Name: Test tworzenia presynaps przy użyciu kulek organizatora presynapsy i hodowli kuli neuronalnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Poznaj metodę tworzenia presynaps przy użyciu kulek organizatora presynapsy i hodowli kuli neuronalnej. Technika umożliwia analizę akumulacji białek synaptycznych w aksonach bez specjalistycznego sprzętu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest częściowo wspierana przez JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (C) (No. 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki). Dziękujemy dr Terukazu Nogi i Pani Makiko Neyazaki (Yokohama City University) za uprzejme dostarczenie biotynylowanego białka LRRTM2. Dziękujemy również Honami Uechi i Rie Ishii za pomoc techniczną.

Eksperymenty opisane w tym manuskrypcie zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi przedstawionymi przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Miejskiego w Yokohamie.
1. Przygotowanie kulek neuronalnych jako hodowli z wiszącej kropli (Dni in vitro (DIV) 0-3)
UWAGA: Opisane tutaj procedury przygotowania hodowli kulek neuronalnych są oparte na metodzie wcześniej opisanej przez grupę Sasaki z pewnymi modyfikacjami9,10. Przyjęliśmy również kilka procedur z metody Bankera dla kultury dysocjacji14.
<ol>
	<li>Potwierdzenie następujących czynności przed rozpoczęciem sekcji
	<ol>
		<li>Przygotuj wszystkie wymagane roztwory i wcześniej wysterylizuj je w autoklawie/filtracji.</li>
		<li>Przygotuj wszystkie instrumenty i materiały, które mają być użyte na każdym etapie tej hodowli neuronów korowych.</li>
		<li>Spryskaj i wytrzyj komorę laminarnego przepływu powietrza, stół separacyjny, płytkę sceniczną mikroskopu stereoskopowego, nożyczki i kleszcze 70% etanolem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji po zastosowaniu CO2 i wypreparuj jamę brzuszną w celu uzyskania zarodków E16.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć mózgi z zarodków za pomocą cienkich końcówek kleszczy i przenieść je do 60-milimetrowych szalek do hodowli komórkowych zawierających 4 ml buforowanego roztworu soli HEPES (HBSS). 
	UWAGA: Pożywka preparcyjna HBSS zawiera 10 mM HEPES (pH 7,4), 140 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,09 mM Na2HPO4, 1,1 mM KH2PO4, 5,6 mM D-glukozy i 5,64 μM czerwieni fenolowej.</li>
	<li>Usuń skórę głowy, odetnij opuszkę węchową, oddziel korę mózgową od każdej półkuli mózgowej za pomocą cienkich końcówek kleszczy pod mikroskopem stereoskopowym i przenieś do innych 60-milimetrowych szalek zawierających świeży HBSS. Użyj co najmniej 3-5 zarodków do każdej oddzielnej hodowli kulki neuronalnej.</li>
	<li>Pokrój korę na małe kawałki za pomocą sprężynowych nożyczek do mikropreparowania w kapturze do hodowli komórek z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Przenieś zmieloną korę mózgową do probówki o pojemności 15 ml i trypsynizuj zmieloną korę w 4 ml 0,125% trypsyny w HBSS przez 4,5 minuty w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Ten czas trypsynizacji ma kluczowe znaczenie dla wydajnej hodowli neuronów, ponieważ wydłużający się czas (> 4,5 minuty) prowadzi do znacznie większej liczby martwych neuronów.</li>
	<li>Przenieść agregaty komórek do nowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml HBSS za pomocą sterylnej pipety transferowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Powtórzyć ten krok jeszcze raz.</li>
	<li>Przenieś agregaty komórkowe do nowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml pożywki neuropodstawowej zawierającej GlutaMax, suplement B27 (pożywka NGB), 0,01% DNazy I i 10% surowicy końskiej.</li>
	<li>Trypsynizowane korki należy rozcierać, wielokrotnie pipetując je w górę i w dół (3-5 razy) za pomocą pipety Pasteura z polerowanego ogniowo szkła Pasteur. 
	UWAGA: Średnica pipety Pasteura z polerowanego ogniowo szkła drobnego jest bardzo ważna, zgodnie z opisem w metodzie Bankera paper14. Jeśli pipeta jest zbyt wąska, aby przejść przez korę mózgową, przygotuj pipety o 2-3 różnych rozmiarach i spróbuj użyć większej pipety.</li>
	<li>Aby przygotować kulki neuronowe, weź powyższą zawiesinę komórek i dostosuj gęstość komórek do 1 x 106 komórek/ml za pomocą pożywki NGB.</li>
	<li>Hoduj neurony korowe w postaci wiszących kropli zawierających 10 000 komórek / kroplę (1 kropla to 10 μl) wewnątrz górnych powiek 10 cm naczyń hodowlanych.</li>
	<li>Dodać 7 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do dolnej części szalek hodowlanych, a następnie przechowywać w inkubatorze przez 3 dni w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w warunkach wilgotnych, aby umożliwić tworzenie się kulek neuronowych.</li>
</ol>
2. Umieszczanie kulek neuronów na szkiełkach nakrywkowych pokrytych PLL i utrzymanie hodowli (DIV 3-11)
UWAGA: Przed pokryciem szkiełek nakrywkowych poli-L-lizyną (PLL), ważne jest umycie szkiełek nakrywkowych za pomocą detergentu. Szkiełka nakrywkowe czasami nie są tak czyste dla hodowli neuronów i jednolitego powlekania PLL. Niejednorodna powłoka PLL może powodować nierównomierne wydłużenie aksonów kulek neuronowych.
<ol>
	<li>Namocz szkiełka nakrywkowe w rozcieńczonym w 1/20 neutralnym detergencie bez fosforu w ceramicznych stojakach na 1-3 noce.</li>
	<li>Umyj szkiełka nakrywkowe 8 razy w ultraczystej wodzie, a następnie sterylizuj w piekarniku w temperaturze 200 °C przez 12 godzin 
	UWAGA: Wszystkie kroki od tego miejsca należy wykonać w okapie do hodowli komórek z laminarnym przepływem powietrza.</li>
	<li>Upieczone szkiełka nakrywkowe przełożyć do naczyń o średnicy 100 mm. Po uszczelnieniu naczynia za pomocą parafilmu między pokrywką a dolnym naczyniem, upieczone szkiełka nakrywkowe można przechowywać do długotrwałego przechowywania.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Nałóż kropki parafinowe na szkiełka nakrywkowe. Kropki tworzą przestrzeń, aby zapobiec odklejaniu się kulek neuronalnych od szkiełek nakrywkowych podczas barwienia immunologicznego poprzez bezpośredni kontakt kulek neuronów z plastikowymi naczyniami. Rozpuść parafinę w odpowiedniej butelce w gorącej łaźni wodnej o temperaturze około 90 °C. Zanurz pipetę Pasteura w parafinie, a następnie szybko dotknij jej, aby uzyskać trzy plamy w pobliżu krawędzi szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Pokryć PLL (MW > 300 000) na szkiełkach nakrywkowych z perełkami parafinowymi w 60-milimetrowych szalkach przy użyciu roztworu PLL (15 μg/ml w buforze boranowym) i przechowywać je przez co najmniej 1 godzinę w inkubatorze CO2 .</li>
	<li>Po 4-krotnym przemyciu PBS przenieść szkiełka nakrywkowe pokryte PLL na płytkę 4-dołkową zawierającą 350 μl pożywki NGB w każdym dołku i chlorowodorek cytozyny β-D-arabinofuranozydu (AraC, 3 μM) do pożywki w celu zabicia dzielących się komórek.</li>
	<li>Tę 4-dołkową płytkę zawierającą szkiełka nakrywkowe pokryte PLL należy przechowywać w inkubatorze CO2 przez co najmniej 20 minut, aby upewnić się, że temperatura podłoża osiągnie 37 °C przed przeniesieniem kulek neuronowych.</li>
