Name: Sieci kardiomiocytów pochodzące z ludzkich iPSC na wielodołkowych układach mikroelektrod do powtarzalnych zapisów potencjału czynnościowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Odkryj metodę analizy sieci kardiomiocytów pochodzących z ludzkich iPSC na wielodołkowych układach mikroelektrod z wykorzystaniem odwracalnej elektroporacji i niestandardowego przepływu pracy MATLAB.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Przygotowanie roztworów i materiałów (patrz Tabela Materiałów)
<ol>
	<li>6-dołkowa powłoka podłoża na płytce do hodowli tkankowej
	<ol>
		<li>Rozmrozić podłoże powlekające na lodzie lub w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować rozcieńczenie podłoża do powlekania w stosunku 1:100 w zimnym podłożu DMEM/F12. Wymieszać roztwór, powoli pipetując.</li>
		<li>Przenieść 2 ml roztworu podłoża powlekającego (etap 1.1.2) na dołek 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.</li>
		<li>Natychmiast umieścić powlekaną płytkę do hodowli tkankowej w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 7 godzin i zużyć w ciągu 7 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pożywka hodowlana hiPSC-CM
	<ol>
		<li>Dodać 10 ml suplementu pożywki CM rozmrożonego w temperaturze 4 °C do 500 ml pożywki bazowej CM. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.</li>
		<li>Podać wymaganą ilość pożywki na dzień i doprowadzić do temperatury pokojowej przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pożywka do rozmrażania hiPSC-CM: Przygotować świeżą, mieszając pożywkę hodowlaną hiPSC-CM (krok 1.2) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Doprowadź podłoże do temperatury pokojowej przed rozmrożeniem CM do zawiesiny.</li>
	<li>Fibronektyna 1 mg/ml roztwór podstawowy: Podwielokrotność 200 μl do 1,5 ml sterylnych probówek do mikrofuge i przechowywana w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia. Roztwór roboczy o stężeniu 50 μg/ml przygotować świeżo na lodzie.</li>
	<li>Roztwór czyszczący Multiwell: Połącz 0,5 g detergentu enzymatycznego z 50 ml sterylnej podwójnie destylowanej wody (ddH2O). Wiruj, aby wymieszać zawartość. Przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia.</li>
</ol>
2. Wstępne posiewanie kriokonserwowanego hiPSC-CM do dojrzewania (Rysunek 1)
UWAGA: Ta sekcja jest przeznaczona do rozmrażania i hodowli hiPSC-CM, które zostały zróżnicowane przy użyciu metody monowarstwowej bez zasilania3,16 i kriokonserwowane w ciekłym azocie 10 dni po różnicowaniu przy 1-2 milionach komórek/fiolkę. Komórki z jednej fiolki umieszcza się w dwóch dołkach pokrytych substratem na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Kardiomiocyty mają tendencję do osadzania się na dnie probówki, dlatego delikatne mieszanie w czasie wstępnego powlekania jest ważne dla uzyskania równomiernej gęstości komórek w dołkach.
<ol>
	<li>Podwielokrotność 2 ml FBS na fiolkę hiPSC-CM rozmraża się w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i doprowadza do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Rozmrażaj fiolki z kriokonserwowanymi hiPSC-CM, umieszczając je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i delikatnie obracaj, aby uzyskać równomierne rozmrażanie nie dłużej niż 3 minuty.</li>
	<li>Natychmiast przenieść zawartość fiolki do probówki zawierającej FBS (patrz krok 2.1), mieszać wirując i odwirowywać przy 200 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki do rozmrażania hiPSC-CM (patrz krok 1.3) na rozmrożoną fiolkę. Użyć pipety transferowej, aby ponownie zawiesić osad przez delikatne rozcieranie. Oceń żywotność komórek.</li>
	<li>Dodać dodatkowe 3 ml pożywki do rozmrażania na fiolkę hiPSC-CM rozmrożonego w kroku 2.4 i delikatnie zawiesić za pomocą pipety transferowej, aby jeszcze bardziej zdysocjować grudki komórek.</li>
	<li>Delikatnie dozować 2 ml zawiesiny komórkowej do każdej studzienki 6-dołkowych płytek pokrytych substratem (patrz krok 1.1). Umieścić w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Po 24 godzinach zastąpić nową pożywką do hodowli hiPSC-CM, a następnie 3 razy w tygodniu przez 20 dni. 
	UWAGA: Komórki powinny przylegać do powłoki podłoża przez 24 godziny i bić samoistnie po 48 godzinach po posiewie (patrz Rysunek 1 i Rysunek 2).</li>
</ol>
3. Sterylizacja i powlekanie płytek wielodołkowych MEA (Rysunek 2 i Rysunek 3)
UWAGA: Opisany tutaj protokół służy do przygotowania 24-dołkowych płytek MEA z 12 mikro złotymi elektrodami pokrytymi PEDOT na szkle do powlekania hiPSC-CM. Unikaj dotykania dolnej części płytki, ponieważ może to spowodować uszkodzenie elektrod.
<ol>
	<li>Dwa dni przed posiewem komórek dodać 0,5 ml pożywki hodowlanej hiPSC-CM (patrz krok 1.2) do każdego dołka i przeprowadzić zapis podstawowy w celu sprawdzenia stosunku sygnału do szumu w celu sprawdzenia jakości MEA.</li>
	<li>Odessać pożywkę, spłukać sterylnym ddH2O i wysterylizować w świetle UV w okapie z przepływem laminarnym przez noc.</li>
	<li>Dzień przed posiewem komórek dodaj 0,1 ml FBS do każdej studzienki w celu hydrofilowej obróbki powierzchni MEA. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Ten krok jest niezbędny do podłączenia komórki.</li>
	<li>Odessać FBS i spłukać 0,5 ml sterylnego ddH2O na studzienkę. Powtórz jeszcze raz.</li>
	<li>Pozostaw płytkę do wyschnięcia na noc w okapie z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Przygotować robocze rozcieńczenie 50 μg/ml fibronektyny w zimnym podłożu DMEM/F12 z podstawki (patrz krok 1.4). Utrzymuj roztwór na lodzie.</li>
	<li>Pobrać pipetę z 5 μl roboczego rozcieńczenia fibronektyny (patrz ppkt 3.6) i ostrożnie dozować kroplę do środka każdej studzienki, aby pokryć wszystkie 12 elektrod. Ważne jest, aby pracować szybko w 24 dołkach, aby zapobiec wysychaniu kropli.</li>
	<li>Natychmiast umieść pokrytą fibronektyną wielodołkową płytkę MEA na podniesionej powierzchni wewnątrz komory nawilżającej zawierającej sterylne ddH2O, aby pokryć całą powierzchnię naczynia. Umieścić komorę z wielodołkową płytką MEA na 3 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych. 
	UWAGA: Umieszczenie 24-dołkowej płytki MEA w komorze nawilżającej ma kluczowe znaczenie, aby zapobiec wysychaniu kropelek fibronektyny w okresie inkubacji.</li>
</ol>
4. dysocjacja i posiew hiPSC-CM na płytce Multiwell MEA (Rysunek 3)
UWAGA: Rozpocznij ten krok około 1 godziny przed zakończeniem inkubacji fibronektyny MEA. Upewnij się, że roztwór do dysocjacji komórek ma temperaturę 37 °C, a podłoże do rozmrażania iPSC-CM ma temperaturę pokojową. Metody dysocjacji zostały zoptymalizowane pod kątem 30 dni po zróżnicowanych hiPSC-CM hodowanych na 6-dołkowych płytkach pokrytych podłożem (patrz krok 2) w celu uzyskania około 90% żywotnych CM do posiewu MEA. Należy zachować ostrożność, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza podczas rozcierania, aby zapobiec śmierci komórki.
<ol>
