Name: Przygotowanie i wykorzystanie świeżo wyizolowanych ludzkich komórek mięśni gładkich wypieracza do charakterystyki 9-fenantrolowych prądów kationowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Naucz się izolacji świeżych ludzkich komórek mięśni gładkich wypieracza do badań elektrofizjologicznych metodą patch-clamp. Ta technika umożliwia analizę kanałów jonowych, w tym TRPM4, na poziomie pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH-R01DK106964 i P20DK123971 granty dla Georgi V. Petkova. Autorzy dziękują dr. Wiktorowi Jarockiemu i pani Sarah Maxwell za krytyczną ocenę manuskryptu. Jesteśmy również wdzięczni chirurgom urologicznym z MUSC i UTHSC: dr Thomasowi Keane'owi, Harry'emu Clarke'owi, Stephenowi Savage'owi, Rossowi Ramesowi, Sandipowi Prasadowi, Jonathanowi Picardowi, Christopherowi Ledbetterowi i Anthony'emu Pattersonowi, a także rezydentom urologii MUSC i UTHSC: dr Taylorowi Vaughanowi, Samuelowi Walkerowi Nicklesowi, Matthew Youngowi, Erin Burns, Justinowi Ellettowi, Ryanowi Leveyowi, Austinowi Youngerowi, Markowi Currinowi, Nima Baradaran, Olugbemisola McCoy, Tracy Tipton, Bryce Wyatt, Alyssa Greiman, Sarah Starosta, Aaron Bloch, Christine Callaway, Lucille Cox, Christian Dewan, Erin Heitman, Bradley Houston, Stephen Legg, Robert S. Libby, Cole Locklear, Kristen Marley, Monica O'Hanlon, Patrick Probst, Cynthia Sharadin, Elizabeth Tourville, Daniel Zapata za pomoc w pobieraniu tkanek ludzkich.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komitety Komisji Rewizyjnej Uniwersytetu Tennessee (Memphis, TN, IRB# 17-05714-XP) oraz Uniwersytetu Medycznego Południowej Karoliny (Charleston, SC, IRB# 00045232). Zatwierdzone procedury pozwalają na pobranie próbek pęcherza moczowego o pełnej grubości (>1 cm na >1 cm) - zawierających wszystkie warstwy, w tym błonę śluzową, mięśnie gładkie wypieracza i błonę surowiczą, a także przyczepione naczynia krwionośne i tkankę tłuszczową) - od pacjentów-dawców poddawanych chirurgicznej częściowej ekstrakcji pęcherza moczowego. Dawcami są osoby dorosłe (badany do tej pory przedział wiekowy: od 25 do 87 lat), mężczyźni lub kobiety, z objawami pęcherza nadreaktywnego lub bez (zgodnie z klasyfikacją według Amerykańskiego Towarzystwa Urologicznego I-PSS score41). Zabiegi chirurgiczne obejmują różne schorzenia, w tym radykalną cystektomię z powodu raka urotelialnego i gruczolakoraka. W takich przypadkach pobrana próbka pęcherza moczowego jest oddalona od miejsca guza.
1. Sekcja tkanek DSM i przygotowanie wolnych od błony śluzowej fragmentów DSM
<ol>
	<li>Zbadaj próbkę pęcherza moczowego o całej grubości, która dotarła do laboratorium z sali operacyjnej w szczelnie zamkniętym pojemniku wypełnionym zimnym roztworem do rozwarstwiania/trawienia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1 i Tabela 2 dla składu DS). 
	UWAGA: Próbka jest zwykle przechowywana w zimnym DS od kilku godzin do nocy przed przybyciem do laboratorium. W przypadku dłuższego przechowywania, DS (Tabela 2) jest uzupełniany o 1 mM CaCl2.</li>
	<li>Usuń i spłucz ludzką próbkę DSM o całej grubości (zawierającą wszystkie warstwy, w tym błonę śluzową, DSM i błonę surowiczą) lodowatym DS, aby wypłukać przyczepione zanieczyszczenia i krew.</li>
	<li>Przypnij próbkę pęcherza moczowego, błonę śluzową skierowaną do góry i surowiczą w dół, na pokrytym silikonem enancjomerze (Tabela materiałów) okrągłym naczyniu o średnicy 150 mm wypełnionym lodowatym DS (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Usuń sąsiednią tkankę tłuszczową, naczynia krwionośne, nabłonek (nabłonek dróg moczowych) i błonę śluzową mięśni z próbki przez ostre wypreparowanie za pomocą mikronożyczek i kleszczy.</li>
	<li>Wytnij kilka wolnych od błony śluzowej kawałków DSM (~2-3 mm długości i 4-6 mm szerokości) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
</ol>
2. Enzymatyczna dysocjacja fragmentów DSM, w wyniku której powstają świeżo wyizolowane pojedyncze komórki DSM
<ol>
	<li>Umieścić od 3 do 6 kawałków DSM w probówce zawierającej od 1 do 2 ml wstępnie podgrzanego (~37 °C) DS zawierającego papainę i ditiotreitol (DS-P, Tabela 2) i inkubować kawałki DSM w DS-P przez 30-45 minut w temperaturze ~37 °C, delikatnie potrząsając probówką od czasu do czasu (raz na 10-15 minut). 
	UWAGA: Aby optymalnie kontrolować temperaturę do obróbki enzymatycznej, probówki z kawałkami tkanek i roztworami enzymów umieszcza się w szklanej komorze na chusteczki wypełnionej wodą podłączoną do krążącej podgrzewanej łaźni wodnej (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1D) lub w bardzo precyzyjnej łaźni wodnej z kontrolowaną temperaturą (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1E).</li>
	<li>Wyjmij DS-P z tuby, krótko umyj kawałki DSM lodowatym DS, wyrzuć zimny DS z tubki, pozostawiając kawałki DSM na dnie tubki.</li>
	<li>Dodać 1 do 2 ml kolagenazy typu II (DS-C, tabela 2) zawierającej DS do probówki z kawałkami DSM, delikatnie wymieszać; i inkubować przez 25-40 minut w temperaturze ~37 °C, delikatnie potrząsając probówką od czasu do czasu (co 10-15 minut).</li>
	<li>Wyrzuć DS-C i umyj kawałki DSM poddane działaniu enzymów 5-10 razy lodowatym DS.</li>
	<li>Po ostatnim płukaniu pozostawić roztwór DS w probówce; delikatnie rozetrzeć kilkakrotnie wypolerowaną pipetą Pasteura, aby uwolnić pojedyncze komórki DSM.</li>
	<li>Umieść kilka kropli roztworu DS zawierającego rozproszone komórki DSM w komorze ze szklanym dnem lub szkiełku nakrywkowym i sprawdź wzrokowo jakość pod mikroskopem (przy użyciu obiektywu 20x lub 40x) po co najmniej 5 minutach od aplikacji, aby komórki przylegały do dna.</li>
	<li>Świeżo wyizolowane komórki DSM należy natychmiast wykorzystać do eksperymentów elektrofizjologicznych lub przechowywać komórki w probówce zawierającej DS w temperaturze ~4 °C na lodzie lub w lodówce do czasu użycia (zwykle do 8 godzin przygotowania). 
	UWAGA: W tym samym preparacie jakość komórek waha się od wysoce żywotnych do nadmiernie strawionych, martwych komórek DSM (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Gdy sekwencyjna metoda papainy-kolagenazy daje bardzo dużą liczbę niezdolnych do życia komórek, preparat jest odrzucany i przeprowadza się nowe trawienie kawałków DSM, ale ze skróconymi odstępami między inkubacjami. Jeśli w wyniku zabiegu powstaje zbyt mało komórek DSM, to w celu późniejszego trawienia fragmentów DSM wydłuża się odstępy między inkubacjami. Dodatnia immunoreaktywność na aktynę α mięśni gładkich potwierdza tożsamość komórek DSM (<silna klasa="xfig">Ryc. 3).</li>
</ol>
3. Rejestrowanie prądów kationowych indukowanych napięciem z ogniw DSM przy użyciu techniki perforowanego zacisku napięciowego całego ogniwa amfoterycyny-B
<ol>
	<li>Odpipetować 0,25-1 ml zawiesiny komórek do szklanej dolnej komory umieszczonej na stoliku mikroskopu odwróconego i pozwolić komórkom przylgnąć do szklanego dna.</li>
	<li>Po inkubacji przez co najmniej 45 minut, usunąć DS z kąpieli i zastąpić roztworem E (Tabela 2) przez superfuzję, gdzie przepływ roztworu wspomagany grawitacyjnie przez rurki wlotowe, spowalniając zastępuje DS nowym roztworem, podczas gdy rurka wylotowa podłączona do próżniowego zbiornika na odpady usuwa roztwór komory i zapobiega przepełnieniu. Należy zauważyć, że roztwór E zawiera jony tetraetyloamonu (TEA+) i cezu (Cs+), które hamują prądy K+.</li>
	<li>Przygotować roboczy roztwór podstawowy amfoterycyny-B w dimetylosulfotlenku (DMSO) (1 mg na 10 μl DMSO). Aby całkowicie rozpuścić amfoterycynę w proszku, należy przeprowadzić sonikację (co najmniej 15 min) i dobrze zmieszać roztwór. 
	UWAGA: Ten krok zajmuje zwykle mniej niż 10 minut. Dobrze sprawdza się rozpuszczenie 3-4 mg amfoterycyny-B w 30-40 μl DSMO w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Większe ilości amfoterycyny-B wymagają większej ilości rozpuszczalnika DSMO, co zwykle skutkuje dłuższym okresem mieszania i niepełnym rozpuszczeniem cząstek stałych amfoterycyny-B obecnych w probówce.</li>
	<li>Rozpuścić roztwór podstawowy amfoterycyny-B w roztworze pipety (roztwór P, tabela 2) do uzyskania końcowego stężenia 200-500 μg/ml. Ten etap wymaga rozległej sonikacji i wirowania przy wysokim ustawieniu prędkości (8-10/10) przez ~30 do 60 minut na krok, aby zapewnić optymalne mieszanie i zapobiec tworzeniu się osadu amfoterycyny-B w roztworze pipety. 
	UWAGA: Amfoterycyna-B wytrąca się z czasem i jest wrażliwa na światło. Roztwór roboczy do pipet zawierający amfoterycynę-B jest sprawdzany pod kątem rozpuszczalności, ręcznie mieszany przed napełnieniem pipety i przechowywany w ciemności.</li>
