Name: Wykrywanie fuzji genów onkogennych za pomocą zakotwiczonej reakcji łańcuchowej polimerazy multipleksowej, a następnie sekwencjonowania nowej generacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Poznaj metodę wykrywania onkogennych fuzji genów w próbkach nowotworowych przy użyciu zakotwiczonej PCR multipleksowej i sekwencjonowania nowej generacji. Technika ta umożliwia jednoczesną analizę dziesiątek genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Molecular Pathology Shared Resource Uniwersytetu Kolorado (National Cancer Institute Cancer Center Support Grant No. P30-CA046934) oraz przez Colorado Center for Personalized Medicine.

<ol><li>Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+translocations+and+gene+fusions+on+cancer+causation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The impact of translocations and gene fusions on cancer causation.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).</li>
<li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr%2Fabl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science. 247 (4944), 824-830 (1990).</li>
<li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+a+specific+inhibitor+of+the+BCR-ABL+tyrosine+kinase+in+the+blast+crisis+of+chronic+myeloid+leukemia+and+acute+lymphoblastic+leukemia+with+the+Philadelphia+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome.</a> New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).</li>
<li>Solomon, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-line+crizotinib+versus+chemotherapy+in+ALK-positive+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).</li>
<li>Shaw, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crizotinib+in+ROS1-rearranged+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).</li>
<li>Drilon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+Larotrectinib+in+TRK+Fusion-Positive+Cancers+in+Adults+and+Children%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children.</a> New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).</li>
<li>Kawai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SYT-SSX+gene+fusion+as+a+determinant+of+morphology+and+prognosis+in+synovial+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma.</a> New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).</li>
<li>de Alava, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EWS-FLI1+fusion+transcript+structure+is+an+independent+determinant+of+prognosis+in+Ewing%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing's sarcoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).</li>
<li>Pierron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+subtype+of+bone+sarcoma+defined+by+BCOR-CCNB3+gene+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion.</a> Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).</li>
<li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Classification+and+Prognosis+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li>
<li>Arber, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2016+revision+to+the+World+Health+Organization+classification+of+myeloid+neoplasms+and+acute%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute.</a> Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).</li>
<li>Sanders, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+scanning+by+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+for+detection+of+known+and+novel+EML4-ALK+fusion+variants+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer.</a> Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).</li>
<li>Camidge, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+Detection+of+Lung+Cancer+Patients+Harboring+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+%28ALK%29+Gene+Rearrangements+Potentially+Suitable+for+ALK+Inhibitor+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment.</a> Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).</li>
<li>Mino-Kenudson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+highly+sensitive+antibody+allows+for+the+routine+detection+of+ALK-rearranged+lung+adenocarcinomas+by+standard+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry.</a> Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).</li>
<li>Suehara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+KIF5B-RET+and+GOPC-ROS1+fusions+in+lung+adenocarcinomas+through+a+comprehensive+mRNA-based+screen+for+tyrosine+kinase+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions.</a> Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).</li>
<li>Davies, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Molecular+Testing+Modalities+for+Detection+of+ROS1+Rearrangements+in+a+Cohort+of+Positive+Patient+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples.</a> Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).</li>
<li>Reeser, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+Targeted+RNA+Sequencing+Assay+for+Kinase+Fusion+Detection+in+Solid+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).</li>
<li>Beadling, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multiplexed+Amplicon+Approach+for+Detecting+Gene+Fusions+by+Next-Generation+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).</li>
<li>Mamanova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-enrichment+strategies+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Target-enrichment strategies for next-generation sequencing.</a> Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).</li>
<li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anchored+multiplex+PCR+for+targeted+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing.</a> Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).</li>
<li>Davies, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+Response+to+Crizotinib+in+a+Patient+with+Lung+Cancer+Positive+for+an+HLA-DRB1-MET+Gene+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22JCO+Precision+Oncology%22%5BJournal%5D)">Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion.</a> JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).</li>
<li>Vendrell, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+known+and+novel+ALK+fusion+transcripts+in+lung+cancer+patients+using+next-generation+sequencing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12510(2017).</li>
<li>Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+Spectrum+of+Genetic+Alterations+in+Pseudomyogenic+Hemangioendothelioma+With+Recurrent+Novel+ACTB-FOSB+Gene+Fusions%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions.</a> American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).</li>
<li>Skalova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Profiling+of+Mammary+Analog+Secretory+Carcinoma+Revealed+a+Subset+of+Tumors+Harboring+a+Novel+ETV6-RET+Translocation%3A+Report+of+10+Cases%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases.</a> American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).</li>
<li>Guseva, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anchored+multiplex+PCR+for+targeted+next-generation+sequencing+reveals+recurrent+and+novel+USP6+fusions+and+upregulation+of+USP6+expression+in+aneurysmal+bone+cyst%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+and+Cancer%22%5BJournal%5D)">Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst.</a> Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).</li>
</ol>

Firma D.L.A. otrzymała honoraria za konsultacje od firm Bayer Oncology, Genentech, AbbVie i Bristol Myers Squibb. K.D.D otrzymał sponsorowane podróże od ArcherDx.