	<li>Odessać pożywkę hodowlaną z każdej studzienki 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej za pomocą 30-dniowej hodowli hiPSC-CM po 30 dniach od różnicowania (patrz krok 2.7) i przemyć 2 ml sterylnego D-PBS na studzienkę.</li>
	<li>Dodać 1 ml wstępnie podgrzanego roztworu do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) do studzienki i inkubować przez 4 minuty w temperaturze 37 °C. Użyć pipety transferowej, aby delikatnie rozcierać w celu rozluźnienia komórek w celu dysocjacji. Jeżeli większość komórek nadal przylega, inkubować przez kolejne 3 minuty w temperaturze 37 °C i ponownie rozcierać. Ta dodatkowa inkubacja powinna pomóc w maksymalnym odzyskaniu komórek. Nie inkubować dłużej niż 7 minut, ponieważ może to spowodować niską żywotność komórek.</li>
	<li>Za pomocą pipety transferowej zbierz wszystkie zdysocjowane komórki w stożkowej probówce zawierającej pożywkę do rozmrażania hiPSC-CM (patrz krok 1.3). Zaleca się zawieszenie komórek w co najmniej dwukrotnie większej objętości pożywki (2 ml na pobrany studzienek) w celu zablokowania aktywności roztworu dysocjacji komórek.</li>
	<li>Wirować przy 200 x g przez 5 min.</li>
	<li>Ostrożnie odessać roztwór, ponieważ osad jest luźno przylegający do powierzchni i ponownie zamieszać w 0,1 ml pożywki do rozmrażania hiPSC-CM. Za pomocą pipety transferowej kilkakrotnie zawiesić osad przez delikatne rozcieranie.</li>
	<li>Podamy 2 μl zdysocjowanych komórek i rozcieńczyć 18 μl pożywki w probówce do mikrofuge o pojemności 1,5 ml. Dodać 20 μl błękitu trypanowego i wymieszać w celu oceny liczby komórek i żywotności.</li>
	<li>Dostosuj gęstość komórek do 6 000 komórek/μl, dodając odpowiednią objętość pożywki do rozmrażania hiPSC-CM. Zawieś pellet, delikatnie przesuwając kilka razy. HiPSC-CM łatwo odklejają się od powierzchni szklanych, zwłaszcza gdy są powlekane o dużej gęstości. Zoptymalizowaliśmy gęstość wysiewu i warunki poszycia, aby uzyskać 15 dni nagrań elektrycznych.</li>
	<li>Gdy będzie gotowa, przenieś wielodołkową płytkę MEA do okapu z przepływem laminarnym w celu wysiewu komórek. Bardzo ważne jest, aby wykonać następujące dwa kroki pojedynczo, aby zapobiec wysuszeniu fibronektyny.
	<ol>
		<li>Ostrożnie usuń kroplę fibronektyny za pomocą pipety P10, nie dotykając elektrod.</li>
		<li>Natychmiast dozuj kroplę ogniwa o pojemności 5 μl (30 000 komórek) do środka dołka płytki MEA, obejmującej wszystkie 12 elektrod. Powtarzaj ten krok, aż wszystkie 24 dołki zostaną pokryte. Zaleca się przerywane mieszanie zawiesiny komórkowej przez trzepanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić wielodołkową płytkę MEA z powrotem w luźno przykrytej komorze nawilżania i wrócić do inkubatora do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 3 godziny w celu przyłączenia komórek.</li>
	<li>Ostrożnie dodać 200 μl pożywki do rozmrażania hiPSC-CM do każdego dołka, nie naruszając komórek, za pomocą pipety P200. Dodaj pożywkę kroplami z boku studzienki.</li>
	<li>Umieścić wielodołkową płytkę MEA z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Zastąp świeżą pożywką hodowlaną hiPSC-CM po 24 godzinach od posiewu. W tym momencie można zaobserwować spontaniczne bicie kardiomiocytów (patrz wideo 3).</li>
	<li>Zmieniaj podłoże co 2 dni, aż do końca eksperymentów.</li>
</ol>
5. Elektroporacja hiPSC-CM i akwizycja sygnału (Rysunki 4 – 6)
UWAGA: Ten protokół służy do jednoczesnego rejestrowania sygnałów elektrod o wysokiej przepustowości (12 miejsc dla każdej z 24 studni). 24-dołkowy system wielodołkowy MEA jest używany z oprogramowaniem do akwizycji (patrz Tabela materiałów). Wszystkie zapisy MEA prowadzone są w temperaturze 37 °C.
<ol>
	<li>Włącz kartę interfejsu i uruchom oprogramowanie do akwizycji. Poczekaj, aż wielostudzienkowy stopień główny MEA osiągnie temperaturę 37 °C (patrz strzałka nr 1 w <silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
	<li>Włóż wielodołkową płytkę MEA z kroku 4 do wielodołkowej płyty czołowej MEA, umieszczając ją przykrytą nad platformą nagrywającą i kliknij przycisk Wstaw (patrz strzałka nr 2 w <silna klasa="xfig">Rysunek 4). Poczekaj, aż temperatura się ustabilizuje przed rozpoczęciem nagrywania.</li>
	<li>Dostosuj ustawienia akwizycji i elektroporacji
	<ol>
		<li>Kliknij ikonę Define Experimental Flow (patrz strzałka nr 3 w Rysunek 4) i ustaw czas nagrywania na 2 minuty lub według potrzeb.</li>
		<li>Kliknij ikonę Data Acquisition Setup (patrz strzałka nr 4 w Rysunek 4) i ustaw częstotliwość próbkowania na 20 kHz, filtr górnoprzepustowy na 0,1 Hz, a filtr dolnoprzepustowy na 3500 Hz.</li>
		<li>Kliknij ikonę Ustawienia stymulatora (patrz Rysunek 5). W zakładce Definicja bodźca zdefiniuj stymulację jako dwufazowe symetryczne impulsy napięcia o napięciu 1 mV, 1 ms i 1 Hz. W zakładce Elektrody stymulacyjne wybierz miejsca elektroporacji, podświetlając wszystkie odpowiednie elektrody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kliknij przycisk Eksploruj, aby wyświetlić sygnały we wszystkich studzienkach. Sprawdź jakość sygnału i warunki stanu ustalonego. Rób notatki na elektrodach z sygnałami FP w zakresie mV. Kliknij ten sam przycisk, aby zatrzymać eksplorację. Do tej pory nie zarejestrowano żadnych danych.</li>
	<li>Rozpocznij nagrywanie, klikając przycisk Go!. Elektrody w każdej studzience będą pokazywać sygnały FP w oknie surowych danych (<silna klasa="xfig">Rysunek 6). Po 30 s nagrania kliknij przycisk Stymuluj i pozwól, aby elektroporacja odbywała się w wybranych miejscach przez 30 s; Następnie kliknij ten sam przycisk, aby zatrzymać stymulację i kontynuować nagrywanie przez pozostałe 60 S. 
	UWAGA: Nagrany plik można odtworzyć, przełączając się na "Tryb odtwarzacza" w menu rozwijanym "Aplikacja".</li>
</ol>
6. Czyszczenie płytek wielodołkowych MEA do ponownego użycia
<ol>
	<li>Po końcowych eksperymentach wyczyść wszystkie dołki w płytce wielodołkowej, odsysając całą zawartość pożywki z każdej studzienki i ostrożnie unikając dotykania powierzchni elektrody.</li>
	<li>Dodać 1 ml sterylnego ddH2O do każdego dołka. Zassać i powtórzyć raz.</li>
	<li>Dodać 0,3 ml wielodołkowego roztworu czyszczącego (patrz krok 1.5) do studzienki. Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej, aby usunąć komórki i zanieczyszczenia.</li>
	<li>Następnego ranka odessać roztwór i spłukać 1 ml jałowego ddH2O. Inkubować przez 5 - 7 minut i aspirować. Powtórz 5 razy.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml sterylnego ddH2O do dołka. Zapisz linię bazową oczyszczonej płytki wielodołkowej w celu sprawdzenia jakości oczyszczonych MEA (<silna klasa="xfig">Rysunek 7).</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do użycia.</li>
</ol>
7. Konwersja i eksport plików danych
UWAGA: Dla każdego nagrania zostaną wygenerowane cztery pliki danych: pliki MWR, MWC, MWD i MWS. Za pomocą oprogramowania konwertującego plik MWD można przekonwertować na plik H5 w celu późniejszej analizy za pomocą niestandardowego skryptu (patrz Plik uzupełniający 1).
<ol>