	<li>Wyciągnij kilka elektrod łatkowych, wypoleruj końcówki elektrod i (jeśli to konieczne) pokryj końcówki woskiem dentystycznym.</li>
	<li>Napełnić końcówkę elektrody z plastrem roztworem pipety (roztwór P, tabela 2) bez amfoterycyny-B, zanurzając elektrodę na krótko w roztworze.</li>
	<li>Napełnij elektrodę tym samym roztworem pipety zawierającym amfoterycynę B.</li>
	<li>Zamontuj elektrodę na uchwycie podłączonym do patch-clamp amplifier headstage.</li>
	<li>Za pomocą mikromanipulatora umieść elektrodę tuż pod powierzchnią roztworu zewnątrzkomórkowego, tak aby końcówka elektrody była po prostu zanurzona.</li>
	<li>W trybie cęgów napięcia ustaw potencjał podtrzymania na 0 mV i wyreguluj prąd na 0 pA za pomocą pokrętła przesunięcia pipety na komercyjnym wzmacniaczu (Tabela materiałów).</li>
	<li>Określ rezystancję elektrody za pomocą okna/funkcji testu membrany w komercyjnym oprogramowaniu do akwizycji (tabela materiałów). Aby aktywować, kliknij Narzędzia>Membrane Test>Play lub ikonę skrótu w oprogramowaniu. Wyznaczona rezystancja elektrody powinna mieścić się w zakresie od 2 do 5 MΩ, 
	UWAGA: Funkcja testu membrany dostępna w komercyjnym oprogramowaniu do akwizycji lub opcja testu uszczelnienia we wzmacniaczu może być używana do monitorowania rezystancji elektrody poprzez wielokrotne stosowanie kroków napięcia.</li>
	<li>Kontynuuj monitorowanie rezystancji elektrody, przesuwając elektrodę w kierunku wybranej komórki DSM za pomocą mikromanipulatora (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A). 
	UWAGA: Aby można ją było uznać za żywotną komórkę DSM, musi ona wykazywać wydłużoną morfologię w kształcie wrzeciona, dobrze zdefiniowaną aureolę wokół komórki, ostre krawędzie i półkurczliwy (serpentynowy) wygląd.</li>
	<li>Podczas dotykania elektrodą powierzchni ogniwa - co wskazuje na szybki wzrost rezystancji elektrody mierzonej za pomocą funkcji testu membranowego - utwórz giga-uszczelnienie, przykładając delikatne szybkie podciśnienie do uchwytu elektrody za pomocą rurki. Powoduje to wytwarzanie podciśnienia na końcu elektrody, które wciąga błonę komórkową do elektrody, pomagając w tworzeniu giga-seal lub bardzo ścisłego kontaktu między elektrodą a błoną plazmatyczną (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4B).</li>
	<li>Po uformowaniu się giga-seal skompensuj pojemność pipety, regulując szybkie i wolne pokrętła na komercyjnym wzmacniaczu i monitoruj stabilność giga-seal (prąd wycieku) za pomocą funkcji Membrane Test.</li>
	<li>Odczekaj czas, zwykle 30-60 minut, aby amfoterycyna-B dyfundowała w dół pipety i została wprowadzona do błony plazmatycznej, tworząc pory głównie selektywne dla kationów jednowartościowych. Na tym etapie kontynuuj monitorowanie giga-seal za pomocą funkcji Membrane Test. Wraz ze wzrostem perforacji komórek rośnie również amplituda stanów przejściowych pojemności (porównaj <silna klasa="xfig">Rysunek 4B i <silna klasa="xfig">Rysunek 4C przedstawiający odpowiednio brak i efektywną perforację komórki) mierzoną za pomocą funkcji testu membranowego.</li>
	<li>Gdy perforacja łaty jest optymalna (oceniana na podstawie stabilnej rezystancji szeregowej, zwykle poniżej 50 MΩ), zlikwiduj stany nieustalone pojemności, regulując pokrętła pojemności ogniwa i rezystancji szeregowej na wzmacniaczu. W tym czasie można również przeprowadzić kompensację rezystancji szeregowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 4D).</li>
	<li>Po zaobserwowaniu stabilnych prądów kationowych indukowanych krokowo napięciem wywołanych przez określony protokół, należy zastosować stan złożony lub fizjologiczny do przetestowania przez superfuzję i zapisać odpowiedzi dla warunków kontrolnych, testowych i wymywania (jeśli to możliwe) za pomocą komercyjnego oprogramowania do akwizycji.
	<ol>
		<li>Rejestruj prądy za pomocą rutynowego protokołu krokowego napięcia, który polega na utrzymywaniu ogniw DSM na poziomie -64 lub -74 mV i stopniowaniu napięcia w krokach co 10 mV przez 400 lub 500 ms od -94 do +96 lub +106 mV i powrocie do potencjału podtrzymania. 
		UWAGA: Wartości potencjału membrany są dostosowane do potencjału złącza cieczy wynoszącego 14 mV (przy użyciu roztworów P i E, tabela 2). Potencjał złącza cieczy uzyskuje się w komercyjnym oprogramowaniu do akwizycji (Tabela materiałów) poprzez kliknięcie (Narzędzia>Potencjały złączy) i wprowadzenie stężeń składników jonów roztworu. Protokół ramp może być również wykorzystany do uzyskania bieżących nagrań.</li>
		<li>Uruchom protokół napięcia w ciągłym interwale ~1 min podczas eksperymentu, rejestrując prądy do kontroli przed dodawaniem, warunków testowych i wymłukiwania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza i wizualizacja danych
<ol>
	<li>Otwórz nagrane pliki w komercyjnym oprogramowaniu do analizy danych (Tabela materiałów) dla kontroli, warunków testowych i wymywania, klikając Plik>Otwórz dane i wybierając interesujące Cię pliki do otwarcia. 
	UWAGA: Na potrzeby analizy zazwyczaj otwierane i analizowane są trzy pliki (każdy zawierający pojedynczy zestaw śladów pojedynczego przebiegu protokołu) dla każdego warunku. Odpowiedzi są następnie uśredniane w celu uzyskania średniej odpowiedzi dla każdego warunku. Oprogramowanie używane do akwizycji danych zawiera opcję automatycznego zbierania określonych przez użytkownika wielu przebiegów testowych i uśredniania ich dla pojedynczego pliku wyjściowego, który może być użyty jako alternatywa.</li>
	<li>Uzyskaj średnią odpowiedź w ciągu ostatnich 200 ms dla ścieżki prądu mierzonej dla każdego napięcia; wybrany przedział czasu trwania odzwierciedla poziom aktywacji prądu krokowego w stanie ustalonym. Aby to zrobić, wykonaj poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Wybierz interesujący Cię plik do analizy w komercyjnym oprogramowaniu analitycznym (Tabela materiałów). 
		UWAGA: Oprogramowanie umieszcza ostatnio zaimportowany plik w aktywnym oknie wyświetlania. Otwarty plik wyświetla serię nakładających się na siebie ścieżek uzyskanych za pomocą protokołu krokowego napięcia. Domyślnie w aktywnym oknie wyświetlane są cztery kursory (wyświetlające wartości x i y dla podświetlonego śladu).</li>
		<li>Wybierz zakres do analizy, ustawiając kursor 2 na końcu kroku napięcia 400 lub 500 ms, a kursor 1 w odstępie 200 ms wcześniej, tak aby zakres analizy wynosił 200 ms.</li>
		<li>Uzyskaj odpowiedzi dla każdego napięcia, klikając Analizuj>Szybki wykres>IV (lub ikonę skrótu IV) (w oknie zachęty przed wygenerowaniem danych potwierdź, że dla sygnału osi y (bieżącego) Region są wybrane opcje "Kursory 1..2" i "Średnia"). Kliknij przycisk OK, aby wygenerować wykres I-V i umieścić dane w arkuszu kolumn Wyniki, który można wyświetlić, uzyskując dostęp do programu Windows>Results.</li>
		<li>Analizuj dodatkowe pliki, powtarzając kroki 4.2.1 - 4.2.3. Kliknij przycisk Analizuj>Szybki wykres>IV lub skrót ikony IV, wybierz opcję Dołącz, a nie Zamień, aby dodać dodatkowe dane do arkusza wyników podczas przetwarzania śladów.</li>
		<li>Skopiuj dane do arkusza kalkulacyjnego, zaznaczając interesujące Cię kolumny i naciskając CTRL+C, aby skopiować i CTRL+V, aby wkleić. Zapisz arkusz wyników w komercyjnym oprogramowaniu analitycznym (Tabela materiałów) w formacie (*.rlt), klikając Plik>Zapisz jako.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla każdej komórki znormalizuj odpowiedzi dla wszystkich trzech warunków na wartość kroku maksymalnego napięcia dla kontroli przed dodawaniem (zgodnie ze wzorem: Response/Response Control-Max) i narysuj odpowiedzi jako wartości prądu (lub gęstości prądu) w zależności od napięcia (Rysunek 6).
	<ol>
		<li>W procesorze arkusza roboczego określ średnie odpowiedzi jako prądy (pA) lub gęstości prądu (pA/pF) dla sterowania, warunków testowych (w tym przykładzie 9-fenantrolu) i wymywania na każdym kroku napięcia.</li>
		<li>Podziel wartości dla każdego napięcia w każdym stanie (kontrola, 9-fenantrol i wymywanie) przez maksymalną odpowiedź kontrolną uzyskaną przy najwyższym napięciu (+96 mV w <silnej klasie = "xfig">Rysunek 6) dla kontroli przed dodawaniem zgodnie ze wzorem: Znormalizowana odpowiedź dla warunku (x) = Odpowiedź (x) /Kontrola odpowiedzi-Max dla (x).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu analizy podsumowującej ułóż dane w formacie, który można łatwo skopiować do programu graficznego (np. GraphPad Prism) w celu wizualizacji.</li>
</ol>

