Przygotowanie i wykorzystanie świeżo wyizolowanych ludzkich komórek mięśni gładkich wypieracza do charakterystyki 9-fenantrolowych prądów kationowych

Komórki mięśni gładkich wypieracza tworzą ścianę pęcherza moczowego, która ostatecznie ułatwia oddawanie i magazynowanie moczu. Nasz protokół zapewnia zwalidowaną i niezawodną metodę świeżej izolacji pojedynczych komórek mięśni gładkich. Świeżo wyizolowane ludzkie komórki mięśni gładkich wypieracza dają możliwość badań elektrofizjologicznych i molekularnych na poziomie pojedynczej komórki.

Badając pojedyncze komórki mięśni gładkich wypieracza z kontrolnych, normalnych i chorych ludzkich pęcherzy moczowych, mamy możliwość walidacji celów farmakologicznych, takich jak kanały jonowe. Pojedyncze komórki mięśni gładkich ludzkiego wypieracza są idealne do eksperymentów elektrofizjologicznych, takich jak elektrofizjologia patch-clamp. Tutaj przedstawimy przykład badania pojedynczego kanału jonowego o nazwie TRPM4, przejściowy potencjał receptora melasatyny czterokanałowej, który jest nieselektywnym kanałem kationowym.

Nowicjusze mogą zmagać się z etapami preparacji i leczenia enzymatycznego, które wymagają wydajności i znajomości, w tym rozpoznawania krytycznych ważnych kroków w celu uzyskania świeżych izolowanych komórek DSM. Ważne jest, aby być zaznajomionym z histologią ludzkiego pęcherza moczowego, etapy protokołu izolowania pojedynczych komórek pozostają odporne i początkowo spodziewaj się, że przy użyciu tego protokołu uzyskasz nieoptymalne komórki. Rozpocznij od zbadania próbki pęcherza moczowego o całej grubości.

Przygwoździć próbkę, błoną śluzową skierowaną do góry i surowicą w dół, na pokrytym silikonem enancjomerze okrągłym naczyniu o średnicy 150 mm wypełnionym lodowatym DS i ostrożnie usunąć całą błonę śluzową przez ostre rozwarstwienie. Wytnij kilka pozbawionych błony śluzowej wypieracza, mięśni gładkich lub kawałków DSM. Umieść od trzech do sześciu kawałków DSM w probówce z jednym do dwóch mililitrów wstępnie podgrzanego DS zawierającego papainę i ditiotreitol lub DS-P.

Inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 45 minut, potrząsając probówką co 10 do 15 minut. Po inkubacji wyjmij DS-P z probówki i krótko umyj kawałki DSM lodowatym DS. Przenieś DS z kawałkami DSM do nowej probówki i wyjmij DS, pozostawiając kawałki DSM na dnie tuby. Dodaj jeden do dwóch mililitrów DS zawierającego kolagenazę typu II lub DS-C do probówki.

I inkubuj go w temperaturze 37 stopni Celsjusza, od czasu do czasu potrząsając. Wyrzuć DS-C i umyj kawałki DSM poddane działaniu enzymów od pięciu do 10 razy lodowatym DS. Po ostatnim praniu pozostaw DS w probówce i delikatnie rozcieraj kawałki wypolerowaną ogniowo pipetą Pasteura, aby uwolnić pojedyncze komórki DSM. Pobrać pipetę od 0,25 do jednego mililitra zawiesiny komórek do szklanej dolnej komory umieszczonej na stoliku mikroskopu odwróconego i inkubować przez co najmniej 45 minut, aby komórki mogły przylegać.

Następnie usunąć DS z kąpieli i zastąpić go roztworem E przez przefuzję. Wyciągnij kilka elektrod łatkowych, wypoleruj końcówki elektrod i w razie potrzeby pokryj końcówki woskiem dentystycznym. Napełnij końcówkę elektrody plastrowej roztworem pipety bez amfoterycyny-B, zanurzając elektrodę na krótko w roztworze.

