Name: Lucyferazy-fluorescencyjny wirus reporterowy grypy do obrazowania na żywo i ilościowego oznaczania infekcji wirusowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-14T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Poznaj metodę obrazowania zakażeń wirusem grypy typu A przy użyciu dwureporterowego systemu BIRFLU, który łączy lucyferazę i fluorescencję. Technika umożliwia jednoczesne badania in vitro i in vivo w modelu mysim.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania nad wirusem grypy w laboratorium LM-S są częściowo finansowane przez The New York Influenza Center of Excellence (NYICE) (NIH 272201400005C), członka NIAID Centers of Excellence for Influenza Research and Surveillance (CEIRS) kontrakt nr. HHSN272201400005C (NYICE) oraz przez Departament Obrony (DoD) Peer Reviewed Medical Research Program (PRMRP) grant W81XWH-18-1-0460.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Naukowcy oparli się na rekombinowanych wirusach wykazujących ekspresję reporterową jako kluczowych narzędziach molekularnych, aby zrozumieć i poszerzyć obecną wiedzę na temat replikacji i patogenezy wirusa 26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,54. Najczęściej preferowanymi genami reporterowymi są lucyferazy i białka fluorescencyjne, głównie ze względu na postęp technologiczny w ich identyfikacji, rozwój ulepszonych wariantów i wykrywanie za pomocą technologii obrazowania 43,44,45,46,47,48. Rekombinowane wirusy reporterowe są często wykorzystywane do przyspieszania testów wirusologicznych, badania dynamiki wirusów in vitro i in vivo oraz do testowania skuteczności obecnie zatwierdzonych lub nowych podejść szczepionkowych i terapeutycznych 26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,54. Niestety, w przypadku IAV wcześniejsze badania ograniczały się do ekspresji pojedynczego genu reporterowego, co utrudnia przeprowadzenie tego typu badań 26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,54. Aby uniknąć tego ograniczenia, wygenerowaliśmy dwureporterowy IAV z kompetencjami replikacyjnymi, który wyraża lucyferazy Nluc i białko fluorescencyjne Wenus (BIRFLU).
W niniejszym raporcie opisano charakterystykę in vitro BIRFLU oraz eksperymentalne podejścia do wykorzystania BIRFLU do śledzenia infekcji wirusowej in vivo przy użyciu mysiego modelu zakażenia IAV. Ekspresja BIRFLU Nluc i Wenus korelowała z mianami wirusa. Ponadto BIRFLU pozostał stabilny i kontynuował ekspresję obu genów reporterowych po wydostaniu się z płuc zakażonych myszy. Takie podejście daje naukowcom doskonałą okazję do zbadania IAV w hodowanych komórkach i modelach zwierzęcych, w tym identyfikacji i opracowania nowych alternatyw terapeutycznych w leczeniu zakażeń IAV.
Chociaż BIRFLU został wygenerowany przy użyciu szkieletu PR8, inne rekombinowane IAV wykorzystujące różne typy, podtypy lub szczepy wirusa mogą być generowane przy użyciu tego samego podejścia eksperymentalnego. Podobnie, w niniejszym raporcie opisaliśmy procedury eksperymentalne dotyczące stosowania BIRFLU w mysim modelu IAV. Jednak projekt BIRFLU może być cenną technologią do oceny zakażeń IAV w innych modelach zwierzęcych.

