Name: Nowa metoda korekcji dinukleotydu nikotynamidoadeninowego do wewnątrzkomórkowego pomiaru Ca2+ za pomocą analogu fura-2 w żywych komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Poznaj nową metodę korekcji sygnału NADH w pomiarach wapnia z użyciem analogu fura-2 w żywych komórkach mięśniowych. Technika ta poprawia dokładność fluorescencyjnych pomiarów stężenia Ca²⁺ w mitochondriach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez Program Badań Podstawowych przez Narodową Fundację Badawczą Korei (NRF) finansowany przez Ministerstwo Edukacji (2018R1A6A3A01011832), przez Ministerstwo Nauki, ICT i Planowania Przyszłości (NRF-2016M3C1A6936606) oraz przez Ministerstwo Handlu, Przemysłu i Energii (10068076).

Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez lokalny instytucjonalny komitet ds. opieki i użytkowania zwierząt.
1. Przygotowanie roztworu
<ol>
	<li>Przygotuj pojedyncze, świeżo wyizolowane miocyty serca11. 
	UWAGA: Każde laboratorium może mieć inny roztwór do przechowywania komórek. Tutaj miocyty są przechowywane w pożywce hodowlanej (DMEM).</li>
	<li>Przygotować 100 ml roztworu wolnego od Ca2+ (Tabela 1).</li>
	<li>Przygotować 50 ml pożywki hodowlanej w zlewce o pojemności 50 ml. Podać 5 ml i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Pozostały roztwór przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować 50 ml roztworu saponin, dodając 5 mg saponiny do 50 ml roztworu wolnego od Ca2+. 
	UWAGA: Saponina służy do przenikania miocytów serca, usuwania przedziałów cytozolowych i wizualizacji tylko fluorescencji mitochondrialnej.</li>
	<li>Przygotować 16 μl 1 mM fura-2-FF-AM rozpuszczonego w dimetylosulfotlenku (DMSO). 
	UWAGA: Przygotować 1 mM roztwór podstawowy fura-2-FF-AM rozpuszczony w DMSO i podwielokrotność 16 μl w probówce o pojemności 2 ml. Przechowywać je w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Przygotować 50 ml roztworu wolnego od Ca2+ wolnego od NADH (tabela 1) i 50 ml roztworu nasyconego Ca2+ wolnego od NADH (tabela 1), gdy mają być mierzone punkty izobestowe. Dostosuj pH do 7,0 za pomocą KOH. 
	UWAGA: Roztwór wolny od Ca2+ bez NADH (tabela 1) zawiera 10 μM FCCP i 100 μM ADP bez żadnych substratów mitochondrialnych w celu zminimalizowania NADH w mitochondriach.</li>
	<li>Przygotować 50 ml roztworu wolnego od Ca2+, 50 ml roztworu jabłczanu, 50 ml roztworu pirogronianu, 50 ml roztworu jabłczanu i pirogronianu oraz 50 ml roztworu rotenonu do wykorzystania do pomiarów współczynnika korygującego NADH (Tabela 1).</li>
</ol>
2. Procedura ładowania fluorosondy do mitochondriów
<ol>
	<li>Przygotować roztwór obciążający barwnik, dodając 2 ml pożywki hodowlanej do 16 μl 1 mM fura-2-FF-AM. 
	UWAGA: Barwnik fluorescencyjny jest kruchy w świetle. Przygotuj roztwór tuż przed użyciem. Roztwór zawierający barwnik fluorescencyjny należy przechowywać w ciemnym miejscu. Końcowe stężenie fura-2-FF-AM wynosi 8 μM. Jeśli użyto karboksy-SNARF-1, należy przygotować roztwór do ładowania barwnika z 2 μM karboksy-SNARF-1-AM.</li>
	<li>Weź 2 ml wyizolowanych komórek i umieść je w probówce o pojemności 5 ml w pozycji pionowej.</li>
	<li>Odczekaj 15 minut, aż miocyty opadną na dno i usuń supernatant. 
	UWAGA: Supernatant może zawierać resztki komórek. Nie odwirowywać probówki, aby uniknąć uszkodzenia komórek.</li>
	<li>Dodać 2 ml roztworu obciążającego barwnik.</li>
	<li>Inkubować roztwór barwiący z komórkami przez 60 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Następnie umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 30 minut w pozycji pionowej.</li>
	<li>Usunąć sklarowany osad i dodać 4 ml podgrzanej pożywki o temperaturze 37 °C. Inkubować komórki przez 60 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Na koniec usunąć supernatant, dodać 4 ml pożywki hodowlanej o temperaturze pokojowej i utrzymywać probówkę w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
3. Wprowadzenie wieloparametrycznego systemu pomiarowego
UWAGA: Rysunek 1 pokazuje schemat całego systemu.
<ol>
	<li>Jako źródło światła wzbudzającego należy użyć szybkiego monochromatora (polichromia II), który może zmienić światło w ciągu 3 ms.</li>
	<li>Użyj soczewki olejowej (40x, NA 1.3) z odwróconym mikroskopem, aby zwiększyć intensywność sygnału.</li>
	<li>Użyj filtra bliskiej podczerwieni i kamery ze sprzężeniem ładunkowym (CCD), aby monitorować pole obiektu bez zakłóceń sygnału fluorescencyjnego.</li>
	<li>Przechwyć obraz pola obiektu, aby uzyskać obszar.</li>
	<li>Dostosuj pole obiektu na ekranie monitora za pomocą przysłony pola tylko po to, aby pokazać komórkę w celu zmniejszenia tła.</li>
	<li>Użyj czterech fotopowielaczy z każdym filtrem pasmowo-przepustowym (450, 500, 590 i 640 nm), aby wykryć długości fal emisji metodą zliczania fotonów. Użyj odpowiednich lusterek dichroicznych, aby rozdzielić i przekierować światło emisyjne. 
	UWAGA: Światło wzbudzenia jest bardzo silne w porównaniu ze światłem emisyjnym. Dlatego wybierz filtr pasmowo-przepustowy o najwyższych parametrach blokowania, aby zmniejszyć tło. System zliczania fotonów składa się z kombinacji PMT, jednostek licznika fotonów i szybkiego licznika. Do sterowania systemem i pobierania próbek danych wykorzystano specjalne oprogramowanie do jazdy. Konieczne jest znalezienie sposobu na zastosowanie tej metody z innymi systemami.</li>
</ol>
4. Metody korekcji NADH z wieloparametrycznym systemem pomiarowym
<ol>
	<li>Identyfikacja punktów izobestycznych Fura-2-FF in situ. 
