Analiza zawartości kropelek lipidów w drożdżach rozszczepialnych i pączkujących przy użyciu zautomatyzowanego przetwarzania obrazu

Protokół ten ułatwia ilościowe analizy zawartości lipidów magazynujących w komórkach w różnych gatunkach drożdży na małą i dużą skalę, w sposób bezstronny i ustandaryzowany. Technika ta pozwala na szybkie przetwarzanie obrazów mikroskopowych i zapewnia szczegółowe wyniki ilościowe w celu łatwego porównania próbek, takich jak różne mutanty i komórki hodowane w różnych warunkach. Aby rozpocząć, postępuj zgodnie z dołączonym protokołem tekstowym, aby przygotować roztwory barwiące, pożywki hodowlane i komórki.

Upewnij się, że komórki są zdrowe i znajdują się w pożądanej fazie wzrostu przed przeprowadzeniem eksperymentu. Następnie przygotuj szkiełko nakrywkowe mikroskopu dla każdej próbki, która ma być zobrazowana. Rozprowadzić jeden mikrolitr szkiełka powlekającego na czystym szkiełku nakrywkowym, używając dłuższego boku poziomo umieszczonej końcówki pipety.

Poczekaj, aż roztwór powlekający całkowicie wyschnie, a następnie przechowuj szkiełka nakrywkowe w środowisku wolnym od kurzu. Następnie należy zmierzyć gęstości optyczne kultur komórkowych, a w przypadku kultur, które mają być analizowane w tej samej fazie wzrostu, spróbować osiągnąć podobne wartości wśród wszystkich badanych kultur, aby zapewnić porównywalne warunki eksperymentalne. Następnie odpipetuj jeden mililitr kultury komórkowej do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej.

Tylko w przypadku komórek S. cerevisiae dodać do probówki również pięć mikrolitrów roztworu powlekającego szkiełko. Następnie krótko zawiruj wszystkie probówki do mikrowirówek i inkubuj je w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wstrząsając przez pięć minut. Następnie dodaj jeden mikrolitr roztworu do barwienia lipidów do każdej podwielokrotności kultury i krótko je zwiruj.

Następnie dodaj 10 mikrolitrów roztworu do wizualizacji granic komórek i krótko je zwiruj po raz drugi. Zbierz komórki, odwirowując je pod ciśnieniem 1000 razy większym niż grawitacja przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu wirowania usunąć 950 mikrolitrów z supernatantu i ponownie zawiesić komórki w pozostałym supernatantze za pomocą pipety.

Następnie odpipetować dwa mikrolitry gęstej zawiesiny komórek na szkiełko nakrywkowe pokryte lektyną. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na czystym szkiełku mikroskopowym, aby utworzyć monowarstwę komórki, i przystąp do mikroskopii tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować artefakty w obrazowaniu. Ustawienie mikroskopu wymaga długiej ekspozycji na silne źródła światła, które mogą spowodować uszkodzenie próbki i zniekształcenie wyników.

W związku z tym należy skonfigurować warunki obrazowania za pomocą dedykowanego szkiełka do próbki, które nie będzie dalej wykorzystywane do ilościowego oznaczania kropelek lipidów. Umieść dedykowaną próbkę na stoliku mikroskopu kontrastowego z kontrastem fazowym lub interferencją różnicową i skup się na komórkach. W oprogramowaniu mikroskopu ustaw ustawienia stosu Z tak, aby obejmowały całą objętość komórki.

Całkowita odległość w pionie zależy od rozmiaru komórki, a liczba warstw optycznych zależy od apertury numerycznej obiektywu. Następnie ustaw ostrość tak, aby poruszała się względem centralnej płaszczyzny ogniskowej. Aby zobrazować kropelki lipidów, eksperymentalnie ustaw natężenie światła i czas ekspozycji w kanale zielonym.

Należy zachować ostrożność podczas obrazowania, ponieważ BODIPY jest bardzo jasnym fluorochromem, który może być szybko wybielany. Dodatkowo zminimalizuj czas ekspozycji, aby uniknąć przesycenia. Najpierw uchwyć pełny zielony kanał Z-stack przed przełączeniem na kanał niebieski, aby zapobiec rozmyciu ruchomych kropelek lipidów.

Aby zobrazować granice komórek, eksperymentalnie ustaw natężenie światła i czas ekspozycji w kanale niebieskim. Jeśli to możliwe, skonfiguruj i używaj zautomatyzowanego przepływu pracy eksperymentalnej w oprogramowaniu sterującym mikroskopem, aby ułatwić obrazowanie wielu próbek w standardowych warunkach. Co ważne, wszystkie obrazy muszą być uzyskane przy użyciu tych samych ustawień, aby umożliwić odpowiednie porównanie między próbkami.

