Wykrywanie aktywności retrotranspozycyjnej gorącej linii-1 za pomocą długodystansowego odwrotnego PCR
27 lipca 2019
Ten artykuł przedstawia prosty test oparty na PCR do monitorowania aktywności aktywnej retrotranspozonu LINE-1 i mapowania retrotranspozycji de novo w danym genomie. Korzystając z linii komórkowej MCF7, pokazujemy tutaj, w jaki sposób można zastosować tę metodę do wykrywania aktywności LINE-1 zlokalizowanej w 22q12.1.
Metoda ta może wykrywać aktywność retrotranspozycji zwanych LINE-1s. Te ruchome elementy genetyczne powodują insercje de novo w genomach nowotworów, a tym samym przyczyniają się do niestabilności genomu. Zaletą tej techniki opartej na PCR jest to, że jest prosta i opłacalna w porównaniu z podejściami do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości.
Pokazujemy tutaj jego przydatność w wykrywaniu insercji de novo, które pochodzą z LINE-1 wewnątrz genu TTC28 na ludzkim chromosomie 22. Aktywność LINE-1 może służyć jako biomarker złośliwości lub stanu przednowotworowego, zwłaszcza w typach nowotworów nabłonkowych, takich jak rak jelita grubego lub surowiczy rak jajnika o wysokim stopniu złośliwości. Oprócz insercji LINE-1, metoda ta może wykryć inne aberracje genomowe, takie jak rearanżacje DNA, które zawsze wymagają rearanżacji z jakiegoś powodu.
Aby wybrać odpowiedni enzym restrykcyjny i zaprojektować startery odwrotne, najpierw należy pobrać sekwencję TTC28 LINE-1 w formacie FASTA z bazy danych LINE-1, takiej jak L1Base. Identyfikator L1Base dla TTC28 Line-1 to 135. Zawiera sekwencję pięciu kilozasad, flankującą zarówno pięć głównych, jak i trzy pierwsze, koniec sekwencji Linii-1.
Wyeksportuj sekwencję do edytora tekstu. Tutaj sekwencja flankująca Line-1 jest oznaczona brązową czcionką, a sekwencje Line-1 szarą czcionką. Określenie unikalnego znacznika w jednej sekwencji kilozasad za trzema liczbami pierwszymi TTC28 Line-1 i w jednym z narzędzi do przewidywania sygnału poliadenylacji, takich jak Polyadq lub Dragon PolyA Spotter.
Opisz wszystkie sygnały poliadenylacji w tym oknie o jednej kilobazie. Sekwencja między słabym sygnałem poliadenylacji TTC28 LINE-1 zaznaczonym tutaj na różowo a najsilniejszym sygnałem poliadenylacji poniżej jest unikalnym znacznikiem tej LINE-1 zaznaczonym tutaj na żółto. Aby zaprojektować odwrócone startery PCR, wprowadź unikalną sekwencję znaczników do internetowego narzędzia do projektowania starterów, takiego jak NCBI's Primer-BLAST, które generuje określone startery PCR, utrzymuj parametr długości produktu na minimalnym poziomie, aby pokazać, że pary starterów są blisko siebie.
Wybierz odpowiednią bazę danych genomu. Ponieważ wynik Primer Blast generuje konwencjonalne startery PCR zwrócone do siebie, użyj funkcji odwrotnego dopełnienia dla pary starterów, aby wykonać odwrotny PCR. Startery międzyprojektowe, odpowiadające wschodniemu sygnałowi poliadenylacji, gdy tylko jest to możliwe.
Opisaliśmy trzy pary starterów, podświetlone na kolor turkusowy i zielony, odpowiadające trzem silnym sygnałom poliadenylacji w unikalnym znaczniku TTC28 LINE-1. Następnie, aby wybrać odpowiedni enzym restrykcyjny, należy strawić sekwencję LINE-1 wraz z jej pięcioma kilozasadowymi bokami w górę i w dół w krzemionce za pomocą narzędzi internetowych, takich jak RestrictionMapper. To da wyczerpującą listę enzymów restrykcyjnych, które trawią ten powód, generując różne fragmenty restrykcyjne.
