Name: Synteza deuterowanego wzorca do oznaczania ilościowego 2-arachidonoiloglicerolu w Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 25 s
Description: Poznaj metodę ilościowego oznaczania 2-arachidonoiloglicerolu w Caenorhabditis elegans przy użyciu syntetycznego wzorca deuterowanego i spektrometrii mas LC-ESI-MS/MS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem badawczym z Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., G.P. i B.H.C. są stypendystami CONICET. D.d.M. i G.R.L. są członkami Zespołu Karier Badawczych CONICET. Jesteśmy wdzięczni Gonzalo Lamberto (INMET) za analizę LC-MS/MS i pomocną dyskusję. Kręceniem i montażem filmów są Ramiro Ortega i María Soledad Casasola z Dirección de Comunicación de la Ciencia, Facultad de Ciencia Política y Relaciones Internacionales, Universidad Nacional de Rosario w Rosario w Argentynie.

1. Przygotowanie 1-AG-d5
UWAGA: Aby uzyskać 1-AG-d5 jako deuterowany wzorzec wewnętrzny do testów ilościowych, postępuj zgodnie z protokołem opisanym poniżej.
<ol>
	<li>Zabezpieczenie różnicowe
	<ol>
		<li>Aby chronić tylko alkohole pierwszorzędowe, najpierw dodaj 38 mg glicerolu-d8 do probówki reakcyjnej o pojemności 10 ml za pomocą pipety Pasteura i dodaj mieszadło magnetyczne.</li>
		<li>Dodać 5 ml bezwodnego dichlorometanu (DCM) za pomocą 5 ml strzykawki Hamiltona i napełnić probówkę suchymN2 w celu uzyskania obojętnej atmosfery.</li>
		<li>Przygotować kąpiel przy użyciu płytkiej kolby Dewara wypełnionej destylowanym octanem etylu.</li>
		<li>Umieścić hermetycznie zamkniętą rurkę reakcyjną wewnątrz kąpieli i schłodzić ją, powoli dodając cieczN2 do octanu etylu, aż rozpuszczalnik zostanie zamrożony. 
		UWAGA: Płyn gwałtownie wrze w temperaturze pokojowej (RT) i może spowodować poważne oparzenia w kontakcie z oczami i skórą.</li>
		<li>Dodać 54 mg bezwodnej zderydyny za pomocą strzykawki Hamiltona. 
		UWAGA: Kolidyna jest lotna i ma bardzo silny i nieprzyjemny zapach.</li>
		<li>Dodać 70 mg chlorku tert-butylodimetylosililu i mieszać cały roztwór przez 3 godziny w temperaturze -78 °C na mieszadle magnetycznym.</li>
		<li>Po 3 godzinach pozostawić reakcję do ogrzania w temperaturze pokojowej i mieszać przez dodatkowe 12 godzin.</li>
		<li>Dodaj 2 ml solanki, aby ugasić reakcję.</li>
		<li>Ekstrahować roztwór 3x 2 ml destylowanego dichlorometanu za pomocą rozdzielacza, za każdym razem oszczędzając ekstrakt organiczny.</li>
		<li>Połącz trzy ekstrakty organiczne i wysusz je na siarczanie sodu.</li>
		<li>Ostrożnie odparować dichlorometan pod zmniejszonym ciśnieniem w próżniowej wyparce obrotowej, aby uniknąć rozpylania rozpuszczalnika.</li>
		<li>Oczyść surową mieszaninę za pomocą chromatografii kolumnowej, używając żelu krzemionkowego jako fazy stacjonarnej i 10% rosnącego gradientu heksanu/octanu etylu, zaczynając od 100% heksanu, a kończąc na 100% octanie etylu.</li>
		<li>Połączyć frakcje zawierające produkt i usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem w próżniowej wyparce rotacyjnej, aby otrzymać czysty 1-O,3-O-bis-(TBDMS) glicerol-d5 w postaci bezbarwnej cieczy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Estryfikacji
	<ol>
		<li>Dodać 10 mg 1-O,3-O-bis(TBDMS)-glicerol-d5 (wcześniej zsyntetyzowanego) do 10 ml probówki reakcyjnej za pomocą pipety Pasteura i dodać mieszadło magnetyczne.</li>
		<li>Dodać 2 ml bezwodnego dichlorometanu za pomocą 5 ml strzykawki Hamiltona i napełnić probówkę suchymN2 do uzyskania obojętnej atmosfery.</li>
		<li>Schłodzić roztwór do temperatury 0 °C w łaźni lodowej.</li>
		<li>Dodać 36 mg kwasu arachidonowego za pomocą regulowanej mikropipety o dużej objętości i wymieszać.</li>
		<li>Dodać 15 mg 4-dimetyloaminopirydyny i wymieszać.</li>
		<li>Dodać 15 mg N,N'-diizopropylokarbodimidu za pomocą mikropipety o regulowanej objętości i wymieszać.</li>
		<li>Pozostawić mieszaninę w temperaturze 0 °C na 3 godziny.</li>
		<li>Po 3 godzinach pozostawić reakcję do ogrzania w temperaturze pokojowej i mieszać przez dodatkowe 12 godzin.</li>
		<li>Dodaj 2 ml wody, aby ugasić reakcję.</li>
		<li>Ekstrahować roztwór organiczny 3x 2 ml destylowanego dichlorometanu (DCM) za pomocą rozdzielacza.</li>
		<li>Umieść trzy ekstrakty organiczne w tej samej probówce i wysusz je na siarczanie sodu.</li>
		<li>Ostrożnie odparować dichlorometan pod zmniejszonym ciśnieniem w próżniowej wyparce obrotowej, aby uniknąć rozpylania rozpuszczalnika.</li>
		<li>Oczyść surową mieszaninę za pomocą chromatografii kolumnowej, używając żelu krzemionkowego jako fazy stacjonarnej i 10% rosnącego gradientu heksanu/octanu etylu, zaczynając od 100% heksanu, a kończąc na 50% heksanie/50% octanie etylu.</li>
		<li>Połączyć frakcje zawierające produkt i usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem w próżniowej wyparce obrotowej, aby otrzymać czysty 1-O, 3-O-bis(TBDMS)-2-AG-d5 w postaci żółtawej cieczy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dezochrona
	<ol>
		<li>Dodać 15 mg 1-O,3-O-bis(TBDMS)-2-AG-d5 (wcześniej zsyntetyzowanego) do 10 ml probówki reakcyjnej za pomocą pipety Pasteura i dodać mieszadło magnetyczne.</li>
		<li>Dodać 2 ml bezwodnego THF za pomocą strzykawki Hamiltona o pojemności 5 ml i napełnić probówkę suchymN2, aby uzyskać obojętną atmosferę.</li>
		<li>Schłodzić roztwór do temperatury 0 °C w łaźni lodowej.</li>
		<li>Dodać kroplami 150 μl 1 M roztworu fluorku tetrabutyloamonu w THF za pomocą strzykawki Hamiltona.</li>
		<li>Pozwól reakcji ogrzać się do RT i mieszaj przez 1 godzinę.</li>
		<li>Po 1 godzinie dodaj 2 ml wody, aby wygasić reakcję.</li>
		<li>Ekstrahować roztwór 3x 2 ml destylowanego dichlorometanu za pomocą rozdzielacza.</li>
		<li>Połącz trzy ekstrakty organiczne i wysusz je na siarczanie sodu.</li>
		<li>Odparować dichlorometan pod zmniejszonym ciśnieniem w próżniowej wyparce obrotowej, aby otrzymać czysty 1-AG-d5 w postaci żółtawej cieczy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Monitoruj wszystkie reakcje za pomocą chromatografii cienkowarstwowej przeprowadzonej na wstępnie powlekanych blachach aluminiowych z żelem krzemionkowym 60 F254. Wizualizacja pasm pod lampą UV 254 nm po zabarwieniu etanolowym roztworem aldehydu 4-aniżowego.</li>
</ol>
2. Przygotowanie standardowych roztworów podstawowych i pomiarowych
<ol>
	<li>Rozpuścić 1 mg wzorca wewnętrznego 1-AG-d5 w 1 ml ACN i sonikować przez 1 minutę, aby uzyskać 1,000 ppm wzorcowego roztworu podstawowego.</li>
	<li>Aby przygotować roztwór 1000 ppb używany do oznaczania ilościowego u robaków, najpierw przygotuj roztwór o stężeniu 10 ppm: weź 10 μl roztworu podstawowego za pomocą strzykawki Hamiltona i rozcieńcz go do końcowej objętości 1 ml, dodając 990 μl ACN.</li>
