstwami lipidowymi w celu bezdetergentowego dostarczania tych białek błonowych do dwuwarstwy pofuzyjnej. Połączenie tych podejść umożliwia szybki i łatwy w obsłudze montaż złożonych, wieloskładnikowych systemów membranowych.

Ultraszybka rekonstytucja białek błonowych w dwuwarstwach lipidowych bez użycia fusogenicznych proteoliposomów naładowanych komplementarnie.

Udostępniamy protokół do testów samoorganizacji MinD i MinE in vitro na podpartej dwuwarstwie lipidowej w otwartej komorze. Dodatkowo opisujemy, jak zamknąć test w mikrokompartmentach PDMS pokrytych lipidami, aby naśladować warunki in vivo poprzez uwięzienie reakcji.

In vitro Rekonstrukcja samoorganizujących się wzorców białkowych na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół rekonstytucji aktywności ekstrakcji Msp1 z w pełni oczyszczonymi składnikami w zdefiniowanych proteoliposomach.

Rekonstrukcja aktywności ekstrakcji Msp1 z w pełni oczyszczonymi składnikami

Ten artykuł przedstawia prostą metodę szybkiego wytwarzania gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych z zamkniętymi białkami cytoszkieletu. Metoda ta okazuje się przydatna do oddolnego odtwarzania struktur cytoszkieletu w zamknięciu i interakcjach cytoszkielet-błona.

Szybka enkapsulacja odtworzonego cytoszkieletu w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

Ten protokół opisuje tworzenie wspieranych dwuwarstw lipidowych oraz dodawanie włókien cytoszkieletu i białek motorycznych w celu zbadania dynamiki odtworzonych, połączonych błoną sieci cytoszkieletu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Rekonstytucja minimalnych kory aktynowych połączonych błoną na podpartych dwuwarstwach lipidowych

W tym manuskrypcie demonstrujemy eksperymentalne techniki hermetyzacji cytoszkieletu F-aktyny w gigantyczne jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe (zwane również liposomami) oraz metodę tworzenia warstwy F-aktyny naśladującej korę mózgową na wewnętrznej wlotce błony liposomowej.

In vitro Rekonstrukcja cytoszkieletu aktynowego w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

Przedstawiamy protokół do odtwarzania białek błonowych i enkapsulacji enzymów oraz innych rozpuszczalnych w wodzie składników w pęcherzykach lipidowych o rozmiarach sub-mikrometrowych i mikrometrowych.

Budowa nierównowagowych sieci metabolicznych w pęcherzykach o rozmiarach nano- i mikrometrowych

Poznaj metodę rekonstytucji białka atlastin z Drosophila w liposomy przy użyciu detergentów i test mieszający lipidy oparty na FRET. Technika ta umożliwia badanie fuzji błon komórkowych bez konieczności stosowania barwników.

Rekonstytucja rekombinowanej Drosophila Atlastin w liposomach wspomagana detergentami do testów mieszających lipidy

Przeglądaj więcej filmów