Nowa metoda korekcji dinukleotydu nikotynamidoadeninowego do wewnątrzkomórkowego pomiaru Ca2+ za pomocą analogu fura-2 w żywych komórkach
20 września 2019
Ze względu na nakładanie się na siebie długości fal wzbudzenia i emisji analogów NADH i fura-2, zakłócenia sygnału od obu substancji chemicznych w żywych komórkach są nieuniknione podczas ilościowego pomiaru [Ca2+]. W związku z tym opracowano nowatorską metodę korekcji online zakłóceń sygnału NADH w celu pomiaru [Ca2+].
Sondy liczby mnogiej pobudliwe UV mają nieodłączne zanieczyszczenie sygnału ze względu na dźwięki w liczbie mnogiej. Główny problem z NADH polega na ograniczeniu użycia sondy w liczbie mnogiej. Można zastosować metodę precyzyjnej korekty zewnętrznego kwitnienia z NADH, w celu wyodrębnienia prawdziwego, niezanieczyszczonego sygnału sondy w liczbie mnogiej.
Procedurę zademonstruje Jeong Hoon Lee, nasz adiunkt z mojego laboratorium. Po umożliwieniu miocytom osiądnięcia na dnie probówki, odessać supernatant. Oznacz komórki dwoma mililitrami świeżo przygotowanego jednomilimolowego roztworu rozcieńczającego fura-2-FFAM przez 60 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Pod koniec inkubacji umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut w pozycji pionowej przed usunięciem supernatantu. Następnie dodaj cztery mililitry pożywki hodowlanej o temperaturze pokojowej do przechowywania w temperaturze pokojowej. W celu identyfikacji izobestycznej fury-2-ffa in situ zamontuj rozcieńczone komórki na stoliku mikroskopu i poczekaj trzy minuty, aż komórki opadną na dno.
Wlej roztwór wolny od wapnia o temperaturze 37 stopni Celsjusza do hodowli komórkowej i zlokalizuj komórkę docelową. Obfity roztwór saponin przez 60 sekund przed ponownym obficie roztworem bezwapniowym wolnym od NADH. Jednocześnie mierz sygnały emitowane przez fura-2-ff na 450 i 500 nanometrach, używając skanowania wzbudzenia od 350 do 365 nanometrów z krokiem 0,1 nanometra i ponownie obficie roztworem bezwapniowym wolnym od NADH.
Następnie odejmij sygnały w roztworze nasyconym wapniem od sygnałów w warunkach bezwapniowych. Następnie oblicz odchylenia standardowe emisji przy każdym wzbudzeniu i wybierz długość fali wzbudzenia, pokazując minimalne wartości odchylenia standardowego jako pojedyncze punkty izobestyczne. Aby użyć wieloparametrycznego systemu pomiarowego do wykrycia sygnału tła i skorygowania sygnału w obszarze komórki, zamontuj komórki bez barwnika w kąpieli mikroskopowej i pozwól komórkom osiąść przez trzy minuty.
Wlej roztwór bezwapniowy NADH do kąpieli na około pięć minut z szybkością od dwóch do trzech mililitrów na minutę i ustaw pole obiektu tak, aby pokryło docelową komórkę. Po wyjęciu komórki poza pole zmierz sygnały tła okna bezkomórkowego i ustaw sygnały jako przesunięcia. Następnie przywróć komórkę do pozycji początkowej i zmierz sygnały tła komórki oraz obszar komórki.
Aby obliczyć współczynnik R, użyj uzyskanych sygnałów tła i obszaru komórki przed ponownym zamontowaniem komórek wolnych od barwnika pod mikroskopem i zalaniem roztworem bezwapniowym. Zmierz sygnały zgodnie ze wskazaniami przed wylewaniem zawiesiny komórek roztworem jabłczanu. Po zmierzeniu sygnałów napełnij komórki roztworem pirogronianu, a następnie oblej roztworem jabłczanu i pirogronianu i roztworem rotenonu.
Następnie oblicz nachylenie dla każdego sygnału. Tutaj pokazane są zmiany w mitochondrialnym wapniu przed i po korekcji. Wyniki wyraźnie ujawniają istotne zmiany w mitochondrialnym wapniu przy mitochondrialnym stężeniu wapnia spoczynkowym bez cytozolowego wapnia wynoszącym 1,03 plus minus 0,13 mikromola i maksymalnym mitochondrialnym wapniu przy jednym mikromolu wapnia wynoszącym 29,6 plus lub minus 1,61 mikromola.
Mitochondrialny potencjał transbłonowy monitorowano za pomocą obfitości dwóch nanozębów trzonowych TMRE. Zmianę potencjału mitochondrialnego obliczono na podstawie założonego początkowego potencjału błony mitochondrialnej wynoszącego minus 150 miliwoltów, wykazując spadek NADH w odpowiedzi na dodatek wapnia, przy znikomym wpływie na potencjał błony mitochondrialnej. Na pH mitochondriów nie miał wpływu wzrost mitochondrialnego wapnia wywołany obciążeniem karboksylowym SNARF-1.
Nieprawidłowe punkty izobestyczne skutkują nieprawidłową korekcją R i NADH. Dlatego zadbaj o to, aby zawsze prawidłowo mierzyć tło i obszar komórki wolne od komórek. Technika ta służy do przygotowania mitochondrialnych badań dynamiki wapnia w wyciekach bioanalitycznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie podejmuje problem interferencji sygnałów pochodzących od NADH i analogów fura-2 podczas pomiaru stężeń wapnia w żywych komórkach. Opracowano nowatorską metodę korekcji online w celu poprawy dokładności pomiarów [Ca2+] w obecności zanieczyszczeń sygnałem NADH.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Interferencje sygnału w pomiarach fluorescencji
- Pomiar stężenia wapnia w żywych komórkach
- Opracowanie technik korekcji
Wstęp
- Nakładanie się widm długości fal pobudzenia i emisji komplikuje pomiary.