	<li>Pobrać 100 μl z roztworu wytworzonego w kroku 2.2 za pomocą strzykawki Hamiltona i rozcieńczyć go do końcowej objętości 1 ml przez dodanie 900 μl ACN w celu otrzymania roztworu 1000 ppb użytego do oznaczania ilościowego.</li>
	<li>Sonikuj przez 1 minutę między każdym krokiem, aby zapewnić całkowitą rozpuszczalność. Roztwory należy przechowywać w temperaturze -78 °C w celu utrzymania stężeń i integralności wzorców. Po użyciu roztworu wzorcowego należy przepuścić trochę azotu przed zamknięciem fiolki, aby zapobiec utlenianiu.</li>
</ol>
3. Wzrost i utrzymanie C. elegans
UWAGA: Zasiej płytki agarowe pożywki dla nicieni (NGM) E. coli OP50 i rozmnóż robaki na tych płytkach.
<ol>
	<li>Wymieszaj 3 g NaCl z 17 g agaru.</li>
	<li>Dodać 2,5 g peptonu, a następnie dodać 975 ml H2O.</li>
	<li>Przechowywać w autoklawie przez 50 minut, a następnie schłodzić kolbę do temperatury 55 °C.</li>
	<li>Wymieszać następujące elementy: 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4, 25 ml 1 M KH2PO4 buforu (z których wszystkie zostały wcześniej autoklawowane) i 1 ml 5 mg/ml cholesterolu w etanolu.</li>
	<li>Utrzymując sterylne środowisko, dozować roztwór NGM do 60-milimetrowych płytek Petriego, wypełniając płytki do dwóch trzecich ich objętości. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umieść kulturę bakterii E. coli z bulionu glicerolu o temperaturze -80 °C na płytkę agarową LB. Pozostaw na noc na talerzu w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zebrać pojedynczą kolonię, aby zaszczepić 100 ml płynnego LB przez noc w temperaturze 37 °C z mieszaniem. 
	UWAGA: Nie jest konieczne sprawdzanie średnicy zewnętrznej, ponieważ w tym czasie szczep ten może osiągnąć fazę stacjonarną.</li>
	<li>Wyjmij przechowywane płytki NGM, zdejmij pokrywki z okapu z przepływem laminarnym i pozostaw otwarte, aby umożliwić odparowanie nadmiaru wilgoci z płyt.</li>
	<li>Po wysuszeniu płytek użyj pipety Pasteura, aby dodać 100 μl OP50 E. coli do środka płytki bez rozprowadzania.</li>
	<li>Pozostaw trawnik OP50 E. coli do wzrostu na noc w temperaturze pokojowej lub 37 °C przez 8 godzin.</li>
	<li>Dodać żądaną liczbę zarodków robaków otrzymanych przez poddziałanie podchlorynu lub "wybielanie" (sekcja 4). 
	UWAGA: Ostudzić talerze do temperatury RT przed dodaniem robaków.</li>
</ol>
4. Technika wybielania do synchronizacji kultur C elegans
<ol>
	<li>Nasiona i kawałki robaków na 6 cm talerze NGM.</li>
	<li>Pozostaw robaki rosnące na 2-3 dni, aby uzyskać wystarczającą liczbę jaj i ciężarnych dorosłych osobników na talerzu.</li>
	<li>Gdy będzie wystarczająca ilość jaj/dorosłych, wlej 5 ml M9 na talerz</li>.
	<li>Przenieś robaki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml za pomocą szklanej pipety.</li>
	<li>Odwiruj probówkę przez 2 minuty przy 2,000 x g i rozpuść robaki.</li>
	<li>Wysysaj większość M9, unikając zakłóceń granulki robaka.</li>
	<li>Dodać 3 ml roztworu wybielającego (stosunek NaOH:NaOCl:H2O 2:1:1).</li>
	<li>Delikatnie odwróć, aby mieszać roztwór przez 5 minut lub do momentu, gdy liczba nienaruszonych dorosłych robaków zmniejszy się. 
	UWAGA: Nie wybielać dłużej niż 5 minut.</li>
	<li>Wirować przez 1 minutę przy 2,000 x g i odsysać większość roztworu wybielającego bez naruszania osadu robaka.</li>
	<li>Dodaj 15 ml M9 i dobrze wymieszaj.</li>
	<li>Odwirować ponownie przy 2000 x g przez 1 min.</li>
	<li>Wysysaj większość M9 bez naruszania granulki robaka.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.10-4.12 jeszcze raz lub dwa razy.</li>
	<li>Dodać 5 ml świeżego M9 i wymieszać.</li>
	<li>Pozwól jajom wykluć się przez noc, delikatnie kołysząc.</li>
</ol>
5. Przygotowanie próbki robaka
<ol>
	<li>Pozostawić zarodki N2 uzyskane w procesie bielenia na noc wylęgnąć się w buforze M9 (5 ml w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml) w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Zbierz zsynchronizowane L1, odwirowując probówkę przez 2 minuty przy 2,000 x g.</li>
	<li>Umyj robaki buforem M9 1x, a następnie określ ilościowo liczbę żywych robaków L1.</li>
	<li>Wysiew około 10 000 robaków na płytki NGM (średnica 10 cm) z 1 ml OP50 E. coli (wcześniej wysuszonych).</li>
	<li>Inkubować płytki przez 48 godzin w temperaturze 20 °C, aż robaki osiągną stadium L4.</li>
	<li>Zbierz robaki za pomocą zimnego bufora M9 w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml, umyj je 1x, a następnie przenieś do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Granulować robaki przez odwirowanie przy 2 000 x g przez 1 minutę, usunąć większość supernatantu, zanurzyć probówki w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
6. Ekstrakcja lipidów
<ol>
	<li>Rozmrozić na lodzie około 100 μl zamrożonych granulek robaków należących do N2, dodać 1,3 ml metanolu i poddać próbkę sonikacji przez 4 minuty.</li>
	<li>Dodać 2,6 ml chloroformu i 1,3 ml 0,5 M KCl/0,08 M H3PO4 do końcowego stosunku 1:2:1, 1000 ppb wzorca wewnętrznego 1-AG-d5 i butylowany hydroksytoluen jako środek przeciwutleniający w końcowym stężeniu 50 μg/ml.</li>
	<li>Wirować próbki przez 1 minutę i sonikować w ultradźwiękowej łaźni wodnej przez 15 minut na lodzie.</li>
	<li>Wirować próbki 2x przez 1 minutę i odwirowywać przez 10 minut przy 2 000 x g, aby wywołać separację faz.</li>
	<li>Zebrać dolną fazę i zebrać ją w czystej probówce, wysuszyć pod azotem i ponownie zawiesić stałą pozostałość w 100 μl ACN.</li>
</ol>
7. Analiza endokannabinoidów metodą HPLC-MS/MS
<ol>
	<li>Użyj chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrem masowym ESI z potrójnym kwadrupolem do wykrywania i ilościowego oznaczania 2-AG w próbkach nicieni.</li>
	<li>Dla HPLC z odwróconymi fazami należy stosować następujące proporcje: od 0,0-0,5 min H2O:ACN (40:60), 0,5-6,5 min H2O:ACN (40:60) do (25:75), 6,5-7,5 min H2O:ACN (25:75), 7,5-8,0 min H2O:ACN (25:75) do (40:60), 8,0-12,0 min H2O:ACN (40:60).</li>
	<li>Utrzymuj temperaturę kolumny na poziomie 40 °C i ustaw temperaturę tacy automatycznego podajnika próbek na 10 °C.</li>
	<li>Ustaw następujące warunki jonizacji: tryb jonów dodatnich; temperatura gazu suszącego (N2) = 300 °C; natężenie przepływu gazu suszącego = 10 l/min; ciśnienie nebulizatora = 10 UA; i napięcie nasadki = 4 kV.</li>
	<li>Do wykrywania analitu należy użyć MRM z następującymi przejściami: 379,2 m/z do 289,2 m/z dla 2-AG i 384,2 m/z do 289,2 m/z dla 1-AG-d5.</li>
</ol>
8. Kwantyfikacja endokannabinoidów u robaków
<ol>
	<li>Użyć deuterowanego wzorca wewnętrznego 1-AG-d5 i obliczyć stosunek powierzchni pików analitu do wzorca wewnętrznego.</li>
	<li>Użyj następujących przejść: 384,2 m/z do 287,2 m/z dla 2-AG i 379,2 m/z do 287,2 m/z dla 1-AG-d5.</li>
	<li>Obliczyć stężenie endogennego 2-AG, porównując je ze stosunkami powierzchni pików deuterowanego wzorca, stosując wartość stężenia wzorca.</li>
</ol>