	<li>Uruchom oprogramowanie konwertera (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Wybierz opcję Ustaw ścieżkę wejściową z menu Plik. Wybierz folder zawierający interesujące Cię pliki danych.</li>
	<li>Wybierz opcję Ustaw ścieżkę wyjściową z menu Plik. Wybierz folder, w którym mają zostać zapisane przekonwertowane pliki.</li>
	<li>Zaznacz interesujący Cię plik MWD.</li>
	<li>Kliknij przycisk EKSPORTUJ do HDF5.</li>
</ol>
8. Segmentacja i analiza danych (Rysunki 8-10)
UWAGA: Niestandardowe oprogramowanie oparte na Matlabie służy do segmentacji i wyodrębniania różnych parametrów danych FP i AP. Oprogramowanie jest dostępne na żądanie.
<ol>
	<li>Uruchom kod Waveform Analysis za pomocą Matlaba (zobacz Rysunek 8, aby zobaczyć widok głównego okna GUI).</li>
	<li>Kliknij Plik i wybierz Proces .h5.</li>
	<li>Znajdź i wybierz plik mwd.h5 utworzony zgodnie z krokiem 7 powyżej.</li>
	<li>Kliknij przycisk Zapisz katalog, aby zmienić lokalizację przechowywania plików wyjściowych.</li>
	<li>Utwórz kolejkę przetwarzania sygnału, wybierając interesujące kombinacje elektrod/studzienek, a następnie klikając przycisk Kolejka. Powtórz ten krok, aby dodać więcej kombinacji elektroda/studzienka do przetworzenia do kolejki.</li>
	<li>Edytuj kolejkę, klikając bezpośrednio na Nazwa Med / Stężenie Med, jeśli komórki były leczone lekami (Rysunek 8).</li>
	<li>Gdy kolejka jest ostateczna, kliknij przycisk Initialize Waveforms (Zainicjuj przebiegi). Spowoduje to rozpoczęcie wstępnego przetwarzania, w którym sygnały są identyfikowane i wyodrębniane w celu segmentacji.</li>
	<li>Kliknij przycisk Powiększ i wybierz kursorem obszar potencjalnego działania (Rysunek 9).</li>
	<li>Kliknij przycisk Zachowaj i przejrzyj panele. Szczyty (czerwony 'x') i dołki (żółte kółka) są wykrywane dla każdego kształtu fali, a znormalizowane potencjały czynnościowe są nakładane na siebie. Kliknij przycisk Keep i przejdź do następnego śladu w kolejce (Rysunek 10).</li>
	<li>Powtórz kroki 8.8-8.9 dla pozostałych sygnałów kombinacji elektroda/studzienka w kolejce. 
	UWAGA: Zostanie wygenerowany plik .csv z parametrami APD zmierzonymi dla każdego przebiegu. Plik .mat dla każdego pliku .h5 jest również zapisywany, aby umożliwić dodatkowe przetwarzanie danych podzielonych na segmenty.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Z biegiem lat zastosowanie MEA ograniczało się do przeprowadzania pomiarów FP komórek pobudliwych w celu zbadania ich właściwości elektrofizjologicznych 36,37,38,39. Tylko kilka grup zgłosiło ślady AP z ogniw elektrogenicznych przy użyciu niestandardowej technologii opartej na MEA 18,29,30. Podejścia te nie zostały jednak zbadane w przypadku powtarzających się nagrań z tych samych preparatów. Opracowaliśmy innowacyjną i dokładną metodologię badania punktów dostępowych z tej samej lokalizacji komórkowej przez kilka dni w wielu sieciach hiPSC-CMjednocześnie 3. W opublikowanym przez nas badaniu wykorzystano wielodołkową platformę MEA z mikro-złotem do generowania bibliotek przebiegów AP z wielu partii kultur hiPSC-CM z dużą precyzją i rozdzielczością czasową 1 μs. Opisany tutaj protokół wyjaśnia rozsiewanie hiPSC-CM w macierzy w celu efektywnego rozwoju syncytialnych sieci CM dla wysokoprzepustowych nagrań AP. Kilka krytycznych etapów protokołu to: 1) produkcja wielu partii CM o wysokiej czystości o kontrolowanej jakości do kriokonserwacji, 2) wysoce opłacalne CM po rozmrożeniu do wstępnego powlekania i dojrzewania, 3) obróbka wielodołkowej płytki MEA do wysiewu CM, 4) dysocjacja kultur hiPSC-CM po 30 dniach od różnicowania w celu posiewu MEA oraz 5) przywrócenie MEA do wielokrotnego ponownego użycia.
Ważne jest, aby pamiętać, że różnice w różnicowaniu hiPSC między partiami mogą wpływać na wyniki eksperymentalne. Jednowarstwowa metoda różnicowania została zoptymalizowana wewnętrznie pod kątem wysokiego procentu produkcji kardiomiocytów 3,40. Analiza FACS markerów MLC2v i TNNT2 naszych kultur wykazuje ≥90% podobny do komorowego fenotypu3. Te kultury o kontrolowanej jakości są kriokonserwowane do badań eksperymentalnych. Obecne podejścia różnicowania dają niejednorodną mieszaninę komórek węzłowych, przedsionkowych i komorowych 3,16,17,41. W związku z tym strategie stosowane w celu wzbogacenia populacji podtypów CM mogą jeszcze bardziej poprawić specyficzność kultur. Ponadto można zastosować podejścia inżynierii tkankowej w celu przyspieszenia ich dojrzewania. Proponowane tutaj metody można łatwo wdrożyć w odniesieniu do innych źródeł syntezy zdolności wytwórczych.
Przebiegi AP zarejestrowane za pomocą MEA były podobne do tych zarejestrowanych z sieci kardiomiocytów za pomocą mapowania optycznego42,43, komplementarnego MEA opartego na półprzewodnikach tlenku metalu18,21 i symulowanego AP za pomocą zapisów FP20. Aby zająć się mechanizmem pomiarów AP za pomocą MEA, Hai i Spira,25 wykazało, że interfejs elektropore-elektroda naśladuje sprawdzoną technikę mikroelektrod z ostrego szkła. Jednak spoczynkowy potencjał błonowy i rzeczywiste wartości amplitudy w naszym badaniu nie mogą być ustalone, biorąc pod uwagę, że granica faz elektroporę-elektroda w systemach MEA nie jest skalibrowana, a amplituda jest funkcją czułości i rozdzielczości techniki. Nasze podejście ma podobne ograniczenia jak mapowanie optyczne, jeśli chodzi o amplitudę AP.
Odczyty FP/AP oparte na wielu dołkach MEA, o których mowa tutaj, otwierają nowe możliwości oceny bezpieczeństwa leków. Chociaż spontaniczne, te monowarstwy hiPSC-CM biją w stałym tempie. Analiza parametrów APD w wielu sieciach dostarcza informacji na temat niejednorodności elektrycznej (rysunek 13). Jednak kompleksowe analizy restytucji APD muszą uwzględniać wcześniejsze interwały rozkurczowe. Co więcej, wysokiej jakości przebiegi AP zarejestrowane z tego samego miejsca w komórce przez 96 godzin (ryc. 11B) są pierwszym raportem śledzącym elektrodynamikę błony w czasie, co będzie przydatne w rozwoju i chorobie.
Opisany tutaj protokół do ilościowego określania parametrów AP może być wykorzystany do generowania krzywych dawka-odpowiedź w celu badania związków. Jak niedawno donieśli Edwards i wsp.3, odpowiedź na dawkę noradrenaliny, izoproterenolu i E 4031 jest wykreślona dla APD w różnych fazach repolaryzacji. Opublikowane badanie wykazało dokładność i niezawodność podejścia do identyfikacji zależnych od dawki subtelnych zmian w przebiegach AP w czasie rzeczywistym. Technikę tę można łatwo rozszerzyć na inne związki lub biblioteki małych cząsteczek w celu zrozumienia różnych reakcji elektrofizjologicznych.
Podejście oparte na MEA do pomiarów AP przedstawione w tym badaniu będzie interesujące nie tylko dla elektrofizjologów, ale także dla biologów komórkowych i osób zajmujących się modelowaniem in silico . Co więcej, nagrania FP/AP z tego samego miejsca w komórce hiPSC-CM umożliwią naukowcom wygenerowanie bibliotek danych bioelektrycznych szerokiej gamy pobudliwych sieci komórkowych w krótkim czasie. Dostępność tych zasobów będzie cenna dla odkrywania leków i modelowania chorób.