Opisane tutaj procedury wyjaśniają etapy związane z przygotowaniem żywotnych, świeżo wyizolowanych komórek DSM z próbek ludzkiego pęcherza moczowego o pełnej grubości przy użyciu trawienia enzymatycznego oraz w rejestrowaniu prądów kationowych całych komórek wrażliwych na inhibitor kanału TRPM4 9-fenantrol przy użyciu metody perforowanej amfoterycyny-B. Procedura enzymatyczna opiera się na dwuetapowej sekwencyjnej ekspozycji, zwanej tutaj sekwencyjną metodą trawienia papainy i kolagenazy. Tkanki DSM są najpierw traktowane papainą i ditiotreitolem (środkiem stabilizującym enzymy) w warunkach nominalnego wolnego od Ca2+, a następnie w drugim etapie kolagenazą typu II w obecności niskiego Ca2+. Uzasadnienie przeprowadzania trawienia papainą w warunkach niskiego poziomu Ca2 + w komórkach mięśni gładkich sięga końca lat 1980-tych. Świeżo wyizolowane komórki mięśni gładkich tętnicy szyjnej przygotowane za pomocą papainy wykazywały wydłużony kształt, wykazywały żywotność (odporność na wychwyt błękitu trypanowego) i reagowały na bodźce skurczowe (wyższy poziomCa2+ i histaminy)65. Wiele lat później metodę tę zastosowano do przygotowania komórek DSM (zob. tabela 1). Wybór kolagenazy typu II, a nie innych typów, wiąże się z jej stosunkowo wysoką aktywnością proteolityczną idealnie nadającą się do tkanek mięśni gładkich, w tym DSM. Rzeczywiście, samo leczenie kolagenazą może dać pojedyncze komórki DSM, choć wymaga rozległej ekspozycji na enzymy (≥60 min)53,54. Ponieważ aktywność kolagenazy zależy odCa2+, a enzym jest nieaktywny w warunkach wolnych odCa2+, optymalne trawienie enzymatyczne fragmentów DSM wymaga obecnościCa2+66. W naszym przypadku DS-C zawiera 100-200 μM [Ca2+] (Tabela 2). Po obróbce enzymatycznej strawione kawałki DSM są delikatnie przemywane kilka razy zimnym DS bez enzymów lub Ca2+ w celu usunięcia wszelkich enzymów związanych z tkankami. Lodowaty DS pomaga zachować integralność komórek DSM i ograniczyć aktywność enzymatyczną pozostałej papainy lub kolagenazy. W ostatnim kroku rozcieranie fragmentów DSM poddanych działaniu enzymów za pomocą polerowanej ogniowo pipety Pasteura uwalnia pojedynczą komórkę DSM. Komórki DSM są albo natychmiast umieszczane w komorze rejestracyjnej w celu przeprowadzenia badań typu patch-clamp lub innych rodzajów eksperymentów, albo przechowywane na lodzie w DS do wykorzystania później tego samego dnia (zwykle w ciągu 8 godzin od przygotowania, ale komórki zachowują żywotność do 24 godzin).
Zidentyfikowaliśmy kilka ważnych kwestii, które należy wziąć pod uwagę przy pomyślnym uzyskaniu pojedynczych komórek DSM. Pierwsza z nich dotyczy jakości źródłowej próbki DSM dla ludzi. Aby optymalnie zachować integralność tkanek, próbki DSM uzyskane z operacji otwartego pęcherza moczowego są umieszczane w lodowatym DS tak szybko, jak to możliwe i przechowywane w zimnym środowisku. W szczególności, po chirurgicznym pobraniu od pacjenta, próbka pęcherza moczowego jest natychmiast umieszczana na w pełni przygotowanym stoliku bocznym na sali operacyjnej. Następuje ogólne badanie całej próbki (zwykle uzyskane podczas radykalnej lub prostej cystektomii) i jej otwarcie. Po oględzinach wyjmuje się kawałek próbki z drabiny moczowej o całej grubości z odległego obszaru próbki rażąco niezwiązanej z guzem i natychmiast umieszcza się go w kubku (50 lub 100 ml) zawierającym zimny (~ 4 °C) roztwór preparacyjny (DS) (Tabela 2), a następnie szczelnie zamyka pokrywką. Ze względu na planowany charakter pobrania tkanki, personel sali operacyjnej i personel pomocniczy wykonujący pobieranie jest powiadamiany na początku przypadku operacyjnego, aby materiały były dostępne na sali operacyjnej w momencie ekstrakcji tkanki. Te środki ostrożności wraz z rutynowym, powtarzalnym charakterem etapów przetwarzania utrzymują czas niedokrwienia tkanki w cieple - od ekstrakcji do umieszczenia w schłodzonym pojemniku z roztworem DS - do mniej niż 5 minut. Pojemnik jest następnie umieszczany w lodówce lub na lodzie w chłodziarce w celu utrzymania zimnego środowiska i transportowany (lodowaty) do laboratorium. Gdy próbka dotrze do laboratorium, rozpoczyna się etap preparacji i dysocjacji enzymatycznej. Bardzo trudno jest przewidzieć, czy dana próbka DSM da wysokiej jakości komórki DSM po dysocjacji enzymatycznej, dlatego przystępujemy do etapów dysocjacji enzymatycznej. W wielu przypadkach, równolegle z eksperymentami elektrofizjologicznymi, nasza grupa prowadzi zapisy naprężeń izometrycznych na paskach DSM przygotowanych z tych samych próbek DSM. Odkryliśmy, że zazwyczaj możemy uzyskać wysokiej jakości komórki DSM z preparatów, które z powodzeniem dostarczają również żywotnych pasków do izometrycznych badań skurczu (nasza niepublikowana obserwacja).
Drugi czynnik odnosi się do różnych zmienności partii enzymów. Zaobserwowaliśmy, że zarówno w przypadku papainy, jak i kolagenazy typu II, za każdym razem, gdy nowa partia enzymu dociera od dostawcy, aktywność enzymu w DS do trawienia tkanek może się różnić. W związku z tym rutynowo optymalizujemy stężenie enzymów i odstępy między inkubacjami dla każdej nowej partii. Aby zminimalizować wpływ zmienności partii, zamawiamy większe ilości tej samej partii i wytwarzamy dużą partię roztworów podstawowych w 2 ml porcji enzymów i przechowujemy je w temperaturze ~-20 °C do momentu użycia. Z czasem jednak zamrożone wywary (przechowywane do 2 tygodni) mogą stracić swoją aktywność enzymatyczną. Trzecia zmienna odnosi się do temperatury zabiegów trawienia enzymatycznego. Aktywność enzymatyczna zarówno papainy, jak i kolagenazy wykazuje zależność od temperatury. Papaina i kolagenaza typu II wykazują aktywność w zakresach temperatur obejmujących normalną fizjologię ciała67,68. Dlatego dążymy do utrzymania stabilności zabiegów enzymatycznych w temperaturze ~37 °C, unikając wyższych temperatur, aby zachować integralność komórek DSM. Czwarta kwestia dotyczy zmienności jakości komórek DSM obecnych w każdym preparacie, od wysoce żywotnych (wykazujących doskonałe klasyczne cechy mięśni gładkich) do niezdrowych, nadmiernie trawionych komórek. Wydłużony okres inkubacji enzymów jest jednym z głównych powodów uzyskania dużej liczby uszkodzonych komórek. Nadmierne leczenie enzymatyczne upośledza również struktury białkowe kanałów jonowych, receptorów i transporterów, wpływając niekorzystnie na ich funkcjonalność. Interpretacja wyników uzyskanych z enzymatycznie, świeżo wyizolowanych komórek powinna mieć to na uwadze. Optymalizacja warunków trawienia enzymatycznego ma na celu zwiększenie odsetka wysoce żywotnych komórek. Podejścia eksperymentalne opierające się na większej liczbie żywotnych komórek, takie jak analizy mikromacierzy, wymagają bardziej niezawodnych optymalizacji niż te z powodzeniem przeprowadzone na mniejszej liczbie komórek, takie jak elektrofizjologia jednokomórkowa typu patch-clamp lub obrazowanieCa2+. Uwzględnienie wyżej wymienionych czynników ukierunkowało nasze wysiłki badawcze w ciągu ostatniej dekady w celu uzyskania wysokiej jakości pojedynczych ogniw DSM.