	<li>W DIV 3, gdy "kulki neuronowe" są bardzo dobrze uformowane, przenieś je na szkiełka nakrywkowe pokryte PLL wewnątrz 4-dołkowej płytki (5 kulek neuronów / studzienkę) przechowywanej w inkubatorze CO2</li>.
	<li>Po 48 godzinach zastąp pożywkę do hodowli kulek neuronów świeżą pożywką NGB wolną od AraC. Bezpośrednio przed tą procedurą należy użyć płyty grzejnej w okapie do hodowli komórek z laminarnym przepływem powietrza, którego temperatura jest utrzymywana na poziomie 37 °C. 
	UWAGA: Konieczna jest jak najszybsza zmiana pożywki na płycie grzejnej, aby skrócić czas, w którym kultury znajdują się na zewnątrz inkubatora CO2 .</li>
	<li>Utrzymuj tę hodowlę kulek neuronalnych w inkubatorze CO2 do DIV 11. 
	UWAGA: W DIV 11-12 do eksperymentów używa się kulek neuronalnych rozciągających neuryty do 1-2 mm.</li>
</ol>
3. Stosowanie kulek LRRTM2 na hodowli kulek neuronów z ciałami komórkowymi lub bez nich (DIV 11-12)
UWAGA: Przed zastosowaniem koralików LRRTM2 na hodowli kulek neuronów, zaleca się usunięcie ciał komórkowych. Dlatego najpierw przygotuj kulki LRRTM2, następnie usuń ciała komórek, a następnie jak najwcześniej nałóż kulki LRRTM2 na hodowlę. Biotynylowany LRRTM2 jest dostarczany przez grupę Nogi (Uniwersytet Miejski w Jokohamie) jako pożywka kondycjonowana. Używają wektora ekspresji, w tym sekwencji akceptora biotyny i ligazy biotyny z E. coli (BirA)15,16, aby dołączyć biotynę do LRRTM2, a wektor ekspresji jest transfekowany do komórek Expi293F zawartych w systemie ekspresji Expi293. Informacje o wektorach są dostępne na rysunku uzupełniającym 1. Biotynylowane kulki streptawidyny sprzężone z LRRTM2 znacznie zmniejszyły tło barwienia immunologicznego w porównaniu z LRRTM2-Fc – sprzężonymi kulkami białka A, które są używane w prototypowym systemie LRRTM2 8.
<ol>
	<li>Przygotowanie biotynylowanych kulek LRRTM2
	<ol>
		<li>Aby usunąć nadmiar biotyny z kondycjonowanej pożywki komórek Expi293F eksprymujących biotynylowany LRRTM2, nałóż 1,7 ml kondycjonowanej pożywki zmieszanej z 0,8 ml PBS (łącznie 2,5 ml) do kolumny filtracyjnej żelu PD-10. Kolumnę PD-10 wstępnie równoważy się z 25 ml ultraczystej wody i 25 ml PBS.</li>
		<li>Eluować za pomocą 3,5 ml PBS i zebrać przepływ w postaci LRRTM2 stock. 
		UWAGA: Ten bulion LRRTM2 może być dozowany do podwielokrotności i przechowywany w temperaturze -80 °C przez długi czas. Poziomy ekspresji biotynylowanego LRRTM2 czasami różnią się w zależności od partii. W związku z tym należy określić odpowiednią objętość LRRTM2 do sprzężenia z kulkami, aby utworzyć wystarczającą ilość presynaps na kulkach neuronów, gdy nowa partia LRRTM2 jest używana po raz pierwszy.</li>
		<li>Pobrać 20 μl z zawiesiny cząstek magnetycznych pokrytych streptawidyną (średnica: 4-5 μm) do probówki mikrowirówkowej. Unieruchomić kulki do ręcznie wykonanego aparatu przymocowanego za pomocą neodymowych magnesów trwałych i przemyć trzykrotnie 100 μl PBS-MCBC w probówkach mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. 
		UWAGA: PBS-MCBC zawiera PBS, w tym 5 mM MgCl2, 3 mM CaCl2, 0,1% BSA i 0,1% Complete EDTA.</li>
		<li>Po całkowitym usunięciu PBS-MCBC z kulek, dodaj z góry określoną objętość bulionu LRRTM2 (zwykle 500-1,000 μL, patrz uwaga 3.1.2) do umytych kulek. Inkubować mieszaninę za pomocą rotatora w temperaturze 4 °C przez 1-2 godziny.</li>
		<li>Umyj kulki dwukrotnie 100 μl PBS-MCBC, a następnie 100 μl pożywki NGB.</li>
		<li>Ponownie zawiesić kulki LRRTM2 w 50 μl pożywki NGB w celu zastosowania do hodowli kulek neuronowych.</li>
		<li>Stosować te same procedury do przygotowania kulek kontrolnych (kontrola ujemna) w innej probówce do mikrowirówki, z wyjątkiem dodania biotynylowanych białek LRRTM2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuwanie ciał komórkowych z kulek neuronalnych w DIV 11-12 i nakładanie kulek LRRTM2
	<ol>
		<li>Oznacz studzienki płytki 4-dołkowej jako "Ciało komórki (+)" i "Ciało komórki (-)".</li>
		<li>Odetnij koniec żółtej końcówki pod kątem 45° za pomocą żyletki uprzednio spryskanej 70% etanolem pod mikroskopem stereoskopowym (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Umieść żółty koniec końcówki na obszarze ciała komórki kuli neuronu i usuń ciała komórkowe przez odsysanie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Aby zidentyfikować każdy określony warunek eksperymentu, ponownie oznacz studzienki jako "Koraliki LRRTM2" i "Koraliki kontrolne".</li>
		<li>Zastosuj LRRTM2 i kulki kontrolne na kulturze kulki neuronalnej i zanurz na dnie płytek na 1 minutę za pomocą magnesów ferrytowych, aby rozpocząć tworzenie presynaps. Ta procedura zapewnia przyziemienie wszystkich koralików w tym samym czasie. Szczególnie byłby skuteczny w przypadku inkubacji krótkotrwałej (np. 30 min i 1 godzina) z kulkami LRRTM2 synchronicznie.</li>
		<li>Aby przeprowadzić eksperymenty z biegiem czasu, oznacz każdy z nich osobno jako 0 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h i 18 h i nałóż koraliki LRRTM2 we wskazanych odstępach czasu.</li>
		<li>Po dodaniu kulek LRRTM2 inkubuj kulturę kulek neuronowych z kulkami przez określony czas (od 0 min do 18 godzin), aby utworzyć presynapsy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Barwienie immunologiczne i mikroskopia
UWAGA: Utrwalaj komórki przez 4 godziny poprzez inkubację z koralikami LRRTM2 w warunkach eksperymentalnych z ciałami komórkowymi i bez nich, ponieważ aksony mają tendencję do stopniowego obumierania przy braku ciał komórkowych po 4 godzinach. W przypadku kursu czasu z koralikami LRRTM2, zamocuj ogniwa we wskazanym określonym czasie.
<ol>
	<li>Utrwalanie i barwienie neuronów w hodowli kulek neuronów po utworzeniu presynapsy za pomocą kulek LRRTM2
	<ol>
		<li>Usuń pożywkę NGB i utrwal kulki neuronowe 4% PFA w PBS (250 μL/studzienkę) przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyj 500 μl PBS 4 razy co 5 minut.</li>
		<li>Przemywać utrwalone komórki TBS (sól fizjologiczna buforowana tris: 50 mM Tris-HCl (pH 7,3) i 150 mM NaCl) przez ponad 5 minut.</li>
		<li>Przepuszczalność komórek/aksonów hodowli kulek neuronalnych za pomocą TBS zawierającego 0,3% Triton X-100 przez 5 minut.</li>
		<li>Utrzymuj komórki przez 1 godzinę w celu zablokowania za pomocą buforu blokującego (0,1% Triton X-100 i 5% NGS (normalna surowica kozia) w TBS).</li>
		<li>Inkubować komórki z pierwszorzędowymi przeciwciałami: anty-króliczym vGlut1 (pęcherzykowy transporter glutaminianu 1 (1:4000)) i anty-mysim-Munc18-1 (1:300) rozcieńczonymi rozcieńczalnikiem przeciwciał przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umyj szkiełka nakrywkowe 4 razy buforem immunofluorescencyjnym (IF) (0,1% Triton X-100 i 2% BSA w TBS) i inkubuj przez 30 minut z 2nd sprzężonymi z fluoroforem (barwnik Alexa); anty-mysimi IgG-Alexa 555 (1:500), anty-króliczymi IgG-Alexa 488 (1:1000).</li>
