Lucyferazy-fluorescencyjny wirus reporterowy grypy do obrazowania na żywo i ilościowego oznaczania infekcji wirusowej

Naukowcy wcześniej stworzyli rekombinowane wirusy grypy, które wykazują ekspresję fluorescencyjnych lub bioluminescencyjnych reporterów białkowych. Część naszej pojedynczej ekspresji genów reporterowych w wirusie grypy poważnie ogranicza jego zastosowanie w eksperymentach. Nasz protokół opisuje zastosowanie wirusa grypy bireporter, który wykazuje ekspresję zarówno fluorescencyjnych, jak i bioluminescencyjnych genów reporterowych, a tym samym przezwycięża swoje ograniczenia.

Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie pojedynczego rekombinowanego wirusa grypy do badań in vitro i in vivo. Podczas wykonywania tej techniki ważne jest szybkie wstrzyknięcie substratu lucyferazy i właściwe planowanie postępowania z myszami, ponieważ substrat jest szybko metabolizowany. Zaleca się również golenie myszy w celu poprawy wykrywania sygnału bioluminescencyjnego.

Aby zarazić myszy, zacznij od przygotowania BIRFLU w 1X PBS. Utrzymuj wirusa na lodzie do momentu zaszczepienia. Sprawdź, czy nie ma odruchu szczypania palców u stóp, aby upewnić się, że mysz jest znieczulona, i zaszczepij ją donosowo przygotowanym rozcieńczeniem BIRFLU.

Upewnij się, że wszystkie myszy oddychają prawidłowo, zanim włożysz je z powrotem do klatek. Otwórz oprogramowanie do obrazowania i naciśnij przycisk Inicjuj, a następnie ustaw parametry, które będą używane do obrazowania. Aby monitorować myszy zakażone wirusem BIRFLU, należy ogolić ich klatkę piersiową, aby poprawić wykrywanie sygnału bioluminescencyjnego.

Gdy myszy zostaną znieczulone, użyj igły o rozmiarze 22, aby podawać po ortopie 100 mikrolitrów substratu lucyferazy Nluc, rozcieńczonego od 1 do 10 w PBS. Bezpośrednio po wstrzyknięciu należy umieścić zwierzęta w komorze izolacyjnej klatką piersiową skierowaną do góry. Następnie umieść komorę izolacyjną w przyrządzie do obrazowania, zamknij drzwi i uzyskaj obrazy.

Po zobrazowaniu umieść myszy z powrotem w klatkach i monitoruj je, aż w pełni wyzdrowieją. Użyj narzędzia ROI oprogramowania do obrazowania, aby przeanalizować uzyskane dane bioluminescencyjne, wyznaczając obszar zainteresowania i klikając pomiar. Aby wykonać obrazowanie ex vivo płuc myszy, należy pobrać płuca zgodnie ze wskazówkami rękopisu, uruchomić oprogramowanie do akwizycji obrazu i ustawić parametry obrazowania.

Po zainicjowaniu urządzenia umieść płuca na czarnym tle i upewnij się, że tkanki są oddzielone od siebie. Włóż tacę do termowizora, zamknij drzwiczki i uzyskaj obrazy. Po zobrazowaniu należy natychmiast usunąć tkanki i przechowywać je na lodzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza, jeśli próbki będą przetwarzane tego samego dnia.

Jeśli będą przetwarzane później, zamroź je szybko w tubie na suchym lodzie i przechowuj w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Aby przetworzyć obrazy, wybierz narzędzie ROI, narysuj obszary zainteresowania wokół każdego z poszczególnych płuc i kliknij przycisk Zmierz. BIRFLU został scharakteryzowany in vitro poprzez określenie poziomów ekspresji Venus, Nluc i NP w zakażonych komórkach.

Ekspresja Venus i Nluc jest wykrywana tylko w komórkach zakażonych BIRFLU, podczas gdy NP ulega ekspresji zarówno w komórkach PR8 typu dzikiego, jak i zakażonych BIRFLU. Nie obserwuje się ekspresji w pozorowanych zainfekowanych komórkach. Ponadto aktywność Nluc mierzono w supernatantach z kultur tkankowych po 24, 48, 72 i 96 godzinach po zakażeniu.

Jest wykrywany już 24 godziny po zakażeniu, a poziom ekspresji wzrasta po 96 godzinach. Można również wykazać, że kinetyka replikacji BIRFLU jest porównywalna z wirusem PR8 typu dzikiego. BIRFLU ma zdolność ekspresji zarówno fluorescencyjnych, jak i bioluminescencyjnych genów reporterowych, a korelację między nimi można ocenić za pomocą obrazowania in vivo i ex vivo płuc myszy.

Płuca myszy zakażonych BIRFLU wykazywały wysoką bioluminescencję in vivo i fluorescencję ex vivo. Określono również miana wirusa i stabilność genetyczną BIRFLU in vivo. Testy blaszek nazębnych na wirusach z płuc myszy wykazały, że wirus może tworzyć blaszki i wyrażać oba geny reporterowe.

Projekt BIRFLU może być również wykorzystany do oceny skuteczności przeciwciał przeciwwirusowych i neutralizujących przeciwko grypie. Wyniki tych testów były ze sobą skorelowane i są szybkie i łatwe do wykonania.