Technika perforowanego zacisku krosowego jest podstawowym podejściem elektrofizjologicznym od ponad ćwierć wieku. Kilka publikacji zawiera szczegółowe informacje na temat rozważań technicznych 69,70,71,72,73. Perforację komórek można uzyskać za pomocą amfoterycyny-B, nystatyny, gramicydyny lub β-escyny (patrz odniesienie32 w celu zapoznania się z każdym z nich). Główną zaletą perforowanych zapisów patch-clamp w porównaniu z innymi podejściami elektrofizjologicznymi jest to, że natywne środowisko wewnątrzkomórkowe - w tym wewnątrzkomórkowe Ca2+ i cząsteczki sygnałowe (np. cAMP, PKA, fosforany i fosfodiesterazy) - jest zachowane. Technika ta idealnie nadaje się zatem do badania prądów kanałów jonowych w całej komórce i ich mechanizmów regulacyjnych w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Kluczowym zastrzeżeniem jest to, że skład komórek wewnątrzkomórkowych nie może być precyzyjnie kontrolowany, w przeciwieństwie do innych metod elektrofizjologicznych, takich jak konwencjonalne zapisy całych komórek i jednokanałowych nagrań z wyciętymi łatami (wewnątrz i na zewnątrz). Z naszego doświadczenia wynika, że trzy czynniki rutynowo przyczyniają się do pomyślnych wyników eksperymentów z perforowanymi amfoterycyną B. Pierwszą z nich jest jakość komórki DSM wybranej do próby nagrania. Gdy ogniwa DSM są wysoce żywotne, wykazując półkurczliwy (serpentynowy), błyszczący wygląd o wysokim kontraście z dobrze zdefiniowaną aureolą wokół powierzchni komórki i ściśle przylegają do szklanego dna komory zapisu, wówczas tworzenie giga-uszczelnień i perforacja komórek zachodzą stosunkowo łatwo. Drugi i trzeci czynnik sukcesu, odpowiednio, odnoszą się do jakości źródła i rozpuszczalności amfoterycyny-B (w dimetylosulfotlenku / DMSO i wewnątrzkomórkowym roztworze pipety). Zaobserwowaliśmy rozbieżności pomiędzy różnymi dostawcami pod względem zmienności źródła i partii. Każdego dnia przygotowujemy świeży roztwór podstawowy amfoterycyny-B z proszku, a następnie rozcieńczamy go w wewnątrzkomórkowym roztworze pipety. Etapy te wymagają rozległej sonikacji i wirowania. W przypadku świeżo przygotowanego roztworu pipet zawierających amfoterycynę B można zwykle uzyskać w ciągu 30 minut pomyślną perforację komórek (<50 MΩ) po utworzeniu giga-seal. Stężenie amfoterycyny-B w roztworze pipety również wymaga optymalizacji w zależności od partii amfoterycyny-B i źródła. W naszych warunkach eksperymentalnych końcowe stężenia amfoterycyny-B w pipecie wahają się od 200 do 500 μg/ml. Ponieważ amfoterycyna-B wykazuje wrażliwość na światło, jej roztwory należy przechowywać w ciemności. Korzystając z techniki perforowanego patch-clamp amfoterycyny-B, nasza grupa zarejestrowała indukowane napięciem prądy K+, Ca2+ i nieselektywne prądy kationowe z komórek DSM ludzi, świnek morskich, myszy i / lub szczurów 17,21,22,23,29,30,31,35,60. W tym miejscu opisujemy warunki rejestrowania nieselektywnych prądów kationowych w ludzkich komórkach DSM. 9-fenantrol, bloker kanałów TRPM4, tłumił prądy indukowane napięciem, wspierając rolę tych kanałów w kontroli pobudliwości DSM. Należy pamiętać, że zwykle wymaga to co najmniej 45 minut po uzyskaniu giga-seal i zainicjowaniu perforacji, aby zarejestrować optymalne, stabilne, nieselektywne prądy kationowe indukowane krokowo napięciem. Rampy napięciowe mogą być również stosowane jako alternatywa dla protokołów krokowych30,64. W tym przypadku preferowany był protokół krokowy napięcia z hiperspolaryzowanego potencjału membrany podtrzymującej niż protokół rampy, ponieważ pierwsze podejście minimalizuje efekt inaktywacji zależnej od napięcia i pozwala na uśrednianie prądu wywołanego w czasie kroku napięcia, w którym rampa zapewnia pojedynczy punkt danych na napięcie. Ten ostatni punkt dotyczy w szczególności ludzkich komórek DSM, ponieważ prądy wykazują zmienną aktywność podczas kroków napięcia (rysunek 5 i rysunek 6). Technika perforowanego patch-clamp amfoterycyny-B miała zasadnicze znaczenie w identyfikacji właściwości komórek DSM i innych typów komórek i będzie nadal pomagać w dostarczaniu nowych odkryć w przyszłości. Co więcej, świeżo wyizolowane pojedyncze ogniwa DSM mogą być z powodzeniem wykorzystywane do pomiaru prądów K+, Cl- i Ca2+ dla całych komórek w konwencjonalnym trybie techniki patch-clamp, rejestracji potencjału membranowego za pomocą cęgów prądowych oraz nagrań jednokanałowych, czego przykładem są nasze wcześniejsze raporty 23,29,35,64.
Oprócz metod patch-clamp jednokomórkowych, świeżo wyizolowane komórki DSM można badać za pomocą innych podejść technicznych, w tym obrazowania Ca2 +, RT-PCR / q-RT-PCR, immunocytochemii, testu ligacji zbliżeniowej in situ i podejść genomicznych (np. mikromacierz, sekwencjonowanie RNA, CHIP-seq)15,18,30,33,34. Ponieważ metody oznaczania transkryptomu pojedynczej komórki wciąż ewoluują i stają się bardzo czułe, przewidujemy w przyszłości możliwość rutynowego i specyficznego łączenia właściwości elektrycznych lub farmakologicznych poszczególnych komórek DSM z ich profilami transkryptomu/proteomu. Zostanie to osiągnięte poprzez najpierw rejestrację z komórki DSM, a następnie ekstrakcję mRNA lub białka, a następnie analizy transkryptomiczne/proteomiczne. Chociaż takie metody zostały już przetestowane w komórkach innych niż DSM, są one obecnie technicznie trudne, brakuje im czułości, aby można je było uznać za rutynowe, i ograniczają się do skutecznego wykrywania kilku wybranych produktów genowych74. Badania łączące ekspresję profilu funkcyjno-molekularnego przeprowadzone na komórkach DSM uzyskanych z pęcherzy moczowych pochodzących od kontrolnych i chorych dawców pacjentów-dawców dostarczą informacji na temat procesów fizjologicznych niezbędnych do kierowania normalnymi funkcjami DSM, patogenezy oraz do identyfikacji skutecznych nowych podejść terapeutycznych.