		<li>Wybarwić jądra ciał komórkowych neuronów przez 5 minut 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI, 1 μg/ml) w PBS.</li>
		<li>Umyć szkiełka nakrywkowe trzykrotnie PBS, a następnie zamontować na szkiełkach podstawowych za pomocą podłoża montażowego zawierającego 167 mg/ml alkoholu poli(winylowego) i 6 mg/ml galusanu N-propylu.</li>
		<li>Szkiełka podstawowe należy przechowywać w lodówce w temperaturze -20 °C do czasu badania mikroskopowego. Sygnały fluorescencyjne szkiełek podstawowych są wykrywalne przez co najmniej 1 rok, gdy szkiełka są przechowywane w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonywanie zdjęć pod mikroskopem fluorescencyjnym
	<ol>
		<li>Rejestruj obrazy różnicowych zakłóceń, kontrastu i IF pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym za pomocą chłodzonej kamery CCD z 60-krotnym obiektywem olejkowym. W przypadku oprogramowania do akwizycji obrazu należy użyć zainstalowanego w oprogramowaniu systemu mikroskopowego. Użyj Image J jako oprogramowania do analizy obrazu.</li>
		<li>Zmierz intensywność IF w presynapsach w aksonie, korzystając z następującego wzoru; Intensywności IF obszaru zainteresowania na koralikach (ROI) – Intensywność obszaru poza koralikami/Intensywność aksonów wzdłuż 20 μm od koralików – intensywność tła. Ten współczynnik intensywności zapewnia wskaźnik akumulacji białka (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4A). Wykonaj pomiary na oryginalnych 16-bitowych obrazach za pomocą oprogramowania Image J.</li>
		<li>Aby określić ilościowo poziom akumulacji określonego białka w presynapsie indukowanej kulkami LRRTM2, zawsze wybieraj obszar z dala od 2 lub więcej pól widzenia poza ciałem komórki za pomocą mikroskopu (60X). 
		UWAGA: Wybór obszaru w kuli neuronowej do obrazowania ma kluczowe znaczenie, ponieważ gęste aksony znajdują się w pobliżu ciała komórki, a na obrzeżach kuli neuronowej może znajdować się pojedynczy akson.</li>
		<li>Aby uzyskać dokładny pomiar, wybierz 5 różnych pól aksonalnych (podobna odległość od ciał komórek) / szkiełko nakrywkowe.</li>
		<li>Utrzymuj identyczne warunki obrazowania w różnych dniach i między eksperymentami</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Vertebrate+Synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).</li>
<li>Ziv, N. E., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+presynaptic+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).</li>
<li>Chia, P. H., Li, P., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+underlying+presynapse+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation.</a> Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).</li>
<li>Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li>
<li>Saitsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CASK+aberrations+in+male+patients+with+Ohtahara+syndrome+and+cerebellar+hypoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia.</a> Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).</li>
<li>Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+New+Individual+Excitatory+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Assembly of New Individual Excitatory Synapses.</a> Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).</li>
<li>Bresler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+density+assembly+is+fundamentally+different+from+presynaptic+active+zone+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).</li>
<li>Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragile+X+mental+retardation+protein+regulates+accumulation+of+the+active+zone+protein+Munc18-1+in+presynapses+via+local+translation+in+axons+during+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis.</a> Neuroscience Research. , (2018).</li>
<li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+Zipcode+Binding+Protein+1+Is+Required+for+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Signaling+of+Local+%CE%B2-Actin+Synthesis+and+Growth+Cone+Turning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local β-Actin Synthesis and Growth Cone Turning.</a> Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).</li>
<li>Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+axon-enriched+microRNAs+localized+to+growth+cones+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons.</a> Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).</li>
<li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li>
<li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li>
<li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
<li>Hirai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+ligand+capture+and+release+by+the+endocytic+receptor+ApoER2%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2.</a> EMBO reports. , (2017).</li>
<li>Yasui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Importance+of+Covalent+Homodimer+of+Reelin+Protein+Linked+via+Its+Central+Region%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).</li>
<li>Bassell, G. J., Warren, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragile+X+Syndrome%3A+Loss+of+Local+mRNA+Regulation+Alters+Synaptic+Development+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function.</a> Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).</li>
<li>Darnell, J. C., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+translation+of+translational+control+by+FMRP%3A+therapeutic+targets+for+FXS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS.</a> Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).</li>
<li>Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+and+restoration+of+translational+homeostasis+in+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).</li>
<li>Lucido, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Assembly+of+Functional+Presynaptic+Boutons+Triggered+by+Adhesive+Contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts.</a> Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).</li>
<li>Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+Translation+of+%CE%B2-Catenin+Regulates+Synaptic+Vesicle+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Axonal Translation of β-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics.</a> Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).</li>
<li>Batista, A. F. R., Martínez, J. C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-axonal+Synthesis+of+SNAP25+Is+Required+for+the+Formation+of+Presynaptic+Terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals.</a> Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opracowaliśmy nowatorską metodę badania powstawania presynaps stymulowanych kulkami LRRTM2 przy użyciu hodowli kulek neuronalnych. Obecnie większość testów tworzenia presynaps obejmuje kulki pokryte poli-D-lizyną (PDL) i zdysocjowaną hodowlę/komorę mikroprzepływową 20,21,22. Jedną z zalet tej metody są koraliki LRRTM2. Podczas gdy LRRTM2 oddziałuje z neureksyną, tworząc pobudzające presynapsy specyficznie...