Wirus grypy A (IAV) jest jednoniciowym, segmentowanym wirusem RNA o ujemnym znaczeniu z rodziny Orthomyxoviridae1,2,3. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) szacuje, że na całym świecie odnotowuje się od 3 do 5 milionów przypadków grypy rocznie i ponad 250 000 zgonów z powodu grypy4,5,6. Grupy, które są szczególnie narażone na grypę, to osoby starsze, osoby z obniżoną odpornością i dzieci7,8,9,10,11. Chociaż szczepionki są dostępne i stanowią najpowszechniejszą i najskuteczniejszą interwencję przeciwko infekcji wirusowej, IAV jest w stanie szybko ewoluować i uciec przed istniejącą wcześniej odpornością3,12,13,14,15. Ponowne pojawienie się pandemicznego szczepu H1N1 w 2009 r. i pojawienie się patogennego wirusa IAV potwierdza ciągłe zagrożenie dla zdrowia publicznego ludzi na całym świecie4,16.
Podczas epidemii lub pandemii kluczowe jest szybkie określenie chorobotwórczości i zdolności przenoszenia nowo wyizolowanych wirusów. Obecnie dostępne techniki wykrywania wirusa są czasochłonne i czasami wymagają zastosowania pracochłonnych metod, co może opóźnić zakończenie tych analiz17,18,19,20. Co więcej, obecne testy na obecność wirusa są trudne do zwiększenia skali, co może być konieczne w przypadku wybuchu epidemii. Wreszcie, stosowanie zwalidowanych zwierzęcych modeli infekcji, takich jak myszy, świnki morskie i fretki, jest rutynowo stosowane i ma zasadnicze znaczenie w badaniu zakażeń grypą, odpowiedzi immunologicznych i skuteczności nowych szczepionek i/lub leków przeciwwirusowych. Modele te są jednak restrykcyjne ze względu na brak możliwości obserwowania dynamiki wirusa w czasie rzeczywistym; Ogranicza to badania do statycznego obrazowania infekcji wirusowych<klasa SUP = "xref" > 21,< klasa SUP = "xref" > 22 < klasa SUP = "xref">23,< klasa SUP = "xref">24,< klasa SUP = "XREF">25. Zwierzęta wykorzystywane w tych testach są również poddawane eutanazji w celu określenia wiremii, zwiększając w ten sposób liczbę zwierząt wymaganych do ukończenia tych badań26. Aby obejść wszystkie te ograniczenia, wielu badaczy polega na użyciu rekombinowanych, kompetentnych do replikacji, wykazujących ekspresję reporterową, IAV, które są w stanie przyspieszyć testy wirusologiczne oraz wykrywać miano wirusa i rozprzestrzenianie się in vivo w czasie rzeczywistym26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41. Co ważne, te IAV wykazujące ekspresję reporterową są w stanie replikować się podobnie do IAV typu dzikiego (WT) w hodowli komórkowej i w zwierzęcych modelach infekcji33,42.
Białka fluorescencyjne i bioluminescencyjne to dwa systemy reporterowe powszechnie używane przez badaczy ze względu na ich czułość, stabilność i łatwość użycia. Ponadto istnieje ogromne wsparcie i postęp w technologiach wykrywania białek fluorescencyjnych i bioluminescencyjnych43,44,45,46,47,48. Białka fluorescencyjne i lucyferazy mają różne właściwości, które pozwalają im świecić, w szczególności różnią się sposobem generowania stanów wzbudzonych i wykrywaniem emisji43,44,45,46,47,48. Białka fluorescencyjne są najpierw wzbudzane przez pochłanianie energii, która jest następnie uwalniana jako światło o innej długości fali, gdy cząsteczki spadają do niższego stanu energetycznego43. Z drugiej strony, bioluminescencja wywodzi się z chemicznej reakcji egzotermicznej, która obejmuje substrat, tlen, a czasem ATP w celu wytworzenia światła45. Ze względu na różne właściwości tych dwóch typów białek reporterowych, jedno może być bardziej korzystne od drugiego, w zależności od interesującego badania. Podczas gdy białka fluorescencyjne są szeroko stosowane do obserwacji lokalizacji komórkowej28,41, ich sygnały in vivo mają nieodpowiednią intensywność i często są przesłonięte przez autofluorescencję w żywych tkankach49. Dlatego naukowcy polegają na lucyferazach do oceny dynamiki wirusa w żywych organizmach, chociaż białka fluorescencyjne mogą być preferowane w badaniach ex vivo50,51,52,53. W przeciwieństwie do białek fluorescencyjnych, lucyferazy są wygodniejsze w badaniach in vivo i mają większe zastosowanie w podejściach nieinwazyjnych26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35,36,37,38,39,40,41,54. Ostatecznie, w zależności od rodzaju badania, naukowcy muszą wybrać między użyciem białka reporterowego fluorescencyjnego lub lucyferazy jako odczytu, co poddaje ich badanie kompromisowi między funkcjonalnościami i czułością oraz poważnie ogranicza użyteczność rekombinowanych wirusów reporterowych. Ponadto istnieją obawy dotyczące korelacji między ekspresją różnych genów reporterowych za pomocą systemów fluorescencyjnych lub lucyferazy a replikacją lub rozprzestrzenianiem się wirusa, co może zagrozić interpretacji danych uzyskanych za pomocą IAV wykazujących ekspresję reportera.
Pokonaliśmy to ograniczenie, generując rekombinowany, kompetentny do replikacji bi-reporterowy IAV (BIRFLU), który koduje zarówno białko fluorescencyjne, jak i lucyferazy w tym samym genomie wirusa55 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). W tym przypadku lucyferazy NanoLuc (Nluc), małe i jasne białko bioluminescencyjne48, zostało wprowadzone przed sekwencją hemaglutyniny (HA) w wirusowym segmencie HA grypy A/Puerto Rico/08/1934 H1N1 (PR8)24,33,40,55,56,57. Ponadto Venus, często używane monomeryczne białko fluorescencyjne, zostało wstawione do niestrukturalnego <(NS) segmentu wirusa sup class="xref">32,33,36,41,55. Ponieważ BIRFLU koduje zarówno geny reporterowe fluorescencyjne, jak i lucyferazy, każdy sygnał białka reporterowego może być wykorzystany jako odczyt do określenia replikacji i rozprzestrzeniania się wirusa in vitro lub in vivo55. Dodatkowe informacje na temat wytwarzania i charakterystyki in vitro lub in vivo BIRFLU można znaleźć w naszej najnowszej publikacji55. BIRFLU może być stosowany do testowania skuteczności leków przeciwwirusowych lub przeciwciał neutralizujących za pomocą nowatorskiego testu mikroneutralizacji opartego na fluorescencji i bioluminescencji55. Co więcej, BIRFLU może być również wykorzystany do oceny dynamiki wirusa w mysim modelu infekcji55. W tym manuskrypcie opisujemy procedury charakteryzujące BIRFLU55 in vitro oraz sposób badania zakażenia BIRFLU u myszy przy użyciu systemów obrazowania luminescencyjnego in vivo do wykrywania Nluc in vivo lub Venus ex vivo.
Połączenie najnowocześniejszych technik w biologii molekularnej, badaniach na zwierzętach i technologiach obrazowania, daje naukowcom unikalną możliwość wykorzystania BIRFLU do badań nad IAV, w tym do badania interakcji wirus-gospodarz, dynamiki infekcji wirusowych; rozwoju nowych podejść do szczepionek do terapeutycznego leczenia zakażeń IAV lub potencjalnego wykorzystania IAV jako wektora szczepionki do leczenia innych infekcji patogennych.