Zakotwiczone wzbogacanie celów w oparciu o multipleksowy PCR i przygotowanie biblioteki, a następnie sekwencjonowanie nowej generacji dobrze nadaje się do oceny fuzji genów multipleksowych w klinicznych próbkach guza. Skupiając się na danych wejściowych RNA, a nie na genomowym DNA, unika się konieczności sekwencjonowania dużych i powtarzających się intronów. Ponadto, ponieważ takie podejście wzmacnia fuzje genów niezależnie od tożsamości partnera fuzji, wykrywane są nowe fuzje. Jest to krytyczna zaleta w sferze kliniczne...

Fuzja dwóch lub więcej genów w jedną jednostkę transkrypcyjną może nastąpić w wyniku dużych zmian chromosomowych, w tym delecji, duplikacji, insercji, inwersji i translokacji. Poprzez zmienioną kontrolę transkrypcji i/lub zmienione właściwości funkcjonalne produktu wyrażonego genu, te geny fuzyjne mogą nadawać właściwości onkogenne komórkom nowotworowym1. W wielu przypadkach wiadomo, że geny fuzyjne działają jako główne czynniki onkogenne poprzez bezpośrednią aktywację szlaków proliferacji komórkowej i przeżycia.
Kliniczne znaczenie fuzji genów dla pacjentów z rakiem po raz pierwszy stało się oczywiste wraz z odkryciem chromosomu Philadelphia i odpowiadającego mu genu fuzji BCR-ABL1 w przewlekłej białaczce szpikowej (CML)2. Małocząsteczkowy inhibitor imatynibu mesylan został opracowany specjalnie do tego genu fuzyjnego i wykazał niezwykłą skuteczność u pacjentów z CML BCR-ABL1-dodatnim3. Terapeutyczne ukierunkowanie na fuzje genów onkogennych odniosło również sukces w guzach litych, a hamowanie genów fuzji ALK i ROS1 w niedrobnokomórkowym raku płuca służy jako główne przykłady4,5. Niedawno inhibitor NTRK larotrektynib został zatwierdzony przez FDA do leczenia guzów litych NTRK1/2/3 z dodatnim wynikiem fuzji, niezależnie od miejsca choroby6. Poza doborem terapii, wykrywanie fuzji genów odgrywa również rolę w diagnozowaniu i prognozowaniu choroby. Jest to szczególnie powszechne w różnych podtypach mięsaków i nowotworów hematologicznych, które są diagnostycznie definiowane na podstawie obecności określonych zrostów i/lub dla których obecność zrostu bezpośrednio wpływa na rokowanie7,8,9,10,11. To tylko kilka przykładów klinicznego zastosowania wykrywania fuzji genów u pacjentów z nowotworami.
Ze względu na kluczową rolę w podejmowaniu decyzji klinicznych, dokładne wykrywanie fuzji genów z próbek klinicznych ma kluczowe znaczenie. W laboratoriach klinicznych zastosowano liczne techniki analizy fuzji lub rearanżacji chromosomów, w tym: techniki cytogenetyczne, reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR), fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH), immunohistochemię (IHC) i analizę nierównowagi ekspresji 5'/3' (między innymi)12,13,14,15. Obecnie szybko rozszerzająca się lista możliwych do działania fuzji genów w nowotworach spowodowała potrzebę oceny statusu fuzji wielu genów jednocześnie. W związku z tym niektóre tradycyjne techniki, które mogą badać tylko jeden lub kilka genów na raz, stają się nieefektywnymi podejściami, zwłaszcza biorąc pod uwagę, że kliniczne próbki guza są często bardzo ograniczone i nie można ich podzielić na kilka testów. Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) jest jednak platformą analityczną, która dobrze nadaje się do testowania wielu genów, a testy oparte na NGS stały się powszechne w klinicznych laboratoriach diagnostyki molekularnej.