<ol><li>McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+origins+of+the+endocannabinoid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Evolutionary origins of the endocannabinoid system.</a> Gene. 370, 64-74 (2006).</li>
<li>Le Foll, B., Goldberg, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoid+CB1+receptor+antagonists+as+promising+new+medications+for+drug+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 312 (3), 875-883 (2005).</li>
<li>Pesce, M., Esposito, G., Sarnelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoids+in+the+treatment+of+gastrointestinal+inflammation+and+symptoms%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoids in the treatment of gastrointestinal inflammation and symptoms.</a> Current Opinion in Pharmacology. 43, 81-86 (2018).</li>
<li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+the+worm%3A+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (21), 4774-4807 (2011).</li>
<li>Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+in+regenerative+medicine%3A+a+simple+model+for+a+complex+discipline%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans in regenerative medicine: a simple model for a complex discipline.</a> Drug Discovery Today. 19 (6), 730-734 (2014).</li>
<li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acylethanolamine+signalling+mediates+the+effect+of+diet+on+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 473 (7346), 226-229 (2011).</li>
<li>Galles, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoids+in+Caenorhabditis+elegans+are+essential+for+the+mobilization+of+cholesterol+from+internal+reserves%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6398(2018).</li>
<li>Kurihara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Arachidonoylglycerol+and+Anandamide+Oppositely+Modulate+Norepinephrine+Release+from+the+Rat+Heart+Sympathetic+Nerves%5BTitle%5D)+AND+%22The+Japanese+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">2-Arachidonoylglycerol and Anandamide Oppositely Modulate Norepinephrine Release from the Rat Heart Sympathetic Nerves.</a> The Japanese Journal of Pharmacology. 87 (1), 93-96 (2001).</li>
<li>Harris, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+Serotonergic+Food+Signal+Stimulating+Sensory-Mediated+Aversive+Behavior+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dissecting the Serotonergic Food Signal Stimulating Sensory-Mediated Aversive Behavior in C. elegans.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21897(2011).</li>
<li>Pastuhov, S. I., Matsumoto, K., Hisamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoid+signaling+regulates+regenerative+axon+navigation+in+Caenorhabditis+elegans+via+the+GPCRs+NPR-19+and+NPR-32%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoid signaling regulates regenerative axon navigation in Caenorhabditis elegans via the GPCRs NPR-19 and NPR-32.</a> Genes to Cells. 21 (7), 696-705 (2016).</li>
<li>Oakes, M. D., Law, W. J., Clark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoids+Activate+Monoaminergic+Signaling+to+Modulate+Key+C.+elegans+Behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cannabinoids Activate Monoaminergic Signaling to Modulate Key C. elegans Behaviors.</a> Journal of Neuroscience. 37 (11), 2859-2869 (2017).</li>
<li>Sofia, R. D., Nalepa, S. D., Harakal, J. J., Vassar, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-edema+and+analgesic+properties+of+%CE%949-tetrahydrocannabinol+%28THC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Anti-edema and analgesic properties of Δ9-tetrahydrocannabinol (THC).</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 186 (3), 646-655 (1973).</li>
<li>Mills, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoamines+and+neuropeptides+interact+to+inhibit+aversive+behaviour+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 31 (3), 667-678 (2012).</li>
<li>Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+identification+of+anandamide+and+2-arachidonoylglycerol+in+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biodiversity%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes.</a> Chemistry & Biodiversity. 5 (11), 2431-2441 (2008).</li>
<li>Lehtonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+endocannabinoids+in+nematodes+and+human+brain+tissue+by+liquid+chromatography+electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%3A+Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Determination of endocannabinoids in nematodes and human brain tissue by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879 (11-12), 677-694 (2011).</li>
<li>Aarnio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+Elegans+Mutants+Predict+Regulation+of+Fatty+Acids+and+Endocannabinoids+by+the+CYP-35A+Gene+Family%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis Elegans Mutants Predict Regulation of Fatty Acids and Endocannabinoids by the CYP-35A Gene Family.</a> Frontiers in Pharmacology. 2 (12), 12(2011).</li>
<li>Annibal, A., Karalay, Ö, Latza, C., Antebi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+EI-GC%2FMS+method+for+the+accurate+quantification+of+anti-aging+compound+oleoylethanolamine+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel EI-GC/MS method for the accurate quantification of anti-aging compound oleoylethanolamine in C. elegans.</a> Analytical Methods. 10 (22), 2551-2559 (2018).</li>
<li>Oakes, M., Law, W. J., Komuniecki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoids+Stimulate+the+TRP+Channel-Dependent+Release+of+Both+Serotonin+and+Dopamine+to+Modulate+Behavior+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cannabinoids Stimulate the TRP Channel-Dependent Release of Both Serotonin and Dopamine to Modulate Behavior in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (21), 4142-4152 (2019).</li>
<li>Batugedara, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helminth-Derived+Endocannabinoids+That+Have+Effects+on+Host+Immunity+Are+Generated+during+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Helminth-Derived Endocannabinoids That Have Effects on Host Immunity Are Generated during Infection.</a> Infection and Immunity. 86 (11), e00441(2018).</li>
<li>Zhang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+2-arachidonoylglycerol%2C+1-arachidonoylglycerol+and+arachidonic+acid+in+mouse+brain+tissue+using+liquid+chromatography%2Ftandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of 2-arachidonoylglycerol, 1-arachidonoylglycerol and arachidonic acid in mouse brain tissue using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 45 (2), 167-177 (2010).</li>
<li>Zoerner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+UPLC-MS%2FMS+quantification+of+the+endocannabinoids+2-arachidonoyl+glycerol+%282AG%29%2C+1-arachidonoyl+glycerol+%281AG%29%2C+and+anandamide+in+human+plasma%3A+Minimization+of+matrix-effects%2C+2AG%2F1AG+isomerization+and+degradation+by+toluene+solvent+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Simultaneous UPLC-MS/MS quantification of the endocannabinoids 2-arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and anandamide in human plasma: Minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomerization and degradation by toluene solvent extraction.</a> Journal of Chromatography B. 883-884, 161-171 (2012).</li>
<li>Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+simultaneous+determination+of+N-arachidonoylethanolamine%2C+N-oleoylethanolamine%2C+N-palmitoylethanolamine+and+2-arachidonoylglycerol+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).</li>
<li>Keereetaweep, J., Chapman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomic+Analysis+of+Endocannabinoid+Signaling%3A+Targeted+Metabolite+Identification+and+Quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plasticity%22%5BJournal%5D)">Lipidomic Analysis of Endocannabinoid Signaling: Targeted Metabolite Identification and Quantification.</a> Neural Plasticity. , (2016).</li>
<li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li>
<li>Zoerner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+endocannabinoids+in+biological+systems+by+chromatography+and+mass+spectrometry%3A+a+comprehensive+review+from+an+analytical+and+biological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Quantification of endocannabinoids in biological systems by chromatography and mass spectrometry: a comprehensive review from an analytical and biological perspective.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 706-723 (2011).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Endokannabinoidy to klasa lipidów, które są zaangażowane w regulację tworzenia się dauer u C. elegans7. Mówiąc dokładniej, synteza wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA) jest ważna dla transportu cholesterolu i rozwoju reprodukcyjnego robaków. Okazuje się tutaj, że 2-AG, kwas arachidonowy zawierający endokannabinoid, jest odpowiedzialny za przywrócenie larwy dauer do normalnego cyklu u robaków, które mają upośledzony metabolizm cholesterolu7.
<p class="j...

