Synteza deuterowanego wzorca do oznaczania ilościowego 2-arachidonoiloglicerolu w Caenorhabditis elegans

Endokannabinoidy są konserwatywnymi mediatorami lipidowymi, które regulują wiele procesów biologicznych w różnych organizmach. Pierwszymi odkrytymi endokannabinoidami są anandamid i 2-arachidonoiloglicerol, 2-AG. Nicienie C.elegans są potężnym modelem zwierzęcym do badania szerokiej gamy procesów biologicznych.

Niedawno odkryliśmy, że 2-AG odgrywa fundamentalną rolę w regulacji transportu cholesterolu u C.elegans. Z tego powodu konieczne stało się zaprojektowanie i zoptymalizowanie metody badania endogennego 2-AG poprzez detekcję i kwantyfikację u C. elegans. Wcześniej zgłaszane metody analityczne do ilościowego oznaczania 2-AG w próbkach biologicznych zwykle obejmują stosowanie deuterowanych wzorców, które są nabyte komercyjnie, aby były dostępne w sprzedaży.

Niemniej jednak są drogie, a ze względu na obecność wielu wiązań podwójnych są wrażliwe na utlenianie się z czasem. Najpopularniejsza wersja wzorców opiera się na oktadeuterowanym kwasie arachidonowym, który nadaje się do oznaczania ilościowego przez rozcieńczenie izotopowe, chromatografię cieczową i spektroskopię mas a posterior. Aby przezwyciężyć trudności związane z kosztem i stabilnością deuterowanych wzorców do ilościowego oznaczania 2-AG, zastosowaliśmy wygodną i prostą metodę przygotowania wzorca analitycznego na bazie deuteru-5-glicerolu.

Sekwencja przygotowania wzorzec wahadłowo-deuterowany wymaga trzyetapowej procedury. Możliwość przechowywania w formie chronionej do czasu, gdy będzie potrzebna. Głównym celem niniejszej pracy jest przedstawienie kompletnej metody badania 2-AG u C. elegans od syntezy analitycznego wzorca deuterowanego do przygotowania i ekstrakcji próbek nicieni i wreszcie analizy metodą chromatografii cieczowej i spektroskopii mas.

Aby uzyskać deuterowany 1-AG jako deuterowany wzorzec wewnętrzny do testów ilościowych, postępuj zgodnie z trzyetapowym protokołem. W celu ochrony tylko pierwszorzędowych alkoholi, najpierw dodaj 38 miligramów glicerolu deuterowanego do 10-mililitrowej probówki reakcyjnej za pomocą pipety Pasteura i dodaj mieszadło magnetyczne. Następnie dodaj pięć mililitrów bezwodnego DCM za pomocą pięciomililitrowej strzykawki Hamiltona i napełnij probówkę suchym azotem, aby uzyskać obojętną atmosferę.

Przygotować kąpiel przy użyciu płytkiej kolby Dewara wypełnionej destylowanym octanem etylu. Napełnić hermetycznie zamkniętą rurkę reakcyjną wewnątrz kąpieli i schłodzić ją, powoli dodając ciekły azot do octanu etylu, aż rozpuszczalnik zostanie zamrożony. Uwaga, płyn gwałtownie wrze w temperaturze pokojowej i może spowodować poważne oparzenia w kontakcie z oczami i skórą.

Następnie dodaj 54 miligramy bezwodnej kolidyny za pomocą strzykawki Hamiltona. Uwaga, kolidyna jest lotna i ma bardzo silny i nieprzyjemny zapach. Na 70 miligramów chlorku terbutylu-dimetylo-cetylu i mieszaj wszystko przez trzy godziny w temperaturze minus 78 stopni na mieszadle magnetycznym.

Dodaj dwa mililitry solanki, aby ugasić reakcję. Ekstrahować roztwór dwoma mililitrami destylowanego dichlorometanu trzykrotnie, używając oddzielnego lejka, za każdym razem zachowując ekstrakty organiczne. Następnie połącz trzy ekstrakty organiczne i wysusz siarczyn sodu.

