Name: Test in vitro w celu zbadania interakcji między guzem a makrofagami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Poznaj metodę in vitro do oceny przyciągania makrofagów przez komórki nowotworowe. To badanie pomaga zrozumieć interakcje w mikrośrodowisku guza i wspiera rozwój spersonalizowanych terapii przeciwnowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Udziel wsparcia: Z. Otrzymał wsparcie od Alex's Lemonade Stand Foundation, American Brain Tumor Association, NIH T32CA108462 i Program for Breakthrough Biomedical Research, który jest częściowo finansowany przez Sandler Foundation. W. Weiss był wspierany przez granty NIH R01CA221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103; Fundacja Badań nad Rakiem im. Samuela G. Waxmana; oraz Przewodnicząca Evelyn i Mattie Anderson.

1. Przygotowanie podłoża
<ol>
	<li>Przygotowanie pożywki z komórek macierzystych bez surowicy
	<ol>
		<li>Rozmrozić 50x suplement B27, naskórkowy czynnik wzrostu (EGF, 20 μg/ml w 10 mM kwasu octowego z 0,1% BSA) i czynnik wzrostu fibroblastów (FGF, 20 μg/ml w 10 mM kwas octowy z 0,1% BSA).</li>
		<li>Dodać 500 μl EGF (stężenie końcowe 20 ng/ml), 500 μl FGF (stężenie końcowe 20 ng/ml), 10 ml 50x B27 do 500 ml zmodyfikowanej mieszanki Eagle Medium / Nutrient Blend F-12 firmy Dulbecco (DMEM/F12) i 5 ml 100x penicylina/streptomycyna (długopis/paciorkowiec). Odwróć butelkę 4-6 razy, aby wymieszać, przefiltruj i wysterylizuj przez kubek filtracyjny o pojemności 500 ml 0,1 μm. Oznaczyć butelkę i przechowywać w temperaturze 4 °C. 
		nuta: Pożywkę można stosować przez okres do miesiąca w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj pożywkę hodowlaną MV-4-11: Dodaj 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do 500 ml zmodyfikowanej pożywki Dulbecco (IMDM) firmy Iscove. Odwróć butelkę 4-6 razy, aby wymieszać, przefiltruj i wysterylizuj przez kubek filtracyjny o pojemności 500 ml 0,1 μm. Oznaczyć butelkę i przechowywać w temperaturze 4 °C. 
	nuta: Pożywkę można stosować przez okres do miesiąca w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę podtrzymującą komórki nowotworowe: Dodaj 50 ml FBS do 500 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco. Odwróć butelkę 4-6 razy, aby wymieszać, przefiltruj i wysterylizuj przez kubek filtracyjny o pojemności 500 ml 0,1 μm. Oznaczyć butelkę i przechowywać w temperaturze 4 °C. 
	nuta: Pożywkę można stosować przez okres do miesiąca w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek
Dzień 1:
<ol>
	<li>Rozmrażanie komórek nowotworowych</li>
	<li>Rozgrzać pożywkę do konserwacji komórek nowotworowych (jak opisano w kroku 1.3) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Weź zamrożone ogniwa U87, U87:EGFR, U87:EGFRvIII i U87:EGFR+EGFRvIII ze zbiornika ciekłego azotu. Rozmrażać komórki w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 2 min. 
	UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas wyjmowania ogniw ze zbiornika ciekłego azotu. W razie potrzeby nosić rękawice z ochroną termiczną i okulary ochronne.</li>
	<li>Spryskaj powierzchnię kaptura do hodowli tkankowych 70% etanolem i zetrzyj 70% etanolu z powierzchni ręcznikami papierowymi.</li>
	<li>Spryskaj fiolki kriogeniczne zawierające komórki i pożywkę butelką 70% etanolem, zetrzyj 70% etanolu z powierzchni ręcznikami papierowymi i przenieś je do kaptura do hodowli tkankowej.</li>
	<li>Odpipetować 5 ml pożywki do utrzymania komórek nowotworowych do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwróć probówkę zawierającą komórki nowotworowe 4-6 razy, aby wymieszać. Odpipetować wszystkie komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwróć probówkę wirówkową 4-6 razy, aby wymieszać.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant.</li>
	<li>Umyj komórki 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 12 ml pożywki podtrzymującej komórki nowotworowe (zgodnie z opisem w kroku 1.3). Pipetować w górę i w dół 3-5 razy, aby wymieszać. Przenieść komórki do kolby do hodowli komórek T75.</li>
	<li>Hodować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Włóż pożywkę do konserwacji komórek nowotworowych z powrotem do lodówki o temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
Dzień 2:
<ol start="2">
	<li>Sprawdź komórki pod mikroskopem. W razie potrzeby zmień nośnik. Komórki powinny rosnąć w monowarstwie w hodowli.</li>
</ol>
Dzień 3:
<ol start="3">
	<li>Rozmrażanie ogniw MV-4-11
	<ol>
		<li>Rozgrzać pożywkę hodowlaną MV-4-11 (zgodnie z opisem w kroku 1.2) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 minut 
		nuta: MV-4-11 można zmienić na pierwotne makrofagi lub inne linie komórkowe makrofagów, w zależności od potrzeb konkretnego badania.</li>