Powodzenie elektrofizjologii patch clamp zależy od jakości ogniw DSM i solubilizacji amfoterycyny-B. Napełnij elektrodę tym samym roztworem pipety zawierającym amfoterycynę-B i zamontuj elektrodę na uchwycie podłączonym do patch clamp amplifier head stage. Użyj mikromanipulatora, aby umieścić elektrodę tuż pod powierzchnią roztworu zewnątrzkomórkowego, tak aby końcówka elektrody była po prostu zanurzona.

Następnie określ rezystancję elektrody za pomocą funkcji okna testowego membrany w komercyjnym oprogramowaniu akwizycyjnym i przesuń elektrodę w kierunku interesującego ogniwa. Dotykając powierzchni ogniwa elektrodą, utwórz giga-uszczelnienie, przykładając delikatne szybkie podciśnienie do elektrody za pomocą rurki. Powoduje to podciśnienie na końcówce elektrody, co skutkuje udanym gigauszczelnieniem, co zostało potwierdzone w teście membranowym.

Odczekać od 30 do 60 minut, aż amfoterycyna-B rozdyfunduje się w pipecie i zostanie wprowadzona do błony plazmatycznej, tworząc pory głównie selektywne w stosunku do kationów jednowartościowych. Kontynuuj monitorowanie giga-seal za pomocą funkcji testu membrany. Gdy perforacja łaty jest optymalna, zlikwiduj stany przejściowe pojemności, regulując pokrętła pojemności ogniwa i rezystancji szeregowej na wzmacniaczu.

Po zaobserwowaniu stabilnych prądów kationowych krokowych napięć, zapisz prądy za pomocą protokołu routingu napięciowego, jak opisano w manuskrypcie. Zastosować związek lub fizjologiczne warunki testowe do badania przez superfuzję i zapisać reakcje dla warunków kontrolnych i testowych, jak również wymłukiwania. Protokół ten może być stosowany do izolowania zdrowych, świeżych komórek DSM do badań funkcjonalnych i molekularnych.

Zdrowe pojedyncze komórki DSM charakteryzują się morfologią w kształcie wrzeciona, wyraźnymi, dobrze zdefiniowanymi krawędziami, dobrze zdefiniowaną aureolą wokół komórki i półkurczliwym wyglądem, gdy są oglądane pod mikroskopem. Ponadto świeżo wyizolowane komórki DSM reagują na stymulację mechaniczną i karbachol. W kolejnych eksperymentach z patch-clampem należy unikać fragmentów komórek oraz komórek niezdolnych do życia lub nadmiernie strawionych.

Wyizolowane komórki wykorzystano w eksperymentach z perforowanym patch-clampem amfoterycyny-B, w których prądy całych komórek mierzono za pomocą protokołu indukowanego napięciem lub rampy w trzech różnych ludzkich komórkach DSM. Eksperymenty wykazały, że 9-fenantrol, inhibitor kanału TRPM4, skutecznie i odwracalnie hamuje ludzkie prądy kationowe DSM. Składowa prądowa wrażliwa na 9-fenantrol ilustruje silniejsze hamowanie przy napięciach dodatnich i prostowaniu na zewnątrz.

Stan etapów obróbki enzymatycznej, etapy 2.2 i 2.3, w tym temperatura, czas trwania zabiegów enzymatycznych, źródła partii enzymów i jakość komórek DSM, są kluczowymi determinantami uzyskania wysokiej jakości ludzkich komórek DSM. Ludzkie komórki DSM idealnie nadają się również do oceny wewnątrzkomórkowych poziomów drugiego przekaźnika, w tym wapnia i cyklicznego AMP, wykrywania ekspresji białek za pomocą immunocytochemii i koekspresji za pomocą testu proksymalnego postępowania sądowego in situ oraz ekspresji mRNA za pomocą RT-PCR, qRT-PCR, mikromacierzy i sekwencjonowania nowej generacji. Ludzkie komórki DSM poszerzyły naszą wiedzę na temat roli kanałów BK, wapnia i TRPM4 w pęcherzu moczowym.

Przyszłe osiągnięcia pozwolą na specyficzne powiązanie właściwości elektrofizjologicznych lub farmakologicznych z profilami transkryptomu lub proteomu.