Po zoptymalizowaniu warunków obrazowania skup się na komórkach i zobrazuj je zarówno w kanale zielonym, jak i niebieskim. Obrazuj wiele pól widzenia dla każdej próbki, aby uzyskać solidne, reprezentatywne dane. Zapisz obrazy stosu Z kanału niebieskiego i zielonego jako 16-bitowe, wielowarstwowe pliki TIFF.

Pamiętaj, aby w odpowiednich nazwach plików umieścić słowa zielony lub niebieski. Otwórz obrazy mikroskopowe w ImageJ i usuń wszystkie stosy obrazów zawierające znaczną liczbę komórek, które poruszały się podczas akwizycji. Pojawiają się one w różnych pozycjach w poszczególnych sekcjach Z.

Następnie usuń wszystkie stosy obrazów zawierające wysoce fluorescencyjne cząstki niekomórkowe w kanale niebieskim. Jest to często spowodowane zabrudzeniem powierzchni obrazowania lub zanieczyszczeniami w podłożu uprawowym i może zakłócać wykrywanie komórek w ich pobliżu. Usuń także wszystkie stosy obrazów zawierające dużą część martwych komórek.

Obrazy te będą wyświetlać komórki o zwiększonej niebieskiej fluorescencji w porównaniu z żywymi komórkami. Podczas gdy obecność kilku martwych komórek w próbce zazwyczaj nie stanowi problemu, a komórki te są automatycznie odrzucane podczas analizy, niektóre martwe lub umierające komórki mogą czasami zostać rozpoznane jako żywe komórki przez algorytm segmentacji, a tym samym zniekształcić zgłoszone wyniki. Aby rozpocząć analizę w programie MATLAB, najpierw utwórz folder główny i skopiuj wszystkie skrypty MATLAB do tej lokalizacji.

Następnie utwórz podfoldery z nazwami różnych gatunków drożdży i skopiuj odpowiednie obrazy TIFF do tych lokalizacji. Teraz uruchom MATLAB, otwórz skrypt MAIN. m i uruchom skrypt.

W menu wybierz gatunki drożdży, które mają być analizowane i rozpocznij przetwarzanie obrazu. Sprawdź i przetwórz pliki wyjściowe zgodnie z wymaganiami za pomocą edytora arkuszy kalkulacyjnych lub pakietu statystycznego. Przepływ pracy tworzy pliki CSV oddzielone średnikami i segmentowane pliki TIFF z wykrytymi obiektami komórkowymi i kropelkami lipidów.

Pokazano tutaj komórki S.pombe typu dzikiego, które były hodowane w złożonym pożywce YES lub zdefiniowanej pożywce EMM. W porównaniu z komórkami hodowanymi w pożywce YES, w pożywce EMM wykryto mniej kropelek lipidów i większą intensywność barwienia na jednostkę objętości komórki. Co więcej, pojedyncze kropelki lipidów utworzone w pożywce EMM były większe i wykazywały zwiększoną całkowitą intensywność barwienia.

Jest to zgodne z wcześniejszymi odkryciami dotyczącymi zwiększonej zawartości zmagazynowanych lipidów w komórkach hodowanych w EMM. Następnie, zdjęcia te pokazują komórki S.japonicus z kultur wykładniczych i wczesnostacjonarnych hodowanych na pożywce YES. Komórki wchodzące w fazę stacjonarną wykazywały znacznie zmniejszoną liczbę kropelek lipidów na jednostkę objętości komórki, podczas gdy znormalizowana objętościowo intensywność fluorescencji kropelek lipidów nieznacznie zmniejszyła się między tymi dwoma warunkami.

Wczesne kropelki lipidów w fazie stacjonarnej były zazwyczaj umiarkowanie większe i miały umiarkowanie wyższą całkowitą intensywność fluorescencji w porównaniu z kropelkami z wykładniczo rosnących komórek. W komórkach S. cerevisiae wyhodowanych do fazy wykładniczej w porównaniu z fazą stacjonarną, komórki stacjonarne zawierały nieco mniej kropelek lipidów na jednostkę objętości w porównaniu z komórkami rosnącymi wykładniczo. Jednak ich znormalizowana objętościowo intensywność fluorescencji kropel prawie się podwoiła.

Ten gwałtowny wzrost ogólnej zawartości kropelek lipidów był spowodowany znacznie większą intensywnością fluorescencji i objętością poszczególnych kropelek lipidów w fazie stacjonarnej. Zgodnie z tą procedurą dane wyjściowe można zagregować w pakiecie statystycznym, takim jak R, w celu utworzenia wykresów podsumowanych wyników i przeprowadzenia testów statystycznych dotyczących wszelkich zaobserwowanych różnic w zawartości kropelek lipidów. Zasadniczo potok przetwarzania obrazu może być wykorzystywany do analizy zawartości kropelek lipidów w innych mikroorganizmach lub do analizy innych kropek subkomórkowych