Tworzenie synaps jest jednym z kluczowych etapów podczas rozwoju obwodów neuronowych1,2,3. Tworzenie synaps, które są wyspecjalizowanymi przedziałami złożonymi z pre- i postsynaps, jest złożonym i wieloetapowym procesem obejmującym odpowiednie rozpoznawanie aksonów i dendrytów, tworzenie strefy aktywnej i gęstości postsynaptycznej oraz prawidłowe ustawienie kanałów jonowych i receptorów neuroprzekaźników1,2. W każdym procesie wiele rodzajów białek synaptycznych gromadzi się w tych wyspecjalizowanych przedziałach we właściwym czasie, transportując białka synaptyczne z ciał komórkowych i / lub poprzez lokalną translację w przedziałach. Uważa się, że te białka synaptyczne są ułożone w zorganizowany sposób, tworząc funkcjonalne synapsy. Dysfunkcja niektórych białek synaptycznych polegająca na tworzeniu synaps prowadzi do chorób neurologicznych4,5. Nie jest jednak jasne, w jaki sposób białka synaptyczne gromadzą się we właściwym czasie.
Aby zbadać, jak białka synaptyczne gromadzą się w zorganizowany sposób, konieczne jest zbadanie akumulacji białek synaptycznych w porządku chronologicznym. Niektóre raporty wykazały obrazowanie na żywo w celu obserwacji tworzenia synaps w zdysocjowanej kulturze neuronów6,7. Jednak znalezienie neuronów, które dopiero zaczynają tworzyć synapsy pod mikroskopią, jest czasochłonne. Aby skutecznie obserwować akumulację białek synaptycznych, tworzenie synaps musi rozpocząć się w momencie, gdy naukowcy chcą indukować powstawanie. Drugim wyzwaniem jest rozróżnienie akumulacji białek synaptycznych w wyniku transportu z ciał komórkowych lub lokalnej translacji w synapsach. W tym celu konieczne jest zmierzenie poziomu translacji w warunkach, które nie pozwalają na transport białek synaptycznych z ciał komórkowych.
Opracowaliśmy nowy test tworzenia presynaps, wykorzystując połączenie hodowli kulek neuronalnych z koralikami do wywołania tworzenia presynaps8. Hodowla kulek neuronalnych została opracowana w celu zbadania fenotypu aksonalnego, ze względu na tworzenie się arkuszy aksonalnych otaczających ciała komórek9,10. Użyliśmy kulek magnetycznych sprzężonych z bogatym w leucynę powtarzającym się transbłonowym neuronem 2 (LRRTM2), który jest presynaptycznym organizatorem do indukowania pobudzających presynaps (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A) 11, 12 < sup class = "xref" >13. Dzięki zastosowaniu kulek LRRTM2 tworzenie presynaps rozpoczyna się w momencie nałożenia kulek. Oznacza to, że tworzenie presynaps rozpoczyna się w tysiącach aksonów kuli neuronowej w tym samym czasie, co pozwala na efektywne badanie precyzyjnego przebiegu akumulacji białek synaptycznych w czasie. Ponadto, hodowla kulek neuronalnych jest łatwa do zablokowania transportu białek synaptycznych z somy poprzez usunięcie ciał komórkowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B)8. Potwierdziliśmy już, że aksony bez ciał komórkowych mogą przetrwać i są zdrowe co najmniej 4 godziny po usunięciu ciał komórkowych. W związku z tym protokół ten jest odpowiedni do zbadania, skąd pochodzą białka synaptyczne (ciało komórki lub akson) i jak białka synaptyczne gromadzą się w zorganizowany sposób.