Obecnie używane testy NGS do wykrywania fuzji/rearanżacji różnią się pod względem użytego materiału wejściowego, chemii użytej do przygotowania biblioteki i wzbogacenia celu, oraz liczby genów pytanych w teście. Testy NGS mogą być oparte na RNA lub DNA (lub obu) wyekstrahowanym z próbki. Chociaż analiza oparta na RNA jest utrudniona przez tendencję próbek klinicznych do zawierania wysoce zdegradowanego RNA, omija ona potrzebę sekwencjonowania dużych i często powtarzających się intronów, które są celem testów fuzji opartych na DNA, ale okazały się trudne do analizy danych NGS16. Strategie wzbogacania celów w testach NGS opartych na RNA można w dużej mierze podzielić na podejścia hybrydowe lub oparte na amplikonie. Chociaż obie strategie zostały z powodzeniem wykorzystane do wykrywania fuzji, każda z nich ma przewagę nad drugą17,18. Testy wychwytywania hybrydowego zazwyczaj skutkują bardziej złożonymi bibliotekami i zmniejszonym zanikiem alleli, podczas gdy testy oparte na amplikonach zazwyczaj wymagają niższego wkładu i skutkują mniejszą liczbą sekwencjonowania poza celem19. Jednak być może głównym ograniczeniem tradycyjnego wzbogacania opartego na amplikonach jest potrzeba stosowania starterów do wszystkich znanych partnerów fuzji. Jest to problematyczne, ponieważ wiadomo, że wiele klinicznie ważnych genów łączy się z dziesiątkami różnych partnerów, a nawet gdyby projekt startera pozwolił na wykrycie wszystkich znanych partnerów, nowe zdarzenia fuzji pozostałyby niewykryte. Niedawno opisana technika określana jako zakotwiczony multipleksowy PCR (lub w skrócie AMP) rozwiązuje ten problem: 20. W AMP "półfunkcjonalny" adapter NGS jest ligowany do fragmentów cDNA, które pochodzą z wejściowego RNA. Wzbogacenie celu uzyskuje się poprzez amplifikację między starterami specyficznymi dla genu a starterem do adaptera. W rezultacie, wszystkie fuzje z genami będącymi przedmiotem zainteresowania, nawet jeśli zaangażowany jest nowy partner do fuzji, powinny zostać wykryte (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1). W tym artykule opisano zastosowanie zestawu ArcherDx FusionPlex do guzów litych, testu opartego na NGS, który wykorzystuje AMP do wzbogacania celu i przygotowania biblioteki, do wykrywania onkogennych fuzji genów w próbkach guzów litych (patrz Tabela uzupełniająca 1, aby uzyskać pełną listę genów). Protokół mokrej ławki i etapy analizy danych zostały rygorystycznie zweryfikowane w laboratorium posiadającym certyfikat Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA).

