Sieci kardiomiocytów pochodzące z ludzkich iPSC na wielodołkowych układach mikroelektrod do powtarzalnych zapisów potencjału czynnościowego

Poniższy protokół opisuje rozwój indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych sieci kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych na wielodołkowych płytkach MEA w celu odwracalnego elektroporowania błon komórkowych w celu pomiaru potencjału czynnościowego. Parametry potencjału czynnościowego można następnie wykorzystać do wygenerowania tych krzywych odpowiedzi w celu przetestowania związków do elektrofizjologii. Kodowanie MEA w wielu dołkach i powlekanie komórek to najtrudniejsze etapy, które wymagają szczególnej uwagi.

Czynności te należy wykonywać sumiennie i szybko, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się i wysychaniu kropel. Przy odrobinie wprawy można to łatwo przezwyciężyć. Opracowaliśmy niestandardowy graficzny interfejs użytkownika do pojedynczej segmentacji, zapewnienia jakości i ekstrakcji parametrów.

Nasz solidny przepływ pracy MATLAB został wdrożony w celu szybkiej redukcji dużych ilości surowych danych eksperymentalnych w bezstronne grupowanie przebiegów potencjału czynnościowego. Zacznij od rozmrożenia indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Delikatnie zawiesić komórki za pomocą pipety transferowej, aby zdysocjować grudki komórek.

Następnie ostrożnie dozuj dwa mililitry zawiesiny komórkowej do każdej studzienki sześciodołkowej płytki pokrytej substratem i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Komórki powinny przylegać do kanałów żelu przez 24 godziny i bić spontanicznie po 48 godzinach od posiania. Dwa dni przed posiewem dodaj 0,5 mililitra pożywki hodowlanej ludzkich kardiomiocytów iPSC do każdej studzienki 24-dołkowej matrycy wieloelektrodowej lub płytki MEA i wykonaj zapis podstawowy w celu sprawdzenia stosunku sygnału do szumu jako kontroli jakości MEA.

Następnie odessać pożywkę, przepłukać studzienki sterylną wodą i wysterylizować przez noc pod światłem UV w okapie z przepływem laminarnym. Następnego dnia dodaj 0,1 mililitra FBS do każdej studzienki w celu hydrofilowej obróbki powierzchni MEA i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie odessać FBS i przepłukać każdą studzienkę dwukrotnie 0,5 mililitra sterylnej wody.

Pozostaw płytkę do wyschnięcia na noc w okapie z przepływem laminarnym. Następnego dnia odpipetuj pięć mikrolitrów roboczego rozcieńczenia fibronektyny i ostrożnie dozuj kroplę na środku każdej studzienki, aby pokryć wszystkie 12 elektrod. Natychmiast umieść talerz na podniesionej powierzchni w komorze nawilżającej zawierającej wystarczającą ilość sterylnej wody, aby pokryć całą powierzchnię naczynia.

Umieść komorę z płytką w inkubatorze do hodowli komórkowych na trzy godziny, a następnie przystąp do posiewu komórek. Gdy będziesz gotowy do płytki kardiomiocytów, dostosuj gęstość komórek do 6 000 komórek na mikrolitr, rozcieńczając je w ludzkim pożywce do rozmrażania kardiomiocytów iPSC. Delikatnie przesuwaj, aby zapobiec osadzaniu się komórek.

Umieść płytkę MEA w okapie z przepływem laminarnym i ostrożnie usuń kroplę fibronektyny za pomocą pipety P10, nie dotykając elektrod. Natychmiast dozuj kroplę ogniwa o pojemności pięciu mikrolitrów do środka studzienki, upewniając się, że pokryła wszystkie 12 elektrod. Rób to dobrze na raz, aby zapobiec wysuszeniu fibronektyny.

Po zakończeniu powlekania umieść płytkę MEA z powrotem w luźno zakrytej komorze nawilżania i włóż ją z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych na trzy godziny. Po inkubacji użyj pipety P200, aby ostrożnie dodać 200 mikrolitrów ludzkiego podłoża do rozmrażania kardiomiocytów iPSC do każdego dołka bez naruszania komórek. Umieścić płytkę MEA z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych i wymienić pożywkę 24 godziny po posianiu.