<table><tbody><tr><td>Rozcieńczalnik przeciwciał</td><td>DAKO</td><td>S2022</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-585-151</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-545-152</td><td></td></tr><tr><td>mysi anty-Munc18-1</td><td>BD Biosciences</td><td>610336</td><td></td></tr><tr><td>Suplement B-27 (50X), surowica darmowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Alubumin (BSA)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>01863-48</td><td></td></tr><tr><td>Wielonaczynia poddane hodowli komórkowej (naczynie 4-dołkowe)</td><td>Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Kompletna kamera CCD chłodzona</td><td></td> 11873580001 <td></td> Roche bez EDTA Andor Technology iXON3 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Szkiełko nakrywkowe Matsunami <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>C015001</td><td>Rozmiar: 15 mm, Grubość: 0,13-0,17 mm</td></tr><tr><td>Cytozyna &beta;-D-arabinofuranozyd (AraC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorowodorek 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>11034-56</td><td></td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza 1 (DNaza I)</td><td>Wako czyste chemikalia</td><td>047-26771</td><td></td></tr><tr><td>Expi293 System ekspresji</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>A14635</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji obrazu</td><td></td><td></td> surowicy końskiej Sigma-Aldrich H1270 Nikon NIS-element AR <td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>NIH</td><td>Image J</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Odwrócony mikroskop fluoniedawny</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-E</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> GlutaMAX Thermo Fisher Scientific <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>35050061</tr><tr><td>Podłoże neuropodstawowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia (NGS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#143-06561</td><td></td></tr><tr><td>Galusan N-propylu</td><td>Nacalai Tesque</td><td>29303-92</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26126-25</td><td></td></tr><tr><td> Paraplast Plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3558</td><td></td></tr><tr><td>Bromek poli-L-lizyny (MW > 300 000)</td> <td>Nacalai Tesque</td><td>28359-54</td><td></td></tr><tr><td>poli (alkohol winylowy)</td><td>Sigma</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>Paczkowane jednorazowe kolumny PD-10</td><td>GE opieka zdrowotna</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>przeciwpęcherzykowy transporter glutaminianu</td> królika 1 <td>Systemy synaptyczne</td><td>135-302</td><td></td></tr><tr><td>SCAT 20X-N (obojętny niefosforowy detergent)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>41506-04</td><td></td></tr><tr><td>Cząstki magnetyczne pokryte streptawidyną</td><td>Spherotech Inc</td><td>SVM-40-10</td><td>średnica: 4-5 i mikro; m</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Nacalai Tesque</td><td>18172-94</td><td></td></tr></tbody></table>

