Test tworzenia presynaps przy użyciu kulek organizatora presynapsy i hodowli "kuli neuronalnej"

Protokół ten jest odpowiedni do badania, skąd pochodzą białka presynaptyczne: ciała komórkowe czy aksony. I jak białka presynaptyczne gromadzą się w presynapsach w zorganizowany sposób podczas tworzenia synaps. Technika ta może indukować tysiące presynaps w tym samym czasie i nie wykorzystuje żadnej specjalnej aparatury do utrzymywania aksonów w kulturze, co pozwala na efektywną analizę powstawania wielu presynaps w aksonach.

Wraz z doktorantką, Honami, zademonstruje tę procedurę Rie Ishii, studentka studiów licencjackich w moim laboratorium. Rozpocznij tę procedurę od eutanazji myszy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wypreparować jamę brzuszną w celu uzyskania zarodków E16.

Ostrożnie usuń mózgi z zarodków za pomocą kleszczy z cienką końcówką i przenieś je do 60-milimetrowych naczyń do hodowli komórkowych zawierających cztery mililitry buforowanego roztworu soli HEPES lub HBSS. Usuń opony mózgowe i odetnij opuszkę węchową. Oddziel korę mózgową od każdej półkuli mózgowej za pomocą cienkich końcówek kleszczy pod mikroskopem stereoskopowym i przenieś do innej 60-milimetrowej naczynia zawierającej świeży HBSS.

Użyj co najmniej trzech do pięciu zarodków do każdej oddzielnej hodowli kulki neuronalnej. Pokrój korę na małe kawałki za pomocą sprężynowych nożyczek do mikropreparowania w kapturze do hodowli komórek z przepływem laminarnym. Teraz przenieś zmieloną korę do 15-mililitrowej tuby.

Trypsynizuj mieloną korę w czterech mililitrach 0,125% trypsyny w HBSS przez 4,5 minuty w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przenieś agregaty komórek do nowej 15-mililitrowej probówki zawierającej 10 mililitrów HBSS za pomocą sterylnej pipety transferowej. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie powtórz ten krok jeszcze raz.

Następnie przenieś agregaty komórkowe do nowej 15-mililitrowej probówki zawierającej dwa mililitry pożywki NGB, 0,01% DNazy I i 10% surowicy końskiej. Rozcieraj trypsynizowane kory, wielokrotnie pipetując je w górę i w dół trzy do pięciu razy za pomocą wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura z drobnego szkła. Aby przygotować kulki neuronowe, dostosuj gęstość komórek w zawiesinie komórkowej do miliona komórek na mililitr za pomocą pożywki NGB.

Dodaj siedem mililitrów PBS do dolnej części szalek hodowlanych. Hoduj neurony korowe jako wiszące krople o objętości 10 mikrolitrów zawierające 10 000 komórek na kroplę wewnątrz górnych powiek 10-centymetrowych naczyń hodowlanych. Trzymaj naczynia w inkubatorze przez trzy dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 w wilgotnych warunkach, aby umożliwić tworzenie się kulek neuronowych.

Pokryć poli-L-lizynę lub PLL na szkiełkach nakrywkowych pokrytych parafiną w 60-milimetrowych szalkach, używając roztworu PLL o stężeniu 15 mikrogramów na mililitr w buforze boranowym. Trzymaj je przez co najmniej godzinę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po czterokrotnym przemyciu PBS przenieść szkiełka nakrywkowe pokryte PLL na płytkę czterodołkową zawierającą 350 mikrolitrów podłoża NGB z trzema mikromolowymi AraC w każdym dołku.

AraC jest dodawany do pożywki w celu zabicia dzielących się komórek. Inkubować czterodołkowe płytki zawierające szkiełka nakrywkowe pokryte PLL w inkubatorze CO2 przez co najmniej 20 minut, aby upewnić się, że temperatura pożywki osiągnie 37 stopni Celsjusza przed przeniesieniem kulek neuronowych. W DIV 3, gdy kulki neuronów są bardzo dobrze uformowane, przenieś je na szkiełka nakrywkowe pokryte PLL.

Wewnątrz czterodołkowej płytki dodaj pięć kulek neuronów na dołek. W DIV 11 przenieś 20 mikrolitrów z zawiesiny cząstek magnetycznych pokrytych streptawidyną do probówki mikrowirówkowej. Unieruchomić koraliki do ręcznie wykonanego aparatu przymocowanego za pomocą neodymowych magnesów trwałych i umyć trzykrotnie 100 mikrolitrami PBS-MCBC w 1,5-mililitrowych probówkach do mikrowirówek.