	UWAGA: W wielu raportach stwierdzono, że charakterystyka fluorescencji w komórkach ulega zmianie. Dlatego należy wykonać wszystkie procedury, aby uzyskać parametry korygujące zakłócenia in situ.
	<ol>
		<li>Zamontuj naładowaną barwnikiem komórkę na mikroskopie i odczekaj 3 minuty, aby zanurzyć komórki na dnie. 
		UWAGA: Dostosuj liczbę komórek, aby zobaczyć około jednej komórki na jedno pole obiektywu za pomocą soczewki obiektywu 40x.</li>
		<li>Roztwór wolny od Ca2+ należy ukrwić w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Po wycelowaniu w komórkę zmierz tło wolne od komórek i obszar komórki, jak pokazano w sekcji 4.1. Oblicz tło komórki na podstawie obszaru komórki. 
		UWAGA: Oba sygnały tła muszą być korygowane w każdym eksperymencie.</li>
		<li>Roztworem saponin należy perfundować przez 60 sekund i powrócić do roztworu wolnego od NADH Ca2+.</li>
		<li>Pomiar sygnałów emitowanych przez Fura-2-FF przy długości fali 450 nm i 500 nm jednocześnie poprzez skanowanie wzbudzenia od 350 nm do 365 nm z krokiem co 0,1 nm.</li>
		<li>Przeprowadzić fuzję roztworu nasyconego Ca2+ wolnego od NADH i powtórzyć krok 4.2.5.</li>
		<li>Odejmij sygnały w roztworze nasyconymCa2+ od sygnałów w warunkach wolnych odCa2+.</li>
		<li>Powtórzyć procedury od 4.2.2 do 4.2.7 z innymi pojedynczymi miocytami serca. 
		UWAGA: Jeśli intensywność sygnału osłabnie, powtórz od 4.2.1. Powtórz procedurę dla co najmniej 5 różnych komórek.</li>
		<li>Ze wszystkich uzyskanych sygnałów oblicz odchylenia standardowe emisji przy każdym wzbudzeniu i wybierz długość fali wzbudzenia pokazującą minimalną wartość odchylenia standardowego (SD) jako punkt izobestowy. 
		UWAGA: Reprezentatywne liczby są pokazane w Rysunek 2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie sygnału tła i metody korekcji obszaru komórki 
	UWAGA: Istnieją dwa rodzaje tła. Jedna pochodzi z komórek, a druga z odbicia na szkiełku okładkowym (tło wolne od komórek). Oba tła muszą być korygowane w każdym eksperymencie.
	<ol>
		<li>Zamontuj komórki bez barwnika w kąpieli pod mikroskopem i odczekaj 3 minuty, aby opaść komórki na dno. Uzyskuj roztwór wolny od NADH, Ca2+ przez około 5 minut. 
		UWAGA: Szybkość perfuzji całego roztworu wynosi 2-3 ml / min w temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: Dostosuj liczbę komórek, aby zobaczyć około jednej komórki na jedno pole obiektywu za pomocą soczewki obiektywu 40x.</li>
		<li>Ustaw pole obiektu tak, aby obejmowało komórkę docelową.</li>
		<li>Po wyprowadzeniu komórki poza pole zmierz sygnały tła okna wolnego od komórek i ustaw je jako offsety. 
		UWAGA: Sygnał oznacza sygnał świetlny, który ma zostać wykryty w systemie zliczania fotonów.</li>
		<li>Przywróć komórkę do pozycji początkowej i zmierz sygnały tła komórki oraz obszar komórki. 
		UWAGA: Mimo że światło wzbudzenia jest filtrowane za pomocą filtra pasmowoprzepustowego, nadal zawiera dość dużą ilość przefiltrowanego światła. Światło to jest rozpraszane podczas uderzania w komórki i powoduje znaczny sygnał tła, ponieważ system zliczania fotonów jest bardzo czuły. Trzeba to poprawić. 
		UWAGA: Obszar komórki można obliczyć na podstawie przechwyconego obrazu komórki i dostępnego oprogramowania do obrazowania. Jednostką obszaru komórki może być dowolna jednostka, w tym liczba pikseli. Konieczna jest tylko standaryzacja.</li>
		<li>Powtórz od 4.1.1 do 4.1.4 10 razy, aby uzyskać zależność między obszarem komórki a sygnałami tła komórki. 
		UWAGA: Później sygnały tła komórki można obliczyć na podstawie obszaru komórki z relacji. Ponieważ żarówka wzbudzenia starzeje się, procedurę tę należy powtarzać co najmniej raz w miesiącu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar współczynników R
	<ol>
		<li>Obliczyć Rf za pomocą równania 4 z sygnałów otrzymanych w ppkt 4.2.</li>
		<li>Zamontuj bezbarwne komórki na mikroskopie i przelej roztwór wolny od Ca2+.</li>
		<li>Zmierz sygnały, takie jak F361, 450, NADH, F400, 500, NADH, F361, 450, NADH i F353, 500, NADH.</li>
		<li>Perfaktywować roztwór jabłczanu i powtórzyć czynności opisane w ppkt 4.3.3 i zmierzyć sygnały.</li>
		<li>Przeprowadzić perfuzję roztworu pirogronianu i powtórzyć czynności opisane w pkt 4.3.3 i zmierzyć sygnały.</li>
		<li>Przeprowadzić perfuzję roztworu jabłczanu i pirogronianu i powtórzyć czynności opisane w pkt 4.3.3 i zmierzyć sygnały.</li>
		<li>Przeprowadzić perfuzję roztworu rotenonu i powtórzyć czynności opisane w pkt 4.3.3. i zmierzyć sygnały. 
		UWAGA: Przykład sygnału NADH zarejestrowanego na 5 mM pirogronianu, 5 mM jabłczanu plus 5 mM pirogronianu i 10 μM dodatku rotenonu pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 3.</li>
		<li>Oblicz każde nachylenie F361, 450, NADH w porównaniu z F400, 500, NADH i F361, 450, NADH w stosunku do F353, 500, NADH. Jak pokazano w Rysunek 3. Każde nachylenie wskazuje RN1 i RN2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Wybór światła wzbudzenia i emisji dla TMRE lub karboksy-SNARF-1
<ol>
	<li>Jeśli dodatkowo zastosowano TMRE do pomiaru potencjału mitochondrialnego, należy użyć długości fali wzbudzenia 530 nm i długości fali emisji 590 nm.</li>
	<li>Jeśli dodatkowo użyto karboksy-SNARF-1 do pomiaru potencjału mitochondrialnego, należy użyć długości fali wzbudzenia 540 nm i długości fali emisji 590 nm i 640 nm12.</li>
</ol>
6. Wybór wartości Kd fura-2-FF
<ol>
	<li>Zmiana pH może wpływać na wartości Kd dla wiązania Ca2+ na fura-2-FF10. Użyj wartości Kd 5,28 przy pH 7,5 dla mitochondriów.</li>
</ol>