Gdy będziesz gotowy do uzyskania sygnału z kardiomiocytów, uruchom oprogramowanie do akwizycji i włóż płytkę MEA zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Kliknij przycisk Eksploruj, aby zobrazować sygnał we wszystkich studzienkach i zweryfikować jakość sygnału w warunkach stanu ustalonego. Rób notatki na elektrodach z sygnałami potencjału pola lub FP w zakresie miliwoltów.

Następnie kliknij ten sam przycisk, aby zatrzymać eksplorację. Do tej pory nie zarejestrowano żadnych danych. Kliknij przycisk Przejdź, aby rozpocząć nagrywanie.

Elektrody w każdej studzience będą pokazywać sygnały FP w oknie surowych danych. Po 30 sekundach nagrywania kliknij przycisk Stymuluj i pozwól, aby elektroporacja odbywała się w wybranych miejscach przez 30 sekund. Następnie kliknij ten sam przycisk, aby zatrzymać symulację i kontynuować nagrywanie przez 60 sekund.

Użyj niestandardowego oprogramowania opartego na MATLAB, aby segmentować i wyodrębniać różne parametry danych potencjału pola i potencjału działania. Najpierw uruchom kod analizy przebiegu i kliknij Plik i wybierz Process.h5. Znajdź i wybierz wcześniej utworzony mwd.

Plik h5. Kliknij przycisk Zapisz katalog, aby zmienić lokalizację przechowywania plików wyjściowych. Następnie utwórz kolejkę przetwarzania sygnału, wybierając interesujące Cię kombinacje elektrod i studzienek, a następnie klikając przycisk Kolejka.

Powtórz ten krok, aby dodać więcej kombinacji elektrod i studzienek do kolejki. Jeśli komórki były leczone lekami, kolejkę można edytować, klikając bezpośrednio na Nazwa Med, Stężenie Med. Po sfinalizowaniu kolejki kliknij przycisk Zainicjuj przebiegi, który rozpocznie wstępne przetwarzanie, w którym sygnały są identyfikowane i wyodrębniane w celu segmentacji.

Po zakończeniu przetwarzania kliknij przycisk Powiększ i wybierz obszar zainteresowania potencjału czynnościowego lub AP. Kliknij przycisk Zachowaj i przejrzyj panele. Szczyty i dołki są wykrywane dla każdego kształtu fali, a znormalizowane AP są nakładane

Po zakończeniu kliknij przycisk Zachowaj, aby przejść do następnego śladu w kolejce i powtórz proces dla pozostałych sygnałów kombinacji elektrody i studzienki. Żywotność i gęstość posiewu kardiomiocytów po rozmrożeniu ma kluczowe znaczenie dla wielodołkowej hodowli MEA. Prawidłowe posiewy skutkują zdrową hodowlą jednowarstwową ze spontanicznym biczowaniem po 48 godzinach, podczas gdy słaba żywotność komórek skutkuje hodowlami o wysokim odsetku populacji niebędących miocytami.

Dyspersja kropelek komórek wpływa na gęstość hodowli, a nawet może prowadzić do śmierci komórki, dlatego ważne jest precyzyjne rozmieszczenie komórek. Komórki hodowane na MEA są poddawane kontroli jakości pod kątem aktywności elektrycznej 48 godzin po posiewie. Jeśli 50% elektrod w sieci i 70% wszystkich sieci nie wytwarza sygnałów FP, oznacza to, że hodowla jest nieoptymalna.

Nagrania AP za pośrednictwem elektroporacji można uzyskać wielokrotnie 48 godzin po posiewie MEA. Wielokrotne elektroporacje tego samego miejsca ogniwa po zero, 24, 48, 72 i 96 godzinach nie mają znaczącego wpływu na kształt AP w czasie. Ponadto nie zaobserwowano korelacji między amplitudami AP FP i AP po elektroporacji z tego samego miejsca ogniwa.

Istotną zaletą tej metody jest to, że wielodołkowa płytka MEA może być wielokrotnie używana. Aby zademonstrować niezawodność tej macierzy, 3 815 przebiegów AP są pobierane z trzech partii przywracania, a następnie wyodrębniane są dane dotyczące czasu trwania AP w celu zbadania powtarzalności wyników. W razie zainteresowania możliwe jest wykonanie dodatkowych testów, takich jak ekspresja genów, pomiary stanów przejściowych wapnia i zacisk krosowy w celu zbadania zachowania określonych prądów jonowych.

Technika ta toruje naukowcom drogę do poprawy dojrzewania elektrofizjologicznego, a także do badania przesiewowego przewlekłego wpływu dawki na kardiomiocyty.