Po całkowitym usunięciu PBS-MCBC z kulek, dodaj z góry określoną objętość bulionu LRRTM2 do umytych kulek. Inkubować mieszaninę za pomocą rotatora w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin. Po inkubacji umyj kulki dwukrotnie 100 mikrolitrami PBS-MCBC.

Następnie umyj kulki 100 mikrolitrami pożywki NGB. Ponownie zawiesić kulki LRRTM2 w 50 mikrolitrach pożywki NGB w celu zastosowania do hodowli kulek neuronowych. Teraz odetnij koniec żółtej końcówki pod kątem 45 stopni żyletką pod mikroskopem stereoskopowym.

Umieść żółty koniec końcówki na obszarze ciała komórki kuli neuronowej i usuń ciała komórkowe przez odsysanie. Zastosuj LRRTM2 i koraliki kontrolne na kulturze kulki neuronalnej. Następnie zanurz kulki na dnie płytek kultury kulek neuronowych na jedną minutę za pomocą magnesów ferrytowych, aby rozpocząć tworzenie presynaps.

Ta procedura zapewnia przyziemienie wszystkich koralików w tym samym czasie. Napraw i wybarwij neurony w kulturze kuli neuronalnej po utworzeniu presynapsy za pomocą koralików, jak opisano w protokole tekstowym. Rejestruj obrazy interferencji różnicowej, kontrastu i immunofluorescencji pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym za pomocą chłodzonej kamery CCD z 60-krotną soczewką olejową.

Zmierz intensywność immunofluorescencji w presynapsach w aksonie. Użyj intensywności immunofluorescencji obszaru zainteresowania na koralikach. Minus intensywność obszaru poza koralikami podzielona przez intensywność aksonów, wzdłuż 20 mikronów od koralików.

Minus intensywność tła. Ta intensywność stosunku zapewnia wskaźnik akumulacji białka. Aby określić ilościowo poziom akumulacji określonego białka w presynapsie indukowanej kulkami LRRTM2, zawsze wybieraj obszar, który znajduje się w odległości dwóch lub więcej pól widzenia od ciała komórki.

Aby uzyskać dokładny pomiar, wybierz pięć różnych pól aksonalnych na szkiełko nakrywkowe. Pokazano tutaj zastosowanie kulek LRRTM2 w hodowli kulek neuronów w DIV 11 indukowanej akumulacji Munc18-1 w presynapsach aksonów kulek neuronowych. Koraliki na aksonach kulek neuronalnych są widoczne na obrazach z mikroskopii fazowej.

Akumulację białek presynaptycznych obserwuje się za pomocą obrazów immunofluorescencyjnych. Nawet w aksonach, które są usuwanymi ciałami komórkowymi, zaobserwowano akumulację Munc18-1 pod kulkami, podobnie jak aksony kulek neuronalnych z ciałami komórkowymi. Gdy obszar peryferyjny arkusza aksonalnego był analizowany przez soczewkę obiektywową o dużym powiększeniu, vGlut1 i Munc18-1 wyraźnie gromadziły się w presynapsach aksonów pod kulkami z ciałami komórkowymi i bez.

Eksperymenty z biegiem czasu wykazały, że akumulacja vGlut1 w presynapsach znacznie wzrosła po 30 minutach. Z drugiej strony, akumulacja Munc18-1 zaczęła znacznie rosnąć po dwóch godzinach i osiągnęła plateau po czterech godzinach. Dane te wskazują, że białko pęcherzyków synaptycznych vGlut1 gromadzi się w presynapsach wcześniej niż białko strefy aktywnej Munc18-1.

Akumulacja Munc18-1 w presynapsach neuronów Fmr1-KO wzrosła 1,5 raza bardziej niż w typie dzikim, co wskazuje na udział FMRP w akumulacji Munc18-1. Inhibitor syntezy białek, anizomycyna, znacznie hamował akumulację Munc18-1 w aksonach z ciałami komórkowymi i bez nich. Oznacza to, że akumulacja jest zależna od syntezy białek.

Pipetowanie trypsynizowanej kory za pomocą wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura z drobnego szkła jest ważnym krokiem. Eksperymentatorzy przygotowują wypolerowane ogniowo pipety o dwóch do trzech różnych średnicach i wybierają pipetę o odpowiedniej średnicy. Za pomocą tej procedury uwalnianie synaps z presynaps indukowanych przez kulki LRRTM2 mierzy się za pomocą obrazowania na żywo.

Ta dodatkowa metoda pozwoliłaby odpowiedzieć na pytanie, czy synteza białek w aksonach jest zaangażowana w regulację uwalniania synaptycznego. Korzystając z tej metody, naukowcy badają, w jaki sposób białka presynaptyczne gromadzą się w presynapsach w zorganizowany sposób, a także lokalizację źródła białek presynaptycznych.