		<li>Weź zamrożone ogniwa MV-4-11 ze zbiornika ciekłego azotu. Rozmrażać komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 2 min. 
		ostrożność: Zachowaj ostrożność podczas wyjmowania komórek ze zbiornika ciekłego azotu. W razie potrzeby nosić rękawice z ochroną termiczną i okulary ochronne.</li>
		<li>Spryskaj powierzchnię kaptura do hodowli tkankowych 70% etanolem i zetrzyj 70% etanolu z powierzchni ręcznikami papierowymi.</li>
		<li>Spryskaj fiolki kriogeniczne zawierające komórki i pożywkę butelką 70% etanolem, zetrzyj 70% etanolu z powierzchni ręcznikami papierowymi i przenieś je do kaptura do hodowli tkankowej.</li>
		<li>Odpipetować 5 ml pożywki hodowlanej MV-4-11 (zgodnie z opisem w kroku 1.2) do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwróć probówkę zawierającą komórki nowotworowe 4-6 razy, aby wymieszać. Odpipetować wszystkie komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwróć probówkę wirówkową 4-6 razy, aby wymieszać.</li>
		<li>Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant.</li>
		<li>Przemyć komórki w 10 ml PBS i odwirować komórki w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 12 ml pożywki hodowlanej MV-4-11 (jak opisano w kroku 1.2). Delikatnie pipetuj w górę i w dół 3-5 razy, aby wymieszać. Przenieść komórki do kolby do hodowli komórek T75.</li>
		<li>Hodować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podział komórek nowotworowych
	<ol>
		<li>Podgrzej pożywkę z komórkami macierzystymi bez surowicy (zgodnie z opisem w kroku 1.1) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 minut.</li>
		<li>Spryskaj powierzchnię kaptura do hodowli tkankowych 70% etanolem i zetrzyj 70% etanolu z powierzchni ręcznikami papierowymi. Wyjmij roztwór do oddzielania komórek z lodówki. Spryskaj butelki z roztworem do odwarstwiania pożywki i komórek 70% etanolem, zetrzyj 70% etanolu z powierzchni ręcznikami papierowymi i włóż je do kaptura do hodowli tkankowych. 
		nuta: Nie podgrzewać wstępnie roztworu do oddzielania komórek akutazy.</li>
		<li>Przenieś hodowlę komórek nowotworowych z inkubatora do kaptura do hodowli tkankowej. Odessać pożywkę, dodać 2 ml roztworu do oddzielania komórek do kolby. 
		nuta: Płukanie PBS przed dodaniem akutazy jest tutaj opcjonalne.</li>
		<li>Umieść kolbę w okapie. Sprawdź, czy komórki nowotworowe zaokrąglają się co minutę. Gdy komórki nowotworowe zaokrąglą się, delikatnie postukaj w bok kolby, aby pomóc komórkom odłączyć się od kolby.</li>
		<li>Odpipetować 8 ml pożywki z komórek macierzystych bez surowicy do kolby, pipetować 3 razy w górę i w dół, aby wymieszać, a następnie przenieść komórki do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant.</li>
		<li>Umyj komórki w 10 ml PBS. Pipetować w górę i w dół 3-5 razy, aby wymieszać. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant. 
		nuta: Ten krok jest opcjonalny.</li>
		<li>Zawiesić komórki w 10 ml pożywki z komórkami macierzystymi bez surowicy (jak opisano w kroku 1.1). Pipetować w górę i w dół 3-5 razy, aby wymieszać. Weź 10 μl komórek i wymieszaj z 10 μl roztworu błękitu trypanowego. Odpipetować 10 μl mieszaniny do szkiełka zliczającego, określić ilościowo liczbę żywych komórek za pomocą automatycznego licznika komórek.</li>
		<li>Dostosuj gęstość komórek do 2,5 x 105 komórek/ml za pomocą pożywki z komórkami macierzystymi bez surowicy (jak opisano w kroku 1.1) i zamieść 2 ml komórek do każdego dołka 6-dołkowej płytki do hodowli komórek. Dla każdego rodzaju komórek należy zasiać 3 dołki (potrójna próbka). W tym samym czasie przygotuj 6 studzienek z 2 ml pożywki z komórkami macierzystymi bez surowicy (bez komórek). 
		nuta: Próbki te zostaną wykorzystane: 1) jako kontrole ujemne i 2) do dostosowania objętości kondycjonowanej pożywki na podstawie liczby komórek.</li>
		<li>Umieścić płytki 6-dołkowe w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Pozwól komórkom rosnąć przez 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test przyciągania makrofagów in vitro
<ol>
	<li>Przygotowanie kondycjonowanych pożywek
	<ol>
		<li>Rozgrzać pożywkę do konserwacji komórek nowotworowych (jak opisano w kroku 1.3) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 minut.</li>
		<li>Spryskaj powierzchnię kaptura do hodowli tkankowych 70% etanolem i zetrzyj 70% etanolu z powierzchni ręcznikami papierowymi. Wyjmij roztwór do oddzielania komórek z lodówki. Spryskaj butelki z pożywką i roztworem do oddzielania komórek 70% etanolem, zetrzyj 70% etanolu z powierzchni ręcznikami papierowymi i wprowadź je do kaptura do hodowli tkankowej.</li>
		<li>Wyjąć płytki 6-dołkowe z inkubatora. Ostrożnie odpipetować kondycjonowaną pożywkę do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml. Połóż rurki na lodzie. Odpipetować pożywkę znajdującą się w "samym pożywce" do oddzielnej sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. 