<ol><li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling%3A+dynamics%2C+homeostasis+and+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).</li>
<li>Miyata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+free+Ca2%2B+concentration+in+living+single+rat+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).</li>
<li>Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+loading+of+fura-2+into+mitochondria+in+the+intact+perfused+rat+heart+and+its+use+to+estimate+matrix+Ca2%2B+under+various+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The loading of fura-2 into mitochondria in the intact perfused rat heart and its use to estimate matrix Ca2+ under various conditions.</a> Journal of Molecular Cellular Cardiology. 24 (7), 765-773 (1992).</li>
<li>Griffiths, E. J., Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrophosphate+metabolism+in+the+perfused+heart+and+isolated+heart+mitochondria+and+its+role+in+regulation+of+mitochondrial+function+by+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Pyrophosphate metabolism in the perfused heart and isolated heart mitochondria and its role in regulation of mitochondrial function by calcium.</a> Biochemical Journal. 290 (Pt 2), 489-495 (1993).</li>
<li>Crompton, M., Moser, R., Ludi, H., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interrelations+between+the+transport+of+sodium+and+calcium+in+mitochondria+of+various+mammalian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues.</a> European Journal of Biochemistry. 82 (1), 25-31 (1978).</li>
<li>Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation-reduction+ratio+studies+of+mitochondria+in+freeze-trapped+samples.+NADH+and+flavoprotein+fluorescence+signals%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).</li>
<li>Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinamide+adenine+dinucleotide+fluorescence+spectroscopy+and+imaging+of+isolated+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes.</a> Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).</li>
<li>Brandes, R., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurements+of+mitochondrial+NADH+and+Ca%282%2B%29+during+increased+work+in+intact+rat+heart+trabeculae%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae.</a> Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).</li>
<li>Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-mediated+coupling+between+mitochondrial+substrate+dehydrogenation+and+cardiac+workload+in+single+guinea-pig+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes.</a> Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).</li>
<li>Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Nicotinamide+Adenine+Dinucleotide+Correction+Method+for+Mitochondrial+Ca2%2B+Measurement+with+FURA-2-FF+in+Single+Permeabilized+Ventricular+Myocytes+of+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat.</a> Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).</li>
<li>Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+properties+of+individual+cells+isolated+from+adult+rat+ventricular+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium.</a> Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).</li>
<li>Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chloride-dependent+acid+loader+in+the+guinea-pig+ventricular+myocyte%3A+part+of+a+dual+acid-loading+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism.</a> Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).</li>
<li>Page, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+ultrastructural+analysis+in+cardiac+membrane+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology.</a> American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).</li>
<li>Page, E., McCallister, L. P., Power, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterological+measurements+of+cardiac+ultrastructures+implicated+in+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Z powodzeniem opracowano metodę korekcji zakłóceń do pomiaru sygnałów analogów NADH i fura-2. Dokładny pomiar sygnałów jest niezbędny do dokładnej korekcji. Jednak inherentna natura urządzenia fluorescencyjnego wytwarza sygnał tła niezwiązany z sygnałem NADH fury-2. Najwyższej jakości filtr pasmowo-przepustowy może przepuszczać tylko do 10−8 niepożądanych długości fal światła. Jednak sygnał fluorescencyjny z pojedynczej komórki jest bardzo mały, a odbicie światła wzbudzającego po filtrze pasmowo-przepustowym j...