Oczyść surową mieszaninę za pomocą chromatografii kolumnowej, używając żelu krzemionkowego jako fazy stacjonarnej i zwiększającego się o 10% gradientu octanu etylu heksanu, zaczynając od 100% heksanu, a kończąc na 100% octanie etylu. Na tym etapie estryfikacji dodać 10 miligramów produktu wcześniej podanego do 10-mililitrowej probówki reakcyjnej za pomocą pipety Pasteura i dodać mieszadło magnetyczne. Dodaj dwa mililitry bezwodnego DCM za pomocą pięciomililitrowej strzykawki Hamiltona i napełnij probówkę suchym azotem, aby uzyskać obojętną atmosferę

Schłodzić roztwór do zera stopni za pomocą łaźni lodowej. Dodaj 36 miligramów kwasu arachidonowego za pomocą wieloobjętościowej regulowanej mikropipety i wymieszaj. Następnie dodaj 15 miligramów 40-metylopirydyny i wymieszaj.

Dodać 15 miligramów diacylopropylokarbodimidu za pomocą mikropipety o regulowanej objętości i zamieszać. Dodać dwa mililitry wody, aby wygasić reakcję, a następnie trzykrotnie wyekstrahować roztwór dwoma mililitrami destylowanego DCM za pomocą rozdzielacza. Połącz trzy ekstrakty organiczne i wysusz siarczyn sodu, oczyść surową mieszaninę za pomocą chromatografii kolumnowej, używając żelu krzemionkowego jako fazy stacjonarnej, a następnie zwiększając o 10% gradient octanu etylu heksanu, zaczynając od 100% heksanu, a kończąc na 50-50% octanie etylu heksanu.

Na koniec, na etapie deprotekcji, dodaj 15 miligramów wcześniej zsyntetyzowanego produktu do 10-mililitrowej probówki reakcyjnej za pomocą pipety Pasteura i dodaj mieszadło magnetyczne. Dodaj dwa mililitry bezwodnego tetrahydrofuranu za pomocą pięciomililitrowej strzykawki Hamiltona i napełnij probówkę suchym azotem, aby uzyskać obojętną atmosferę. Następnie schłodzić roztwór do zera stopni za pomocą łaźni lodowej.

Dodaj kroplami 150 mikrolitrów jednego molowego roztworu fluorku tetrabutyloamoniowego w THF za pomocą strzykawki Hamiltona. Po godzinie dodaj dwa mililitry wody, aby ugasić reakcję. Ekstrahować roztwór dwoma mililitrami destylowanego DCM trzykrotnie za pomocą rozdzielacza.

Połącz trzy ekstrakty organiczne i wysusz na siarczynach sodu. W celu przeprowadzenia procedury wybielania obróć robaki na wysiane sześciocentymetrowe płytki NGM. Pozwól robakowi rosnąć od dwóch do trzech dni, aby na talerzu było dużo jaj i ciężarnych dorosłych.

Gdy będziesz miał dużo jaj i dorosłych, wlej pięć mililitrów M9 na talerz. Za pomocą szklanej pipety przenieś robaki do 15-mililitrowej probówki sokoła. Odwirować probówkę przez dwie minuty przy stężeniu 2 000 G i rozdrobnić robaki.

Zasysaj większość M9 bez naruszania granulki robaka. Dodaj trzy mililitry roztworu wybielającego i delikatnie wymieszaj roztwór, odwracając przez około pięć minut lub do momentu, gdy zauważysz spadek liczby nienaruszonych dorosłych robaków. Gdy większość ciał się rozpuści, odwirować przy 2 000 G przez jedną minutę.

Zassać większość roztworu wybielającego bez naruszania granulki robaka. Dodaj 15 mililitrów M9 do probówki i dobrze wymieszaj. Odwirować ponownie przy 2 000 G przez jedną minutę.

Zasysaj większość M9 bez naruszania granulki robaka. W celu przygotowania próbki robaków, niech zarodki N2 uzyskane w procesie bielenia powinny być przechowywane przez noc w buforze M9 w temperaturze 20 stopni. Następnie zbierz zsynchronizowane L1, odwirowując probówkę przez dwie minuty przy 2 000 G. Umyj robaki jeszcze raz buforem M9 i określ ilościowo liczbę żywych L1. Wysiew około 10 000 robaków na płytki NGM z jednym mililitrem OP 50 Escherichia coli, wcześniej wysuszonym.

Inkubować płytki przez co najmniej 48 godzin w temperaturze 20 stopni, aż robaki osiągną stadium L4. Zbierz robaki za pomocą zimnego bufora M9 w 50-mililitrowej tubie sokoła. Umyj je jeszcze raz i przenieś do tubki o pojemności 1,5 mililitra.