Komórki mięśni gładkich wypieracza (DSM) stanowią najliczniejszy typ komórek w pęcherzu moczowym i ostatecznie kontrolują magazynowanie moczu i oddawanie moczu odpowiednio poprzez rozluźnienie i skurcz. Komórki DSM tworzą wiązki mięśni gładkich, które przeplatają się z sąsiednią tkanką łączną, procesami nerwowymi, komórkami śródmiąższowymi i innymi typami komórek1. Obecna wiedza na temat roli komórek DSM w funkcjonowaniu pęcherza moczowego została osiągnięta dzięki wielopoziomowemu zintegrowanemu podejściu. Każda metoda eksperymentalna - niezależnie od tego, czy opiera się na izolowanych pojedynczych komórkach in vitro, paskach tkanek zawierających wiązki mięśni gładkich in vitro/ex vivo, czy też na oznaczeniach in vivo (takich jak cytometria i ocena funkcji mikcji) - dostarcza ważnych i szczegółowych informacji na temat fizjologicznych i farmakologicznych właściwości DSM (zobacz recenzje1,2,3,4,5,6 po szczegóły). Jednak interpretacja wyników uzyskanych z izolowanych pojedynczych komórek pozwala na specyficzne przypisanie wniosków do samego typu pojedynczej komórki. Uświadomienie sobie tego faktu było siłą napędową do opracowania niezawodnej i powtarzalnej metody uzyskiwania świeżo wyizolowanych komórek DSM z próbek pęcherza moczowego o całej grubości. W przeciwieństwie do wielu innych typów komórek, komórki mięśni gładkich nie mogą być wiarygodnie hodowane ze względu na utratę ich natywnego fenotypu, w tym specyficzne zmiany w ich właściwościach elektrofizjologicznych i kurczliwych7,8. Fakt ten dodatkowo wzmacnia znaczenie badań przeprowadzonych na fizjologicznie aktywnych, świeżo wyizolowanych komórkach DSM.
Pod koniec lat 80-tych i na początku lat 90-tych, grupa Isenberga (Niemcy) opublikowała serię badań elektrofizjologicznych na świeżo wyizolowanych komórkach DSM uzyskanych z pęcherzy moczowych świnki morskiej9,10,11,12,13 (Tabela 1). Metoda ta uwypukliła dwie ważne obserwacje, które pomogły w uzyskaniu ważnych komórek i posłużyły jako wstępna wskazówka do naśladowania dla innych. Polegały one na 1) wstępnym traktowaniu wyizolowanych fragmentów DSM roztworem/pożywką wolną od Ca2+ przed obróbką enzymatyczną oraz 2) trawieniu tkanek roztworem zawierającym kolagenazę. Te dwa krytyczne etapy zostały włączone do wszystkich kolejnych wariantów procedur dysocjacji komórek DSM (Tabela 1). Obecnie nasza grupa stosuje dwuetapowe sekwencyjne podejście do dysocjacji papainy i kolagenazy. Kawałki DSM są najpierw traktowane roztworem enzymatycznym zawierającym papainę, a następnie kolagenazą typu II rozpuszczoną w tym samym roztworze (DS, roztwór do rozwarstwiania/trawienia). W wyniku tego podejścia uzyskuje się pojedyncze komórki DSM różnych gatunków, w tym świnki morskiej, świni, szczura, myszy i, co ważne, człowieka (Tabela 1).
Pojedyncze komórki DSM stanowią źródło dla wielu eksperymentów z zakresu biologii molekularnej i fizjologii. Do tej pory ekspresje białek i mRNA badane za pomocą immunocytochemii lub oznaczeń RT-PCR/QRT-PCR wykazały wysoki poziom wykrywalności dla różnych kanałów jonowych, w tym aktywowanych napięciem o dużej przewodności i Ca2+ (BK), o małej przewodności Ca2+ aktywowanych K + typu 3 (SK3), bramkowanych napięciem K+ (Kv), Ca 2+ bramkowanych napięciem typu L i kanałów melamatatyny typu 4 o potencjale przejściowym (TRPM4), a także wymiennik Na/Ca2+14,15,16,17,18,19,20,21,22. Uważa się, że wszystkie kontrolują pobudliwość DSM, wewnątrzkomórkowy poziom Ca2 + i kurczliwość. Podejścia elektrofizjologiczne typu patch-clamp, przeprowadzone bezpośrednio na komórkach DSM świnki morskiej, myszy, szczura lub człowieka, dostarczyły bezpośredniego wykazania właściwości biofizycznych i farmakologicznych kanałów Cav, Kv (Kv2.x. Kv7), SK, BK i TRPM4 typu SK, BK i TRPM417,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Podejścia obejmowały konwencjonalny cęgi napięciowe całego ogniwa, perforowane cęgi napięciowe i nagrania jednokanałowe (konfiguracje z dołączoną komórką, na lewą stronę i na zewnątrz). Dodatkowo, rejestracja potencjału błonowego DSM za pomocą cęgów prądowych dostarczyła dowodów na to, że środki farmakologiczne angażujące cel zmieniają pobudliwość komórek. Na przykład inhibitor TRPM4 9-fenantrol indukował hiperpolaryzację w komórkach DSM uzyskanych z pęcherzy moczowych ludzi, świnek morskich i szczurów19,20,22,31. Wśród różnych metod elektrofizjologicznych, perforowane zapisy patch-clamp amfoterycyny-B (oraz nystatyny, gramicydyny i β-escyny) zapewniają kluczową zaletę, zachowując wewnętrzne wewnątrzkomórkowe cząsteczki i szlaki sygnałowe. Tylko kationy o niskiej masie cząsteczkowej i w mniejszym stopniu Cl- - ale nie białka lub cząsteczki sygnałowe, w tym Ca2+ - są przepuszczalne przez pory błony plazmatycznej utworzone przez amfoterycynę-B lub nystatynę32. Pomyślny wynik eksperymentów z perforowanym zaciskiem krosowym zależy od kilku ogólnych zmiennych unikalnych dla tej techniki. Tutaj opisujemy szczegóły procedury z wykorzystaniem amfoterycyny-B, którą nasza grupa z powodzeniem stosowała przez lata15,22,33,34,35,36,37,38,39.
Prawdopodobnie nieselektywne kanały kationowe pozostają jednym z najmniej zrozumiałych typów kanałów w komórkach DSM. Pierwsze doniesienia o nieselektywnym kanale podobnym do kationów pochodzą z 1993 roku. Artykuł Wellnera i Isenberga11 opisywał pojedynczy kanał aktywowany rozciąganiem 33 pS, wykazujący następującą kolejność przepuszczalności jonów: K+>Na+>Cs+>>>Ba2+>Ca2+ oraz hamowanie aktywności kanału przez Gd3+, ogólny inhibitor nieselektywnych kanałów kationowych. Prawie dekadę później Thorneloe i Nelson40 opisali przepuszczalne prądy kationowe Na+ w mysich komórkach DSM, hamowane przez Gd3+, używając zapisów z całych komórek. Ponieważ tożsamość molekularna nieselektywnych kanałów kationowych i ich charakterystyka biofizyczna pozostają do ustalenia, uzasadnione są przyszłe badania w tym obszarze badawczym. Opisany w niniejszym dokumencie protokół rejestracji nieselektywnych prądów kanałów kationowych - przy użyciu zewnątrzkomórkowych i pipetowych roztworów wewnątrzkomórkowych zawierających Cs+, TEA+ i nifedypinę (Tabela 2), które fizjologicznie i farmakologicznie łagodzą prądy Kv i Cav - był i będzie nadal przydatny w badaniach elektrofizjologicznych nieselektywnych kanałów kationowych. Wykorzystaliśmy ten konkretny protokół do określenia stopnia hamowania prądów kationowych całych komórek przez bloker kanału TRPM4 9-fenantrol w komórkach DSM świnki morskiej, szczura i człowieka19,20,22.
Podsumowując, opisana tutaj metoda uzyskiwania świeżo wyizolowanych pojedynczych komórek DSM z ludzkiego pęcherza moczowego dostarcza żywotnych komórek wysoce przydatnych do badań elektrofizjologicznych przy użyciu różnych konfiguracji techniki patch-clamp, obrazowania Ca2+, immunocytochemii, proksymalnych testów procesowych in situ i pojedynczej komórki RT-PCR/qRT-PCR, a także zaawansowanych technik biologii molekularnej, w tym analizy mikromacierzy, sekwencja RNA i sekwencja CHIP. Zastosowanie metody perforowanego patch-clampu amfoterycyny-B zachowuje natywne środowisko komórkowe w przeciwieństwie do innych konfiguracji. Przeprowadzone przy użyciu określonych tutaj warunków, zaprojektowanych w celu zanegowania wkładu prądów K + i Ca2 + w ogniwach DSM, prądy indukowane napięciem wykazują właściwości nieselektywnych prądów kationowych odpowiednich do charakterystyki biofizycznej i farmakologicznej.