<table><tbody><tr><td>12-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Greiner Bio-one</td><td>665102</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS4</td><td>Adobe</td><td></td><td>To oprogramowanie jest używane w wersji 3.1.10 i 4.4.7</td></tr><tr><td>Roztwór albuminy Bovina (BA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A7409</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Albumina surowicy Bovin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>Przechowywać w 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli komórkowych 100 mm</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664-160</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania ChemiDoc MP</td><td>BioRad</td><td></td><td>Ten instrument jest używany w 4.4.7</td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C581-100</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Młynki do tkanek Dounce</td><td>Thomas Scientific</td><td>7722-7</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-013-CV</td><td>Przechowywać w 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1500-050</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>5 do 7 tygodniowe samice myszy BALB/c</td><td>National Cancer Institute (NCI)</td><td>555</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td><td>Ten instrument służy do obrazowania in vivo (4.2 i 4.3)</td></tr><tr><td>IX81 Zmotoryzowany mikroskop odwrócony</td><td>Olympus</td><td>Olympus IX81</td><td></td></tr><tr><td>Żywy obraz 4.7.2 oprogramowanie</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Ten instrument służy do obrazowania in vivo (4.2 i 4.3)</td></tr><tr><td>Lumicount</td><td>Packard</td><td></td><td>Ten instrument służy do ilościowego określania aktywności lucyferazy (3.2.6)</td></tr> <tr><td>Komórki nabłonkowe nerki psów Madin-Darby (MDCK)</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne anty-NP Wirus grypy A HB-65</td><td>ATCC</td><td>H16-L10-4R5</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Odczynnik do oznaczania lucyferazy Nano-Glo</td><td>Promega</td><td>N1110</td><td>Ten odczynnik służy do pomiaru aktywności Nluc. Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Neutralna buforowana formalina 10%</td> <td>EMD</td><td>65346-85</td><td>Przechowywać w RT</td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-dołkowe mikropłytki</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>269620</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna (PS) 100x</td><td>Corning</td><td>30-00-CI</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna/L-Glutamina (PSG) 100x</td><td>Corning</td><td>30-009-CI</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Retiga 20000R Fast1394 Kamera</td><td>Qimaging Skaner</td><td>Retiga 2000R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>HP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Texas Czerwono-sprzężone przeciwciała wtórne anty-myszy -królika</td><td>Jackson</td><td>715-075-150</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Trypsyna traktowana tosylsulfonylem fenyloalanylem chlorometylowym (TPCK)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8802</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 &; C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>J.T.Baker</td><td>X198-07</td><td>Przechowywać w RT</td></tr><tr><td>Vmax Czytnik płytek kinetycznych</td><td>Urządzenia molekularne</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

lucyferazy-fluorescencyjny wirus reporterowy grypy do obrazowania na żywo i ilościowego oznaczania infekcji wirusowej

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

Wirusy grypy A (IAV) powodują choroby układu oddechowego u ludzi, które mają poważne konsekwencje zdrowotne i ekonomiczne. Podobnie jak w przypadku innych wirusów, badanie IAV wymaga zastosowania pracochłonnych podejść wtórnych w celu wykrycia obecności wirusa w zakażonych komórkach i/lub w zwierzęcych modelach infekcji. Ograniczenie to zostało ostatnio ominięte dzięki generowaniu rekombinowanych IAV wykazujących ekspresję łatwych do wyśledzenia białek reporterowych fluorescencyjnych lub bioluminescencyjnych (lucyferazy). Jednak naukowcy zostali zmuszeni do wybrania genów reporterowych fluorescencyjnych lub lucyferazy ze względu na ograniczoną zdolność genomu IAV do włączania obcych sekwencji. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, wygenerowaliśmy rekombinowany, kompetentny do replikacji bi-reporterowy IAV (BIRFLU) stabilnie eksprymujący zarówno gen reporterowy fluorescencyjny, jak i reporterowy lucyferazy, aby łatwo śledzić infekcje IAV in vitro i in vivo. W tym celu wirusowe segmenty wirusa niestrukturalnego (NS) i hemaglutyniny (HA) wirusa grypy A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) zmodyfikowano tak, aby kodowały odpowiednio fluorescencyjne białka Wenus i bioluminescencyjne białka lucyferazy Nanoluc. W tym miejscu opisujemy zastosowanie BIRFLU w mysim modelu zakażenia IAV i wykrywanie obu genów reporterowych za pomocą systemu obrazowania in vivo. Warto zauważyć, że zaobserwowaliśmy dobrą korelację między ekspresją obu reporterów a replikacją wirusa. Połączenie najnowocześniejszych technik biologii molekularnej, badań na zwierzętach i technologii obrazowania daje naukowcom wyjątkową możliwość wykorzystania tego narzędzia do badań nad grypą, w tym do badania interakcji wirus-gospodarz i dynamiki infekcji wirusowych. Co ważne, możliwość genetycznej modyfikacji genomu wirusa w celu ekspresji dwóch obcych genów z różnych segmentów wirusa otwiera możliwości wykorzystania tego podejścia do: (i) opracowania nowych szczepionek przeciwko IAV, (ii) generowania rekombinowanych wirusów IAV, które mogą być stosowane jako wektory szczepionkowe w leczeniu innych zakażeń patogenami ludzkimi.