<table><tbody><tr><td>10 mM Tris HCl pH 8,0</td><td>IDT</td><td>11-05-01-13</td><td>Używany do rozcieńczania TNA</td></tr><tr><td>1M Tris pH 7,0</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9850G</td><td>Używany w puli bibliotecznej</td></tr><tr><td>25 ml Zbiornik na odczynniki z rozdzielaczem</td><td>USA Scientific</td><td>9173-2000</td><td>Do stosowania z pipeterami wielokanałowymi i dużymi objętościami odczynników</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka TemPlate Semi-Skirt 0,1 ml PCR-naturalna</td><td>USA Scientific</td><td>1402-9700</td><td>Płytka używana do stopni termocyklera</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beads Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Używana do oczyszczania po kilku etapach oznaczania</td></tr><tr><td>Agencourt Formapure Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>A33343</td><td>Używana do ekstrakcji TNA</td></tr><tr><td>Archer FusionPlex Zestaw</td> do guzów litych <td>ArcherDX</td><td>AB0005</td><td>Ten zestaw zawiera większość odczynników niezbędnych do przygotowania biblioteki do sekwencjonowania Illumina (dostępne są również zestawy do sekwencjonowania Ion Torrent)</td></tr><tr><td>Zimny blok, 96-dołkowy</td><td>Light Labs</td><td>A7079</td><td>Służy do chłodzenia próbek na różnych etapach</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>DSP-MD.43</td><td>Używany do mycia koralików</td></tr><tr><td>Biblioteka Kwantyfikacja dla standardu kontroli wewnętrznej Illumina</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4906</td><td>Służy do ilościowego oznaczania biblioteki</td></tr><tr><td>Podstawki do kwantyfikacji biblioteki i mieszanka ROX Low qPCR</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4973</td><td>Służy do kwantyfikacji biblioteki</td></tr><tr><td>Standardy kwantyfikacji biblioteki</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4903</td><td>Służy do kwantyfikacji biblioteki</td></tr><tr><td>Płyta magnetyczna, 96-dołkowa (klasa N38)</td><td>Alpaqua</td><td>A32782</td><td>Stosowana w etapach oczyszczania kulek</td></tr><tr><td>Zestaw adapterów MBC B</td><td>ArcherDX</td><td>AK0016-48</td><td>Adaptery zawierające indeksy specyficzne dla próbki, umożliwiające sekwencjonowanie multipleksowe</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>USA Scientific</td><td>2641-0016</td><td>Służy do obracania probówek PCR</td></tr><tr><td>MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4483485</td><td>Używany do Pre-Seq QClibrary</td></tr><tr><td>Optyczna podkładka kompresyjna Microamp Applied</td><td>Biosystems</td><td>4312639</td><td>Służy do ilościowego oznaczania biblioteki</td></tr><tr><td>Mini wirówka do płytek</td><td>Labnet</td><td>MPS-1000</td><td>Służy do zbierania cieczy na dnie dołków płytowych</td></tr><tr><td>Zestaw odczynników MiSeq v3 (600 cykli)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3003</td><td>Zawiera składniki niezbędne do przebiegu sekwencjonowania MiSeq</td></tr><tr><td>System MiSeqDx</td><td>Przyrząd</td> do <td>sekwencjonowania Illumina</td><td></td> NGS</tr><tr><td>Model 9700 Termocykler</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>Używany do kilku kroków podczas Badanie</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Ambion</td><td>9938</td><td>Używany jako ogólny rozcieńczalnik</td></tr><tr><td>Optyczne ABI 96-dołkowe płytki PCR</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4311971</td><td>Używany do Pre-Seq QClibrary ilościowa</td></tr><tr><td>stacja robocza PCR Model 600</td><td>Systemy oczyszczania powietrza</td><td>BZ10119636</td><td>Etapy testu na mokrym stole wykonywane w tej "skrzynce martwego powietrza"</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Qiagen</td><td>1019499</td><td>Używany w ekstrakcji TNA</td></tr><tr><td>QuantStudio 5</td><td>Applied Biosystems</td><td>LSA28139</td><td>Przyrząd qPCR używany do PreSeq i biblioteki</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania ilościowego kubitowego RNA HS Life</td><td>Technologies</td><td>Q32855</td><td>Służy do określania stężenia RNA w próbkach TNA</td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Fisher</td><td>12-402-178</td><td>Służy do ogólnej dekontaminacji RNazy w miejscach pracy</td></tr><tr><td>Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Materiał referencyjny v2</td><td>SeraCare</td><td>0710-0129</td><td>Stosowany jako kontrola pozytywna testu</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher</td><td>BP359-212</td><td>Stosowany na etapach oczyszczania i do sekwencjonowania</td></tr><tr><td>SYBR Green Supermix</td><td>Bio Rad</td><td>172-5120</td><td>Składnik testu PreSeq QC</td></tr><tr><td>TempAssure PCR 8-tube Strips</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2700</td><td>Używany do mieszania odczynników i próbek itp.</td></tr><tr><td>Szablon Folia RT PCR</td><td>USA Scientific</td><td>2921-7800</td><td>Służy do pokrywania płytek 96-dołkowych</td></tr><tr><td>U-Bottom 96-dołkowa mikropłytka</td><td>LSP</td><td>MP8117-R</td><td>Używana podczas oczyszczania kulek</td></tr></tbody></table>