Wybierz enzymy restrykcyjne, które tworzą pięć głównych cięć przed pięcioma głównymi końcami LINE-1 lub w kierunku pięciu głównych końców LINE-1, jeśli znajduje się w samym LINE-1. I trzy główne karty w dół od unikalnego tagu. Natywny fragment restrykcyjny z sekwencją LINE-1 i jego unikalnym znacznikiem utworzonym przez selektywne enzymy restrykcyjne nie powinien być dłuższy niż 12 kilozasad, ponieważ może nie zostać skutecznie amplifikowany przez PCR.
Należy zauważyć, że selektywne enzymy restrykcyjne byłyby niewrażliwe na metylację DNA, powinny być nieaktywowane termicznie i powinny generować lepkie końce, które są względem siebie komplementarne. Aby zademonstrować odwrotny PCR na duże odległości, użyjemy enzymu restrykcyjnego SacI, który tnie DNA w miejscach DAZCTC zaznaczonych tutaj na jasnozielono. SacI spełnia wszystkie kryteria w locus TTC28 LINE-1 i generuje natywny fragment restrykcyjny składający się z 5 700 par zasad.
Ekstrakcja genomowego DNA z próbek za pomocą dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji DNA, który jest w stanie wyekstrahować dobrej jakości, wysokocząsteczkowe DNA niezbędne do odwróconego PCR na duże odległości. Tutaj wyekstrahowaliśmy genomowe DNA z linii komórkowej raka piersi MCF7 i normalnej ludzkiej krwi zgodnie z instrukcją producenta. Zmierz stężenie DNA za pomocą fluorometru.
100 setek nanogramów DNA na jednej osobie żel agarozowy wraz z markerem masy cząsteczkowej DNA w celu sprawdzenia jakości i ilości DNA. Aby wykonać okrągłe matryce DNA, najpierw trawij DNA za pomocą odpowiedniego enzymu restrykcyjnego. Tutaj używamy SacI do trawienia MCF7 i genomowego DNA krwi Twórz mieszankę reakcji trawienia zgodnie z protokołem tekstowym.
Wymieszaj roztwór, przesuwając probówkę i krótko odwiruj. Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, a następnie inaktywować termicznie, zgodnie z instrukcją producenta. Następnie przygotuj roztwór mieszaniny głównej reakcji ligacji zgodnie z protokołem tekstowym, aby samoliglamentować strawione DNA.
Do każdej reakcji dodać 30 mikrolitrów tej głównej mieszanki reakcji ligacji bezpośrednio do 50 mikrolitrów strawionego roztworu DNA z poprzedniego etapu. Wymieszaj roztwór, przesuwając probówkę i krótko odwiruj probówkę. Inkubuj tę mieszaninę reakcyjną w termocyklerze w temperaturze 22 stopni Celsjusza przez 10 minut, kończąc etapem inaktywacji ciepłem w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez kolejne 10 minut.
Ta okrągła matryca DNA zostanie użyta w kolejnym kroku odwróconego PCR. Ustaw gradient temperatury wyżarzania w termocyklerze, aby określić optymalną temperaturę wyżarzania podkładu za pomocą gradientowego PCR. Przygotuj mieszankę wzorcową do PCR, łącząc i mieszając wszystkie składniki zgodnie z protokołem tekstowym.
Ustaw jedną reakcję dla każdej temperatury wyżarzania w gradiencie. Dla każdej reakcji przydziel 19 mikrolitrów probówek PCR z mieszanką główną i dodaj jeden mikrolitr okrągłej matrycy DNA, wygenerowanej z genomowego DNA krwi. Uruchom program gradientowego PCR.
Uruchom sześć mikrolitrów produktu PCR, podgrzej go w różnych temperaturach wyżarzania w jednym kursie w żelu agarozowym. Aby wykryć aktywność retrotranspozycji de novo TTC28 LINE-1 w genomie linii komórkowej MCF7, należy przeprowadzić PCR przy użyciu odwrotnej pary starterów na kolistych matrycach DNA, wygenerowanych z linii komórkowej MCF-7. Postępuj zgodnie z tymi samymi instrukcjami, co w przypadku gradientowego PCR, ale tym razem zastępując gradient temperatury optymalną temperaturą wyżarzania, która wynosi 64 stopnie Celsjusza.
Przeanalizuj długodystansowe produkty odwróconego PCR za pomocą żelu agarozowego, aby uzyskać wyniki. Ten obraz żelu agarozowego wykonany po elektroforezie pokazuje, że genomowe DNA wyekstrahowane z MCF7 i próbki krwi mają wysoką masę cząsteczkową, dzięki czemu nadają się do odwróconego PCR na duże odległości. Ten obraz żelu agarozowego wykonany po elektroforezie pokazuje, że zaprojektowana przez nas odwrotna para starterów wzmacnia prawidłowy okrągły szablon we wszystkich temperaturach wyżarzania w gradiencie, co obserwuje się za pomocą intensywnego rozpiętości między markerem DNA o długości od 5 do siedmiu kilozasad.