		nuta: Przed tym krokiem sprawdź pod mikroskopem, czy komórki się przyczepiają. Jeśli nie, można użyć powlekanych płytek w kroku 2.4.8, aby umożliwić lepsze mocowanie lub uwzględnić pływające komórki na etapie liczenia.</li>
		<li>Dodaj 0,5 ml roztworu do oddzielania komórek do każdego dołka płytki 6-dołkowej. Sprawdź, czy komórki nowotworowe zaokrąglają się co minutę. Gdy komórki nowotworowe zaokrąglą się, delikatnie postukaj w bok płytki, aby pomóc komórkom się odłączyć.</li>
		<li>Odpipetować 2,5 ml pożywki do utrzymania komórek nowotworowych do studzienki, pipetować w górę iw dół 3 razy, aby wymieszać i przenieść komórki do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Weź 10 μl komórek i wymieszaj z 10 μl roztworu błękitu trypanowego. Odpipetować 10 μl mieszaniny na szkiełko liczące i określić ilościowo liczbę żywych komórek za pomocą automatycznego licznika komórek.</li>
		<li>Dostosuj objętość kondycjonowanej pożywki w zależności od liczby komórek, używając pożywki z komórkami macierzystymi wolnymi od surowicy (inkubacja w temperaturze 37 °C przez noc). Na przykład, jeśli studnia A ma 3 razy więcej żywych komórek niż studnia z najmniejszą liczbą komórek, rozcieńczyć jej kondycjonowane podłoże w stosunku 1:3. Ten krok służy do kontrolowania różnicy spowodowanej szybkością proliferacji komórek. 
		nuta: Powodem, dla którego zaleca się stosowanie pożywki z komórkami macierzystymi bez surowicy w inkubacji w temperaturze 37 °C przez noc, jest kontrola możliwej zmiany w pożywce przy długotrwałej ekspozycji na 37 °C.</li>
		<li>Przefiltruj kondycjonowane media przez filtry 0,45 μm. Umieść kondycjonowane podłoże na lodzie. 
		nuta: Ten etap usuwa komórki i resztki komórek w kondycjonowanym pożywce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie ogniw MV-4-11
	<ol>
		<li>Podgrzej pożywkę IMDM (bez FBS) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 minut.</li>
		<li>Spryskaj powierzchnię kaptura do hodowli tkankowych 70% etanolem i zetrzyj 70% etanolu z powierzchni ręcznikami papierowymi. Spryskaj pożywkę butelką 70% etanolem, zetrzyj 70% etanolu z powierzchni ręcznikami papierowymi i włóż je do kaptura do hodowli tkankowej.</li>
		<li>Przenieść kolbę komórek MV-4-11 do okapu do hodowli tkankowej. Pobrać pipetą 10 ml komórek do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Weź 10 μl komórek i wymieszaj z 10 μl roztworu błękitu trypanowego. Odpipetować 10 μl mieszaniny na szkiełko liczące i określić ilościowo liczbę żywych komórek za pomocą automatycznego licznika komórek. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant.</li>
		<li>Przemyć komórki 10 ml PBS i odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w pożywce IMDM (bez FBS), aby uzyskać końcową gęstość komórek 1x106 komórek/ml. 
		nuta: Liczbę komórek użytych tutaj makrofagów można dostosować.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test Transwell 
	nuta: Na tym etapie użyj zestawu do oznaczania migracji komórek lub kup odczynniki i włóż je osobno. W przypadku ogniw MV-4-11 wybierz wkładki Transwell o wielkości porów 5 μm. Aby wykryć migrację makrofagów, należy bezpośrednio określić ilościowo liczbę makrofagów w dolnej komorze lub użyć metod kolorymetrycznych/fluorymetrycznych. Tutaj demonstrujemy test za pomocą metody kolorymetrycznej.
	<ol>
		<li>Doprowadzić płytkę 24-dołkową, wkładkę i odczynniki do temperatury pokojowej.</li>
		<li>Do każdej wkładki dodać 250 μl przygotowanych powyżej komórek MV-4-11.</li>
		<li>Dodać 400 μl kondycjonowanej pożywki/samej pożywki (przy całonocnej inkubacji w temperaturze 37 °C, próbki te służą jako kontrola ujemna) do dolnych komór płytki 24-dołkowej. Dla każdej linii nowotworowej lub kontroli należy użyć trzech próbek. Unikaj pęcherzyków powietrza między wkładką a kondycjonowanym medium. Bąbelki będą hamować migrację makrofagów do studzienek dennych.</li>
		<li>Inkubować płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 4 godziny 
		nuta: Czas inkubacji można dostosować. Komórki migrujące do dolnych komór można zobaczyć pod mikroskopem.</li>
		<li>Delikatnie postukaj wkładką w wewnętrzną ścianę tej samej studzienki i wyrzuć wkładkę. Ponieważ komórki MV-4-11 rosną w zawiesinie, roztwór do odrywania komórek lub leczenie trypsyną nie jest tutaj potrzebne.</li>
		<li>Delikatnie odpipetuj komórki w studzienkach 3 razy w górę iw dół, aby wymieszać. Przenieść 225 μl zawiesiny komórek na czarnościenną 96-dołkową płytkę odpowiednią do pomiaru fluorescencyjnego.</li>
		<li>Rozcieńczyć barwnik CyQuant w stosunku 1:75 z 4x buforem do lizy. Krótko odwiruj i odkręć roztwór. Dodać 75 μl roztworu do każdego dołka na 96-dołkowej płytce. Inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odczyt fluorescencji za pomocą zestawu filtrów 480/520 nm z czytnikiem płytek fluorescencyjnych.</li>