Endokannabinoidy regulują wiele procesów biologicznych w różnych organizmach i są konserwatywnymi mediatorami lipidów1. Pierwszymi odkrytymi i najlepiej scharakteryzowanymi endokannabinoidami są anandamid (arachidonoiloetanoloamid, AEA) i 2-arachidonoiloglicerol (2-AG). Endokannabinoidy odgrywają wiele kluczowych ról, w tym te zaangażowane w układy nagrody w mózgu, a także uzależnienie od narkotyków, pamięć, nastrój i procesy metaboliczne2. AEA i 2-AG są syntetyzowane tylko wtedy, gdy są potrzebne i mają krótką żywotność, a także są degradowane przez wychwyt zwrotny i hydrolizę białek transportowych3.
Wykorzystanie modeli zwierzęcych, takich jak Caenorhabditis elegans (C. elegans) stało się ważne do badania szerokiej gamy procesów biologicznych, w tym apoptozy, sygnalizacji komórkowej, cyklu komórkowego, polaryzacji komórek, regulacji genów, metabolizmu, starzenia się i determinacji płci4,5. Dodatkowo C. elegans jest doskonałym modelem do badania fizjologicznych ról wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA). AEA zostało zidentyfikowane u C. elegans i jest zmniejszone w ramach ograniczeń dietetycznych6. Niedobór ten wydłuża życie nicieni poprzez mechanizm ograniczeń dietetycznych, który może być stłumiony przez suplementację endokannabinoidem. Niedawno odkryto, że 2-AG i AEA odgrywają fundamentalną rolę w regulacji transportu cholesterolu u C. elegans7. Co ważniejsze, ustalono, że suplementacja egzogennym 2-AG może uratować zatrzymanie dawki, które jest spowodowane upośledzonym transportem cholesterolu w mutantach C. elegans Niemann-Pick typu C1. elegans.
Aby lepiej zrozumieć związek 2-AG z transportem cholesterolu i innymi procesami biologicznymi u nicieni (np. sygnalizacją monoaminergiczną, nocycepcją i lokomocją), kluczowe jest zbadanie tego endogennego metabolitu i jego wpływu w pewnych warunkach środowiskowych i żywieniowych8,9,10,11,12,13. Dlatego konieczne jest zaprojektowanie i zoptymalizowanie metody wykrywania i ilościowego oznaczania endogennego 2-AG w C. elegans, która jest łatwa w użyciu dla naukowców z różnych dziedzin, zwłaszcza tych, którzy badają zachowanie nicieni w odniesieniu do tego endokannabinoidu.
W 2008 roku Lethonenowi i współpracownikom udało się zidentyfikować 2-AG i AEA u C. elegans za pomocą metod analitycznych LC-MS14. W 2011 roku udało im się rozszerzyć tę technikę na inne endokannabinoidy15. Nowsze prace wykazały inne metody analityczne, które odniosły sukces w wykrywaniu i ilościowym określaniu endokannabinoidów w C. elegans, w tym spektrometria mas i GC-MS16,17,18, a także zgłoszono, że podobne metody analityczne można rozszerzyć na inne modele19.
Poprzednio opisywane metody analityczne używane do ilościowego oznaczania 2-AG w próbkach biologicznych zazwyczaj obejmują użycie deuterowanych wzorców, które są komercyjnie nabyte i wymagają dostępności do zakupu20,21. Wiele wzorców analitycznych do oznaczania ilościowego endokannabinoidów LC-MS/MS jest dostępnych na rynku u różnych dostawców. Niemniej jednak są drogie, są wrażliwe i z czasem ulegają utlenieniu ze względu na obecność wielu wiązań podwójnych. Najpopularniejsze wersje tych wzorców są oparte na okta-deuterowanym kwasie arachidonowym i nadają się do oznaczania ilościowego przez rozcieńczenie izotopowe LC-MS/MS14,22. Ponadto większość tych wzorców jest podstawiana w pozycji 2 glicerolu, co czyni je niestabilnymi w większości warunków, ponieważ są podatne na migrację acylową19,23.
Aby przezwyciężyć trudności związane z kosztami i stabilnością tych deuterowanych standardów, przedstawiono wygodną i prostą metodę przygotowania wzorca analitycznego opartego na glicerolu-d5. Sekwencja przygotowania wzorca penta-deuterowanego wymaga trzyetapowej procedury, w wyniku której powstaje wzorzec 1-AG-d5, który jest stabilny i nie ulega migracji acylowej (główny problem przy dążeniu do syntezy 2-monoacylogliceroli).
Głównym celem tutaj jest pokazanie prostej i powtarzalnej metody badania 2-AG u C. elegans, w tym syntezy analitycznego wzorca deuterowanego, przygotowania i ekstrakcji próbek nicieni oraz analizy za pomocą LC-MS/MS (rysunek 1). Ta syntetyczna procedura jest możliwa do osiągnięcia bez zaawansowanej wiedzy na temat syntezy organicznej lub specjalnego sprzętu, dzięki czemu jest odpowiednia dla naukowców z różnych dziedzin, którzy badają zachowanie C. elegans pod wpływem endokannabinoidów. Metodę można również rozszerzyć na inne modele badawcze, dzięki czemu jest przydatna dla różnych celów. Wzorzec, przygotowany zgodnie z opisem tutaj, został zastosowany do pomyślnego opracowania szybkiej i niezawodnej metody chromatograficznej, która pozwala na skuteczne wykrywanie i oznaczanie ilościowe 2-AG w powtarzalny sposób.