test tworzenia presynaps przy użyciu kulek organizatora presynapsy i hodowli "kuli neuronalnej"

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and &ldquo;Neuron Ball&rdquo; Culture

Podczas rozwoju neuronów, tworzenie synaps jest ważnym krokiem do ustanowienia obwodów neuronowych. Aby utworzyć synapsy, białka synaptyczne muszą być dostarczane w odpowiedniej kolejności poprzez transport z ciał komórkowych i/lub lokalną translację w niedojrzałych synapsach. Jednak nie do końca wiadomo, w jaki sposób białka synaptyczne gromadzą się w synapsach we właściwej kolejności. W tym miejscu przedstawiamy nowatorską metodę analizy powstawania presynaps poprzez wykorzystanie połączenia hodowli kulek neuronalnych z kulkami w celu indukowania tworzenia presynaps. Kule neuronalne, czyli agregaty komórek neuronalnych, zapewniają arkusze aksonalne z dala od ciał komórkowych i dendrytów, dzięki czemu można wykryć słabe sygnały fluorescencyjne presynaps, unikając przytłaczających sygnałów ciał komórkowych. Jako kulki do wyzwalania tworzenia presynaps używamy koralików sprzężonych z bogatym w leucynę powtarzającym się neuronem transbłonowym 2 (LRRTM2), pobudzającym organizatorem presynaptycznym. Za pomocą tej metody wykazaliśmy, że pęcherzykowy transporter glutaminianu 1 (vGlut1), białko pęcherzyków synaptycznych, gromadzi się w presynapsach szybciej niż Munc18-1, białko strefy aktywnej. Munc18-1 gromadził się w presynapsie w sposób zależny od translacji, nawet po usunięciu ciał komórkowych. Odkrycie to wskazuje na akumulację Munc18-1 poprzez lokalną translację w aksonach, a nie transport z ciał komórkowych. Podsumowując, metoda ta jest odpowiednia do analizy akumulacji białek synaptycznych w presynapsach i źródle białek synaptycznych. Ponieważ hodowla kulek neuronalnych jest prosta i nie jest konieczne stosowanie specjalnej aparatury, metoda ta może mieć zastosowanie do innych platform eksperymentalnych.

W niniejszej pracy prezentujemy reprezentatywne wyniki akumulacji białek presynaptycznych w presynapsach indukowanych przez LRRTM2 w arkuszach aksonalnych hodowli neuron ball. Jako białka presynaptyczne przeanalizowano białko pęcherzyków synaptycznych pobudzających vGlut1 oraz białko strefy aktywnej Munc18-1. Zbadaliśmy również przebieg czasowy akumulacji vGlut1 i Munc18-1 w presynapsach oraz, wykorzystując aksony pozbawione ciał komórkowych i inhibitor syntezy białek, uzyskaliśmy wyniki wskazujące na źródło Munc18-1 w p...

Tworzenie presynaps to dynamiczny proces, w tym akumulacja białek synaptycznych w odpowiedniej kolejności. W tej metodzie tworzenie presynaps jest wywoływane przez koraliki sprzężone z białkiem organizatora presynapsy na arkuszach aksonalnych hodowli "kuli neuronalnej", dzięki czemu akumulacja białek synaptycznych jest łatwa do analizy podczas tworzenia presynapsy.

Test tworzenia presynaps przy użyciu kulek organizatora presynapsy i hodowli "kuli neuronalnej"

During neuronal development, synapse formation is an important step to establish neural circuits. To form synapses, synaptic proteins must be supplied in ...