Ludzkie pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) są złotym standardem dla coraz większej liczby laboratoriów1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Pokonywanie ciał embrionalnych11,12,13 i monolayer3,7,10,11,12,13,14,15,16,17 preferowaną metodą produkcji kardiomiocytów jest różnicowanie, a matryca wieloelektrodowa (MEA) stała się powszechnym sposobem monitorowania elektrodynamiki tych sieci18,19,20. Podczas gdy parametry, które można wyodrębnić z potencjałów pola (FP), takie jak szybkość dudnienia, amplituda, czas trwania i interwały RR, są podstawowymi reakcjami elektrofizjologicznymi spontanicznie bijących monowarstw18,21,22,23, składowe potencjału czynnościowego (AP) leżące u podstaw tych zewnątrzkomórkowych sygnałów FP są trudne do ekstrapolacji24. Nasza niedawna publikacja na temat odkrycia zastosowania MEA do bezpośrednich powtarzających się pomiarów AP stanowi dowód metodologii dla przykładowych wewnątrzkomórkowych odczytów AP z obszerną analizą kształtu fali w różnych fazach repolaryzacji w wielu partiach sieci kardiomiocytów pochodzących z hiPSC3. W badaniu wykazaliśmy, że dostarczanie impulsów elektroporacyjnych do sieci kardiomiocytów pochodzących z hiPSC umożliwia wewnątrzkomórkowy dostęp do zapisów AP. Te przejściowe nagrania AP są zależne od odzyskiwania potencjału transbłonowego obserwowanego przez miejsce urazu3,25,26. Przebiegi zarejestrowane przez MEA i patch-clamp w naszym badaniu wykazały podobne morfologie AP, potwierdzając w ten sposób niezawodność podejścia3.
Kilka laboratoriów zgłosiło pomiary punktów dostępowych z różnych ogniw elektrogenicznych za pomocą specjalnie zbudowanych MEAs18,21,26,27,28,29,30, ale nie oceniono wiarygodności stosowania MEA do spójnych i powtarzających się pomiarów AP. Obecnie złoty standard techniki patch-clamp jest ograniczony do nagrań terminalowych7,31, podczas gdy pomiary AP oparte na MEA są przejściowe i dlatego mogą być przeprowadzane wiele razy na tej samej komórce. Pokazujemy również, że można łatwo nagrywać wysokiej jakości sygnały AP w zakresie miliwoltów, wymagające minimalnego filtrowania. Naukowcy mogą zatem prowadzić nie tylko badania nad ostrymi, ale także przewlekłymi lekami w tych samych preparatach za pomocą MEA. Dodatkowo technologia ta pozwala na jednoczesny pomiar FP/AP generujący biblioteki elektrobiomów w krótkim czasie. Biorąc pod uwagę rosnący nacisk na przewidywanie arytmii i kardiotoksyczności związanej z lekami24,32,33,34,35, integracja podejść do pomiaru AP poprawi ocenę bezpieczeństwa i skuteczności leków.
Tutaj prezentujemy protokoły do: 1) wstępnego powlekania kriokonserwowanych hiPSC-CM do dojrzewania, 2) dysocjacji i powlekania hiPSC-CM na wielodołkowych MEA, 3) nagrywania FP i AP z sieci hiPSC-CM, 4) segmentacji i ekstrakcji danych do analizy, oraz 5) przywracania tablic do wielokrotnego wykorzystania. Każdy krok został zoptymalizowany, kładąc nacisk na kluczowe kroki tam, gdzie jest to istotne. Omówiono wymagania dotyczące przyłączania komórek w celu zapewnienia bijącej monowarstwy syncytialnej oraz wyjaśniono procedury wielodołkowej odbudowy MEA w powtarzających się badaniach elektrofizjologicznych. Na koniec zaprezentowano niestandardowy graficzny interfejs użytkownika opracowany w laboratorium do ekstrakcji sygnału AP, zapewnienia jakości i przepływu pracy segmentacji w celu ilościowego określenia i analizy parametrów AP.