<table><tbody><tr><td>4-dimetyloaminopirydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107700</td><td>klasa odczynnika, 99%</td></tr> <tr><td>przeciwutleniacz BHT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W21805</td><td></td></tr><tr><td>Kwas arachidonowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10931</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol-d8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>447498</td><td></td></tr><tr><td>Detektor masy Potrójny kwadrupol</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>TSQ Quantum Access Max</td></tr><tr><td>N,N'-diizopropylokarbimidymid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D125407</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr NMR</td><td>Bruker</td><td></td><td>Avance II 300 MHz</td></tr><tr><td>kolumna HPLC z odwróconymi fazami</td><td>Thermo Fisher</td><td>25003-052130</td><td>C18 Hypersil-GOLD (50 x 2,1 mm)</td></tr><tr><td>chlorek tert-butylodimetylosililu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190500</td><td>klasa odczynnika, 97%</td></tr><tr><td>Fluorek tetrabutyloamonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216143</td><td>1,0 m w systemie THF</td></tr><tr><td>UHPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Ultimate 3000 RSLC Dionex</td></tr><tr><td>szczep robaka N2 Bristol</td><td>Caenorhabditis Centrum Genetyki (CGC)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

synteza deuterowanego wzorca do oznaczania ilościowego 2-arachidonoiloglicerolu w caenorhabditis elegans

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Ta praca przedstawia metodę przygotowania standardu analitycznego do jakościowej i ilościowej analizy 2-arachidonoilu glicerolu (2-AG) metodą chromatografii cieczowej-elektrorozpylania Jonizacji-tandemowej spektrometrii mas (LC-ESI-MS/MS). Endokannabinoidy są konserwatywnymi mediatorami lipidowymi, które regulują wiele procesów biologicznych w różnych organizmach. Stwierdzono, że u C. elegans 2-AG pełni różne role, w tym modulację tworzenia dauer i metabolizmu cholesterolu. W niniejszym raporcie opisano metodę przezwyciężenia trudności związanych z kosztami i stabilnością deuterowanych wzorców wymaganych do oznaczania ilościowego 2-AG. Procedura syntezy wzorca jest prosta i może być wykonana w dowolnym laboratorium, bez konieczności posiadania specjalistycznej wiedzy z zakresu syntezy organicznej lub specjalnego sprzętu. Ponadto opisano modyfikację metody Folcha polegającą na ekstrakcji deuterowanego wzorca z kultury C. elegans. Na koniec opisano ilościową i analityczną metodę wykrywania 2-AG przy użyciu stabilnego izotopowo znakowanego analogu 1-AG-d5, która zapewnia wiarygodne wyniki w szybkim przebiegu chromatograficznym. Procedura ta jest przydatna do badania wielorakich ról 2-AG w C. elegans, a jednocześnie ma zastosowanie do innych badań metabolitów w różnych organizmach.