		<li>Analizuj dane, odejmując ślepą próbę i normalizując do linii komórek kontrolnych nowotworu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Liu, Y., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+function+of+tumor-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">The origin and function of tumor-associated macrophages.</a> Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 1-4 (2015).</li>
<li>Riabov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+tumor+associated+macrophages+in+tumor+angiogenesis+and+lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Frontiers in Physiology. 5, (2014).</li>
<li>Coussens, L. M., Zitvogel, L., Palucka, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralizing+tumor-promoting+chronic+inflammation%3A+a+magic+bullet%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutralizing tumor-promoting chronic inflammation: a magic bullet.</a> Science. 339 (6117), 286-291 (2013).</li>
<li>Tsukamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Blockade+of+IL6+and+PD-1%2FPD-L1+Signaling+Abrogates+Mutual+Regulation+of+Their+Immunosuppressive+Effects+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Combined Blockade of IL6 and PD-1/PD-L1 Signaling Abrogates Mutual Regulation of Their Immunosuppressive Effects in the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Research. 78 (17), 5011-5022 (2018).</li>
<li>Borgoni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+tumor-associated+macrophages+switches+the+epigenetic+profile+of+pancreatic+cancer+infiltrating+T+cells+and+restores+their+anti-tumor+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Depletion of tumor-associated macrophages switches the epigenetic profile of pancreatic cancer infiltrating T cells and restores their anti-tumor phenotype.</a> Oncoimmunology. 7 (2), e1393596(2018).</li>
<li>Argyle, D., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Macrophage-Recruiting+Chemokines+as+a+Novel+Therapeutic+Strategy+to+Prevent+the+Progression+of+Solid+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Targeting Macrophage-Recruiting Chemokines as a Novel Therapeutic Strategy to Prevent the Progression of Solid Tumors.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2629(2018).</li>
<li>An, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+cooperates+with+EGFRvIII+to+recruit+macrophages+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">EGFR cooperates with EGFRvIII to recruit macrophages in glioblastoma.</a> Cancer Research. , (2018).</li>
<li>Fan, Q. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+phosphorylates+tumor-derived+EGFRvIII+driving+STAT3%2F5+and+progression+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">EGFR phosphorylates tumor-derived EGFRvIII driving STAT3/5 and progression in glioblastoma.</a> Cancer Cell. 24 (4), 438-449 (2013).</li>
<li>Jacquelot, N., Duong, C. P. M., Belz, G. T., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Chemokines+and+Chemokine+Receptors+in+Melanoma+and+Other+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Targeting Chemokines and Chemokine Receptors in Melanoma and Other Cancers.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2480(2018).</li>
<li>Arimont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Analysis+of+Chemokine+Receptor-Ligand+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structural Analysis of Chemokine Receptor-Ligand Interactions.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (12), 4735-4779 (2017).</li>
<li>Turner, M. D., Nedjai, B., Hurst, T., Pennington, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+and+chemokines%3A+At+the+crossroads+of+cell+signalling+and+inflammatory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytokines and chemokines: At the crossroads of cell signalling and inflammatory disease.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (11), 2563-2582 (2014).</li>
<li>Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemokine+system+in+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The chemokine system in innate immunity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (5), (2015).</li>
<li>Pathria, P., Louis, T. L., Varner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Tumor-Associated+Macrophages+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Targeting Tumor-Associated Macrophages in Cancer.</a> Trends in Immunology. 40 (4), 310-327 (2019).</li>
<li>Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-associated+macrophages+as+treatment+targets+in+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 399-416 (2017).</li>
</ol>