wykrywanie fuzji genów onkogennych za pomocą zakotwiczonej reakcji łańcuchowej polimerazy multipleksowej, a następnie sekwencjonowania nowej generacji

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Fuzje genów często przyczyniają się do onkogennego fenotypu wielu różnych typów raka. Ponadto obecność pewnych fuzji w próbkach pobranych od pacjentów z rakiem często bezpośrednio wpływa na diagnozę, rokowanie i/lub wybór terapii. W rezultacie, dokładne wykrywanie fuzji genów stało się kluczowym elementem postępowania klinicznego w przypadku wielu typów chorób. Do niedawna kliniczne wykrywanie fuzji genów odbywało się głównie za pomocą testów jednogenowych. Jednak stale rosnąca lista fuzji genów o znaczeniu klinicznym stworzyła potrzebę oceny statusu fuzji wielu genów jednocześnie. Testy oparte na sekwencjonowaniu nowej generacji (NGS) zaspokoiły to zapotrzebowanie dzięki możliwości sekwencjonowania kwasów nukleinowych w sposób masowo równoległy. Wiele podejść opartych na NGS, które wykorzystują różne strategie wzbogacania docelowych genów, jest obecnie dostępnych do stosowania w klinicznej diagnostyce molekularnej, a każde z nich ma swoje mocne i słabe strony. W artykule opisano zastosowanie zakotwiczonego wzbogacania celu opartego na multipleksie PCR (AMP) i przygotowania biblioteki, a następnie NGS do oceny fuzji genów w klinicznych próbkach guzów litych. AMP jest wyjątkowy wśród podejść do wzbogacania opartych na amplikonach, ponieważ identyfikuje fuzje genów niezależnie od tożsamości partnera fuzji. Szczegółowo opisano tutaj zarówno etapy mokrej ławki, jak i analizy danych, które zapewniają dokładne wykrywanie fuzji genów w próbkach klinicznych.

Przedstawione na Rysunku 3, Rysunku 4 oraz Rysunku 5 zrzuty ekranu z interfejsu użytkownika analizy demonstrują wyniki z próbki gruczolakoraka płuca. Na Rysunku 3 widoczne jest podsumowanie próbki (góra), w którym wymieniono zidentyfikowane fuzje o silnych dowodach, a także status QC (zakreślony na czerwono). Fuzja ADCK4-NUMBL (wymieniono dla niej 3 izoformy) zostaje natychmiast zignorowana, po...

Ten artykuł szczegółowo opisuje użycie zestawu do przygotowania biblioteki opartej na reakcji łańcuchowej polimerazy zakotwiczonej, a następnie sekwencjonowania nowej generacji, do oceny fuzji genów onkogennych w klinicznych próbkach guzów litych. Opisano zarówno etapy mokrej ławki, jak i analizy danych.

Wykrywanie fuzji genów onkogennych za pomocą zakotwiczonej reakcji łańcuchowej polimerazy multipleksowej, a następnie sekwencjonowania nowej generacji