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>Aldrich A6964-100ML</td><td>roztwór do dysocjacji komórek</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji</td><td>Systemy wielokanałowe</td><td>Multiwell-Screen v 1.9.2.0</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplement</td><td>ThermoFisher</td><td>17504-044</td><td>CM</td></tr><tr><td>Dodatek do mediów Oprogramowanie konwertera</td><td>Systemy wielokanałowe</td><td>MultiChannel DataManager</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007103HI</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>ThermoFisher</td><td>A1413202</td><td>podłoże powłokowe</td></tr><tr><td>Płyta interfejsu Systemy</td><td>wielokanałowe</td><td>Interfejs Multiboot MCS-IFB 3.0 Płyta</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell MEA Plate</td><td>Multichannel Systems</td><td>24W300/30G-288</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>ThermoFisher</td><td>11875-093</td><td>CM podłoże bazowe</td></tr><tr><td>Terg-a-zyme</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z273287-1EA</td><td>detergent enzymatyczny</td></tr><tr><td>Pipety transferowe, pakowane pojedynczo</td><td>Fisher Scientific</td><td>1371148</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Ultraczysta sterylna woda</td><td>ThermoFisher</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki poddane kulturom tkankowym</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr></tbody></table>

sieci kardiomiocytów pochodzące z ludzkich ipsc na wielodołkowych układach mikroelektrod do powtarzalnych zapisów potencjału czynnościowego