William A. Weiss jest współzałożycielem StemSynergy Therapeutics. Żenij An nie ma nic do wyjawienia.

W tym protokole jest kilka kluczowych kroków: 1) wybór wkładki Transwell. W przypadku linii komórkowej MV-4-11 dobrze sprawdzają się wkładki Transwell 5 μm. Jednak w przypadku innych linii komórkowych, takich jak powszechnie stosowana linia komórkowa monocytów THP-1, inna wielkość porów może działać lepiej. 2) Ponieważ różne linie komórkowe rosną z różnymi prędkościami, ważne jest, aby dostosować objętość kondycjonowanego podłoża do liczby komórek. W tym celu do rozcieńczenia kondycjonowanych pożywek można użyć pożywek b...

Makrofagi to komórki odpornościowe o wysokiej heterogeniczności fenotypowej i funkcjonalnej1. Odgrywają ważną rolę w systemach obronnych gospodarza, naprawie tkanek, rozwoju i progresji guza1. TAM to makrofagi w mikrośrodowisku guzów litych. Niektóre TAM mogą promować wzrost guza poprzez hamowanie aktywności cytotoksycznej za pośrednictwem limfocytów T, modulowanie mikrośrodowiska guza (TME), promowanie angiogenezy, inwazji i przerzutów2,3,4,5. TAM są jednymi z najliczniejszych typów komórek w TME, a większa liczba TAM na ogół koreluje z gorszym przeżyciem pacjentów w wielu typach guzów litych6. Wyraźne sygnatury genetyczne komórek nowotworowych wpływają na ich zdolność do rekrutacji makrofagów. W GBM, agresywnym guzie mózgu, na który nie ma lekarstwa, makrofagi mogą stanowić nawet połowę masy guza7. W GBM często obserwuje się koamplifikację receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) i jego mutanta skracającego EGFRvIII, co daje korzyści we wzroście guza8. Komórki wykazujące współekspresję EGFR i EGFRvIII przyciągają więcej makrofagów w porównaniu z komórkami wykazującymi ekspresję EGFRvIII pojedynczo7.
Chemokin to rodzina małych cytokin, które odgrywają znaczącą rolę w regulacji składu immunologicznego w TME6,9. Komórki ludzkie wyrażają ponad 50 cytokin10. Infiltracja immunologiczna w nowotworach jest w dużej mierze realizowana przez interakcję między cytokinami a receptorami cytokin11. Każdy typ komórek odpornościowych wyraża odrębne receptory chemokin/chemokiny i może być rekrutowany przez komórki wydzielające określone chemokiny/receptory chemokin12. Komórki nowotworowe mogą zwiększać ekspresję niektórych chemokin w celu rekrutacji komórek odpornościowych, takich jak TAM, limfocyty T regulatorowe i komórki supresorowe pochodzenia mieloidalnego (MDSC)6. Blokada specyficznej chemokiny wydzielanej przez guzy może być obiecującym sposobem hamowania infiltracji komórek odpornościowych do masy guza.
Tutaj opisujemy protokół, który pozwala na ocenę in vitro interakcji guz-makrofag, przy użyciu kondycjonowanych pożywek z komórek nowotworowych zawierających chemokiny i linie komórkowe makrofagów.