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Protokół ten służy do wykrywania krytycznie informacyjnych fuzji genów w próbkach guza pacjenta. Stan fuzji kilkudziesięciu genów jest oceniany jednocześnie w jednym teście. Zaletą tej techniki jest to, że mogę zidentyfikować fuzje genów niezależnie od tożsamości partnera fuzyjnego na podstawie próbek guza, które zostały przetworzone przez utrwalenie formuły.Wykrycie fuzji określonych genów w klinicznej próbce guza bezpośrednio informuje o diagnozie, rokowaniu i doborze leczenia w wielu typach raka. Bardzo ważne jest, aby zrozumieć, że wiele fuzji wywoływanych przez algorytm analizy to artefakty. Najtrudniejszym zadaniem podczas analizy danych jest rozróżnienie między wywołaniami artefaktu a rzeczywistymi fuzjami.Zacznij od rozcieńczenia całkowitego kwasu nukleinowego, aby osiągnąć pożądane stężenie RNA. Dla każdej próbki przenieść 20 mikrolitrów rozcieńczenia do losowo zasysających probówek z odczynnikiem do zalewania we wstępnie schłodzonym bloku aluminiowym i wymieszać, pipetując w górę iw dół sześć do ośmiu razy. Krótko odwirować próbki, przenieść całą objętość na 96-dołkową płytkę do PCR i uszczelnić folią uszczelniającą do płytek.Włóż płytkę do termocyklera, przykryj podkładką kompresyjną i zamknij pokrywę. Inkubować w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut. Po inkubacji przenieść całą objętość losowego produktu gruntującego do probówek z odczynnikiem pierwszej żyły.Mieszać, pipetując w górę i w dół, a następnie krótko odwirować. Przenieś całą objętość na 96-dołkową płytkę PCR i zamknij folią RT. Włóż płytkę do termocyklera i przeprowadź reakcję zgodnie ze wskazówkami z manuskryptu.Wykonaj drugą nić syntezy i naprawy cDNA oraz etap ligacji zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i przejdź do drugiego etapu ligacji. Aby ponumerować rurki z molekularnym kodem kreskowym lub rurkami z paskiem adaptera MBC, ustaw rurki poziomo z zawiasami do tyłu i użyj markera permanentnego. Weź płytkę do oczyszczania kulek z pierwszego etapu ligacji i przenieś 40 mikrolitrów każdej próbki do probówek z paskiem adaptera MBC, uważając, aby nie naruszyć granulki kulki.Wymieszać odczynniki przez pipetowanie, odwirować probówki i przenieść całą objętość do etapu ligacji dwóch probówek z odczynnikiem. Wymieszaj próbki, odwiruj je i umieść w bloku termocyklera. Pozostaw podgrzewaną pokrywę zdjętą i uruchom termocykler w temperaturze 22 stopni Celsjusza na pięć minut, a następnie przytrzymaj w 4 stopniach Celsjusza.Następnie przygotuj kulki do czyszczenia ligacji, wirując je i dodając 50 mikrolitrów do nowego zestawu probówek paskowych do PCR. Inkubować na magnesie przez jedną minutę i odrzucić supernatant. Wyjmij probówki z paskami z magnesu i ponownie zawieś kulki w 50 mikrolitrach buforu do czyszczenia ligacji, pipetując w górę iw dół.Przenieść całą objętość próbki z drugiego etapu ligacji do paska kulki do czyszczenia ligacji. Zmieszać próbki w celu wymieszania i pozostawić je w temperaturze pokojowej na 10 minut. Wprowadzić wir próbki raz w połowie inkubacji.Następnie zawiruj próbki, odwiruj je w dół i inkubuj na magnesie przez jedną minutę. Odrzucić supernatant i dodać 200 mikrolitrów świeżego bufora do czyszczenia ligacji. Wiruj, aby ponownie zawiesić, odkręć w dół i umieść na magnesie na jedną minutę.Po dwóch praniach wykonaj trzecie płukanie, używając ultraczystej wody zamiast bufora. Ponownie zawiesić kulki w 20 mikrolitrach 5 milimetrów wodorotlenku sodu i przenieść próbki na 96-dołkową płytkę PCR. Umieść płytkę w termocyklerze z podkładką kompresyjną i uruchom ją w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie przytrzymaj w temperaturze 4 stopni Celsjusza.Gdy próbki ostygną do 4 stopni Celsjusza, umieść płytkę na magnesie na co najmniej trzy minuty i przystąp do pierwszego PCR. Przygotuj reakcje PCR, dodając dwa mikrolitry starterów GSP1 do każdego dołka pierwszego paska odczynnika PCR. Przenieś 18 mikrolitrów drugiego produktu do czyszczenia ligacji do pierwszych probówek z odczynnikiem do PCR i wymieszaj, pipetując w górę iw dół.Odkręć próbki i przenieś je na 96-dołkową płytkę do PCR. Umieść je w termocyklerze i przeprowadź PCR zgodnie ze wskazówkami rękopisu. Kontynuuj oczyszczanie kulek, dodając 20 mikrolitrów produktu PCR do płytki z dnem w kształcie litery U wypełnionej 24 mikrolitrami kulek oczyszczających na studzienkę.Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać i pozostawić płytkę w temperaturze pokojowej na pięć minut, a następnie inkubować płytkę na magnesie przez dwie minuty. Wyrzuć supernantant z kulek i umyj je dwukrotnie 200 mikrolitrami 70% etanolu. Po ostatnim myciu usuń cały etanol i pozostaw próbkę do wyschnięcia na powietrzu przez dwie minuty.Wyjmij płytkę z magnesu i ponownie zawieś kulki w 24 mikrolitrach 10 milimetrów Tris-HCl i pH 8,0. Inkubuj magnes przez trzy minuty, a następnie umieść płytkę z powrotem na magnesie na dwie minuty. Rozpocznij kwantyfikację biblioteki od przygotowania od jednego do pięciu rozcieńczeń drugiego produktu PCR w 10-milimetrowym Tris-HCl.Następnie należy przeprowadzić seryjne rozcieńczenie 1:199, 1:199 i 20:80 w 10-milimetrowym Tris-HCl z 05% polisorbatem. Ustawić kluczowy PCR, dodając sześć mikrolitrów mieszanki wzorcowej do każdego dołka 96-dołkowej płytki optycznej, a następnie cztery mikrolitry odpowiedniego rozcieńczenia lub wzorca. Zakręć płytką i załaduj ją do urządzenia qPCR.Wykonaj qPCR zgodnie ze wskazówkami rękopisu. Po zakończeniu kwantyfikacji biblioteki rozcieńczyć wszystkie biblioteki do dwóch nanomolowych 10-milimetrowym Tris-HCl. Utwórz pulę biblioteczną, łącząc 10 mikrolitrów każdej znormalizowanej biblioteki w jedną 1,5-mililitrową probówkę do mikrowirówki.Następnie przygotuj zdenaturowaną bibliotekę amplikonów lub pulę DAL, łącząc 10 mikrolitrów puli bibliotecznej z 10 mikrolitrami 0,2 normalnego wodorotlenku sodu i inkubując mieszaninę przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji dodać 10 mikrolitrów 200 milimetrów Tris-HCl o pH 7,0, a następnie 970 mikrolitrów buforu hybrydyzacyjnego HT1. Wykonaj końcową rurę obciążeniową, łącząc 300 mikrolitrów HT1, 25 mikrolitrów 20 picomolar PhiX i 675 mikrolitrów puli DAL.Dodaj całą objętość rurki ładującej do dołka na próbkę w kartridżu z odczynnikiem sekwensera i załaduj kartridż do sekwencera. Zacznij od wybrania pozytywnej próbki kontrolnej i upewnij się, że wszystkie oczekiwane fuzje i izoformy onkogenne zostały wykryte i są wymienione w zakładce mocne dowody. Dla każdej próbki sprawdź średnią unikatową lokalizację początkową na wartość kontrolną GSP2, a następnie zwizualizuj pomocnicze odczyty dla każdej potencjalnej fuzji, klikając łącze Wizualizuj, które przenosi użytkownika do internetowego widoku JBrowse stosów poszczególnych odczytów pomocniczych fuzji.Upewnij się, że odczyty są w większości wolne od niezgodności, ale ponad 30 zasad odczytów jest wyrównanych z partnerem fuzyjnym i że sekwencje sąsiadujące z punktem przerwania między genami a miejscami wiązania starterów są wolne od insercji lub delecji. Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że każda fuzja wywołania jest ogólnie wolna od niewspółosiowości i że znaczna część odczytów jest zgodna z partnerem fuzji. Protokół ten został wykorzystany do zbadania statusu fuzji genów w próbce gruczolakoraka płuc.Podsumowanie pokazuje silne fuzje dowodów, a strona Statystyki odczytu pokazuje metryki próby. Ta próbka wykazuje dobrą jakość RNA, więc negatywne wyniki zostaną zgłoszone, jeśli nie zostaną znalezione fuzje. Legalne wywołanie fuzji ma dużą liczbę pomocniczych odczytów, wysoki procent odczytów ze startera obsługującego fuzję i dużą liczbę witryn początkowych.Wizualizacja odczytów pokazuje dobre wyrównanie do dużych obszarów partnera fuzji. Z drugiej strony wywołanie fuzji artefaktów ma niższe metryki pomocnicze i wysoki współczynnik błędów podczas mapowania na partnera. Sztuczne wywołania fuzji wykonywane przez algorytm analizy są powszechne.Bardzo ważne jest, aby ręcznie sprawdzić każde połączenie, aby upewnić się, że reprezentuje ono rzeczywistą fuzję genów w próbce pacjenta.