Generowanie i charakterystyka BIRFLU in vitro (Rysunek 1 i Rysunek 2)
Rekombinowany, zdolny do replikacji wirus IAV wykazujący ekspresję dwóch różnych genów reporterowych (BIRFLU) został skonstruowany przy użyciu nowoczesnych technik biologii molekularnej i odwrotnej genetyki opartej na plazmidach (Rysunek 1). W tym przypadku zdecydowano się na użycie Nluc ze względu na szereg zalet w porównaniu z innymi lucyferazami, w tym niewielki rozmiar, niezależność od ATP, większą intensywność oraz zoptymalizowany substrat48,60. Nluc sklonowano do segmentu HA IAV PR8, po czym dodano miejsce cięcia teschowirusa świńskiego (PTV) 2A (2A) przed otwartą ramką odczytu (ORF) HA (Rysunek 1). ORF HA zawierała mutacje ciche w celu usunięcia oryginalnych sygnałów upakowania i uniknięcia ewentualnej rekombinacji. Przed Nluc dodano kompletny sygnał upakowania HA, aby umożliwić prawidłową inkorporację zmodyfikowanego segmentu HA do wirionu oraz ekspresję Nluc i HA z tego samego wirusowego segmentu RNA (Rysunek 1). Dodatkowo białko fluorescencyjne Venus sklonowano do zmodyfikowanego segmentu NS IAV PR8, który koduje dwa białka wirusowe NS1 i NEP z jednego transkryptu32,36,41,54,57. W tym celu Venus połączono z końcem C-terminalnym NS1, a całą ORF NEP sklonowano w kierunku 3' od miejsca cięcia PTV 2A, które zostało umieszczone pomiędzy sekwencjami NS1-Venus a NEP (Rysunek 1). Ostatecznie te dwie zmodyfikowane konstrukcje plazmidowe wirusowe HA i NS wykorzystano w połączeniu z pozostałymi plazmidami do odwrotnej genetyki IAV PR8 w celu wygenerowania BIRFLU (Rysunek 1). Charakterystyka BIRFLU in vitro i in vivo została opisana wcześniej55.
Na Ryc. 2 scharakteryzowano in vitro BIRFLU poprzez oznaczenie poziomów ekspresji Venus, Nluc i NP z wykorzystaniem fluorescencji oraz pośredniej immunofluorescencji (Ryc. 2A,B). Konfluentne monowarstwy komórek MDCK poddano infekcji pozorowanej (mock) lub zainfekowano (MOI 0,1) wirusami WT lub BIRFLU PR8, a po 18 h od infekcji bezpośrednio oceniono ekspresję Venus za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Ryc. 2A,B). Ekspresję Nluc (Ryc. 2A) i NP (Ryc. 2B) zwizualizowano metodą pośredniej immunofluorescencji z użyciem przeciwciał specyficznych dla każdego z białek. Zgodnie z przewidywaniami, ekspresję Venus i Nluc wykryto wyłącznie w komórkach zainfekowanych BIRFLU, a nie w komórkach zainfekowanych wirusem WT PR8. Ponadto mikroskopia immunofluorescencyjna pośrednia wykazała ekspresję NP zarówno w komórkach zainfekowanych WT, jak i BIRFLU PR8. Jak oczekiwano, w komórkach poddanych infekcji pozorowanej nie stwierdzono ekspresji Venus, Nluc ani NP (Ryc. A,B).
Aby ocenić poziomy ekspresji Nluc in vitro, komórki MDCK zainfekowano (MOI 0,001) wirusami WT lub BIRFLU PR8, a następnie oceniono aktywność Nluc w nadsączach hodowli tkankowych w 24, 48, 72 i 96 h po infekcji (Rysunek 2C). Aktywność Nluc wykryto wyłącznie w nadsączach hodowli tkankowych komórek MDCK zainfekowanych BIRFLU (Rysunek 2C). Aktywność Nluc w nadsączach hodowli tkankowej wykryto już w 24 h po infekcji, przy czym wyższe poziomy ekspresji odnotowano w 96 h po infekcji, co najprawdopodobniej wynika z faktu, że efekt cytopatyczny (CPE) indukowany podczas infekcji wirusowej uwalnia białko Nluc zatrzymane w komórce. Aby ocenić sprawność BIRFLU w hodowlach komórkowych, oceniono również kinetykę wzrostu wirusów WT i BIRFLU PR8 (Rysunek 2D), a obecność zakaźnego wirusa w nadsączach hodowli tkankowych określono za pomocą testu immune-focus (Rysunek 2D). Warto zauważyć, że kinetyka replikacji BIRFLU była porównywalna do kinetyki wirusa WT PR8, choć replikacja BIRFLU była nieco opóźniona i nie osiągnęła tak wysokich mian wirusa jak WT PR8. Niemniej jednak BIRFLU był w stanie osiągnąć miano 5 x 107 PFU/mL (Rysunek 2D), co wskazuje, że ekspresja dwóch genów reporterowych w genomie wirusa nie zakłóca znacząco replikacji BIRFLU w komórkach MDCK.
Śledzenie infekcji BIRFLU u myszy (Rycina 3 i Rycina 4)
Rysunek 3 przedstawia schematycz questiu przepływu oceny dynamiki BIRFLU w mysim modelu zakażenia IAV. Samice myszy BALB/C w wieku od pięciu do siedmiu tygodni zostały poddane pozorowanemu zakażeniu 1x PBS lub zakażone donosowo dawką 1 x 106 PFU BIRFLU. W 3. dobie po zakażeniu myszy znieczulono izofluranem, a następnie wstrzyknięto im retroskrabialnie substrat Nluc. Wszystkie myszy natychmiast umieszczono w urządzeniu IVIS i oceniono sygnał Nluc in vivo za pomocą IVIS. Następnie myszy uśpiono i pobrano płuca. Wycięte płuca przeanalizowano ex vivo za pomocą obrazera in vivo w celu określenia intensywności fluorescencji poprzez ekspresję Venus. Na koniec płuca myszy zhomogenizowano, a miano i stabilność wirusa określono za pomocą metody plackowej. Plaki oceniano poprzez bezpośrednią fluorescencję Venus, immunobarwienie z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych dla Nluc oraz barwienie fioletem krystalicznym.