Analog znakowany izotopowo został pomyślnie zsyntetyzowany z dostępnego komercyjnie d8-glicerolu i kwasu arachidonowego przy użyciu trzystopniowej metody syntetycznej (Rysunek 2, Rysunek 3). Etapy te są proste i nie wymagają zaawansowanego sprzętu, specjalnie kontrolowanych warunków ani drogich odczynników. W związku z tym metoda ta jest odporna i może zostać z powodzeniem rozszerzona na syntezę monoacyloglicerydów zaw...

Ta praca opisuje solidną i prostą metodę wykrywania i ilościowego oznaczania endokannabinoidu 2-arachidonoiloglycerolu (2-AG) u C. elegans. Analityczny deuterowany wzorzec nas przygotowany i stosowany do oznaczania ilościowego 2-AG przez rozcieńczenie izotopowe i chromatografię cieczową - jonizację elektronową - tandemową spektrometrię mas (LC-ESI-MS / MS).

Synteza deuterowanego wzorca do oznaczania ilościowego 2-arachidonoiloglicerolu w Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

Endokannabinoidy są konserwatywnymi mediatorami lipidowymi, które regulują wiele procesów biologicznych w różnych organizmach. Pierwszymi odkrytymi endokannabinoidami są anandamid i 2-arachidonoiloglicerol, 2-AG. Nicienie C.elegans są potężnym modelem zwierzęcym do badania szerokiej gamy procesów biologicznych.Niedawno odkryliśmy, że 2-AG odgrywa fundamentalną rolę w regulacji transportu cholesterolu u C.elegans. Z tego powodu konieczne stało się zaprojektowanie i zoptymalizowanie metody badania endogennego 2-AG poprzez detekcję i kwantyfikację u C. elegans. Wcześniej zgłaszane metody analityczne do ilościowego oznaczania 2-AG w próbkach biologicznych zwykle obejmują stosowanie deuterowanych wzorców, które są nabyte komercyjnie, aby były dostępne w sprzedaży.Niemniej jednak są drogie, a ze względu na obecność wielu wiązań podwójnych są wrażliwe na utlenianie się z czasem. Najpopularniejsza wersja wzorców opiera się na oktadeuterowanym kwasie arachidonowym, który nadaje się do oznaczania ilościowego przez rozcieńczenie izotopowe, chromatografię cieczową i spektroskopię mas a posterior. Aby przezwyciężyć trudności związane z kosztem i stabilnością deuterowanych wzorców do ilościowego oznaczania 2-AG, zastosowaliśmy wygodną i prostą metodę przygotowania wzorca analitycznego na bazie deuteru-5-glicerolu.Sekwencja przygotowania wzorzec wahadłowo-deuterowany wymaga trzyetapowej procedury. Możliwość przechowywania w formie chronionej do czasu, gdy będzie potrzebna. Głównym celem niniejszej pracy jest przedstawienie kompletnej metody badania 2-AG u C. elegans od syntezy analitycznego wzorca deuterowanego do przygotowania i ekstrakcji próbek nicieni i wreszcie analizy metodą chromatografii cieczowej i spektroskopii mas.Aby uzyskać deuterowany 1-AG jako deuterowany wzorzec wewnętrzny do testów ilościowych, postępuj zgodnie z trzyetapowym protokołem. W celu ochrony tylko pierwszorzędowych alkoholi, najpierw dodaj 38 miligramów glicerolu deuterowanego do 10-mililitrowej probówki reakcyjnej za pomocą pipety Pasteura i dodaj mieszadło magnetyczne. Następnie dodaj pięć mililitrów bezwodnego DCM za pomocą pięciomililitrowej strzykawki Hamiltona i napełnij probówkę suchym azotem, aby uzyskać obojętną atmosferę.Przygotować kąpiel przy użyciu płytkiej kolby Dewara wypełnionej destylowanym octanem etylu. Napełnić hermetycznie zamkniętą rurkę reakcyjną wewnątrz kąpieli i schłodzić ją, powoli dodając ciekły azot do octanu etylu, aż rozpuszczalnik zostanie zamrożony. Uwaga, płyn gwałtownie wrze w temperaturze pokojowej i może spowodować poważne oparzenia w kontakcie z oczami i skórą.Następnie dodaj 54 miligramy bezwodnej kolidyny za pomocą strzykawki Hamiltona. Uwaga, kolidyna jest lotna i ma bardzo silny i nieprzyjemny zapach. Na 70 miligramów chlorku terbutylu-dimetylo-cetylu i mieszaj wszystko przez trzy godziny w temperaturze minus 78 stopni na mieszadle magnetycznym.Dodaj dwa mililitry solanki, aby ugasić reakcję. Ekstrahować roztwór dwoma mililitrami destylowanego dichlorometanu trzykrotnie, używając oddzielnego lejka, za każdym razem zachowując ekstrakty organiczne. Następnie połącz trzy ekstrakty organiczne i wysusz siarczyn sodu.Oczyść surową mieszaninę za pomocą chromatografii kolumnowej, używając żelu krzemionkowego jako fazy stacjonarnej i zwiększającego się o 10% gradientu octanu etylu heksanu, zaczynając od 100% heksanu, a kończąc na 100% octanie etylu. Na tym etapie estryfikacji dodać 10 miligramów produktu wcześniej podanego do 10-mililitrowej probówki reakcyjnej za pomocą pipety Pasteura i dodać mieszadło magnetyczne. Dodaj dwa mililitry bezwodnego DCM za pomocą pięciomililitrowej strzykawki Hamiltona i napełnij probówkę suchym azotem, aby uzyskać obojętną atmosferę.Schłodzić roztwór do zera stopni za pomocą łaźni lodowej. Dodaj 36 miligramów kwasu arachidonowego za pomocą wieloobjętościowej regulowanej mikropipety i wymieszaj. Następnie dodaj 15 miligramów 40-metylopirydyny i wymieszaj.Dodać 15 miligramów diacylopropylokarbodimidu za pomocą mikropipety o regulowanej objętości i zamieszać. Dodać dwa mililitry wody, aby wygasić reakcję, a następnie trzykrotnie wyekstrahować roztwór dwoma mililitrami destylowanego DCM za pomocą rozdzielacza. Połącz trzy ekstrakty organiczne i wysusz siarczyn sodu, oczyść surową mieszaninę za pomocą chromatografii kolumnowej, używając żelu krzemionkowego jako fazy stacjonarnej, a następnie zwiększając o 10% gradient octanu etylu heksanu, zaczynając od 100% heksanu, a kończąc na 50-50% octanie etylu heksanu.Na koniec, na etapie deprotekcji, dodaj 15 miligramów wcześniej zsyntetyzowanego produktu do 10-mililitrowej probówki reakcyjnej za pomocą pipety Pasteura i dodaj mieszadło magnetyczne. Dodaj dwa mililitry bezwodnego tetrahydrofuranu