Znacząca rola wewnątrzkomórkowego Ca2+ jest powszechnie znana1. Kwantyfikacja [Ca2+] jest niezbędna do zrozumienia procesów fizjologicznych funkcji komórkowych. Analogi Fura-2 są bardzo przydatne, ponieważ są wzbudzane w zakresie UV (<400 nm), a do pomiaru ilościowego można zastosować metodę ratiometryczną. Dlatego inne parametry fizjologiczne, takie jak pH, potencjał błonowy itp., można mierzyć za pomocą innych barwników fluorescencyjnych. Zakres stężenia mitochondrialnego Ca2+ ([Ca2+]m) wynosił podobno 0,08−20 μM2,3,4,5. Wśród analogów fury-2, fura-2-FF jest odpowiedni do pomiaru tego zakresu [Ca2+]. Jednak żywe komórki niestety zawierają NADH / NADPH dla swoich procesów metabolicznych, a NADH generuje interferencję sygnału z powodu nakładających się widm wzbudzenia i emisji z analogiem fury-2. Interferencja ta znacznie ogranicza stosowanie analogów fury-2. W szczególności, jeśli analog zostanie zastosowany do pomiaru mitochondriów [Ca2+], interferencja ta jest największą przeszkodą, ponieważ największa ilość NADH znajduje się w mitochondriach. Jest to dodatkowo skomplikowane przez to, że zmiany NADH są związane z potencjałem błony mitochondrialnej (Ψm), a zmiana Ψm wpływa na [Ca2+]m6,7,8,9. Ponadto, aby badać dynamikę [Ca2+]m, niezbędna jest znajomość stanu innych parametrów mitochondrialnych, takich jak NADH, Ψm i pH.
Emisje przy 450 nm i 500 nm z wzbudzeniami przy 353 nm, 361 nm i 400 nm zawierają sygnały z NADH i fura-2-FF, a równania są następujące. W tym przypadku 353 nm i 361 nm są izobestowymi punktami fury-2-FF dla emisji odpowiednio przy 450 nm i przy 500 nm.
F361,450 = F361,450,NADH + F361,450,Równanie Fura 1 
F353,500 = F353,500,NADH + F353,500,Równanie Fury 2 
F400,500 = F400,500,NADH + F400,500,Równanie Fury 3
gdzie Fx,y jest zmierzoną intensywnością emisji w y-nm przez wzbudzenie x-nm, Fx,y,NADH reprezentuje czystą intensywność emisji zależną od NADH, a Fx,y,Fura reprezentuje czystą intensywność emisji zależną od fura-2-FF. Przy tym samym stężeniu barwnika fluorescencyjnego pewna intensywność wzbudzenia powinna wytwarzać tę samą intensywność emisji. W związku z tym stosunek intensywności emisji dwóch różnych długości fal wzbudzenia powinien być stały. Ca2+ i fura-2 nie wpływały na charakterystykę fluorescencji NADH; w związku z tym stosunek emisji przy 450 nm i przy 500 nm NADH był stały przy każdej długości fali wzbudzenia. Ta sama zasada może być stosowana dla fury-2-FF w oparciu o założenie, że NADH lub [Ca2+] nie wpływa na widma emisji i wzbudzenia fura-2-FF. Jednak Ca2+ spowodował przesunięcie widmowe emisji fury-2-FF. Dlatego, aby usunąć efekt Ca2+, należy zastosować wzbudzenie izobestowe, które jest niezależne od Ca2+. Każda długość fali emisyjnej (tj. 450 nm i 500 nm) ma inny punkt izobestowy, a z naszego układu doświadczalnego wybrano 353 nm przy 500 nm i 361 nm przy 450 nm. Na tej podstawie poprawne są następujące równania10.
Rf = F361,450,Fura/F353,500,Równanie Fura 4 
RN1 = F400,500,NADH/F361,450,NADH Równanie 5 
RN2 = F353,500,NADH/F361,450,NADH Równanie 6
Z tymi stałymi, następujące równania z (Równanie 1) (Równanie 2) i (Równanie 3) są poprawne.
F361,450 = F361,450,NADH + Rf × F353,500,Równanie Fura 7 
F353,450 = RN2 × F361,450,NADH + F353,500,Równanie Fury 8 
F400,500 = RN1 × F361,450,NADH + F400,500,Równanie Fury 9
Z tych równań, jeśli znane są Rf, RN1 i RN2, można uzyskać czyste sygnały NADH i fura-2 w następujący sposób.
F361,450,NADH = (F361,450 - Rf × F353,500)/(1 − Rf × RN2) Równanie 10 
F353,500,Fura = (RN2 × F361,450 − F353,500)/(Rf × RN2 − 1) Równanie 11 
F400,500,Fura = F400,500 − RN1 × F361,450,NADH Równanie 12 
RFura = F353,500,Fura/F400,500,Fura Równanie 13
Forma fura-2-FF związana z Ca2+ była praktycznie niefluorescencyjna na długości fali wzbudzenia 400 nm. Na podstawie tej właściwości można wyprowadzić następujące nowe równanie kalibracyjne.
[Ca2+] = Kd ∙ (F400,500,max/F353,500,max) × (RFura − Rmin) Równanie 14
gdzie Kd jest stałą dysocjacji, F400,500,max i F353,500,max to maksymalne wartości emitowanych sygnałów przy 500 nm ze wzbudzeniami odpowiednio przy 400 nm i 353 nm, a Rmin to minimumR Fura w stanie wolnym od Ca2+. Ponieważ zastosowano wzbudzenia izobestylowe, równanie można jeszcze bardziej uprościć w następujący sposób.
[Ca2+] = Kd ∙ (1 / Rmin) ∙ (RFura − Rmin) Równanie 15
Dlatego do obliczenia [Ca2+] wymagane są tylko wartości Kd i Rmin.