oncogenic-gene-fusion-detection-using-anchored-multiplex-polymerase

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisujemy przygotowanie bibliotek DNA z kodami kreskowymi i późniejsze przechwytywanie eksonów oparte na hybrydyzacji do wykrywania kluczowych mutacji związanych z rakiem w klinicznych próbkach guzów poprzez masowo równoległe sekwencjonowanie "nowej generacji". Celowane sekwencjonowanie eksonów oferuje korzyści w postaci wysokiej przepustowości, niskich kosztów i głębokiego pokrycia sekwencji, zapewniając w ten sposób wysoką czułość wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości.

Wykrywanie somatycznych zmian genetycznych w próbkach nowotworowych poprzez wychwytywanie eksonów i masowo równoległe sekwencjonowanie

Ten manuskrypt opisuje protokoły kliniczne dla dwóch paneli sekwencjonowania nowej generacji. Jeden panel bada nowotwory hematologiczne, podczas gdy drugi panel koncentruje się na genach powszechnie zmutowanych w guzach litych. Klasyfikacja molekularna mutacji powodujących nowotwory złośliwe u ludzi dostarcza cennych informacji prognostykujących i predykcyjnych.

Sekwencjonowanie nowej generacji do wykrywania mutacji, które można podjąć w celu działania, w guzach litych i płynnych

Opisany jest zintegrowany system do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji próbek onkologicznych. Ten wieloplatformowy system jest zoptymalizowany pod kątem biopsji guza o niskiej jakości i małej ilości, obsługuje niskie dane wejściowe DNA, zawiera dobrze scharakteryzowane wielowariantowe kontrole i zawiera nowatorski wariant wywołujący, który jest informowany o ilościowych przedanalitycznych środkach kontroli jakości.

Integracja procesów na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym optymalizuje ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji biopsji nowotworów o niskiej jakości i małej ilości

Opisujemy metodę opartą na sekwencjonowaniu RNA, która obejmuje przygotowanie indeksowanych bibliotek cDNA, hybrydyzację i przechwytywanie za pomocą niestandardowych sond oraz analizę danych w celu zbadania wybranych transkryptów pod kątem ekspresji genów, mutacji i fuzji genów. Ukierunkowany RNAseq pozwala na ekonomiczną, szybką ocenę wybranych transkryptów na sekwencerze stacjonarnym.

Ukierunkowany test sekwencjonowania RNA w celu scharakteryzowania ekspresji genów i zmian genomowych

Ten manuskrypt opisuje technikę wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości w ctDNA, ER-Seq. Metoda ta wyróżnia się unikalnym zastosowaniem dwukierunkowej korekcji błędów, specjalnego filtra tła i wydajnej akwizycji molekularnej.

Wykrywanie rzadkich mutacji w ctDNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Uzyskanie wysokiej jakości genomowego DNA z tkanek nowotworowych jest niezbędnym pierwszym krokiem do analizy zmian genetycznych za pomocą sekwencjonowania nowej generacji. W tym artykule przedstawiamy prostą i szybką metodę wzbogacania komórek nowotworowych i uzyskiwania nienaruszonego DNA z próbek cytologicznych odcisku dotykowego.

Prosta i szybka metoda uzyskiwania wysokiej jakości DNA guza z próbek kliniczno-patologicznych za pomocą cytologii odcisku dotykowego

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania mutacji somatycznych nowotworu w krążącym DNA obecnym w płynach biologicznych pacjenta (biofluidach). Nasza metoda oparta na kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR) umożliwia ilościowe określenie częstości alleli mutacji nowotworowych (MAF), ułatwiając minimalnie inwazyjne uzupełnienie diagnozy i czasowego monitorowania odpowiedzi guza.

Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta

W artykule opisano metodę identyfikacji zmian klonalnych i subklonalnych wśród różnych próbek od danego pacjenta. Chociaż opisane tutaj eksperymenty koncentrują się na określonym typie nowotworu, podejście to ma szerokie zastosowanie do innych guzów litych.

Analiza porównawcza zmian chorobowych za pomocą ukierunkowanego podejścia sekwencjonowania

Wzrost liczby biomarkerów molekularnych do testowania w leczeniu leczenia niepłaskonabłonkowym niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NS-NSCLC) skłonił do opracowania szybkich i niezawodnych metod wykrywania molekularnego. Opisujemy przebieg pracy do oceny zmian genomowych u pacjentów z NS-NSCLC przy użyciu podejścia ultraszybkiego sekwencjonowania nowej generacji (NGS).

Ultraszybkie sekwencjonowanie nowej generacji oparte na amplikonie w niepłaskonabłonkowym niedrobnokomórkowym raku płuca

Ten protokół zapewnia powtarzalną metodę wizualizacji amplifikacji genów w próbkach tkanek z parafiną (FFPE) utrwaloną w formalinie.

Niezawodna detekcja amplifikacji genów w próbkach zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ

Protokół ten opisuje zautomatyzowany, akredytowany przez ISO15189 proces sekwencjonowania nowej generacji do wykrywania celowanych zmian genomowych w tkankach formalinowych osadzonych w parafinie tkankach raka płuc niedrobnokomórkowych (NSCLC).

Wykrywanie celowalnych zmian w niedrobnokomórkowym raku płuc za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Poznaj metodę wykrywania onkogennych fuzji genów w próbkach nowotworowych przy użyciu zakotwiczonej PCR multipleksowej i sekwencjonowania nowej generacji. Technika ta umożliwia jednoczesną analizę dziesiątek genów.

Wykrywanie fuzji genów onkogennych za pomocą zakotwiczonej reakcji łańcuchowej polimerazy multipleksowej, a następnie sekwencjonowania nowej generacji (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie fuzji genów onkogennych za pomocą zakotwiczonej reakcji łańcuchowej polimerazy multipleksowej, a następnie sekwencjonowania nowej generacji

Przeglądaj więcej filmów