Protokół ten jest odpowiedni do badania, skąd pochodzą białka presynaptyczne: ciała komórkowe czy aksony. I jak białka presynaptyczne gromadzą się w presynapsach w zorganizowany sposób podczas tworzenia synaps. Technika ta może indukować tysiące presynaps w tym samym czasie i nie wykorzystuje żadnej specjalnej aparatury do utrzymywania aksonów w kulturze, co pozwala na efektywną analizę powstawania wielu presynaps w aksonach.Wraz z doktorantką, Honami, zademonstruje tę procedurę Rie Ishii, studentka studiów licencjackich w moim laboratorium. Rozpocznij tę procedurę od eutanazji myszy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wypreparować jamę brzuszną w celu uzyskania zarodków E16.Ostrożnie usuń mózgi z zarodków za pomocą kleszczy z cienką końcówką i przenieś je do 60-milimetrowych naczyń do hodowli komórkowych zawierających cztery mililitry buforowanego roztworu soli HEPES lub HBSS. Usuń opony mózgowe i odetnij opuszkę węchową. Oddziel korę mózgową od każdej półkuli mózgowej za pomocą cienkich końcówek kleszczy pod mikroskopem stereoskopowym i przenieś do innej 60-milimetrowej naczynia zawierającej świeży HBSS.Użyj co najmniej trzech do pięciu zarodków do każdej oddzielnej hodowli kulki neuronalnej. Pokrój korę na małe kawałki za pomocą sprężynowych nożyczek do mikropreparowania w kapturze do hodowli komórek z przepływem laminarnym. Teraz przenieś zmieloną korę do 15-mililitrowej tuby.Trypsynizuj mieloną korę w czterech mililitrach 0,125% trypsyny w HBSS przez 4,5 minuty w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przenieś agregaty komórek do nowej 15-mililitrowej probówki zawierającej 10 mililitrów HBSS za pomocą sterylnej pipety transferowej. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie powtórz ten krok jeszcze raz.Następnie przenieś agregaty komórkowe do nowej 15-mililitrowej probówki zawierającej dwa mililitry pożywki NGB, 0,01% DNazy I i 10% surowicy końskiej. Rozcieraj trypsynizowane kory, wielokrotnie pipetując je w górę i w dół trzy do pięciu razy za pomocą wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura z drobnego szkła. Aby przygotować kulki neuronowe, dostosuj gęstość komórek w zawiesinie komórkowej do miliona komórek na mililitr za pomocą pożywki NGB.Dodaj siedem mililitrów PBS do dolnej części szalek hodowlanych. Hoduj neurony korowe jako wiszące krople o objętości 10 mikrolitrów zawierające 10 000 komórek na kroplę wewnątrz górnych powiek 10-centymetrowych naczyń hodowlanych. Trzymaj naczynia w inkubatorze przez trzy dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 w wilgotnych warunkach, aby umożliwić tworzenie się kulek neuronowych.Pokryć poli-L-lizynę lub PLL na szkiełkach nakrywkowych pokrytych parafiną w 60-milimetrowych szalkach, używając roztworu PLL o stężeniu 15 mikrogramów na mililitr w buforze boranowym. Trzymaj je przez co najmniej godzinę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po czterokrotnym przemyciu PBS przenieść szkiełka nakrywkowe pokryte PLL na płytkę czterodołkową zawierającą 350 mikrolitrów podłoża NGB z trzema mikromolowymi AraC w każdym dołku.AraC jest dodawany do pożywki w celu zabicia dzielących się komórek. Inkubować czterodołkowe płytki zawierające szkiełka nakrywkowe pokryte PLL w inkubatorze CO2 przez co najmniej 20 minut, aby upewnić się, że temperatura pożywki osiągnie 37 stopni Celsjusza przed przeniesieniem kulek neuronowych. W DIV 3, gdy kulki neuronów są bardzo dobrze uformowane, przenieś je na szkiełka nakrywkowe pokryte PLL.Wewnątrz czterodołkowej płytki dodaj pięć kulek neuronów na dołek. W DIV 11 przenieś 20 mikrolitrów z zawiesiny cząstek magnetycznych pokrytych streptawidyną do probówki mikrowirówkowej. Unieruchomić koraliki do ręcznie wykonanego aparatu przymocowanego za pomocą neodymowych magnesów trwałych i umyć trzykrotnie 100 mikrolitrami PBS-MCBC w 1,5-mililitrowych probówkach do mikrowirówek.Po całkowitym usunięciu PBS-MCBC z kulek, dodaj z góry określoną objętość bulionu LRRTM2 do umytych kulek. Inkubować mieszaninę za pomocą rotatora w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin. Po inkubacji umyj kulki dwukrotnie 100 mikrolitrami PBS-MCBC.Następnie umyj kulki 100 mikrolitrami pożywki NGB. Ponownie zawiesić kulki LRRTM2 w 50 mikrolitrach pożywki NGB w celu zastosowania do hodowli kulek neuronowych. Teraz odetnij koniec żółtej końcówki pod kątem 45 stopni żyletką pod mikroskopem stereoskopowym.Umieść żółty koniec końcówki na obszarze ciała komórki kuli neuronowej i usuń ciała komórkowe przez odsysanie. Zastosuj LRRTM2 i koraliki kontrolne na kulturze kulki neuronalnej. Następnie zanurz kulki na dnie płytek kultury kulek neuronowych na jedną minutę za pomocą magnesów ferrytowych, aby rozpocząć tworzenie presynaps.Ta procedura zapewnia przyziemienie wszystkich koralików w tym samym czasie. Napraw i wybarwij neurony w kulturze kuli neuronalnej po utworzeniu presynapsy za pomocą koralików, jak opisano w protokole tekstowym. Rejestruj obrazy interferencji różnicowej, kontrastu i immunofluorescencji pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym za pomocą chłodzonej kamery CCD z 60-krotną soczewką olejową.Zmierz intensywność immunofluorescencji w presynapsach w aksonie. Użyj intensywności immunofluorescencji obszaru zainteresowania na koralikach. Minus intensywność obszaru poza koralikami podzielona przez intensywność aksonów, wzdłuż 20 mikronów od koralików.Minus intensywność tła. Ta intensywność stosunku zapewnia wskaźnik akumulacji białka. Aby określić ilościowo poziom akumulacji określonego białka w presynapsie indukowanej kulkami LRRTM2, zawsze wybieraj obszar, który znajduje się w odległości dwóch lub więcej pól widzenia od ciała komórki.Aby uzyskać dokładny pomiar, wybierz pięć różnych pól aksonalnych na szkiełko nakrywkowe. Pokazano tutaj zastosowanie kulek LRRTM2 w hodowli kulek neuronów w DIV 11 indukowanej akumulacji Munc18-1 w presynapsach aksonów kulek neuronowych. Koraliki na aksonach kulek neuronalnych są widoczne na obrazach z mikroskopii fazowej.Akumulację białek presynaptycznych obserwuje się za pomocą obrazów immunofluorescencyjnych. Nawet w aksonach, które są usuwanymi ciałami komórkowymi, zaobserwowano akumulację Munc18-1 pod kulkami, podobnie jak aksony kulek neuronalnych z ciałami komórkowymi. Gdy obszar peryferyjny arkusza aksonalnego był analizowany przez soczewkę obiektywową o dużym powiększeniu, vGlut1 i Munc18-1 wyraźnie gromadziły się w presynapsach aksonów pod kulkami z ciałami komórkowymi i bez.Eksperymenty z biegiem czasu wykazały, że akumulacja vGlut1 w presynapsach znacznie wzrosła po 30 minutach. Z drugiej strony, akumulacja Munc18-1 zaczęła znacznie rosnąć po dwóch godzinach i osiągnęła plateau po czterech godzinach. Dane te wskazują, że białko pęcherzyków synaptycznych vGlut1 gromadzi się w presynapsach wcześniej niż białko strefy aktywnej Munc18-1.Akumulacja Munc18-1 w presynapsach neuronów Fmr1-KO wzrosła 1,5 raza bardziej niż w typie dzikim, co wskazuje na udział FMRP w akumulacji Munc18-1. Inhibitor syntezy białek, anizomycyna, znacznie hamował akumulację Munc18-1 w aksonach z ciałami komórkowymi i bez nich. Oznacza to, że akumulacja jest zależna od syntezy białek.Pipetowanie trypsynizowanej kory za pomocą wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura z drobnego szkła jest ważnym krokiem. Eksperymentatorzy przygotowują wypolerowane ogniowo pipety o dwóch do trzech różnych średnicach i wybierają pipetę o odpowiedniej średnicy. Za pomocą tej procedury uwalnianie synaps z presynaps indukowanych przez kulki LRRTM2 mierzy się za pomocą obrazowania na żywo.Ta dodatkowa metoda pozwoliłaby odpowiedzieć na pytanie, czy synteza białek w aksonach jest zaangażowana w regulację uwalniania synaptycznego. Korzystając z tej metody, naukowcy badają, w jaki sposób białka presynaptyczne gromadzą się w presynapsach w zorganizowany sposób, a także lokalizację źródła białek presynaptycznych.

presynapse-formation-assay-using-presynapse-organizer-beads-neuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje sposób ilościowego oznaczania liczby synaps zarówno w dysocjowanych kulturach neuronowych, jak i w przekrojach mózgu z wykorzystaniem immunocytochemii. Przy użyciu przeciwciał specyficznych dla poszczególnych przedziałów komórkowych znakujemy terminale presynaptyczne oraz miejsca specjalizacji postsynaptycznej. Synapsy definiujemy jako punkty kolokalizacji sygnałów generowanych przez te markery.