Opisane wcześniej zdolne do replikacji wirusy IAV wykazujące ekspresję genów raportowych zawierają pojedynczy gen raportowy, najczęściej białko fluorescencyjne lub bioluminescencyjne, który służy jako wskaźnik infekcji i replikacji wirusa. Jednak BIRFLU jest w stanie wyekspresować oba typy genów raportowych po infekcji wirusowej. Aby ocenić korelację między bioluminescencją (obrazowanie in vivo) a fluorescencją (obrazowanie ex vivo) po infekcji BIRFLU, samice myszy BALB/c w wieku od pięciu do siedmiu tygodni poddano infekcji pozorowanej z użyciem 1x PBS lub inokulowano BIRFLU (106 PFU) donosowo. Aktywność Nluc (Rycina 4A) oceniono poprzez podanie substratu Nluc w zastrzyku zaoczodołowym w 3. dobie po zakażeniu z wykorzystaniem urządzenia do obrazowania in vivo. Zdecydowano się na ocenę bioluminescencji w 3. dobie, ponieważ wcześniejsze badania wykazały, że replikacja IAV, w tym szczepu PR8, osiąga szczyt między 2. a 4. dobą po zakażeniu24,54Monitorowano bioluminescencję (Rycina 4A, góra) i wykorzystano go do obliczenia średniego całkowitego strumienia (Strumień (log10 p/s) (Rycina 4A, dół). Zgodnie z przewidywaniami, u myszy inokulowanych BIRFLU odnotowano wysoką aktywność bioluminescencyjną, natomiast u myszy w grupie kontrolnej (mock) nie wykryto żadnego sygnału. Następnie pobrano płuca z zainfekowanych myszy i oceniono ekspresję białka Venus za pomocą obrazowania ex vivo (Rycina 4B, góra). Ponadto obliczono średnią wydajność promienistą fluorescencji (Rysunek 4B, dół). Wycięte płuca myszy poddano również homogenizacji w celu oznaczenia mian wirusa oraz stabilności genetycznej BIRFLU in vivo (Rysunek 4C,D). Stabilność genetyczną BIRFLU analizowano za pomocą testu plackowego z wykorzystaniem wirusów wyizolowanych z płuc myszy oraz mikroskopii fluorescencyjnej (Venus, góra), immunobarwienia (Nluc, środek) i barwienia fioletem krystalicznym (dół). BIRFLU odzyskane z płuc myszy były zdolne do tworzenia placków i stabilnie wyrażały oba geny reporterowe (Rycina 4CWarto zauważyć, że zaobserwowano dobrą korelację sygnałów bioluminescencyjnych i fluorescencyjnych z replikacją wirusa.
<img alt="Schemat edycji genów wirusa grypy z ekspresją białek Nluc i Venus, wirus typu dzikiego vs BIRFLU." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczna reprezentacja struktury wirionu i segmentów genomu IAV PR8 WT oraz BIRFLU. Wirusy IAV są otoczone dwuwarstwą lipidową zawierającą dwie główne glikoproteiny wirusowe: hemaglutyninę (HA; kolor czarny) i neuraminidazę (NA; kolor niebieski). IAV zawierają osiem jednoniciowych, ujemnych segmentów RNA (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M oraz NS). Każdy segment wirusowy zawiera regiony niekodujące (NCR) na końcach 3’ i 5’ (czarne prostokąty). Ponadto na końcach 3’ i 5’ wirusowego RNA (vRNA) znajdują się sygnały upakowania, odpowiedzialne za efektywną enkapsydację vRNA do powstających wirionów (białe prostokąty). Segmenty wirusowe i produkty HA oraz NS IAV PR8 zaznaczono na czarno. Sekwencje Nluc, Venus i PTV 2A zaznaczono odpowiednio czerwonymi, zielonymi i prążkowanymi prostokątami. Przedstawiono również schematyczną reprezentację zmodyfikowanych segmentów HA i NS w BIRFLU, które ekspresują odpowiednio Nluc i Venus. Rysunek został zaadaptowany z pracy Nogales et al.55. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza badania wirusa; mikroskopia fluorescencyjna i krzywe wzrostu; BIRFLU vs WT." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Charakterystyka in vitro BIRFLU. (A, B) Analiza ekspresji białek metodą bezpośredniej fluorescencji i immunofluorescencji. Komórki MDCK poddano infekcji pozornej lub zainfekowano (MOI 0,1) wirusami PR8 WT lub BIRFLU. Zainfekowane komórki utrwalono 18 h po infekcji w celu bezpośredniej wizualizacji ekspresji Venus za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz wizualizacji ekspresji Nluc (A) i wirusowego NP (B) z zastosowaniem swoistych przeciwciał i pośredniej immunofluorescencji. Jądra komórkowe barwiono DAPI. Przedstawiono reprezentatywne obrazy (powiększenie 20x). Paski skali = 100 μm. (C, D) Kinetyka wzrostu PR8 WT i BIRFLU. Aktywność Nluc (C) oraz miana wirusa (D) w nadsączach z kultur komórek MDCK zainfekowanych (MOI 0,001) wirusami PR8 WT i BIRFLU oceniano w określonych punktach czasowych po infekcji. Dane przedstawiają średnie ± SD z trzech powtórzeń. Miana wirusa określono za pomocą testu ognisk immunologicznych (FFU/mL). Linia przerywana oznacza granicę wykrywalności (200 FFU/ml). Rysunek został zaadaptowany z pracy Nogales et al.55. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Harmonogram badania wirulencji u myszy: inokulacja, obrazowanie Nluc, pobranie płuc, wykres wyników testu plackowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Schematyczne przedstawienie badania BIRFLU u myszy. Ekspresję genów reporterowych Nluc i Venus oceniano u myszy zainfekowanych 1 x 106 PFU BIRFLU za pomocą obrazowania in vivo lub ex vivo. W skrócie, w dniu 1. samice myszy BALB/c w wieku od 5 do 7 tygodni poddano infekcji pozorowanej (1x PBS) lub inokulowano donosowo 1 x 106 PFU BIRFLU. W 3. dniu po infekcji myszy poddano lekkiej anestezji izofluranem, a substrat Nluc wstrzyknięto drogą retroorbitalną. Sygnał Nluc oceniano bezpośrednio za pomocą obrazowania in vivo. Bezpośrednio po obrazowaniu myszy uśpiono, a ekspresję Venus w całych wyciętych płucach analizowano za pomocą obrazowania