<table><tbody><tr><td>0,1 &mu; m kubek filtracyjny</td><td>Thermo fisher</td><td>566-0010</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; m jednostka filtrująca</td> Pipety serologiczne <td>Millipore</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>10 ml</td><td>Olympus plastics</td><td>12-104</td><td></td></tr><tr><td>15 ml sterylne probówki wirówkowe</td><td>Olympus plastics</td><td>28-103</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka do pipety 1 ml</td><td>ART bioprodukty molekularne</td><td>2779-RI</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta aspiracyjna 2 ml</td><td>Falcon</td><td>357558</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka</td><td>Millipore</td><td>ECM507</td><td>Część ECM507 lub można ją kupić osobno</td></tr><tr><td>4x bufor do lizy</td><td>Millipore</td><td>ECM507</td><td>Część ECM507 lub można ją kupić osobno</td></tr><tr><td>5 &mu; m Wkładka Transwell</td><td>Millipore</td><td>ECM507</td><td>Część ECM507 lub można ją kupić osobno</td></tr><tr><td>75 cm2 kolba</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innowacyjne technologie ogniw</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>CyQuant Dye</td><td>Millipore</td><td>ECM507</td><td>Część ECM507 lub można je kupić osobno</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM: F12</td><td>Gibco</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>FGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Długopis Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Biorad</td><td>1450021</td><td></td></tr></tbody></table>

test in vitro w celu zbadania interakcji między guzem a makrofagami

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Makrofagi związane z nowotworem (TAM) stanowią duży procent komórek w masie guza dla różnych typów nowotworów. Glejak wielopostaciowy (GBM), złośliwy guz mózgu, na który nie ma lekarstwa, ma do połowy masy guza TAM. TAM mogą być pronowotworowe lub przeciwnowotworowe, w zależności od aktywacji określonych genów w komórkach. Mutacje genetyczne w nowotworach, poprzez regulację ekspresji cytokin, mogą wpływać na rekrutację TAM do mikrośrodowiska guza. W tym miejscu opisujemy ilościowy test komórkowy do oceny rekrutacji makrofagów przez kondycjonowane podłoże z komórek nowotworowych. Test ten wykorzystuje ludzką linię komórkową makrofagów MV-4-11 do badania przyciągania makrofagów przez kondycjonowaną pożywkę z glejaka, co pozwala na wysoką odtwarzalność i niską zmienność. Dane uzyskane za pomocą tego testu mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia interakcji między guzem a mikrośrodowiskiem guza. Podobny test można zastosować do oceny interakcji między komórkami nowotworowymi a innymi komórkami odpornościowymi, w tym limfocytami T i komórkami NK (natural killer).

Wyniki są zazwyczaj przedstawiane w formie wykresów słupkowych (przykład pokazano na Rysunku 1). Próbki z wysokimi wartościami 480/520 wskazują, że pożywka warunkowana wykazuje wysoką zdolność do rekrutacji makrofagów. W zależności od potrzeb doświadczalnych można uwzględnić dodatkowe kontrole. Na przykład można zastosować przeciwciała neutralizujące do obróbki pożywki warunkowanej w celu zniesienia chemotaksji makrofagów, a następnie przeprowadzić ten sam te...

Ten artykuł przedstawia użyteczny test in vitro do oceny zdolności kondycjonowanej pożywki z komórek nowotworowych do przyciągania makrofagów.