za pomocą pięciomililitrowej strzykawki Hamiltona i napełnij probówkę suchym azotem, aby uzyskać obojętną atmosferę. Następnie schłodzić roztwór do zera stopni za pomocą łaźni lodowej.Dodaj kroplami 150 mikrolitrów jednego molowego roztworu fluorku tetrabutyloamoniowego w THF za pomocą strzykawki Hamiltona. Po godzinie dodaj dwa mililitry wody, aby ugasić reakcję. Ekstrahować roztwór dwoma mililitrami destylowanego DCM trzykrotnie za pomocą rozdzielacza.Połącz trzy ekstrakty organiczne i wysusz na siarczynach sodu. W celu przeprowadzenia procedury wybielania obróć robaki na wysiane sześciocentymetrowe płytki NGM. Pozwól robakowi rosnąć od dwóch do trzech dni, aby na talerzu było dużo jaj i ciężarnych dorosłych.Gdy będziesz miał dużo jaj i dorosłych, wlej pięć mililitrów M9 na talerz. Za pomocą szklanej pipety przenieś robaki do 15-mililitrowej probówki sokoła. Odwirować probówkę przez dwie minuty przy stężeniu 2 000 G i rozdrobnić robaki.Zasysaj większość M9 bez naruszania granulki robaka. Dodaj trzy mililitry roztworu wybielającego i delikatnie wymieszaj roztwór, odwracając przez około pięć minut lub do momentu, gdy zauważysz spadek liczby nienaruszonych dorosłych robaków. Gdy większość ciał się rozpuści, odwirować przy 2 000 G przez jedną minutę.Zassać większość roztworu wybielającego bez naruszania granulki robaka. Dodaj 15 mililitrów M9 do probówki i dobrze wymieszaj. Odwirować ponownie przy 2 000 G przez jedną minutę.Zasysaj większość M9 bez naruszania granulki robaka. W celu przygotowania próbki robaków, niech zarodki N2 uzyskane w procesie bielenia powinny być przechowywane przez noc w buforze M9 w temperaturze 20 stopni. Następnie zbierz zsynchronizowane L1, odwirowując probówkę przez dwie minuty przy 2 000 G. Umyj robaki jeszcze raz buforem M9 i określ ilościowo liczbę żywych L1. Wysiew około 10 000 robaków na płytki NGM z jednym mililitrem OP 50 Escherichia coli, wcześniej wysuszonym.Inkubować płytki przez co najmniej 48 godzin w temperaturze 20 stopni, aż robaki osiągną stadium L4. Zbierz robaki za pomocą zimnego bufora M9 w 50-mililitrowej tubie sokoła. Umyj je jeszcze raz i przenieś do tubki o pojemności 1,5 mililitra.Granulować robaki przez odwirowanie w stężeniu 2 000 G przez jedną minutę. Wyeliminuj większość supernatantu. Następnie zanurz probówkę w ciekłym azocie i mieszaj w temperaturze minus 80 stopni.Rozmrozić około 100 mikrolitrów zamrożonych granulek robaków należących do N2, a następnie dodać 1,3 mililitra metanolu. Następnie należy poddać próbkę działaniu sonikacji przez cztery minuty. Po sonikacji dodać 1 000 ppb wewnętrznego deuterowanego wzorca, 2,6 mililitra chloroformu i 1,3 mililitra 0,5 mola chlorku potasu, 0,08 mola kwasu fosforowego do końcowego stosunku jeden do jednego.Wirować próbki przez jedną minutę, a następnie poddać je sonikacji w ultradźwiękowej łaźni wodnej przez 15 minut na lodzie. Ponownie wirować próbki dwa razy przez jedną minutę i odwirowywać je przez 10 minut w temperaturze 2 000 G w celu wywołania separacji faz. Zbierz dolną fazę do czystej szklanej probówki, wysusz ją pod azotem i ponownie zawieś w 100 mikrolitrach acetonitrylu.Aby osiągnąć pomyślną kwantyfikację endogennego 2-AG, konieczne było zsyntetyzowanie jego nasyconego analogu przy użyciu metody trzyetapowej. Następnie dodano go do próbek robaków, wyekstrahowano i przeanalizowano za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas. Stosowany jako wzorzec wewnętrzny, syntetyczny deuterowany 1-AG był narzędziem do ilościowego oznaczania endogennego metabolitu.Metodę zoptymalizowano przy użyciu przejść dla 2-AG i dla deuterowanego 1-AG, w których cząsteczki glicerolu są tracone. 2-AG endogenny z próbek C.elegans został pomyślnie wykryty i oznaczony ilościowo przez rozcieńczenie izotopowe chemicznie zsyntetyzowanym deuteryzowanym 1-AG przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas. Próbkę pierwszą przygotowano przy użyciu deuterowanego wzorca 1-AG, natomiast próbkę drugą bez wzorca.Ponieważ pierwotne stężenie deutowanego wzorca w próbce pierwszej i trzeciej wynosiło po 1 000 ppb, ze stosunku powierzchni piku można obliczyć endogenne stężenie 2-AG w próbce 340 ppb dla próbki pierwszej i 360 ppb dla próbki trzeciej, co daje średnią 350 ppb. Stosunki obliczono jako jakość między obszarami pików odpowiednio 2-AG i deuterowanego 1-AG dla dwóch izolowanych próbek. Oba z deuterowanym wzorcem dodanym przed ekstrakcją.Biorąc pod uwagę niedawno odkryte znaczenie 2-AG w zwiększaniu transportu cholesterolu i brak informacji o tym, jak lipidy wpływają na ten proces, konieczna była niezawodna metoda wykrywania tego endokannabinoidu. Pomyślne opracowanie opisanej tutaj prostej i solidnej metody syntezy w celu uzyskania deuterowanego analogu 2-AG było kluczowym krokiem w realizacji tego protokołu. Większość zgłoszonych metod ilościowego oznaczania monoacylogliceroli wiąże się z wykorzystaniem dostępnych na rynku wzorców analitycznych, które są zwykle drogie i niestabilne w normalnych warunkach przechowywania, co czyni je nieosiągalnymi dla laboratoriów o niższym budżecie.Jednak ta metoda rozwiązuje ten problem, proponując syntezę normy przy użyciu bardziej dostępnych materiałów wyjściowych. Metoda syntezy jest prosta i nie wymaga skomplikowanych warunków, dzięki czemu idealnie nadaje się do wykonania w każdym laboratorium przy minimalnym sprzęcie i dostępie do reagentów, nawet przy ograniczonym budżecie. Podsumowując, ta nowa procedura opisuje prosty i powtarzalny sposób wykrywania i ilościowego oznaczania 2-AG, który pomoże odpowiedzieć na niektóre z pytań postawionych po opisie roli tych endokannabinoidów w transporcie cholesterolu u C.elegans.