ex vivo. Odzyskane płuca myszy poddano homogenizacji w celu oceny replikacji i stabilności wirusa za pomocą testu plackowego. Strzałki wskazują korelację między fluorescencją (Venus), immunobarwieniem (Nluc) a barwieniem fioletem krystalicznym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazowanie bioluminescencyjne, fluorescencja Nluc i Venus, analiza miana wirusa, wyniki eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Ekspresja bioluminescencji i fluorescencji in vivo. Samice myszy BALB/c w wieku od pięciu do siedmiu tygodni poddano infekcji pozorowanej (1x PBS) lub zaszczepiono dawką 1 x 106 PFU BIRFLU donosowo. W 3. dobie po zakażeniu aktywność Nluc (A) określono w całym organizmie myszy. Reprezentatywne obrazy pojedynczej myszy przedstawiające skalę radiancji (p/sek/cm2Wartości promieniowania bioluminescencyjnego zostały ilościowo określone i przedstawiono średni całkowity strumień (Strumień (Log10 p/s). Po obrazowaniu Nluc pobrano płuca do obrazowania ex vivo (B). Przedstawiono reprezentatywne zdjęcia całych płuc. W celu ilościowego określenia ekspresji białka Venus znormalizowano średnie wartości z obszarów zainteresowania (ROI) względem autofluorescencji płuc myszy z grupy kontrolnej (mock-infected) i obliczono krotność zmian. Aby przeanalizować stabilność genetyczną BIRFLU in vivo, wirusy wyizolowane z płuc myszy poddano analizie metodą testu płytek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej (Venus, góra), immunobarwienia (Nluc, środek) oraz barwienia fioletem krystalicznym (dół) (C). Przedstawiono reprezentatywne obrazy od jednej myszy. W celu oceny replikacji wirusa, całe płuca poddano homogenizacji po wykonaniu obrazowania, a następnie wykorzystano je do zakażenia komórek MDCK i oznaczenia mian wirusa za pomocą testu plackowego (PFU/ml) (D). Strzałki wskazują korelację między fluorescencją (Venus), barwieniem immunologicznym (Nluc) a barwieniem fioletem krystalicznym. Słupki reprezentują średnią ± SD mian wirusa w płucach. Rysunek został zaadaptowany z pracy Logales i wsp.55. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig4large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pożywki i roztwory do hodowli tkankowych</td>
			<td>Skład</td>
			<td>Przechowywanie</td>
			<td>Zastosowanie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pożywki do hodowli tkankowych: podłoże DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium), 10% płodowa surowica bydlęca (FBS), 1% penicylina-streptomycyna-L-glutamina (PSG) (DMEM z 10% FBS i 1% PSG).</td>
			<td>445 ml DMEM, 50 ml FBS oraz 5 ml 100x PSG.</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>Utrzymanie hodowli komórek MDCK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pożywka poinfekcyjnaDMEM 0,3% albuminy bydlęcej (BA), 1% PSG (DMEM 0,3% BA 1% PSG).</td>
			<td>491 ml DMEM, 4,2 ml 35% BA oraz 5 ml 100x PSG</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>Utrzymanie komórek MDCK po infekcji wirusowej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x roztwór soli fosforowo-buforowanej (PBS)</td>
			<td>80 g NaCl, 2 g KCl, 11,5 g Na2HPO4.7H2O, 2 g KH2PO4Dodać ddH2O2do 1 L. Dostosować pH do 7,3</td>
			<td>Temperatura pokojowa</td>
			<td>Aby przygotować 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS </td>
			<td>Rozcieńczyć 10x PBS w ddH2O2O</td>
			<td>Temperatura pokojowa</td>
			<td>Przemycie komórek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pożywki do zakażania: 1x PBS, 0,3% BA, 1% penicyliny-streptomycyny (PS) (PBS/BA/PS).</td>
			<td>487 ml sterylnego 1x PBS, 4,2 ml 35% BA oraz 5 ml 100x 1% PS (100 J/ml)</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>Infekcje wirusowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór do fiksacji/permeabilizacji: 4% formaldehyd, 0,5% Triton X-100 rozcieńczone w 1x PBS.</td>
			<td>400 ml 10% neutralnego buforowanego formaliny, 5 ml Tritonu X-100 oraz 595 ml 1x PBS</td>
			<td>Temperatura pokojowa</td>
			<td>Fiksacja i permeabilizacja komórek MDCK.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór blokujący: 2,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 1x PBS.</td>
			<td>2,5 g BSA w 97,5 ml 1x PBS</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>Roztwór blokujący do immunofluorescencji i testów plackowych.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór do rozcieńczania przeciwciał (1% BSA w 1x PBS)</td>
			<td>1 g BSA w 99 ml 1x PBS</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>Rozcieńczanie przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,1% roztwór fioletowego krystalicznego</td>
			<td>1 g fioletowego kryształu w 400 ml metanolu. Dodać 600 ml wodyy dddH2O2O</td>
			<td>Temperatura pokojowa</td>
			<td>Barwienie komórek MDCK w testach plackowych.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsyna traktowana tosylosulfonylowo-fenyloalanilochlorometyloketonem (TPCK)</td>
			<td>Przygotować 1000-krotny roztwór zapasowy o stężeniu 1 mg/ml w ddH2O2O</td>
			<td>-20 °C</td>
			<td>W przypadku infekcji wirusowych.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Pożywki i roztwory do hodowli tkankowych.