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

Badania przesiewowe bezpieczeństwa serca mają ogromne znaczenie dla odkrywania leków i terapii. W związku z tym opracowanie nowatorskich, wysokoprzepustowych metod elektrofizjologicznych do wytwarzania preparatów kardiomiocytów pochodzących z hiPSC (hiPSC-CM) jest bardzo potrzebne do skutecznego testowania leków. Chociaż matryce wieloelektrodowe (MEA) są często stosowane do pomiarów potencjału pola komórek pobudliwych, niedawna publikacja Joshi-Mukherjee i współpracowników opisała i potwierdziła jej zastosowanie do zapisów rekurencyjnego potencjału czynnościowego (AP) z tego samego preparatu hiPSC-CM w ciągu kilku dni. Celem jest przedstawienie szczegółowych metod krok po kroku do zasiewania CM i pomiaru przebiegów AP za pomocą elektroporacji z dużą precyzją i rozdzielczością czasową 1 μs. Podejście to rozwiązuje problem braku łatwej w użyciu metodologii umożliwiającej uzyskanie dostępu wewnątrzkomórkowego do wysokoprzepustowych pomiarów AP w celu przeprowadzenia wiarygodnych badań elektrofizjologicznych. Omówiono szczegółowy przebieg pracy i metody powlekania hiPSC-CM na wielodołkowych płytkach MEA, kładąc nacisk na kluczowe etapy tam, gdzie jest to istotne. Ponadto raportowany jest niestandardowy skrypt MATLAB do szybkiej obsługi, ekstrakcji i analizy danych w celu kompleksowego zbadania analizy kształtu fali w celu ilościowego określenia subtelnych różnic w morfologii dla różnych parametrów czasu trwania AP związanych z arytmią i kardiotoksycznością.

Ten artykuł zawiera zestaw protokołów do rozwoju ludzkich sieci indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-CM) hodowanych na wielodołkowych płytkach MEA w celu odwracalnego elektroportowania błony komórkowej do pomiarów potencjału czynnościowego. Nagrania o wysokiej przepustowości są uzyskiwane z tych samych lokalizacji komórkowych wielokrotnie przez kilka dni.

Sieci kardiomiocytów pochodzące z ludzkich iPSC na wielodołkowych układach mikroelektrod do powtarzalnych zapisów potencjału czynnościowego