<table><tbody><tr><td>2 mL probówka eppendorf</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C</td><td>2 mL Probówka</td></tr><tr><td>AD/DA konwerter</td><td>Instrutech</td><td>ITC-18</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>ADP, sól monopotasowa 5&prime;-difosforanu adenozyny dwuwodna</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A5285</td><td>Chemikalia</td></tr><tr><td><silny>Filtr pasmowy</mocny></td><td>Ealing Electro-Optics, Inc</td><td>35-3920</td><td>Sprzęt, 640&plusmn; Filtr pasmowy 11nm</td></tr> <tr><td> </td><td>Omega Optical</td><td>690-9823</td><td>Equipment, 590 i plusmn; Filtr pasmowy 15nm</td></tr> <tr><td> / strong</td><td>Omega Optical</td><td>500DF20-9916</td><td>Sprzęt, 500 i plusmn; Filtr pasmowy 20nm</td></tr><tr><td></td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>60685</td><td>Sprzęt, 450&plusmn; 30nm</td></tr><tr><td>Roztwór chlorku wapnia</td><td>Sigma-aldrich</td><td>21114</td><td>Chemikalia<</td></tr><tr><td>strong>karboksyl-SNARF-1(AM)</td><td>Invitrogen</td><td>C1272</td><td>Chemikalia</td></tr><tr><td><silna>Kamera z urządzeniem sprzężonym z ładunkiem (CCD)</td><td>Philips</td><td>FTM1800NH/HGI</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Dichroic mirror</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>86009</td><td>Sprzęt, Wielopasmowe zwierciadło dichroiczne, Odbicie : < 400nm, 490 i plusmn; 10, 560&plusmn; 10, skrzynia biegów: 460&plusmn; 15, 510&plusmn; 20, >580nm</td></tr><tr><td><mocne>Dichroiczne lustro< / mocne></td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>567DCXRU</td><td>Sprzęt, Odbicie : < 560nm, Transmisja : > 580 nm</td></tr> <tr><td>< mocne>zwierciadło dichroiczne</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>480dclp</td><td>Sprzęt, Odbicie : < 470nm, Transmisja: > 490 nm</td></tr> <tr><td>< mocne>zwierciadło dichroiczne</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>20728</td><td>Sprzęt, Wielopasmowe zwierciadło dichroiczne, Odbicie : < 405 nm, 470 i plusmn; 30, transmisja: 430nm ~ 520nm, > 640 nm</td></tr> <tr><td>Dimethyl suloxide (DMSO) </td><td>Sigma-aldrich</td><td>154938</td><td>Chemicals</td></tr><tr><td>DMEM, Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D5030</td><td>Chemikalia</td></tr><tr><td>EGTA, Kwas egtazynowy, Kwas etylenowo-bis(oksyetylenonitrolo)tetraoctowy, Eter glikolowy, Kwas diaminotetraoctowy</td><td>Sigma-aldrich</td><td>E4378</td><td>Chemikalia</td></tr><tr><td>FCCP, 4-trifluorometoksyfenylohydrazon mezosalonitrylu</td><td>Sigma-aldrich</td><td>21857</td><td>Chemikalia</td></tr><tr><td><silna>polowa membrana</mocna></td><td>Nikon</td><td>86506</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td><silny>Fura-2-FF(AM)</mocny></td><td>TEFLABS</td><td>137</td><td>chemikalia</td></tr><tr><td><mocny>Zielona probówka</mocny></td><td>probówka</td> <td>DWM</td><td></td></tr><tr><td><silny>HEPES,&nbsp; Kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy, Kwas N-(2-hydroksyetylo)piperazyno-N&prime;-(2-etanosulfonowy), Kwas N-(2-hydroksyetylo)piperazyno-N&prime;-(2-etanosulfonowy)) </td><td>Sigma-aldrich</td><td>H3375</td><td>Chemicals</td></tr><tr><td>High-speed counter</td><td>National Instruments</td><td>NI-6022</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Hot mirror</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>21002</td><td>Sprzęt, 50:50</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony </td><td>Nikon</td><td>TE-300</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td><silny>Malate</mocny></td><td>Sigma-aldrich</td><td>27606</td><td>Chemicals</td></tr><tr><td>Filtr bliskiej podczerwieni </td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>Sprzęt D750/100X</td><td>, 750&plusmn; Soczewka</td></tr> <tr><td>zanurzeniowa 100nm </td><td>Nikon</td><td>MRF01400</td><td>40x, NA 1.3; Ekwipunek</td></tr><tr><td><silny>Licznik fotonów</silny></td><td>Hamamatsu</td><td>C3866</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td><silny>Rurka zwielokrotniająca fotony</silny></td><td>Hamamatsu</td><td>R2949</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td><silny>Polichromia II</silny></td><td>Till Photonics</td><td>SA3/MG04</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td><silny>Chlorek potasu</silny></td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td>Chemikalia</td></tr><tr><td><silny>Roztwór wodorotlenku potasu</silny></td><td>Sigma-aldrich</td><td>P4494</td><td>Chemikalia</td></tr><tr><td><silny>Pirogronian</silny></td><td>Sigma-aldrich</td><td>107360</td><td>Chemikalia</td></tr><tr><td><silny>Rotenon</silny></td><td>Sigma-aldrich</td><td>R8875</td><td>Chemikalia</td></tr><tr><td><silny>Saponina</silny></td><td>Sigma-aldrich</td><td>S4521</td><td>Chemikalia</td></tr><tr><td>TMRE, Tetrametylorodamina, ester etylowy </td><td>Sondy molekularne</td><td>T669</td><td>Chemikalia</td></tr></tbody></table>