- NADH może ograniczać użyteczność wielu sond w mikroskopii fluorescencyjnej.
- Dokładne pomiary [Ca2+] są kluczowe w badaniach komórkowych.
Zastosowane metody
- Pomiar fluorescencji z użyciem fura-2
- Testy komórkowe z wykorzystaniem miocytów
- Techniki korekcji sygnału i pomiar tła
Główne wyniki
- Zaobserwowano znaczne zmiany w stężeniach wapnia w mitochondriach.
- Opracowano systematyczne podejście w celu skorygowania interferencji NADH.
- Technikę zwalidowano za pomocą rygorystycznych procedur eksperymentalnych.
Wnioski
- Badanie pomyślnie demonstruje metodę poprawy dokładności pomiaru fluorescencji.
- Ma to znaczenie dla analiz ilościowych w biologii komórki.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładny pomiar wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia jest kluczowy dla walidacji celu w procesie odkrywania leków, szczególnie w przypadku szlaków sygnalizacji mitochondrialnej. Autofluorescencja NADH wprowadza istotne zakłócenia w testach opartych na fura-2, co obniża wiarygodność danych i zwiększa odsetek wyników fałszywie dodatnich we wczesnych etapach screeningu. Przedstawiona metoda korekty NADH zwiększa pewność prognostyczną poprzez izolację rzeczywistych sygnałów wapniowych, co wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego w programach ukierunkowanych na cele sercowo-naczyniowe i metaboliczne.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie gospodarki wapniowej mitochondriów jako hipotezy terapeutycznej w modelach chorób.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez oddzielenie autofluorescencji NADH od rzeczywistych sygnałów fura-2.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do wybranego celu poprzez ilościowe, wolne od zakłóceń pomiary przepływu wapnia.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość testu: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do późniejszego przesiewania związków poprzez ustalenie bazowej fluorescencji skorygowanej o NADH.
- Powtarzalność: Standaryzuje wybór długości fali wzbudzenia poprzez wyznaczenie punktu izobestycznego, co minimalizuje zmienność międzytestową.
- Możliwość multipleksowania: Umożliwia jednoczesny pomiar NADH, wapnia oraz pH lub potencjału błonowego przy użyciu odrębnych zestawów wzbudzenia/emisji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Bezpośrednio stosowalne w modelach dysfunkcji mitochondriów w zaburzeniach neurodegeneracyjnych i metabolicznych.
- Ciągłość translacyjna: Łączy obserwacje przepływu wapnia w fazie odkryć z walidacją przedkliniczną przy użyciu skorygowanych sygnałów fura-2-FF.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia podejmowanie bardziej wiarygodnych decyzji typu go/no-go poprzez redukcję fałszywych sygnałów w testach wapnia mitochondrialnego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkrywania leków, od testowania hipotez dotyczących celu, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po przedkliniczną walidację mechanistyczną, w szczególności w odniesieniu do celów mitochondrialnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez izolację sygnałów zależnych od wapnia od zakłóceń metabolicznych w testach na żywych komórkach.
- Przesiewanie: Poprawia gotowość testów poprzez odejmowanie tła i korekcję przesunięcia, co zwiększa stosunek sygnału do szumu podczas oceny związków.
- Analityka: Umożliwia ilościowe pomiary ratiometryczne poprzez obliczanie współczynnika R z wykorzystaniem skorygowanej emisji przy 450 nm i 500 nm.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi poprzez jednoczesny monitoring poziomu wapnia i potencjału błony mitochondrialnej z użyciem TMRE.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielokrotnego użytku system korekcji, który można zastosować w różnych typach komórek i sond fluorescencyjnych podatnych na interferencję NADH.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez eliminację wyników fałszywie dodatnich indukowanych przez NADH w sygnalizacji wapniowej.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność testu dzięki systematycznej identyfikacji punktu izobestycznego i odejmowaniu tła.
- Wartość strategiczna: Wspiera lepsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez redukcję szumu biologicznego w kaskadach wczesnego przesiewu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów mitochondrialnych z uwzględnieniem ryzyka dzięki wiarygodnym, wolnym od interferencji odczytom funkcjonalnym.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii fluorescencyjnej oraz pracy z sondami ratiometrycznymi.
- Wymaga aparatury umożliwiającej skanowanie długości fali wzbudzenia (350–365 nm) oraz detekcję podwójnej emisji (450 nm, 500 nm).
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji pomiaru sygnału tła oraz protokołów korekcji przesunięcia (offsetu).
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody przy zastosowaniu różnych procedur przygotowania komórek bez barwników.
- Jest zależne od precyzyjnego pomiaru sygnałów tła bezkomórkowego oraz obszarów komórek, aby uniknąć błędnego wyboru punktu izobestycznego.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:41
Mitochondrial Fluoroprobe Loading
1:22
In Situ Isosbestic Fura-2-FF Point Identification
2:40
Background Signal Detection and Cell Area Correction
3:30
R Factor Measurement
4:12
Results: Representative Intracellular Ca2+ Measurement
5:15
Conclusion