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Poniższy protokół opisuje rozwój indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych sieci kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych na wielodołkowych płytkach MEA w celu odwracalnego elektroporowania błon komórkowych w celu pomiaru potencjału czynnościowego. Parametry potencjału czynnościowego można następnie wykorzystać do wygenerowania tych krzywych odpowiedzi w celu przetestowania związków do elektrofizjologii. Kodowanie MEA w wielu dołkach i powlekanie komórek to najtrudniejsze etapy, które wymagają szczególnej uwagi.Czynności te należy wykonywać sumiennie i szybko, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się i wysychaniu kropel. Przy odrobinie wprawy można to łatwo przezwyciężyć. Opracowaliśmy niestandardowy graficzny interfejs użytkownika do pojedynczej segmentacji, zapewnienia jakości i ekstrakcji parametrów.Nasz solidny przepływ pracy MATLAB został wdrożony w celu szybkiej redukcji dużych ilości surowych danych eksperymentalnych w bezstronne grupowanie przebiegów potencjału czynnościowego. Zacznij od rozmrożenia indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Delikatnie zawiesić komórki za pomocą pipety transferowej, aby zdysocjować grudki komórek.Następnie ostrożnie dozuj dwa mililitry zawiesiny komórkowej do każdej studzienki sześciodołkowej płytki pokrytej substratem i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Komórki powinny przylegać do kanałów żelu przez 24 godziny i bić spontanicznie po 48 godzinach od posiania. Dwa dni przed posiewem dodaj 0,5 mililitra pożywki hodowlanej ludzkich kardiomiocytów iPSC do każdej studzienki 24-dołkowej matrycy wieloelektrodowej lub płytki MEA i wykonaj zapis podstawowy w celu sprawdzenia stosunku sygnału do szumu jako kontroli jakości MEA.Następnie odessać pożywkę, przepłukać studzienki sterylną wodą i wysterylizować przez noc pod światłem UV w okapie z przepływem laminarnym. Następnego dnia dodaj 0,1 mililitra FBS do każdej studzienki w celu hydrofilowej obróbki powierzchni MEA i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie odessać FBS i przepłukać każdą studzienkę dwukrotnie 0,5 mililitra sterylnej wody.Pozostaw płytkę do wyschnięcia na noc w okapie z przepływem laminarnym. Następnego dnia odpipetuj pięć mikrolitrów roboczego rozcieńczenia fibronektyny i ostrożnie dozuj kroplę na środku każdej studzienki, aby pokryć wszystkie 12 elektrod. Natychmiast umieść talerz na podniesionej powierzchni w komorze nawilżającej zawierającej wystarczającą ilość sterylnej wody, aby pokryć całą powierzchnię naczynia.Umieść komorę z płytką w inkubatorze do hodowli komórkowych na trzy godziny, a następnie przystąp do posiewu komórek. Gdy będziesz gotowy do płytki kardiomiocytów, dostosuj gęstość komórek do 6 000 komórek na mikrolitr, rozcieńczając je w ludzkim pożywce do rozmrażania kardiomiocytów iPSC. Delikatnie przesuwaj, aby zapobiec osadzaniu się komórek.Umieść płytkę MEA w okapie z przepływem laminarnym i ostrożnie usuń kroplę fibronektyny za pomocą pipety P10, nie dotykając elektrod. Natychmiast dozuj kroplę ogniwa o pojemności pięciu mikrolitrów do środka studzienki, upewniając się, że pokryła wszystkie 12 elektrod. Rób to dobrze na raz, aby zapobiec wysuszeniu fibronektyny.Po zakończeniu powlekania umieść płytkę MEA z powrotem w luźno zakrytej komorze nawilżania i włóż ją z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych na trzy godziny. Po inkubacji użyj pipety P200, aby ostrożnie dodać 200 mikrolitrów ludzkiego podłoża do rozmrażania kardiomiocytów iPSC do każdego dołka bez naruszania komórek. Umieścić płytkę MEA z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych i wymienić pożywkę 24 godziny po posianiu.Gdy będziesz gotowy do uzyskania sygnału z kardiomiocytów, uruchom oprogramowanie do akwizycji i włóż płytkę MEA zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Kliknij przycisk Eksploruj, aby zobrazować sygnał we wszystkich studzienkach i zweryfikować jakość sygnału w warunkach stanu ustalonego. Rób notatki na elektrodach z sygnałami potencjału pola lub FP w zakresie miliwoltów.Następnie kliknij ten sam przycisk, aby zatrzymać eksplorację. Do tej pory nie zarejestrowano żadnych danych. Kliknij przycisk Przejdź, aby rozpocząć nagrywanie.Elektrody w każdej studzience będą pokazywać sygnały FP w oknie surowych danych. Po 30 sekundach nagrywania kliknij przycisk Stymuluj i pozwól, aby elektroporacja odbywała się w wybranych miejscach przez 30 sekund. Następnie kliknij ten sam przycisk, aby zatrzymać symulację i kontynuować nagrywanie przez 60 sekund.Użyj niestandardowego oprogramowania opartego na MATLAB, aby segmentować i wyodrębniać różne parametry danych potencjału pola i potencjału działania. Najpierw uruchom kod analizy przebiegu i kliknij Plik i wybierz Process.h5. Znajdź i wybierz wcześniej utworzony mwd.Plik h5. Kliknij przycisk Zapisz katalog, aby zmienić lokalizację przechowywania plików wyjściowych. Następnie utwórz kolejkę przetwarzania sygnału, wybierając interesujące Cię kombinacje elektrod i studzienek, a następnie klikając przycisk Kolejka.Powtórz ten krok, aby dodać więcej kombinacji elektrod i studzienek do kolejki. Jeśli komórki były leczone lekami, kolejkę można edytować, klikając bezpośrednio na Nazwa Med, Stężenie Med. Po sfinalizowaniu kolejki kliknij przycisk Zainicjuj przebiegi, który rozpocznie wstępne przetwarzanie, w którym sygnały są identyfikowane i wyodrębniane w celu segmentacji.Po zakończeniu przetwarzania kliknij przycisk Powiększ i wybierz obszar zainteresowania potencjału czynnościowego lub AP. Kliknij przycisk Zachowaj i przejrzyj panele. Szczyty i dołki są wykrywane dla każdego kształtu fali, a znormalizowane AP są nakładane na siebie.Po zakończeniu kliknij przycisk Zachowaj, aby przejść do następnego śladu w kolejce i powtórz proces dla pozostałych sygnałów kombinacji elektrody i studzienki. Żywotność i gęstość posiewu kardiomiocytów po rozmrożeniu ma kluczowe znaczenie dla wielodołkowej hodowli MEA. Prawidłowe posiewy skutkują zdrową hodowlą jednowarstwową ze spontanicznym biczowaniem po 48 godzinach, podczas gdy słaba żywotność komórek skutkuje hodowlami o wysokim odsetku populacji niebędących miocytami.Dyspersja kropelek komórek wpływa na gęstość hodowli, a nawet może prowadzić do śmierci komórki, dlatego ważne jest precyzyjne rozmieszczenie komórek. Komórki hodowane na MEA są poddawane kontroli jakości pod kątem aktywności elektrycznej 48 godzin po posiewie. Jeśli 50% elektrod w sieci i 70% wszystkich sieci nie wytwarza sygnałów FP, oznacza to, że hodowla jest nieoptymalna.Nagrania AP za pośrednictwem elektroporacji można uzyskać wielokrotnie 48 godzin po posiewie MEA. Wielokrotne elektroporacje tego samego miejsca ogniwa po zero, 24, 48, 72 i 96 godzinach nie mają znaczącego wpływu na kształt AP w czasie. Ponadto nie zaobserwowano korelacji między amplitudami AP FP i AP po elektroporacji z tego samego miejsca ogniwa.Istotną zaletą tej metody jest to, że wielodołkowa płytka MEA może być wielokrotnie używana. Aby zademonstrować niezawodność tej macierzy, 3 815 przebiegów AP są pobierane z trzech partii przywracania, a następnie wyodrębniane są dane dotyczące czasu trwania AP w celu zbadania powtarzalności wyników. W razie zainteresowania możliwe jest wykonanie dodatkowych testów, takich jak ekspresja genów, pomiary stanów przejściowych wapnia i zacisk krosowy w celu zbadania zachowania określonych prądów jonowych.Technika ta toruje naukowcom drogę do poprawy dojrzewania elektrofizjologicznego, a także do badania przesiewowego przewlekłego wpływu dawki na kardiomiocyty.

human-ipsc-derived-cardiomyocyte-networks-on-multiwell-micro

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wideo pokazuje, jak używać zestawu mikroelektrod (MEA) do rejestrowania aktywności elektrofizjologicznej neuronów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC). Aktywność elektrofizjologiczna z wielodołkowego MEA zawierającego kokulturę neuronów i astrocytów jest rejestrowana w celu wykrycia potencjałów czynnościowych z wielu neuronów w sieci, potwierdzając pomyślne różnicowanie hiPSC w neurony.