nowa metoda korekcji dinukleotydu nikotynamidoadeninowego do wewnątrzkomórkowego pomiaru ca2+ za pomocą analogu fura-2 w żywych komórkach

A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells

Do ilościowego pomiaru [Ca2+] często używa się analogów fura-2, które są ratiometrycznymi fluorosondami. Jednak użycie barwnika jest wewnętrznie ograniczone w żywych komórkach z powodu interferencji autofluorescencji, głównie z dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADH). Mówiąc dokładniej, jest to główna przeszkoda przy ilościowym pomiarze mitochondriów [Ca2+] przy użyciu analogów fury-2, ponieważ większość NADH znajduje się w mitochondriach. Jeśli stężenie barwnika fluorescencyjnego jest takie samo, pewna intensywność wzbudzenia powinna wytwarzać tę samą intensywność emisji. W związku z tym stosunek intensywności emisji dwóch różnych długości fal wzbudzenia powinien być stały. W oparciu o tę zasadę opracowano nowatorską metodę korekcji online zakłóceń sygnału NADH w celu pomiaru [Ca2+], dzięki której można uzyskać rzeczywistą intensywność sygnału NADH i fura-2. Ponadto opracowano nowatorskie równanie do obliczania [Ca2+] ze wzbudzeniem izobestowym lub wzbudzeniem przy 400 nm. Dzięki tej metodzie można było z powodzeniem zmierzyć zmiany w mitochondriach [Ca2+]. Ponadto, przy innym zestawie długości fal wzbudzenia i emisji, można jednocześnie mierzyć wiele parametrów, w tym NADH, [Ca2+] i pH lub potencjał błony mitochondrialnej (Ψm). Mitochondria [Ca2+] i Ψm lub pH mierzono za pomocą fura-2-FF i estru etylowego tetrametylorodaminy (TMRE) lub karboksyl-seminaftorodafluoru-1 (karboksyl-SNARF-1).

Zmiany mitochondrialnego Ca2+ po korekcie10 
Rycina 4 przedstawia zmiany [Ca2+]m przed i po korekcie. Wyniki wyraźnie wykazały znaczne zmiany w [Ca2+]m. Mitochondrialne spoczynkowe stężenie wapnia przy braku cytosolowego Ca2+ ([Ca2+]c) wynosiło 1,03 ± 0,13 µM (średnia ± S.E., n = 32), a maksymalne [Ca2+]m przy 1-µM [Ca2+]c wynosiło 29,6 ± 1,61 µM (...

Ze względu na nakładanie się na siebie długości fal wzbudzenia i emisji analogów NADH i fura-2, zakłócenia sygnału od obu substancji chemicznych w żywych komórkach są nieuniknione podczas ilościowego pomiaru [Ca2+]. W związku z tym opracowano nowatorską metodę korekcji online zakłóceń sygnału NADH w celu pomiaru [Ca2+].

Nowa metoda korekcji dinukleotydu nikotynamidoadeninowego do wewnątrzkomórkowego pomiaru Ca2+ za pomocą analogu fura-2 w żywych komórkach

To measure [Ca2+] quantitatively, fura-2 analogs, which are ratiometric fluoroprobes, are frequently used. However, dye usage is intrinsically limited in ...

