Test in vitro w celu zbadania interakcji między guzem a makrofagami

Makrofagi związane z nowotworem odgrywają ważną rolę w mikrośrodowisku guza. Zrozumienie, w jaki sposób różne mutacje genetyczne w komórkach nowotworowych wpływają na rekrutację makrofagów, ma kluczowe znaczenie dla projektowania spersonalizowanego leczenia pacjentów z rakiem. Test ten zapewnia łatwy i niezawodny sposób oceny interakcji między komórkami nowotworowymi a makrofagami in vitro.

Test ten można zmodyfikować w celu oceny interakcji między komórkami nowotworowymi a innymi komórkami odpornościowymi in vitro. Aby rozpocząć tę procedurę, podgrzej pożywkę z komórkami macierzystymi bez surowicy, umieszczając ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 minut. Spryskaj powierzchnię kaptura do hodowli tkankowych 70% etanolem i wytrzyj spryskaną powierzchnię ręcznikami papierowymi.

Następnie spryskaj butelki z roztworem do oddzielania pożywki i komórek 70% etanolem i wytrzyj je ręcznikami papierowymi. Przenieś oczyszczone butelki do kaptura do hodowli tkankowych. Pobrać komórkę nowotworową i przenieść ją do kaptura do hodowli tkankowej.

Odessać pożywkę i umyć komórki 10 mililitrami PBS. Następnie dodać dwa mililitry roztworu oddzielającego komórki do kolby. Umieść kolbę w kapturze, sprawdzając co minutę, czy komórki nowotworowe zaokrągliły się w górę.

Gdy komórki nowotworowe zaokrąglą się, delikatnie postukaj w bok kolby, aby pomóc komórkom się odłączyć. Następnie odpipetować osiem mililitrów pożywki komórkowej bez surowicy do kolby i pipetować trzy razy w górę i w dół, aby wymieszać. Przenieś tę zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i wiruj pod ciśnieniem 200 razy g i w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.

Odessać supernatant. Następnie umyj komórki w 10 mililitrach PBS, upewniając się, że pipetujesz w górę i w dół trzy do pięciu razy, aby wymieszać. Odwirować komórki w temperaturze 200 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.

Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach pożywki wolnej od surowicy. Pipetuj w górę i w dół trzy do pięciu razy, aby wymieszać. Wymieszaj 10 mikrolitrów tej zawiesiny komórkowej z 10 mikrolitrami roztworu błękitu trypanowego.

Następnie odpipetować 10 mikrolitrów mieszaniny błękitu trypanowego i komórek do szkiełka liczącego i użyć automatycznego licznika komórek, aby określić ilościowo liczbę żywych komórek. Użyj pożywki komórkowej bez surowicy, aby dostosować gęstość komórek do 2,5 razy 10 do piątych komórek na mililitr. Następnie zasiej dwa mililitry komórek w każdym dołku sześciodołkowej płytki hodowlanej.

W tym samym czasie przygotuj sześć studzienek z zaledwie dwoma mililitrami pożywki z komórek macierzystych bez surowicy. Następnie inkubuj sześciodołkowe płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny. Najpierw spryskaj powierzchnię kaptura do hodowli tkankowych 70% etanolem i wytrzyj spryskaną powierzchnię ręcznikami papierowymi.

Następnie spryskaj butelki z roztworem do oddzielania pożywki i komórek 70% etanolem i wytrzyj je ręcznikami papierowymi. Przenieś oczyszczone butelki do kaptura do hodowli tkankowych. Następnie wyjmij sześciodołkowe płytki z inkubatora.

Ostrożnie odpipetować kondycjonowane podłoże do 15-mililitrowych sterylnych probówek wirówkowych i umieścić probówki na lodzie. Dodaj 0,5 mililitra roztworu do oddzielania komórek do każdej studzienki z sześciodołkowymi płytkami i sprawdzaj co minutę, czy komórki nowotworowe zaokrągliły się w górę. Gdy komórki nowotworowe zaokrąglą się, delikatnie postukaj w bok płytki, aby pomóc oderwać komórki.