Test in vitro w celu zbadania interakcji między guzem a makrofagami

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Makrofagi związane z nowotworem odgrywają ważną rolę w mikrośrodowisku guza. Zrozumienie, w jaki sposób różne mutacje genetyczne w komórkach nowotworowych wpływają na rekrutację makrofagów, ma kluczowe znaczenie dla projektowania spersonalizowanego leczenia pacjentów z rakiem. Test ten zapewnia łatwy i niezawodny sposób oceny interakcji między komórkami nowotworowymi a makrofagami in vitro.Test ten można zmodyfikować w celu oceny interakcji między komórkami nowotworowymi a innymi komórkami odpornościowymi in vitro. Aby rozpocząć tę procedurę, podgrzej pożywkę z komórkami macierzystymi bez surowicy, umieszczając ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 minut. Spryskaj powierzchnię kaptura do hodowli tkankowych 70% etanolem i wytrzyj spryskaną powierzchnię ręcznikami papierowymi.Następnie spryskaj butelki z roztworem do oddzielania pożywki i komórek 70% etanolem i wytrzyj je ręcznikami papierowymi. Przenieś oczyszczone butelki do kaptura do hodowli tkankowych. Pobrać komórkę nowotworową i przenieść ją do kaptura do hodowli tkankowej.Odessać pożywkę i umyć komórki 10 mililitrami PBS. Następnie dodać dwa mililitry roztworu oddzielającego komórki do kolby. Umieść kolbę w kapturze, sprawdzając co minutę, czy komórki nowotworowe zaokrągliły się w górę.Gdy komórki nowotworowe zaokrąglą się, delikatnie postukaj w bok kolby, aby pomóc komórkom się odłączyć. Następnie odpipetować osiem mililitrów pożywki komórkowej bez surowicy do kolby i pipetować trzy razy w górę i w dół, aby wymieszać. Przenieś tę zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i wiruj pod ciśnieniem 200 razy g i w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.Odessać supernatant. Następnie umyj komórki w 10 mililitrach PBS, upewniając się, że pipetujesz w górę i w dół trzy do pięciu razy, aby wymieszać. Odwirować komórki w temperaturze 200 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach pożywki wolnej od surowicy. Pipetuj w górę i w dół trzy do pięciu razy, aby wymieszać. Wymieszaj 10 mikrolitrów tej zawiesiny komórkowej z 10 mikrolitrami roztworu błękitu trypanowego.Następnie odpipetować 10 mikrolitrów mieszaniny błękitu trypanowego i komórek do szkiełka liczącego i użyć automatycznego licznika komórek, aby określić ilościowo liczbę żywych komórek. Użyj pożywki komórkowej bez surowicy, aby dostosować gęstość komórek do 2,5 razy 10 do piątych komórek na mililitr. Następnie zasiej dwa mililitry komórek w każdym dołku sześciodołkowej płytki hodowlanej.W tym samym czasie przygotuj sześć studzienek z zaledwie dwoma mililitrami pożywki z komórek macierzystych bez surowicy. Następnie inkubuj sześciodołkowe płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny. Najpierw spryskaj powierzchnię kaptura do hodowli tkankowych 70% etanolem i wytrzyj spryskaną powierzchnię ręcznikami papierowymi.Następnie spryskaj butelki z roztworem do oddzielania pożywki i komórek 70% etanolem i wytrzyj je ręcznikami papierowymi. Przenieś oczyszczone butelki do kaptura do hodowli tkankowych. Następnie wyjmij sześciodołkowe płytki z inkubatora.Ostrożnie odpipetować kondycjonowane podłoże do 15-mililitrowych sterylnych probówek wirówkowych i umieścić probówki na lodzie. Dodaj 0,5 mililitra roztworu do oddzielania komórek do każdej studzienki z sześciodołkowymi płytkami i sprawdzaj co minutę, czy komórki nowotworowe zaokrągliły się w górę. Gdy komórki nowotworowe zaokrąglą się, delikatnie postukaj w bok płytki, aby pomóc oderwać komórki.Następnie odpipetuj 2,5 mililitra pożywki do utrzymania komórek nowotworowych do studzienki i pipetuj trzy razy w górę iw dół, aby wymieszać. Przenieś komórki do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów. Wymieszaj 10 mikrolitrów komórek z 10 mikrolitrami roztworu błękitu trypanowego i przenieś 10 mikrolitrów tej mieszaniny do szkiełka liczącego.Użyj automatycznego licznika komórek, aby określić ilościowo liczbę żywych komórek i użyj pożywki z komórek macierzystych bez surowicy, która była inkubowana w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, aby dostosować objętość kondycjonowanej pożywki zgodnie z liczbą komórek. Przefiltruj kondycjonowane media przez filtry 0,45 mikrometra i umieść kondycjonowane media na lodzie. Na początek podgrzej podłoże IMDM w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut.Oczyść kaptur do hodowli tkankowych 70% etanolem, wyczyść butelkę z pożywki i przetransportuj ją do kaptura, jak opisano wcześniej. Następnie przenieś kolbę komórek MV-4-11 do okapu. Odpipetować 10 mililitrów komórek do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.Użyj błękitu trypanowego i automatycznego licznika komórek, aby określić ilościowo liczbę żywych komórek, jak opisano wcześniej. Następnie odwirować komórki w temperaturze 200 razy g i w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Odessać supernatant i przemyć komórki 10 mililitrami PBS.Ponownie odwirować w temperaturze 200 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce IMDM przy końcowej gęstości komórek wynoszącej milion komórek na mililitr. Najpierw doprowadź niezbędne materiały do temperatury pokojowej.Do każdej wkładki dodać 250 mikrolitrów przygotowanych komórek MV-4-11. Następnie dodaj 400 mikrolitrów kondycjonowanej pożywki lub tylko pożywki do dolnych komór 24-dołkowej płytki, upewniając się, że dodałeś próbki w trzech powtórzeniach. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez cztery godziny.Następnie delikatnie postukaj wkładką w wewnętrzną ściankę tej samej studzienki i wyrzuć wkładkę. Delikatnie odpipetuj komórki w studzienkach trzy razy w górę i w dół, aby wymieszać. Przenieś 225 mikrolitrów tej zawiesiny komórek do studzienek 96-dołkowej płytki o czarnych ściankach, odpowiedniej do pomiaru fluorescencyjnego.Następnie rozcieńczyć barwnik CyQUANT 4x buforem do lizy w stosunku od 1 do 75. Krótko odwiruj i odkręć roztwór. Przenieść 75 mikrolitrów tego roztworu do każdego dołka płytki 96-dołkowej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.Za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych odczytaj fluorescencję i przeanalizuj dane zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W tym badaniu stosuje się test in vitro do badania interakcji makrofagów nowotworowych. Próbki o wysokich wartościach fluorescencji wskazują, że kondycjonowane podłoże ma dużą zdolność do rekrutacji makrofagów.W zależności od potrzeb eksperymentalnych można dołączyć dodatkowe kontrole. Na przykład można użyć przeciwciał neutralizujących do leczenia kondycjonowanych pożywek w celu zniesienia chemotaksji makrofagów i działania w ten sam sposób. Do kondycjonowanych pożywek można również dodać dodatkowe chemokiny, które służą jako kontrola pozytywna.W tym teście ważne jest, aby kontrolować różnice w liczbie komórek, ponieważ różne typy komórek mogą rosnąć z różną prędkością. Potwierdzenie in vivo wyników in vitro ma kluczowe znaczenie. Można wstrzyknąć komórki nowotworowe myszom i przeanalizować guzy za pomocą cytometrii przepływowej, barwienia immunologicznego i CyTOF, aby potwierdzić wyniki.