Sondy liczby mnogiej pobudliwe UV mają nieodłączne zanieczyszczenie sygnału ze względu na dźwięki w liczbie mnogiej. Główny problem z NADH polega na ograniczeniu użycia sondy w liczbie mnogiej. Można zastosować metodę precyzyjnej korekty zewnętrznego kwitnienia z NADH, w celu wyodrębnienia prawdziwego, niezanieczyszczonego sygnału sondy w liczbie mnogiej.Procedurę zademonstruje Jeong Hoon Lee, nasz adiunkt z mojego laboratorium. Po umożliwieniu miocytom osiądnięcia na dnie probówki, odessać supernatant. Oznacz komórki dwoma mililitrami świeżo przygotowanego jednomilimolowego roztworu rozcieńczającego fura-2-FFAM przez 60 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut w pozycji pionowej przed usunięciem supernatantu. Następnie dodaj cztery mililitry pożywki hodowlanej o temperaturze pokojowej do przechowywania w temperaturze pokojowej. W celu identyfikacji izobestycznej fury-2-ffa in situ zamontuj rozcieńczone komórki na stoliku mikroskopu i poczekaj trzy minuty, aż komórki opadną na dno.Wlej roztwór wolny od wapnia o temperaturze 37 stopni Celsjusza do hodowli komórkowej i zlokalizuj komórkę docelową. Obfity roztwór saponin przez 60 sekund przed ponownym obficie roztworem bezwapniowym wolnym od NADH. Jednocześnie mierz sygnały emitowane przez fura-2-ff na 450 i 500 nanometrach, używając skanowania wzbudzenia od 350 do 365 nanometrów z krokiem 0,1 nanometra i ponownie obficie roztworem bezwapniowym wolnym od NADH.Następnie odejmij sygnały w roztworze nasyconym wapniem od sygnałów w warunkach bezwapniowych. Następnie oblicz odchylenia standardowe emisji przy każdym wzbudzeniu i wybierz długość fali wzbudzenia, pokazując minimalne wartości odchylenia standardowego jako pojedyncze punkty izobestyczne. Aby użyć wieloparametrycznego systemu pomiarowego do wykrycia sygnału tła i skorygowania sygnału w obszarze komórki, zamontuj komórki bez barwnika w kąpieli mikroskopowej i pozwól komórkom osiąść przez trzy minuty.Wlej roztwór bezwapniowy NADH do kąpieli na około pięć minut z szybkością od dwóch do trzech mililitrów na minutę i ustaw pole obiektu tak, aby pokryło docelową komórkę. Po wyjęciu komórki poza pole zmierz sygnały tła okna bezkomórkowego i ustaw sygnały jako przesunięcia. Następnie przywróć komórkę do pozycji początkowej i zmierz sygnały tła komórki oraz obszar komórki.Aby obliczyć współczynnik R, użyj uzyskanych sygnałów tła i obszaru komórki przed ponownym zamontowaniem komórek wolnych od barwnika pod mikroskopem i zalaniem roztworem bezwapniowym. Zmierz sygnały zgodnie ze wskazaniami przed wylewaniem zawiesiny komórek roztworem jabłczanu. Po zmierzeniu sygnałów napełnij komórki roztworem pirogronianu, a następnie oblej roztworem jabłczanu i pirogronianu i roztworem rotenonu.Następnie oblicz nachylenie dla każdego sygnału. Tutaj pokazane są zmiany w mitochondrialnym wapniu przed i po korekcji. Wyniki wyraźnie ujawniają istotne zmiany w mitochondrialnym wapniu przy mitochondrialnym stężeniu wapnia spoczynkowym bez cytozolowego wapnia wynoszącym 1,03 plus minus 0,13 mikromola i maksymalnym mitochondrialnym wapniu przy jednym mikromolu wapnia wynoszącym 29,6 plus lub minus 1,61 mikromola.Mitochondrialny potencjał transbłonowy monitorowano za pomocą obfitości dwóch nanozębów trzonowych TMRE. Zmianę potencjału mitochondrialnego obliczono na podstawie założonego początkowego potencjału błony mitochondrialnej wynoszącego minus 150 miliwoltów, wykazując spadek NADH w odpowiedzi na dodatek wapnia, przy znikomym wpływie na potencjał błony mitochondrialnej. Na pH mitochondriów nie miał wpływu wzrost mitochondrialnego wapnia wywołany obciążeniem karboksylowym SNARF-1.Nieprawidłowe punkty izobestyczne skutkują nieprawidłową korekcją R i NADH. Dlatego zadbaj o to, aby zawsze prawidłowo mierzyć tło i obszar komórki wolne od komórek. Technika ta służy do przygotowania mitochondrialnych badań dynamiki wapnia w wyciekach bioanalitycznych.

a-novel-nicotinamide-adenine-dinucleotide-correction-method-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Sygnały wapniowe odgrywają kluczową rolę w wielu procesach komórkowych, w tym w ekspresji genów, przeżywalności i różnicowaniu. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak przeprowadzić obrazowanie wapnia z wykorzystaniem Fura-2 AM. Obrazowanie wapnia jest cennym narzędziem do badania w czasie rzeczywistym regulacji wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia oraz jego wpływu na kaskady sygnałowe.

Obrazowanie wapniowe neuronów korowych z użyciem Fura-2 AM

Zakres wlotu Ca2+ zależnego od zapasów (SOCE) można monitorować przy użyciu fluorescencyjnych wskaźników Ca2+. Wygaszanie tych wskaźników przez Mn2+ pozwala na badanie SOCE w hodowlach komórkowych i włóknach mięśni szkieletowych. Opisano również technikę umożliwiającą rozdzielczość przestrzenną i czasową SOCE poprzez obrazowanie konfokalne mechanicznie odskórkowanych włókien mięśniowych.