Ilościowe oznaczanie synaps: test oparty na immunocytochemii do ilościowego oznaczania liczby synaps

Ten film pokazuje proces generowania kulek neuronów za pomocą techniki hodowli wiszącej kropli. W wiszących kroplach komórki przemieszczają się w kierunku dołu, samoorganizując się w trójwymiarowe struktury tworzące kule neuronów, które można wykorzystać do badań neurobiologicznych.

Rozwijanie kulek neuronalnych przy użyciu techniki hodowli wiszącej kropli

Ten film demonstruje technikę szybkiego inicjowania i rozszerzania neuronu oraz tworzenia nowych połączeń z neuronem docelowym za pomocą urządzenia mikroprzepływowego i mikromanipulacji. Można to wykorzystać w terapiach, które mają na celu ponowne połączenie obwodów neuronalnych po urazie lub w chorobach neurodegeneracyjnych.

Inicjowanie szybkiej rozbudowy neurytów i tworzenie funkcjonalnych połączeń neuronalnych

Ten film demonstruje procedurę przygotowania hodowanych neuronów do analizy optycznej przetworzonych pęcherzyków synaptycznych. Proces ten obejmuje znakowanie fluorescencyjne białek pęcherzyków synaptycznych i barwienie immunologiczne w celu oznakowania i wizualizacji pęcherzyków pochodzących z recyklingu w neuronach.

Przygotowanie hodowanych neuronów do analizy optycznej przetworzonych pęcherzyków synaptycznych

Mechanizmy molekularne, które koordynują powstawanie hamujących synaps GABA-ergicznych podczas ontogenezy, są w dużej mierze nieznane. Aby zbadać te procesy, opracowaliśmy system modelu kohodowli, który obejmuje embrionalne średnio kolczaste neurony GABA-ergiczne hodowane razem ze stabilnie transfekowanymi ludzkimi embrionalnymi komórkami nerkowymi 293 (HEK293) wyrażającymi funkcjonalne receptoryGABA A.

Hamujące tworzenie synaps w modelu kokultury obejmującym średnie neurony kolczaste GABA-ergiczne i komórki HEK293 stabilnie eksprymujące receptory GABAA

Opisano protokół generowania systemu kokulturowego składającego się z neuronów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), pierwotnych neuronów korowych i astrocytów. Ten system kohodowli umożliwia wykrycie powstawania kontaktów i obwodów synaptycznych między nowymi neuronami pochodzącymi z iPSC a istniejącymi wcześniej neuronami korowymi wykazującymi ekspresję rodopsyny kanałowej-2.

Optogenetyczne podejście do oceny tworzenia połączeń neuronalnych w systemie kokulturowym

Ta procedura opisuje, jak szybko inicjować, rozszerzać i łączyć neuryty zorganizowane w komorach mikroprzepływowych za pomocą pokrytych poli-D-lizyną koralików przymocowanych do mikropipet, które kierują wydłużaniem neurytu.

Przeprogramowanie obwodów neuronalnych: nowa metoda szybkiego wydłużania neurytów i funkcjonalnego połączenia neuronalnego

Opisujemy optyczny test do recyklingu pęcherzyków synaptycznych (SV) w hodowanych neuronach. Połączenie tego protokołu z podwójną transfekcją w celu ekspresji markera presynaptycznego i białka będącego przedmiotem zainteresowania pozwala nam zlokalizować miejsca presynaptyczne, ich zdolność do recyklingu pęcherzyków synaptycznych i określić rolę białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Test optyczny do recyklingu pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach z nadekspresją białek presynaptycznych

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania akumulacji neuronalnej α-synukleiny w pierwotnych mysich neuronach dopaminowych. Fosforylowane agregaty α-synukleiny w neuronach są indukowane za pomocą wstępnie uformowanych włókienek α-synukleinowych. Zautomatyzowane obrazowanie komórek znakowanych immunofluorescencyjnie i bezstronna analiza obrazu sprawiają, że ten solidny protokół nadaje się do średnio- i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, które hamują akumulację α-synukleiny.

Badanie indukowanej wcześniej fibrylami akumulacji α-synukleiny w pierwotnych embrionalnych neuronach dopaminowych śródmózgowia myszy

DetectSyn to bezstronny, szybki test fluorescencyjny, który mierzy zmiany we względnej liczbie synaps (zaangażowanie pre- i postsynaptyczne) w różnych terapiach lub stanach chorobowych. Technika ta wykorzystuje technikę ligacji zbliżeniowej, która może być stosowana zarówno w hodowanych neuronach, jak i w tkance stałej.

DetectSyn: szybka, bezstronna metoda fluorescencyjna do wykrywania zmian w gęstości synaps

Gotowy do użycia zamrożony zasób neuronów jest potężnym narzędziem do oceny funkcji synaptycznych. Tutaj wprowadzamy łatwą hodowlę pierwotną o niskiej gęstości z zamrożonego wywaru przy użyciu 96-dołkowej płytki.

Łatwa i powtarzalna hodowla pierwotna o niskiej gęstości przy użyciu zamrożonego materiału embrionalnych neuronów hipokampa

Poznaj metodę tworzenia presynaps przy użyciu kulek organizatora presynapsy i hodowli kuli neuronalnej. Technika umożliwia analizę akumulacji białek synaptycznych w aksonach bez specjalistycznego sprzętu.

Test tworzenia presynaps przy użyciu kulek organizatora presynapsy i hodowli "kuli neuronalnej"

Przeglądaj więcej filmów