Wirusy grypy A (IAV) są zakaźnymi patogenami układu oddechowego, które powodują coroczne epidemie i sporadyczne pandemie. W tym miejscu opisujemy protokół śledzenia infekcji wirusowych in vivo przy użyciu nowej rekombinowanej lucyferazy i bi-reporterowego IAV z ekspresją fluorescencji (BIRFLU). Takie podejście zapewnia naukowcom doskonałe narzędzie do badania IAV in vivo.

Lucyferazy-fluorescencyjny wirus reporterowy grypy do obrazowania na żywo i ilościowego oznaczania infekcji wirusowej

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

Naukowcy wcześniej stworzyli rekombinowane wirusy grypy, które wykazują ekspresję fluorescencyjnych lub bioluminescencyjnych reporterów białkowych. Część naszej pojedynczej ekspresji genów reporterowych w wirusie grypy poważnie ogranicza jego zastosowanie w eksperymentach. Nasz protokół opisuje zastosowanie wirusa grypy bireporter, który wykazuje ekspresję zarówno fluorescencyjnych, jak i bioluminescencyjnych genów reporterowych, a tym samym przezwycięża swoje ograniczenia.Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie pojedynczego rekombinowanego wirusa grypy do badań in vitro i in vivo. Podczas wykonywania tej techniki ważne jest szybkie wstrzyknięcie substratu lucyferazy i właściwe planowanie postępowania z myszami, ponieważ substrat jest szybko metabolizowany. Zaleca się również golenie myszy w celu poprawy wykrywania sygnału bioluminescencyjnego.Aby zarazić myszy, zacznij od przygotowania BIRFLU w 1X PBS. Utrzymuj wirusa na lodzie do momentu zaszczepienia. Sprawdź, czy nie ma odruchu szczypania palców u stóp, aby upewnić się, że mysz jest znieczulona, i zaszczepij ją donosowo przygotowanym rozcieńczeniem BIRFLU.Upewnij się, że wszystkie myszy oddychają prawidłowo, zanim włożysz je z powrotem do klatek. Otwórz oprogramowanie do obrazowania i naciśnij przycisk Inicjuj, a następnie ustaw parametry, które będą używane do obrazowania. Aby monitorować myszy zakażone wirusem BIRFLU, należy ogolić ich klatkę piersiową, aby poprawić wykrywanie sygnału bioluminescencyjnego.Gdy myszy zostaną znieczulone, użyj igły o rozmiarze 22, aby podawać po ortopie 100 mikrolitrów substratu lucyferazy Nluc, rozcieńczonego od 1 do 10 w PBS. Bezpośrednio po wstrzyknięciu należy umieścić zwierzęta w komorze izolacyjnej klatką piersiową skierowaną do góry. Następnie umieść komorę izolacyjną w przyrządzie do obrazowania, zamknij drzwi i uzyskaj obrazy.Po zobrazowaniu umieść myszy z powrotem w klatkach i monitoruj je, aż w pełni wyzdrowieją. Użyj narzędzia ROI oprogramowania do obrazowania, aby przeanalizować uzyskane dane bioluminescencyjne, wyznaczając obszar zainteresowania i klikając pomiar. Aby wykonać obrazowanie ex vivo płuc myszy, należy pobrać płuca zgodnie ze wskazówkami rękopisu, uruchomić oprogramowanie do akwizycji obrazu i ustawić parametry obrazowania.Po zainicjowaniu urządzenia umieść płuca na czarnym tle i upewnij się, że tkanki są oddzielone od siebie. Włóż tacę do termowizora, zamknij drzwiczki i uzyskaj obrazy. Po zobrazowaniu należy natychmiast usunąć tkanki i przechowywać je na lodzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza, jeśli próbki będą przetwarzane tego samego dnia.Jeśli będą przetwarzane później, zamroź je szybko w tubie na suchym lodzie i przechowuj w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Aby przetworzyć obrazy, wybierz narzędzie ROI, narysuj obszary zainteresowania wokół każdego z poszczególnych płuc i kliknij przycisk Zmierz. BIRFLU został scharakteryzowany in vitro poprzez określenie poziomów ekspresji Venus, Nluc i NP w zakażonych komórkach.Ekspresja Venus i Nluc jest wykrywana tylko w komórkach zakażonych BIRFLU, podczas gdy NP ulega ekspresji zarówno w komórkach PR8 typu dzikiego, jak i zakażonych BIRFLU. Nie obserwuje się ekspresji w pozorowanych zainfekowanych komórkach. Ponadto aktywność Nluc mierzono w supernatantach z kultur tkankowych po 24, 48, 72 i 96 godzinach po zakażeniu.Jest wykrywany już 24 godziny po zakażeniu, a poziom ekspresji wzrasta po 96 godzinach. Można również wykazać, że kinetyka replikacji BIRFLU jest porównywalna z wirusem PR8 typu dzikiego. BIRFLU ma zdolność ekspresji zarówno fluorescencyjnych, jak i bioluminescencyjnych genów reporterowych, a korelację między nimi można ocenić za pomocą obrazowania in vivo i ex vivo płuc myszy.Płuca myszy zakażonych BIRFLU wykazywały wysoką bioluminescencję in vivo i fluorescencję ex vivo. Określono również miana wirusa i stabilność genetyczną BIRFLU in vivo. Testy blaszek nazębnych na wirusach z płuc myszy wykazały, że wirus może tworzyć blaszki i wyrażać oba geny reporterowe.Projekt BIRFLU może być również wykorzystany do oceny skuteczności przeciwciał przeciwwirusowych i neutralizujących przeciwko grypie. Wyniki tych testów były ze sobą skorelowane i są szybkie i łatwe do wykonania.