Jednak różne pasma są również obserwowane w niższych temperaturach, co wskazuje na słabą specyficzność podkładu i słabe temperatury wyżarzania. Tak więc dla tej pary podkładów 64 stopnie Celsjusza są optymalną temperaturą wyżarzania. Ten obraz w żelu agarozowym przedstawia produkt PCR uzyskany po wykonaniu odwrotnego PCR na duże odległości na DNA wyekstrahowanym z linii komórkowej MCF7 i normalnej krwi.
Iloczyn PCF składający się z 5 700 par zasad, oznaczony gwiazdką, reprezentuje natywny PCR odpowiadający linii-1 w jej natywnym locus. Ten natywny produkt PCR jest widoczny zarówno w MCF7, jak i w normalnym DNA krwi. Retrotranspozycja de novo LINE-1 i genom MCF7 są wykrywalne jako produkt PCR o różnych rozmiarach, wraz z natywnym produktem PCR w żelu agarozowym.
Sekwencjonowanie długodystansowego produktu odwróconego PCR za pomocą technologii jednocząsteczkowego sekwencjonowania z długim odczytem może umożliwić identyfikację celu w rozdzielczości jądrowej. Chociaż jest to kłopotliwe podejście, możliwe jest również klonowanie i sekwencjonowanie Sangera produktu odwróconego PCR na duże odległości. W tym filmie wykryto aktywność LINE-1 na chromosomie 22.
Ten sam przepływ pracy można dostosować do monitorowania innych LINE-1, które są aktywne w różnych typach nowotworów.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia prosty test oparty na metodzie PCR, służący do monitorowania aktywności aktywnego retrotranspozonu LINE-1 oraz mapowania retrotranspozycji de novo w danym genomie. Wykorzystując linię komórkową MCF7, demonstrujemy w niniejszym opracowaniu, w jaki sposób metoda ta może zostać zastosowana do wykrycia aktywności elementu LINE-1 zlokalizowanego w obrębie 22q12.1.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Genetyka
- Niestabilność genomowa
- Badania nad nowotworami
Wstęp
- Retrotranspozony LINE-1 to mobilne elementy genetyczne, które mogą powodować niestabilność genomową.
- Przyczyniają się one do insercji de novo w genomach nowotworowych.
- Wykrywanie aktywności LINE-1 może służyć jako biomarker złośliwości nowotworu.
- Niniejsze badanie koncentruje się na genie TTC28 znajdującym się na ludzkim chromosomie 22.
Cel badania
- Opracowanie kosztownej i efektywnej techniki opartej na PCR do wykrywania aktywności LINE-1.
- Wykazanie użyteczności tej metody w identyfikacji retrotranspozych de novo.
- Przedstawienie protokołu, który badacze mogą stosować w podobnych badaniach.
Zastosowane metody
- Izolacja genomowego DNA z komórek MCF7 oraz normalnej krwi ludzkiej.
- Projektowanie starterów do odwrotnej reakcji PCR w oparciu o unikalne sekwencje tagów z elementów LINE-1.
- Wykorzystanie enzymów restrykcyjnych do trawienia DNA w celu przygotowania kolistej matrycy.
- Przeprowadzenie gradientowego PCR w celu optymalizacji temperatury przyłączania starterów w reakcjach PCR.
Główne wyniki
- Metoda pomyślnie wykryła aktywność retrotranspozycji de novo LINE-1 w TTC28.
- Ustalono optymalne warunki dla amplifikacji PCR.
- Wykazano prostotę i skuteczność testu opartego na metodzie PCR.
- Stworzono podstawy dla przyszłych badań nad aktywnością LINE-1 w nowotworach.
Wnioski
- Niniejszy test oparty na metodzie PCR jest cennym narzędziem do monitorowania aktywności LINE-1.
- Może on pomóc w zrozumieniu roli retrotranspozonów w nowotworach.