Granulować robaki przez odwirowanie w stężeniu 2 000 G przez jedną minutę. Wyeliminuj większość supernatantu. Następnie zanurz probówkę w ciekłym azocie i mieszaj w temperaturze minus 80 stopni.

Rozmrozić około 100 mikrolitrów zamrożonych granulek robaków należących do N2, a następnie dodać 1,3 mililitra metanolu. Następnie należy poddać próbkę działaniu sonikacji przez cztery minuty. Po sonikacji dodać 1 000 ppb wewnętrznego deuterowanego wzorca, 2,6 mililitra chloroformu i 1,3 mililitra 0,5 mola chlorku potasu, 0,08 mola kwasu fosforowego do końcowego stosunku jeden do jednego.

Wirować próbki przez jedną minutę, a następnie poddać je sonikacji w ultradźwiękowej łaźni wodnej przez 15 minut na lodzie. Ponownie wirować próbki dwa razy przez jedną minutę i odwirowywać je przez 10 minut w temperaturze 2 000 G w celu wywołania separacji faz. Zbierz dolną fazę do czystej szklanej probówki, wysusz ją pod azotem i ponownie zawieś w 100 mikrolitrach acetonitrylu.

Aby osiągnąć pomyślną kwantyfikację endogennego 2-AG, konieczne było zsyntetyzowanie jego nasyconego analogu przy użyciu metody trzyetapowej. Następnie dodano go do próbek robaków, wyekstrahowano i przeanalizowano za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas. Stosowany jako wzorzec wewnętrzny, syntetyczny deuterowany 1-AG był narzędziem do ilościowego oznaczania endogennego metabolitu.

Metodę zoptymalizowano przy użyciu przejść dla 2-AG i dla deuterowanego 1-AG, w których cząsteczki glicerolu są tracone. 2-AG endogenny z próbek C.elegans został pomyślnie wykryty i oznaczony ilościowo przez rozcieńczenie izotopowe chemicznie zsyntetyzowanym deuteryzowanym 1-AG przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas. Próbkę pierwszą przygotowano przy użyciu deuterowanego wzorca 1-AG, natomiast próbkę drugą bez wzorca.

Ponieważ pierwotne stężenie deutowanego wzorca w próbce pierwszej i trzeciej wynosiło po 1 000 ppb, ze stosunku powierzchni piku można obliczyć endogenne stężenie 2-AG w próbce 340 ppb dla próbki pierwszej i 360 ppb dla próbki trzeciej, co daje średnią 350 ppb. Stosunki obliczono jako jakość między obszarami pików odpowiednio 2-AG i deuterowanego 1-AG dla dwóch izolowanych próbek. Oba z deuterowanym wzorcem dodanym przed ekstrakcją.

Biorąc pod uwagę niedawno odkryte znaczenie 2-AG w zwiększaniu transportu cholesterolu i brak informacji o tym, jak lipidy wpływają na ten proces, konieczna była niezawodna metoda wykrywania tego endokannabinoidu. Pomyślne opracowanie opisanej tutaj prostej i solidnej metody syntezy w celu uzyskania deuterowanego analogu 2-AG było kluczowym krokiem w realizacji tego protokołu. Większość zgłoszonych metod ilościowego oznaczania monoacylogliceroli wiąże się z wykorzystaniem dostępnych na rynku wzorców analitycznych, które są zwykle drogie i niestabilne w normalnych warunkach przechowywania, co czyni je nieosiągalnymi dla laboratoriów o niższym budżecie.

Jednak ta metoda rozwiązuje ten problem, proponując syntezę normy przy użyciu bardziej dostępnych materiałów wyjściowych. Metoda syntezy jest prosta i nie wymaga skomplikowanych warunków, dzięki czemu idealnie nadaje się do wykonania w każdym laboratorium przy minimalnym sprzęcie i dostępie do reagentów, nawet przy ograniczonym budżecie. Podsumowując, ta nowa procedura opisuje prosty i powtarzalny sposób wykrywania i ilościowego oznaczania 2-AG, który pomoże odpowiedzieć na niektóre z pytań postawionych po opisie roli tych endokannabinoidów w transporcie cholesterolu u C.elegans.