synthesis-deuterated-standard-for-quantification-2

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano profilowanie stabilnych izotopów za pomocą analizy chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas w celu badania przepływu metabolitów pośrednich u nicienia Caenorhabditis elegans. Szczegółowo przedstawiono metody oceny wzbogacenia izotopowego w dwutlenku węgla, kwasach organicznych i aminokwasach po ekspozycji na izotopy, zarówno podczas rozwoju na płytkach agarowych, jak i w okresie dorosłości w hodowli ciekłej.

Stabilne profilowanie izotopowe strumieni metabolicznych produktów pośrednich u Caenorhabditis elegans w stadium rozwojowym i dorosłym

Prezentujemy solidne metody biochemiczne i mikroskopowe do badania zapasów lipidów Caenorhabditis elegans. Szybka, prosta procedura barwienia utrwalającego do fluorescencyjnego obrazowania kropelek lipidów wykorzystuje właściwości spektralne lipofilowego barwnika czerwieni nilowej. Następnie przedstawiono pomiar biochemiczny triglicerydów i fosfolipidów z wykorzystaniem ekstrakcji do fazy stałej i chromatografii gazowej ze spektrometrią mas.

Biochemiczna i wysokoprzepustowa ocena mikroskopowa masy tłuszczowej w Caenorhabditis elegans

W tym artykule opisujemy zoptymalizowaną procedurę ekstrakcji i analizy prostaglandyn i innych eikozanoidów z C. elegans za pomocą LC-MS/MS.

Ekstrakcja i analiza prostaglandyn w Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans to użyteczny model do badania funkcji wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w rozwoju i fizjologii.  Protokół ten opisuje skuteczną metodę uzupełniania diety C. elegans w wielonienasycone kwasy tłuszczowe.

Suplementacja diety wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w Caenorhabditis elegans

Barwienie czerwienią nilową utrwalonych Caenorhabditis elegans jest metodą ilościowego pomiaru neutralnych złogów lipidowych, podczas gdy barwienie czerwienią olejową O ułatwia jakościową ocenę dystrybucji lipidów wśród tkanek.

Kwantyfikacja obfitości lipidów i ocena rozmieszczenia lipidów w Caenorhabditis elegans za pomocą barwienia czerwienią nilową i czerwienią olejową O

Spadek proteostazy jest cechą charakterystyczną starzenia się, ułatwiając wystąpienie chorób neurodegeneracyjnych. Przedstawiamy protokół do ilościowego pomiaru proteostazy w dwóch różnych tkankach Caenorhabditis elegans poprzez heterologiczną ekspresję powtórzeń poliglutaminy połączonych z fluorescencyjnym reporterem. Model ten umożliwia szybką analizę genetyczną proteostazy in vivo.

Kwantyfikacja swoistego dla tkanki spadku proteostazy u Caenorhabditis elegans

Worm-align/Worm_CP to prosty proces pracy FIJI/CellProfiler, który może być używany do prostowania i wyrównywania próbek Caenorhabditis elegans oraz do oceny testów opartych na obrazach całych robaków bez konieczności wcześniejszego szkolenia. Zastosowaliśmy Worm-align/Worm_CP do ilościowego oznaczania ekspresji wywołanej szokiem cieplnym u żywych zwierząt lub kropelek lipidów w ustalonych próbkach.

Worm-align i Worm_CP, dwa potoki typu open source do prostowania i kwantyfikacji danych obrazu fluorescencji uzyskanych z Caenorhabditis elegans

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia selektywne, bezznacznikowe obrazowanie określonych cząsteczek chemicznych i została skutecznie wykorzystana do obrazowania cząsteczek lipidów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy krótkie wprowadzenie do zasady działania mikroskopii SRS i opisujemy metody jej wykorzystania w obrazowaniu magazynowania lipidów w Caenorhabditis elegans.

Bezznacznikowe obrazowanie dynamiki magazynowania lipidów u Caenorhabditis elegans przy użyciu mikroskopii wymuszonego rozpraszania Ramana

Tutaj prezentujemy tanią metodę ilościową wykorzystującą spektrometrię mas z tlenkiem deuteru i chromatografią gazową (GCMS) do analizy całkowitej lipogenezy de novo kwasów tłuszczowych w brunatnej tkance tłuszczowej in vivo.

Ilościowe oznaczanie syntezy kwasów tłuszczowych de novo w brunatnej tkance tłuszczowej przy użyciu tlenku deuteru

Nauczanie nauk biologicznych może być bardziej stymulujące dla studentów dzięki zastosowaniu eksperymentów. Ten manuskrypt przedstawia dwa różne, ale uzupełniające się protokoły, które można wykorzystać w klasie, aby zachęcić uczniów do formułowania i testowania hipotez związanych z dietami wysokokalorycznymi, głodówką i starzeniem się.

Stosowanie tanich barwników do wizualizacji akumulacji glikogenu i integralności jelit u Caenorhabditis elegans

Ten protokół ustanawia metody ekstrakcji i ilościowego określania reakcji na lotny feromon płciowy w C. elegans, zapewniając narzędzia do badania komunikacji chemicznej i trajektorii nawigacji.

Lotna ekstrakcja feromonów płciowych i test chemoatrakcji w Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę ilościowego oznaczania 2-arachidonoiloglicerolu w Caenorhabditis elegans przy użyciu syntetycznego wzorca deuterowanego i spektrometrii mas LC-ESI-MS/MS.

Synteza deuterowanego wzorca do oznaczania ilościowego 2-arachidonoiloglicerolu w Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów