Wykrywanie fuzji genów onkogennych za pomocą zakotwiczonej reakcji łańcuchowej polimerazy multipleksowej, a następnie sekwencjonowania nowej generacji

Protokół ten służy do wykrywania krytycznie informacyjnych fuzji genów w próbkach guza pacjenta. Stan fuzji kilkudziesięciu genów jest oceniany jednocześnie w jednym teście. Zaletą tej techniki jest to, że mogę zidentyfikować fuzje genów niezależnie od tożsamości partnera fuzyjnego na podstawie próbek guza, które zostały przetworzone przez utrwalenie formuły.

Wykrycie fuzji określonych genów w klinicznej próbce guza bezpośrednio informuje o diagnozie, rokowaniu i doborze leczenia w wielu typach raka. Bardzo ważne jest, aby zrozumieć, że wiele fuzji wywoływanych przez algorytm analizy to artefakty. Najtrudniejszym zadaniem podczas analizy danych jest rozróżnienie między wywołaniami artefaktu a rzeczywistymi fuzjami.

Zacznij od rozcieńczenia całkowitego kwasu nukleinowego, aby osiągnąć pożądane stężenie RNA. Dla każdej próbki przenieść 20 mikrolitrów rozcieńczenia do losowo zasysających probówek z odczynnikiem do zalewania we wstępnie schłodzonym bloku aluminiowym i wymieszać, pipetując w górę iw dół sześć do ośmiu razy. Krótko odwirować próbki, przenieść całą objętość na 96-dołkową płytkę do PCR i uszczelnić folią uszczelniającą do płytek.

Włóż płytkę do termocyklera, przykryj podkładką kompresyjną i zamknij pokrywę. Inkubować w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut. Po inkubacji przenieść całą objętość losowego produktu gruntującego do probówek z odczynnikiem pierwszej żyły.

Mieszać, pipetując w górę i w dół, a następnie krótko odwirować. Przenieś całą objętość na 96-dołkową płytkę PCR i zamknij folią RT. Włóż płytkę do termocyklera i przeprowadź reakcję zgodnie ze wskazówkami z manuskryptu.

Wykonaj drugą nić syntezy i naprawy cDNA oraz etap ligacji zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i przejdź do drugiego etapu ligacji. Aby ponumerować rurki z molekularnym kodem kreskowym lub rurkami z paskiem adaptera MBC, ustaw rurki poziomo z zawiasami do tyłu i użyj markera permanentnego. Weź płytkę do oczyszczania kulek z pierwszego etapu ligacji i przenieś 40 mikrolitrów każdej próbki do probówek z paskiem adaptera MBC, uważając, aby nie naruszyć granulki kulki.

Wymieszać odczynniki przez pipetowanie, odwirować probówki i przenieść całą objętość do etapu ligacji dwóch probówek z odczynnikiem. Wymieszaj próbki, odwiruj je i umieść w bloku termocyklera. Pozostaw podgrzewaną pokrywę zdjętą i uruchom termocykler w temperaturze 22 stopni Celsjusza na pięć minut, a następnie przytrzymaj w 4 stopniach Celsjusza.

Następnie przygotuj kulki do czyszczenia ligacji, wirując je i dodając 50 mikrolitrów do nowego zestawu probówek paskowych do PCR. Inkubować na magnesie przez jedną minutę i odrzucić supernatant. Wyjmij probówki z paskami z magnesu i ponownie zawieś kulki w 50 mikrolitrach buforu do czyszczenia ligacji, pipetując w górę iw dół.

Przenieść całą objętość próbki z drugiego etapu ligacji do paska kulki do czyszczenia ligacji. Zmieszać próbki w celu wymieszania i pozostawić je w temperaturze pokojowej na 10 minut. Wprowadzić wir próbki raz w połowie inkubacji.

Następnie zawiruj próbki, odwiruj je w dół i inkubuj na magnesie przez jedną minutę. Odrzucić supernatant i dodać 200 mikrolitrów świeżego bufora do czyszczenia ligacji. Wiruj, aby ponownie zawiesić, odkręć w dół i umieść na magnesie na jedną minutę.

Po dwóch praniach wykonaj trzecie płukanie, używając ultraczystej wody zamiast bufora. Ponownie zawiesić kulki w 20 mikrolitrach 5 milimetrów wodorotlenku sodu i przenieść próbki na 96-dołkową płytkę PCR. Umieść płytkę w termocyklerze z podkładką kompresyjną i uruchom ją w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie przytrzymaj w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Gdy próbki ostygną do 4 stopni Celsjusza, umieść płytkę na magnesie na co najmniej trzy minuty i przystąp do pierwszego PCR. Przygotuj reakcje PCR, dodając dwa mikrolitry starterów GSP1 do każdego dołka pierwszego paska odczynnika PCR. Przenieś 18 mikrolitrów drugiego produktu do czyszczenia ligacji do pierwszych probówek z odczynnikiem do PCR i wymieszaj, pipetując w górę iw dół.

Odkręć próbki i przenieś je na 96-dołkową płytkę do PCR. Umieść je w termocyklerze i przeprowadź PCR zgodnie ze wskazówkami rękopisu. Kontynuuj oczyszczanie kulek, dodając 20 mikrolitrów produktu PCR do płytki z dnem w kształcie litery U wypełnionej 24 mikrolitrami kulek oczyszczających na studzienkę.

Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać i pozostawić płytkę w temperaturze pokojowej na pięć minut, a następnie inkubować płytkę na magnesie przez dwie minuty. Wyrzuć supernantant z kulek i umyj je dwukrotnie 200 mikrolitrami 70% etanolu. Po ostatnim myciu usuń cały etanol i pozostaw próbkę do wyschnięcia na powietrzu przez dwie minuty.

Wyjmij płytkę z magnesu i ponownie zawieś kulki w 24 mikrolitrach 10 milimetrów Tris-HCl i pH 8,0. Inkubuj magnes przez trzy minuty, a następnie umieść płytkę z powrotem na magnesie na dwie minuty. Rozpocznij kwantyfikację biblioteki od przygotowania od jednego do pięciu rozcieńczeń drugiego produktu PCR w 10-milimetrowym Tris-HCl.

Następnie należy przeprowadzić seryjne rozcieńczenie 1:199, 1:199 i 20:80 w 10-milimetrowym Tris-HCl z 05% polisorbatem. Ustawić kluczowy PCR, dodając sześć mikrolitrów mieszanki wzorcowej do każdego dołka 96-dołkowej płytki optycznej, a następnie cztery mikrolitry odpowiedniego rozcieńczenia lub wzorca. Zakręć płytką i załaduj ją do urządzenia qPCR.

Wykonaj qPCR zgodnie ze wskazówkami rękopisu. Po zakończeniu kwantyfikacji biblioteki rozcieńczyć wszystkie biblioteki do dwóch nanomolowych 10-milimetrowym Tris-HCl. Utwórz pulę biblioteczną, łącząc 10 mikrolitrów każdej znormalizowanej biblioteki w jedną 1,5-mililitrową probówkę do mikrowirówki.

Następnie przygotuj zdenaturowaną bibliotekę amplikonów lub pulę DAL, łącząc 10 mikrolitrów puli bibliotecznej z 10 mikrolitrami 0,2 normalnego wodorotlenku sodu i inkubując mieszaninę przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji dodać 10 mikrolitrów 200 milimetrów Tris-HCl o pH 7,0, a następnie 970 mikrolitrów buforu hybrydyzacyjnego HT1. Wykonaj końcową rurę obciążeniową, łącząc 300 mikrolitrów HT1, 25 mikrolitrów 20 picomolar PhiX i 675 mikrolitrów puli DAL.

Dodaj całą objętość rurki ładującej do dołka na próbkę w kartridżu z odczynnikiem sekwensera i załaduj kartridż do sekwencera. Zacznij od wybrania pozytywnej próbki kontrolnej i upewnij się, że wszystkie oczekiwane fuzje i izoformy onkogenne zostały wykryte i są wymienione w zakładce mocne dowody. Dla każdej próbki sprawdź średnią unikatową lokalizację początkową na wartość kontrolną GSP2, a następnie zwizualizuj pomocnicze odczyty dla każdej potencjalnej fuzji, klikając łącze Wizualizuj, które przenosi użytkownika do internetowego widoku JBrowse stosów poszczególnych odczytów pomocniczych fuzji.

Upewnij się, że odczyty są w większości wolne od niezgodności, ale ponad 30 zasad odczytów jest wyrównanych z partnerem fuzyjnym i że sekwencje sąsiadujące z punktem przerwania między genami a miejscami wiązania starterów są wolne od insercji lub delecji. Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że każda fuzja wywołania jest ogólnie wolna od niewspółosiowości i że znaczna część odczytów jest zgodna z partnerem fuzji. Protokół ten został wykorzystany do zbadania statusu fuzji genów w próbce gruczolakoraka płuc.

Podsumowanie pokazuje silne fuzje dowodów, a strona Statystyki odczytu pokazuje metryki próby. Ta próbka wykazuje dobrą jakość RNA, więc negatywne wyniki zostaną zgłoszone, jeśli nie zostaną znalezione fuzje. Legalne wywołanie fuzji ma dużą liczbę pomocniczych odczytów, wysoki procent odczytów ze startera obsługującego fuzję i dużą liczbę witryn początkowych.

Wizualizacja odczytów pokazuje dobre wyrównanie do dużych obszarów partnera fuzji. Z drugiej strony wywołanie fuzji artefaktów ma niższe metryki pomocnicze i wysoki współczynnik błędów podczas mapowania na partnera. Sztuczne wywołania fuzji wykonywane przez algorytm analizy są powszechne.

Bardzo ważne jest, aby ręcznie sprawdzić każde połączenie, aby upewnić się, że reprezentuje ono rzeczywistą fuzję genów w próbce pacjenta.