Pomiar wewnątrzkomórkowego napływu wapnia sterowanego zapasami w żywych komórkach z wykorzystaniem fluorescencji: od hodowlanych komórek nowotworowych po włókna mięśni szkieletowych

Ten film opisuje test oparty na obrazowaniu opartym na mikroskopii konfokalnej, mierzący pobieranie wapnia przez mitochondria w hodowanych komórkach. Test wykorzystuje wrażliwy na wapń barwnik fluorescencyjny Rhod-2/AM do pomiaru mitochondrialnego wapnia w permeabilizowanych komórkach hodowlanych.

Test napływu wapnia w celu pomiaru mitochondrialnego wychwytu wapnia w hodowanych komórkach

Procedury są opisane w celu jednoczesnego rejestrowania potencjału błonowego lub prądu oraz zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. Neurony jądra nadskrzyżowaniowego są wypełnione wskaźnikiem wapnia bis-fura-2 za pomocą elektrody patch clamp w konfiguracji patch clamp całej komórki.

Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i obrazowanie wapnia neuronów jądra nadskrzyżowaniowego

Ten artykuł opisuje protokół, który ocenia zmiany wrażliwości miofilamentu Ca2+ podczas skurczu w izolowanych miocytach serca szczura. Wraz z elektrofizjologią serca, skurczowymi/rozkurczowymi poziomami cytozolu Ca2+ i skurczem/rozluźnieniem, pomiar ten jest niezbędny do wzmocnienia mechanizmów pośredniczących w sprzężeniu pobudzenia-skurczu serca w zdrowych i chorych sercach.

Ocena wrażliwości miofilamentu ca2+ leżącej u podstaw sprzężenia wzbudzenia-skurczu serca

Mitochondria mogą wykorzystywać potencjał elektrochemiczny w swojej wewnętrznej błonie (ΔΨm) do sekwestracji wapnia (Ca2+), co pozwala im kształtować cytozolową sygnalizację Ca2+ w komórce. Opisano metodę jednoczesnego pomiaru wychwytu Ca2+ i ΔΨm w mitochondriach w żywych komórkach za pomocą barwników fluorescencyjnych i mikroskopii konfokalnej.

Jednoczesny pomiar mitochondrialnego wapnia i potencjału błony mitochondrialnej w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Prezentujemy metodologię izolacji mysich miocytów oraz sposób uzyskiwania śladów napięcia lub wapnia jednocześnie ze śladami skracania sarkomeru za pomocą fotometrii fluorescencyjnej z jednoczesnymi cyfrowymi pomiarami geometrii komórek.

Obrazowanie optyczne izolowanych mysich miocytów komorowych

Obrazowanie wapnia w komórkach jest wszechstronną metodologią do badania dynamicznej sygnalizacji pojedynczych komórek, na mieszanych populacjach w kulturze, a nawet na przebudzonych zwierzętach, w oparciu o ekspresję przepuszczalnych dla wapnia kanałów/receptorów, które dają unikalne sygnatury funkcjonalne.

Wizualizacja zmian w obwodzie neuron-glej za pomocą techniki obrazowania wapnia

Przedstawiono zestaw protokołów, które opisują pomiar funkcji skurczu za pomocą wykrywania długości sarkomeru wraz z pomiarem przejściowym wapnia (Ca2+) w izolowanych miocytach szczurów. Uwzględniono również zastosowanie tego podejścia w badaniach na zwierzęcych modelach niewydolności serca.

Analiza dysfunkcji kurczliwości serca i stanów przejściowych Ca2+ w miocytach gryzoni

Ten protokół opisuje metodę jednoczesnego pomiaru cytozolu, wolnego wapnia [Ca2+]i i średnicy naczynia w kurczących się naczyniach limfatycznych w czasie rzeczywistym, a następnie obliczania bezwzględnych stężeń Ca2+ oraz parametrów kurczliwości/rytmiczności. Protokół ten może być stosowany do badania Ca2+ i dynamiki kurczliwości w różnych warunkach eksperymentalnych.

Ocena w czasie rzeczywistym bezwzględnego, cytozolowego, wolnego Ca2+ i odpowiadającej mu kurczliwości w izolowanych, ciśnieniowych naczyniach limfatycznych

Ten artykuł przedstawia metodę ilościowego monitorowania stężenia jonów wapnia (Ca2+) w komórkach w czasie rzeczywistym za pomocą jednokomórkowego obrazowania Ca2+ barwnikiem Fura-2/AM. Technika ta umożliwia efektywne ładowanie barwnika i dokładne obliczanie poziomów Ca2+ za pomocą współczynników intensywności fluorescencji, dzięki czemu jest to proste i szybkie podejście do zastosowań badawczych.

Obrazowanie wapnia w pojedynczych komórkach do badania aktywacji kanałów jonowych wapnia

Poznaj nową metodę korekcji sygnału NADH w pomiarach wapnia z użyciem analogu fura-2 w żywych komórkach mięśniowych. Technika ta poprawia dokładność fluorescencyjnych pomiarów stężenia Ca²⁺ w mitochondriach.

Nowa metoda korekcji dinukleotydu nikotynamidoadeninowego do wewnątrzkomórkowego pomiaru Ca2+ za pomocą analogu fura-2 w żywych komórkach (Wideo) | JoVE Journal

Nowa metoda korekcji dinukleotydu nikotynamidoadeninowego do wewnątrzkomórkowego pomiaru Ca²⁺ za pomocą analogu fura-2 w żywych komórkach

Przeglądaj więcej filmów