a-luciferase-fluorescent-reporter-influenza-virus-for-live-imaging

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano metody obrazowania bioluminescencyjnego infekcji bakteryjnych u żywych zwierząt. Patogeny są modyfikowane w celu ekspresji lucyferazy, co umożliwia optyczne obrazowanie całego ciała w celu wykrycia infekcji u żywych zwierząt. Modele zwierzęce mogą zostać zainfekowane patogenami wykazującymi ekspresję lucyferazy, a wynikający z tego przebieg choroby może być wizualizowany w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Wykorzystanie lucyferazy do obrazowania infekcji bakteryjnych u myszy

Metoda ta opisuje zastosowanie systemu obrazowania opartego na barwnikach w podczerwieni do wykrywania H1N1 w płyku z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) zakażonych myszy z wysoką czułością. Metodykę tę można przeprowadzić na płytce 96- lub 384-dołkowej, wymaga ona objętości materiału badawczego &lt;10 μl i umożliwia jednoczesny screening wielu patogenów.

Metoda wysokoprzepustowego wykrywania wirusa grypy

Wykorzystanie lucyferazy oraz systemów obrazowania in vivo (IVIS) jako nowej metody identyfikacji punktów końcowych choroby przed wystąpieniem objawów klinicznych. IVIS pozwolił nam na wizualizację w czasie rzeczywistym inwazji wirusów zapalenia mózgu przez wiele dni, co zapewnia dokładniejszy model choroby do przyszłych badań. Pozwoliło to również na szybszą identyfikację potencjalnych właściwości ochronnych leków przeciwwirusowych i szczepionek niż w przypadku obecnie stosowanych modeli...

Wykrywanie neuroinwazyjnego wirusa zapalenia mózgu za pomocą systemów obrazowania In Vivo (IVIS)

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates a luciferase-based assay to quantify pseudovirus infection in epithelial cells. The pseudovirus encodes the luciferase gene, which is expressed in infected cells. After washing, and cells are incubated with lysis buffer at an ultra-low temperature, and then thawed to induce lysis.

Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay

Źródło: Garcia, V., et al. High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses. J. Vis. Exp. (91), e51890, doi:10.3791/51890 (2014).W niniejszym filmie zaprezentowano przygotowanie próbek hodowli komórkowych do oceny ładunku wirusowego z wykorzystaniem testu opartego na lucyferazie. Przedstawiono proces zakażania komórek nabłonkowych genetycznie zmodyfikowanym wirusem, przenoszenia nadnadkresów wirusowych i standardów do dołków testowych oraz wspomagania wnikania wirusa...

Przygotowanie próbek do ilościowego oznaczania wirusa metodą opartą na lucyferazie

Ten film demonstruje metodę śledzenia infekcji wirusowych w modelach mysich przy użyciu rekombinowanego wirusa grypy A z ekspresją białka rekombinowanego i fluorescencji, wyrażającego bi-reporter. Metoda ta umożliwia prowadzenie badań zarówno in vivo, jak i ex vivo, umożliwiając naukowcom uzyskanie wglądu w dynamikę wirusa i efekty interwencji.

Wirus wirusa grypy reporterowej lucyferazy-fluorescencji do śledzenia infekcji wirusowych

Opisujemy użycie fluorescencyjnego wirusa krowianki reporterowej, który umożliwia pomiar zakaźności wirusa i ekspresji genów w czasie rzeczywistym poprzez specyficzną dla etapu ekspresję spektralnie odrębnych fluoroforów reporterowych. Szczegółowo opisujemy metodę opartą na płytkach do dokładnej identyfikacji etapu, na którym replikacja wirusa jest zaburzona w odpowiedzi na hamowanie małych cząsteczek.

Wirusy reporterowe krowianki do ilościowego określania funkcji wirusa na wszystkich etapach ekspresji genów

Ten artykuł przedstawia wysokoprzepustową metodę miareczkowania różnych wirusów RNA i DNA opartą na ekspresji lucyferazy przy użyciu automatycznych i ręcznych płynów.

Wysokoprzepustowe miareczkowanie rekombinowanych wirusów eksprymujących lucyferazy

Prezentowany tutaj jest protokół dla metody obrazowania fluorescencyjnego, multiplex immunofluorescencyjna metodawykrywania DNA, RNA i proteiny (MICDDRP), metoda zdolna do jednoczesnej fluorescencyjnej wizualizacji pojedynczych komórek białka wirusowego i kwasów nukleinowych o różnym typie i nici. Takie podejście można zastosować do różnych systemów.

Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy

Ten protokół opisuje dynamikę infekcji wirusowych za pomocą rekombinowanego (r)SARS-CoV-2 z ekspresją lucyferazy i fluorescencji oraz systemów obrazowania in vivo (IVIS) u transgenicznych myszy K18 hACE2, aby przezwyciężyć potrzebę wtórnych podejść wymaganych do badania infekcji SARS-CoV-2 in vivo.

Obrazowanie na żywo i kwantyfikacja infekcji wirusowej u myszy transgenicznych K18 hACE2 przy użyciu rekombinowanego SARS-CoV-2 z ekspresją reporterową

Poznaj metodę obrazowania zakażeń wirusem grypy typu A przy użyciu dwureporterowego systemu BIRFLU, który łączy lucyferazę i fluorescencję. Technika umożliwia jednoczesne badania in vitro i in vivo w modelu mysim.

Lucyferazy-fluorescencyjny wirus reporterowy grypy do obrazowania na żywo i ilościowego oznaczania infekcji wirusowej

Przeglądaj więcej filmów