<table><tbody><tr><td>5 ml polistyrenowa probówka okrągłodenna</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td>Probówki do DS zawierające enzymy stosowane na etapach trawienia</td></tr><tr><td>9-Phenanthrol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>211281</td><td>Inhibitor kanału TRPM4</td></tr><tr><td>Amfoterycyna-B</td><td>Fisher</td><td>BP928-250</td><td>Stosowany do perforacji plastrów/komórek</td></tr><tr><td>Amfoterycyna-B</td><td>Normy referencyjne Farmakopei Europejskiej</td><td>5</td><td>Używany do łatki/ perforacja komórek</td></tr><tr><td>Amfoterycyna-B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9528-100MG</td><td>Służy do perforacji łat/komórek</td></tr><tr><td>Analogowy mieszalnik wirowy</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Kwas asparaginowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9006</td><td>Wewnątrzkomórkowy roztwór do pipet</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>DS</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>Roztwór zewnątrzkomórkowy i DS</td></tr><tr><td>Szkło kapilarne</td><td>Sutter</td><td>BF150-110-7.5</td><td>Kapilara, do przygotowania elektrod ciągniętych Hydrat</td></tr><tr><td>wodorotlenku cezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8518</td><td>Wewnątrzkomórkowy roztwór pipetowy</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Clampex ver. 10 zawiera programy do pozyskiwania danych (Clampex) i analizy (Clampfit)</td><td>Axon Instruments/ Molecular Devices</td><td>pCLAMP-10</td><td>Oprogramowanie komercyjne i część konfiguracji zestawu do zacisków krosowych</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu 2</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004177</td><td>DS-C</td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203025</td><td>Roztwory zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe</td></tr><tr><td>Wosk dentystyczny</td><td>Miltex Dental Wax Technologies, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termometr cyfrowy 18058351 z sondą</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-077-32</td><td>Umieszczony w kąpieli tkankowej w celu monitorowania temperatury</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>DL-Ditiothreitol (DDT)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td>Środki redukujące stosowane razem z Papainą</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>Chelatator Ca2+, stosowany w wewnątrzkomórkowym roztworze do pipet</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet Flaming/Brown</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td>Wymagany do wyciągania elektrod z bardzo cienkimi końcówkami</td></tr><tr><td>Pływający stojak/uchwyt na rurki piankowe</td><td>VWR Scientific</td><td>82017-634</td><td>Służy do trzymania probówek z enzymami do kontroli temperatury</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Kwas glutaminowy (sól Na)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td>DS</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Bufor pH</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-1</td><td>Roztwór zewnątrzkomórkowy</td></tr><tr><td>System akwizycji danych o niskim poziomie szumów</td><td>Axon Instruments/ Urządzenia molekularne</td><td>Digidata 1440A</td><td>Część zestawu z zaciskiem krosowym</td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>VWR</td><td>01-442-684</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (sześciowodne)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>Roztwory zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe</td></tr><tr><td>MicroForge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>Stosowany do elektrod do polerowania ogniowego</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Roztwory zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Nifedypina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7634</td><td>Kanał Ca2+ bramkowany napięciem typu L bloker</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony firmy Nikon, TS100 ze stolikiem T1-SM z obiektywami 5x, 10x, 20x i 40x</td><td>Nikon</td><td>wycofany z produkcji</td><td>Część zestawu Patch-clamp</td></tr><tr><td>Igła do strzykawek Niemetalowa igła strzykawkowa, MicroFil</td><td>WPI</td><td>MF-34G-5</td><td>Napełnianie wewnątrzkomórkowego roztworu pipet</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS003126</td><td>DS-P</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura</td><td>FisherBrand</td><td>13-678-20A</td><td>Końcówki są odłamywane i polerowane ogniowo i używane do miareczkowania tkanek poddanych działaniu enzymatycznym w celu uwolnienia pojedynczych komórek DSM z kawałków</td></tr><tr><td>Wzmacniacz patch-clamp</td><td>Axon Instruments/ Urządzenia molekularne</td><td>Axon Axopatch 200B</td><td>Część zestawu do zacisków krosowych</td></tr><tr><td>Komputer PC</td><td>DELL</td><td>Konfiguracja niestandardowa</td><td>Część zestawu do zacisków krosowych</td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Aspera Instruments</td><td>PH700</td><td></td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa</td><td>Intramedic</td><td>427-436</td><td>Rurka do superfuzji kąpieli zewnątrzkomórkowej podłączona do komory zapisu ze szklanym dnem</td></tr><tr><td>Chlorek tetraetyloamonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2265</td><td>Bloker kanałów jonowych Kv i BK dodany do roztworu do kąpieli zewnątrzkomórkowej</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Precyzyjna kąpiel wodna z wytrząsaniem (model 2870)</td><td>Thermo Scientific</td><td>Wycofane ze sprzedaży</td><td>Łaźnia wodna do kontroli temperatury trawienia enzymatycznego stosowana jako alternatywa dla kąpieli w komorze cyrkulacyjnej</td></tr><tr><td>tkanek Kąpiel tkankowa, 100 ml</td><td>Radnoti</td><td>1583-101</td><td>Podłączone do kąpieli cyrkulacyjnej i wypełnione wodą, probówki z kawałkami DS i DSM są umieszczane w konfiguracji do kontrolowania temperatury etapów trawienia</td></tr><tr><td>Rurki winylowe</td><td>ColePalmer</td><td>06405-3</td><td>Wiele zastosowań, w tym do łączenia kąpieli tkankowej z kąpielą z obiegową wodą</td></tr><tr><td>Kąpiel cyrkulatora wody, Haake D1 L</td><td>Haake</td><td>Wycofane</td><td>Połączone z kąpielą tkankową</td></tr><tr><td>Waga Waga</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS64</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony ZeissAxiovert 40C z obiektywami 10x i 40x</td><td>Carl-Zeiss</td><td>Wycofane</td><td>Część zestawu z zaciskiem krosowym</td></tr></tbody></table>