Pomiar aktywności elektrofizjologicznej sieci neuronalnych za pomocą układów mikroelektrod

Modyfikujemy i wdrażamy wcześniej opublikowany protokół opisujący szybkie, powtarzalne i efektywne różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) w pobudzające neurony korowe12. W szczególności nasza modyfikacja pozwala na kontrolę gęstości komórek neuronalnych i wykorzystanie ich na układach mikroelektrod do pomiaru właściwości elektrofizjologicznych na poziomie sieci.

Szybkie różnicowanie neuronalne indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do pomiaru aktywności sieci na układach mikroelektrod

Elektrofizjologiczna charakterystyka kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CMs) jest kluczowa dla modelowania chorób serca i określania odpowiedzi na leki. Protokół ten dostarcza informacji niezbędnych do dysocjacji i płytki hPSC-CM na matrycach wieloelektrodowych, pomiaru ich potencjału pola oraz metody analizy odstępów QT i RR.

Analiza elektrofizjologiczna ludzkich kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CM) przy użyciu macierzy wieloelektrodowych (MEA)

Tutaj prezentujemy metodę optycznego obrazowania potencjałów czynnościowych, szczególnie w indukowanych komorowo indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych. Metoda opiera się na sterowanej przez promotor ekspresji wrażliwego na napięcie białka fluorescencyjnego.

Specyficzne dla podtypu zapisy optycznego potencjału czynnościowego w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach komorowych pochodzących z komórek macierzystych

Tutaj opisujemy optyczne pozyskiwanie i charakterystykę potencjałów czynnościowych z indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych za pomocą szybkiego modułowego systemu fotometrycznego.

Pomiar potencjału czynnościowego optycznego pojedynczej komórki w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) okazały się obiecującym modelem in vitro do badań przesiewowych kardiotoksyczności indukowanej lekami i modelowania chorób. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół pomiaru kurczliwości i elektrofizjologii hiPSC-CM.

Techniczne zastosowania nagrań matrycy mikroelektrod i patch clamp na indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Analiza zmian w funkcji skurczowej i integralności komórkowej ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC ma ogromne znaczenie dla nieklinicznego rozwoju leków. Hybrydowy system analizy komórek z 96 dołkami analizuje oba parametry w czasie rzeczywistym i w sposób fizjologiczny, zapewniając wiarygodne wyniki istotne dla człowieka, niezbędne do bezpiecznego przejścia do etapów klinicznych.

Hybrydowy system analizy komórek do oceny zmian strukturalnych i kurczliwych ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC do przedklinicznej oceny ryzyka kardiologicznego

Kombinacja poracji laserowej i matryc mikroelektrod (MEA) pozwala na rejestrację kardiomiocytów z hodowanych pierwotnych i pochodzących z komórek macierzystych zapisów podobny do potencjału czynnościowego. Kształt fali zapewnia lepszy wgląd w sposób działania badanych związków niż standardowe nagrania. Łączy on patch-clamp i odczyt MEA, aby jeszcze bardziej zoptymalizować badania nad bezpieczeństwem kardiologicznym w przyszłości.

Indukowane laserowo pomiary potencjału czynnościowego kardiomiocytów na układach mikroelektrod w celu zwiększenia predykcyjności bezpieczeństwa farmakologii

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) stanowią alternatywę dla wykorzystywania zwierząt do przedklinicznych badań przesiewowych kardiotoksyczności. Ograniczeniem dla powszechnego stosowania hiPSC-CM w przedklinicznych badaniach przesiewowych toksyczności jest niedojrzały, podobny do płodu fenotyp komórek. Poniżej przedstawiono protokoły solidnego i szybkiego dojrzewania hiPSC-CM.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe kardiotoksyczności z wykorzystaniem dojrzałych, indukowanych przez człowieka monowarstw kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj używamy HD-MEA, aby zagłębić się w dynamikę obliczeniową dużych zespołów neuronalnych, szczególnie w hipokampie, obwodach opuszki węchowej i ludzkich sieciach neuronowych. Uchwycenie aktywności czasoprzestrzennej w połączeniu z narzędziami obliczeniowymi zapewnia wgląd w złożoność zespołu neuronalnego. Metoda ta pomaga lepiej zrozumieć funkcje mózgu, potencjalnie identyfikując biomarkery i metody leczenia zaburzeń neurologicznych.

Rejestrowanie i analizowanie multimodalnej dynamiki zespołów neuronalnych na zintegrowanej z CMOS matrycy mikroelektrod o dużej gęstości

Ten protokół ma na celu stabilne umieszczanie grzbietowo-brzusznych zrośniętych asembloidów na wieloelektrodowych układach do modelowania padaczki in vitro.

Wieloelektrodowa platforma matrycowa do modelowania padaczki przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych zespołów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Odkryj metodę analizy sieci kardiomiocytów pochodzących z ludzkich iPSC na wielodołkowych układach mikroelektrod z wykorzystaniem odwracalnej elektroporacji i niestandardowego przepływu pracy MATLAB.

Sieci kardiomiocytów pochodzące z ludzkich iPSC na wielodołkowych układach mikroelektrod do powtarzalnych zapisów potencjału czynnościowego (Wideo) | JoVE Journal

Sieci kardiomiocytów pochodzące z ludzkich iPSC na wielodołkowych układach mikroelektrod do powtarzalnych zapisów potencjału czynnościowego

Przeglądaj więcej filmów