- Metoda ta jest przystępna i może zostać dostosowana do różnych badań genomicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Retrotranspozycja LINE-1 przyczynia się do niestabilności genomowej w guzach nabłonkowych, służąc jako potencjalny biomarker złośliwości nowotworu. Wykrywanie insercji de novo z aktywnych loci LINE-1 umożliwia mechanistyczną ocenę ryzyka w walidacji celów terapeutycznych poprzez powiązanie aktywności elementów mobilnych z tumorigenezą. Ta kosztowo efektywna metoda oparta na PCR wspiera procesy wczesnego odkrywania, zapewniając ilościowe odczyty zdarzeń retrotranspozycji bez konieczności stosowania sekwencjonowania wysokoprzepustowego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie niestabilności genomicznej indukowanej przez LINE-1 jako hipotezy terapeutycznej w nowotworach nabłonkowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia prosty i tani test do monitorowania aktywności retrotranspozycji specyficznych aktywnych loci LINE-1.
- Wartość prognostyczna: Wspiera identyfikację biomarkerów złośliwości lub stanów przednowotworowych w modelach raka jelita grubego i jajnika.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe produkty PCR w celu wykrywania insercji LINE-1 de novo oraz zdarzeń transdukcji 3'.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje startery do odwrotnej PCR, zaprojektowane na podstawie unikalnych tagów flankujących, w celu amplifikacji specyficznej dla locus.
- Skalowalność: Możliwość adaptacji do innych aktywnych LINE-1 w różnych typach nowotworów przy użyciu tego samego schematu postępowania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy aktywność LINE-1 z fenotypami nowotworowymi w komórkach raka piersi MCF7 oraz w prawidłowych kontrolach krwi.
- Wartość operacyjna: Wymaga standardowych narzędzi biologii molekularnej: enzymów restrykcyjnych, ligazy, termocyklera oraz elektroforezy w żelu agarozowym.
- Ciągłość translacyjna: Wykrywa retrotranspozycję w genomach nowotworowych, co wspiera decyzje o rozwoju modeli przedklinicznych w oparciu o ocenę ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, od walidacji celu po badania przedkliniczne, umożliwiając wykrywanie zmian genomicznych pośredniczonych przez retrotranspozony, co pozwala na mechanistyczną redukcję ryzyka.
- Biologia odkrywcza: Weryfikacja hipotezy, że specyficzne loci LINE-1 napędzają insercje de novo w genomach nowotworowych.
- Przesiewanie: Pozyskiwanie amplikonów o określonej wielkości (np. 5 700 bp) do ilościowej oceny zdarzeń retrotranspozycji metodą elektroforezy żelowej.
- Analityka: Umożliwienie wyznaczenia wielkości i sekwencjonowania produktów PCR w celu potwierdzenia miejsc insercji oraz flankujących sekwencji transdukowanych.
- Badania translacyjne: Powiązanie aktywności LINE-1 z biomarkerami złośliwości w modelach guzów nabłonkowych.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwach: Protokół może zostać znormalizowany w różnych laboratoriach w celu monitorowania różnych aktywnych elementów LINE-1 w różnych typach nowotworów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez powiązanie aktywności LINE-1 z niestabilnością genomiczną w nowotworach.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje dostępne, niskokosztowe odczynniki oraz standardowy sprzęt laboratoryjny.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) na podstawie aktywności retrotranspozycji jako biomarkera złośliwości nowotworu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów w programach dotyczących nowotworów nabłonkowych w oparciu o analizę ryzyka.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w projektowaniu starterów do PCR, wyborze enzymów restrykcyjnych oraz ligacji DNA genomicznego.
- Wymaga dostępu do enzymów restrykcyjnych generujących lepkie końce i możliwych do inaktywacji termicznie (np. SacI).
- Zależność od wysokiej jakości DNA genomicznego o wysokiej masie cząsteczkowej w celu wydajnej amplifikacji długich fragmentów.
- Konieczna jest optymalizacja temperatury przyłączania poprzez gradientowy PCR w celu zapewnienia specyficzności starterów.
- Ograniczenie do wykrywania zdarzeń retrotranspozycji z flankującą transdukcją; metoda może nie wyłapać insercji bez transdukcji na końcu 3'.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Title
1:41
Designing Inverse Primers and Selecting Restriction Enzymes (Bioinformatics)
5:56
Making Circular DNA Templates for Long-distance Inverse PCR: DNA Extraction and Quality Assessment
8:29
Long-distance Inverse PCR: Determining Primer Annealing Temperature by Gradient PCR
10:25
Representative Results of LDI-PCR
11:27
Conclusion