przygotowanie i wykorzystanie świeżo wyizolowanych ludzkich komórek mięśni gładkich wypieracza do charakterystyki 9-fenantrolowych prądów kationowych

Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents

Komórki mięśni gładkich (DSM) znajdujące się w ścianie pęcherza moczowego ostatecznie ułatwiają magazynowanie moczu i oddawanie moczu. Przygotowanie zdolnych do życia, świeżych i wyizolowanych komórek DSM stanowi ważne wyzwanie techniczne, którego osiągnięcie zapewnia optymalne komórki do późniejszych badań funkcjonalnych i molekularnych. Metoda opracowana i opracowana w niniejszym dokumencie, z powodzeniem stosowana przez naszą grupę od ponad dekady, opisuje sekcję próbek ludzkiego pęcherza moczowego uzyskanych z operacji otwartego pęcherza, a następnie enzymatyczną dwuetapową obróbkę kawałków DSM i mechaniczne rozcieranie w celu uzyskania świeżo wyizolowanych komórek DSM. Pierwszym krokiem jest rozwarstwienie w celu oddzielenia warstwy DSM (znanej również jako muscularis propria) od błony śluzowej (nabłonka dróg moczowych, blaszka właściwa i błona śluzowa mięśni) oraz przylegających tkanek łącznych, naczyniowych i tłuszczowych. DSM jest następnie cięty na kawałki (2-3 mm x 4-6 mm) w nominalnym roztworze do rozwarstwiania/trawienia (DS) zawierającym Ca2+. Fragmenty DSM są następnie przenoszone i sekwencyjnie traktowane oddzielnie DS zawierającym papainę i kolagenazę w temperaturze ~37 °C przez 30-45 minut na krok. Po przemyciu DS zawierającym bezenzymatyczną surowicę bydlęcą i roztarciu za pomocą wypolerowanej ogniowo pipety, kawałki uwalniają pojedyncze komórki DSM. Świeżo wyizolowane komórki DSM idealnie nadają się do elektrofizjologicznych i farmakologicznych charakterystyk kanałów jonowych. W szczególności pokazujemy, że bloker kanałów TRPM4 9-fenantrol zmniejsza krokowe prądy kationowe wywołane napięciem zarejestrowane za pomocą perforowanego podejścia patch-clamp amfoterycyny-B. Komórki DSM można również badać za pomocą innych technik, takich jak RT-PCR z pojedynczą komórką, analiza mikromacierzy, immunocytochemia, test ligacji zbliżeniowej in situ i obrazowanie Ca2 +. Główną zaletą wykorzystania pojedynczych komórek DSM jest to, że poczynione obserwacje odnoszą się bezpośrednio do ujawnionych cech pojedynczych komórek. Badania świeżo wyizolowanych ludzkich komórek DSM dostarczyły ważnych informacji charakteryzujących właściwości różnych kanałów jonowych, w tym przepuszczalnych dla kationów w pęcherzu moczowym, i będą kontynuowane jako złoty standard w wyjaśnianiu właściwości komórkowych DSM i mechanizmów regulacyjnych.

Opisujemy metodę przygotowania pojedynczych, świeżo wyizolowanych komórek mięśni gładkich wypieracza z próbek ludzkiego pęcherza moczowego, stosując dwuetapową procedurę enzymatyczną. Uzyskane żywotne komórki DSM można badać za pomocą różnych technik jednokomórkowych, w tym opisanej elektrofizjologii amfoterycyny-B patch-clamp, w celu ujawnienia właściwości fizjologicznych i farmakologicznych.

Przygotowanie i wykorzystanie świeżo wyizolowanych ludzkich komórek mięśni gładkich wypieracza do charakterystyki 9-fenantrolowych prądów kationowych

Detrusor smooth muscle (DSM) cells present within the urinary bladder wall ultimately facilitate urine storage and voiding. Preparation of the viable, ...

Komórki mięśni gładkich wypieracza tworzą ścianę pęcherza moczowego, która ostatecznie ułatwia oddawanie i magazynowanie moczu. Nasz protokół zapewnia zwalidowaną i niezawodną metodę świeżej izolacji pojedynczych komórek mięśni gładkich. Świeżo wyizolowane ludzkie komórki mięśni gładkich wypieracza dają możliwość badań elektrofizjologicznych i molekularnych na poziomie pojedynczej komórki.Badając pojedyncze komórki mięśni gładkich wypieracza z kontrolnych, normalnych i chorych ludzkich pęcherzy moczowych, mamy możliwość walidacji celów farmakologicznych, takich jak kanały jonowe. Pojedyncze komórki mięśni gładkich ludzkiego wypieracza są idealne do eksperymentów elektrofizjologicznych, takich jak elektrofizjologia patch-clamp. Tutaj przedstawimy przykład badania pojedynczego kanału jonowego o nazwie TRPM4, przejściowy potencjał receptora melasatyny czterokanałowej, który jest nieselektywnym kanałem kationowym.Nowicjusze mogą zmagać się z etapami preparacji i leczenia enzymatycznego, które wymagają wydajności i znajomości, w tym rozpoznawania krytycznych ważnych kroków w celu uzyskania świeżych izolowanych komórek DSM. Ważne jest, aby być zaznajomionym z histologią ludzkiego pęcherza moczowego, etapy protokołu izolowania pojedynczych komórek pozostają odporne i początkowo spodziewaj się, że przy użyciu tego protokołu uzyskasz nieoptymalne komórki. Rozpocznij od zbadania próbki pęcherza moczowego o całej grubości.Przygwoździć próbkę, błoną śluzową skierowaną do góry i surowicą w dół, na pokrytym silikonem enancjomerze okrągłym naczyniu o średnicy 150 mm wypełnionym lodowatym DS i ostrożnie usunąć całą błonę śluzową przez ostre rozwarstwienie. Wytnij kilka pozbawionych błony śluzowej wypieracza, mięśni gładkich lub kawałków DSM. Umieść od trzech do sześciu kawałków DSM w probówce z jednym do dwóch mililitrów wstępnie podgrzanego DS zawierającego papainę i ditiotreitol lub DS-P.Inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 45 minut, potrząsając probówką co 10 do 15 minut. Po inkubacji wyjmij DS-P z probówki i krótko umyj kawałki DSM lodowatym DS. Przenieś DS z kawałkami DSM do nowej probówki i wyjmij DS, pozostawiając kawałki DSM na dnie tuby. Dodaj jeden do dwóch mililitrów DS zawierającego kolagenazę typu II lub DS-C do probówki.I inkubuj go w temperaturze 37 stopni Celsjusza, od czasu do czasu potrząsając. Wyrzuć DS-C i umyj kawałki DSM poddane działaniu enzymów od pięciu do 10 razy lodowatym DS. Po ostatnim praniu pozostaw DS w probówce i delikatnie rozcieraj kawałki wypolerowaną ogniowo pipetą Pasteura, aby uwolnić pojedyncze komórki DSM. Pobrać pipetę od 0,25 do jednego mililitra zawiesiny komórek do szklanej dolnej komory umieszczonej na stoliku mikroskopu odwróconego i inkubować przez co najmniej 45 minut, aby komórki mogły przylegać.Następnie usunąć DS z kąpieli i zastąpić go roztworem E przez przefuzję. Wyciągnij kilka elektrod łatkowych, wypoleruj końcówki elektrod i w razie potrzeby pokryj końcówki woskiem dentystycznym. Napełnij końcówkę elektrody plastrowej roztworem pipety bez amfoterycyny-B, zanurzając elektrodę na krótko w roztworze.Powodzenie elektrofizjologii patch clamp zależy od jakości ogniw DSM i solubilizacji amfoterycyny-B. Napełnij elektrodę tym samym roztworem pipety zawierającym amfoterycynę-B i zamontuj elektrodę na uchwycie podłączonym do patch clamp amplifier head stage. Użyj mikromanipulatora, aby umieścić elektrodę tuż pod powierzchnią roztworu zewnątrzkomórkowego, tak aby końcówka elektrody była po prostu zanurzona.Następnie określ rezystancję elektrody za pomocą funkcji okna testowego membrany w komercyjnym oprogramowaniu akwizycyjnym i przesuń elektrodę w kierunku interesującego ogniwa. Dotykając powierzchni ogniwa elektrodą, utwórz giga-uszczelnienie, przykładając delikatne szybkie podciśnienie do elektrody za pomocą rurki. Powoduje to podciśnienie na końcówce elektrody, co skutkuje udanym gigauszczelnieniem, co zostało potwierdzone w teście membranowym.Odczekać od 30 do 60 minut, aż amfoterycyna-B rozdyfunduje się w pipecie i zostanie wprowadzona do błony plazmatycznej, tworząc pory głównie selektywne w stosunku do kationów jednowartościowych. Kontynuuj monitorowanie giga-seal za pomocą funkcji testu membrany. Gdy perforacja łaty jest optymalna, zlikwiduj stany przejściowe pojemności, regulując pokrętła pojemności ogniwa i rezystancji szeregowej na wzmacniaczu.Po zaobserwowaniu stabilnych prądów kationowych krokowych napięć, zapisz prądy za pomocą protokołu routingu napięciowego, jak opisano w manuskrypcie. Zastosować związek lub fizjologiczne warunki testowe do badania przez superfuzję i zapisać reakcje dla warunków kontrolnych i testowych, jak również wymłukiwania. Protokół ten może być stosowany do izolowania zdrowych, świeżych komórek DSM do badań funkcjonalnych i molekularnych.Zdrowe pojedyncze komórki DSM charakteryzują się morfologią w kształcie wrzeciona, wyraźnymi, dobrze zdefiniowanymi krawędziami, dobrze zdefiniowaną aureolą wokół komórki i półkurczliwym wyglądem, gdy są oglądane pod mikroskopem. Ponadto świeżo wyizolowane komórki DSM reagują na stymulację mechaniczną i karbachol. W kolejnych eksperymentach z patch-clampem należy unikać fragmentów komórek oraz komórek niezdolnych do życia lub nadmiernie strawionych.Wyizolowane komórki wykorzystano w eksperymentach z perforowanym patch-clampem amfoterycyny-B, w których prądy całych komórek mierzono za pomocą protokołu indukowanego napięciem lub rampy w trzech różnych ludzkich komórkach DSM. Eksperymenty wykazały, że 9-fenantrol, inhibitor kanału TRPM4, skutecznie i odwracalnie hamuje ludzkie prądy kationowe DSM. Składowa prądowa wrażliwa na 9-fenantrol ilustruje silniejsze hamowanie przy napięciach dodatnich i prostowaniu na zewnątrz.Stan etapów obróbki enzymatycznej, etapy 2.2 i 2.3, w tym temperatura, czas trwania zabiegów enzymatycznych, źródła partii enzymów i jakość komórek DSM, są kluczowymi determinantami uzyskania wysokiej jakości ludzkich komórek DSM. Ludzkie komórki DSM idealnie nadają się również do oceny wewnątrzkomórkowych poziomów drugiego przekaźnika, w tym wapnia i cyklicznego AMP, wykrywania ekspresji białek za pomocą immunocytochemii i koekspresji za pomocą testu proksymalnego postępowania sądowego in situ oraz ekspresji mRNA za pomocą RT-PCR, qRT-PCR, mikromacierzy i sekwencjonowania nowej generacji. Ludzkie komórki DSM poszerzyły naszą wiedzę na temat roli kanałów BK, wapnia i TRPM4 w pęcherzu moczowym.Przyszłe osiągnięcia pozwolą na specyficzne powiązanie właściwości elektrofizjologicznych lub farmakologicznych z profilami transkryptomu lub proteomu.