Następnie odpipetuj 2,5 mililitra pożywki do utrzymania komórek nowotworowych do studzienki i pipetuj trzy razy w górę iw dół, aby wymieszać. Przenieś komórki do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów. Wymieszaj 10 mikrolitrów komórek z 10 mikrolitrami roztworu błękitu trypanowego i przenieś 10 mikrolitrów tej mieszaniny do szkiełka liczącego.

Użyj automatycznego licznika komórek, aby określić ilościowo liczbę żywych komórek i użyj pożywki z komórek macierzystych bez surowicy, która była inkubowana w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, aby dostosować objętość kondycjonowanej pożywki zgodnie z liczbą komórek. Przefiltruj kondycjonowane media przez filtry 0,45 mikrometra i umieść kondycjonowane media na lodzie. Na początek podgrzej podłoże IMDM w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut.

Oczyść kaptur do hodowli tkankowych 70% etanolem, wyczyść butelkę z pożywki i przetransportuj ją do kaptura, jak opisano wcześniej. Następnie przenieś kolbę komórek MV-4-11 do okapu. Odpipetować 10 mililitrów komórek do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.

Użyj błękitu trypanowego i automatycznego licznika komórek, aby określić ilościowo liczbę żywych komórek, jak opisano wcześniej. Następnie odwirować komórki w temperaturze 200 razy g i w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Odessać supernatant i przemyć komórki 10 mililitrami PBS.

Ponownie odwirować w temperaturze 200 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce IMDM przy końcowej gęstości komórek wynoszącej milion komórek na mililitr. Najpierw doprowadź niezbędne materiały do temperatury pokojowej.

Do każdej wkładki dodać 250 mikrolitrów przygotowanych komórek MV-4-11. Następnie dodaj 400 mikrolitrów kondycjonowanej pożywki lub tylko pożywki do dolnych komór 24-dołkowej płytki, upewniając się, że dodałeś próbki w trzech powtórzeniach. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez cztery godziny.

Następnie delikatnie postukaj wkładką w wewnętrzną ściankę tej samej studzienki i wyrzuć wkładkę. Delikatnie odpipetuj komórki w studzienkach trzy razy w górę i w dół, aby wymieszać. Przenieś 225 mikrolitrów tej zawiesiny komórek do studzienek 96-dołkowej płytki o czarnych ściankach, odpowiedniej do pomiaru fluorescencyjnego.

Następnie rozcieńczyć barwnik CyQUANT 4x buforem do lizy w stosunku od 1 do 75. Krótko odwiruj i odkręć roztwór. Przenieść 75 mikrolitrów tego roztworu do każdego dołka płytki 96-dołkowej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

Za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych odczytaj fluorescencję i przeanalizuj dane zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W tym badaniu stosuje się test in vitro do badania interakcji makrofagów nowotworowych. Próbki o wysokich wartościach fluorescencji wskazują, że kondycjonowane podłoże ma dużą zdolność do rekrutacji makrofagów.

W zależności od potrzeb eksperymentalnych można dołączyć dodatkowe kontrole. Na przykład można użyć przeciwciał neutralizujących do leczenia kondycjonowanych pożywek w celu zniesienia chemotaksji makrofagów i działania w ten sam sposób. Do kondycjonowanych pożywek można również dodać dodatkowe chemokiny, które służą jako kontrola pozytywna.

W tym teście ważne jest, aby kontrolować różnice w liczbie komórek, ponieważ różne typy komórek mogą rosnąć z różną prędkością. Potwierdzenie in vivo wyników in vitro ma kluczowe znaczenie. Można wstrzyknąć komórki nowotworowe myszom i przeanalizować guzy za pomocą cytometrii przepływowej, barwienia immunologicznego i CyTOF, aby potwierdzić wyniki.