preparation-utilization-freshly-isolated-human-detrusor-smooth-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Szczegółowe metody obrazowania Ca2+ o wysokiej rozdzielczości w mięśniach gładkich w obrębie izolowanych organów, obejmujące: przygotowanie tkanki, akwizycję obrazu oraz analizę danych.

Wykrywanie ogniskowych przejściowych zmian stężenia Ca2+ w mięśniach gładkich

W tym filmie pokazujemy izolację komórek mięśni gładkich wypieracza z próbek ludzkiego pęcherza moczowego za pomocą dwuetapowej sekwencyjnej obróbki enzymatycznej.

Izolacja komórek mięśni gładkich Detrusor: procedura trawienia enzymatycznego w celu uzyskania komórek DSM z próbek ludzkiego pęcherza moczowego

Ten film demonstruje charakterystykę prądów kationowych z kanałów jonowych melastatyny typu 4 (TRPM4) o potencjale przejściowym w komórkach mięśni gładkich detruzja za pośrednictwem amfoterycyny-B. Technika ta pomaga ocenić właściwości biofizyczne i farmakologiczne kanałów jonowych.

Analiza perforowanego zacisku krosowego za pośrednictwem amfoterycyny-B: elektrofizjologiczna technika badania prądów jonowych w komórkach pęcherza moczowego

Opisujemy izolację ludzkich miocytów przedsionkowych, które mogą być używane do wewnątrzkomórkowych pomiarów Ca2+ w połączeniu z elektrofizjologicznymi badaniami patch-clamp.

Izolacja ludzkich miocytów przedsionkowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądów błonowych

Prezentujemy protokół hodowli komórkowej do bezpośredniego badania neuronalnych i glejowych składników jelitowego układu nerwowego. Mieszana hodowla neuronów i glejów na szkiełkach nakrywkowych jest przygotowywana ze splotu mięśniowo-jelitowego dorosłej myszy, co daje możliwość zbadania funkcji poszczególnych neuronów i gleju za pomocą elektrofizjologii, immunohistochemii itp.

Preparat in vitro izolowanych neuronów jelitowych i gleju ze splotu mięśniowo-jelitowego dorosłej myszy

Ten manuskrypt przedstawia prostą, ale potężną metodę in vitro do oceny kurczliwości mięśni gładkich w odpowiedzi na środki farmakologiczne lub stymulację nerwów. Główne zastosowania to badania przesiewowe leków i zrozumienie fizjologii tkanek, farmakologii i patologii.

Kurczliwość paska mięśni gładkich pęcherza moczowego jako metoda oceny farmakologii dolnych dróg moczowych

Ten artykuł opisuje eksperymentalne protokoły do badania skurczów ex vivo ludzkiej mięśniówki macicy i ich zastosowanie w odkrywaniu leków. Technika ta jest wykorzystywana w celu lepszego zrozumienia fizjologii i patofizjologii mięśniówki macicy, a także do walidacji danych farmakologicznych z nowych sond badawczych lub potencjalnych leków.

Pomiary kurczliwości mięśni gładkich macicy w celu wspomagania opracowywania leków

Model pęcherza bez detrusorów umożliwia bezpośredni dostęp do błony podmoczowej w celu zbadania lokalnych mechanizmów regulacji dostępności biologicznie aktywnego mediatora w suburotelium/blaszce właściwej podczas przechowywania i oddawania moczu. Preparat bardzo przypomina napełnianie nienaruszonego pęcherza moczowego i pozwala na wykonanie badań ciśnienia i objętości bez wpływów ogólnoustrojowych.

Zdecentralizowany (ex vivo) mysi model pęcherza moczowego z usuniętym mięśniem wypierającym w celu uzyskania bezpośredniego dostępu do błony dróg moczowych podczas napełniania pęcherza

Tutaj udostępniamy protokół do generowania in vitro NMJ z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Ta metoda może indukować NMJ o dojrzałej morfologii i funkcji w ciągu 1 miesiąca w jednym dołku. Powstałe w ten sposób NMJ mogą być potencjalnie wykorzystane do modelowania powiązanych chorób, badania mechanizmów patologicznych lub badań przesiewowych związków leczniczych do terapii.

Połączenie nerwowo-mięśniowe in vitro indukowane z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje metodę badania elektrogenicznych białek błonowych poprzez pomiar zmian potencjału błonowego. Test ten stanowi platformę do funkcjonalnego odczytu wielu kanałów jonowych ulegających endogenicznej ekspresji w liniach komórkowych nabłonka.

Oparty na fluorescencji test potencjału błonowego do wysokoprzepustowego badania funkcjonalnego dwóch endogennych kanałów jonowych w dwóch nabłonkowych liniach komórkowych

Naucz się izolacji świeżych ludzkich komórek mięśni gładkich wypieracza do badań elektrofizjologicznych metodą patch-clamp. Ta technika umożliwia analizę kanałów jonowych, w tym TRPM4, na poziomie pojedynczych komórek.

Przygotowanie i wykorzystanie świeżo wyizolowanych ludzkich komórek mięśni gładkich wypieracza do charakterystyki 9-fenantrolowych prądów kationowych (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie i wykorzystanie świeżo wyizolowanych ludzkich komórek mięśni gładkich wypieracza do charakterystyki 9-fenantrolowych prądów kationowych

Przeglądaj więcej filmów