in-vitro-assay-to-study-tumor-macrophage-interaction

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W tym filmie badamy interakcję guz-makrofag za pomocą testu interakcji makrofagów transwell opartego na fluorescencji. Test obejmuje analizę migracji makrofagów przez chemotaksję wywołaną chemicznie.

Test przyciągania makrofagów Transwell oparty na fluorescencji: metoda in vitro do badania interakcji guza-makrofag poprzez chemotaksję indukowaną chemicznie

Zrozumienie złośliwego zachowania raka wymaga stworzenia dokładnych modeli interakcji komórek nowotworowych z elementami mikrośrodowiska guza, takimi jak makrofagi. W tym miejscu opisujemy dwie metody badania interakcji komórek glejaka z makrofagami związanymi z nowotworem i mikroglejem, w których oceniany jest wpływ na inwazję glejaka.

Testy kokulturowe w celu zbadania stymulacji makrofagów i mikrogleju inwazji glejaka

Aktywność fagocytarna makrofagów przeciwko komórkom rakowym, w szczególności komórkom raka sutka myszy 4T1, została zobrazowana w tym badaniu. Stworzono model kokultury żywych komórek i obserwowano go za pomocą kombinacji fluorescencyjnej i różnicowej interferencyjnej mikroskopii kontrastowej. Ocena ta została zobrazowana za pomocą oprogramowania do obrazowania w celu opracowania wielopunktowego filmu poklatkowego.

Poklatkowe obrazowanie 2D aktywności fagocytarnej w komórkach raka sutka myszy M1 Macrophage-4T1 w kokulturach

Tutaj prezentujemy metodę wykorzystującą przepuszczalne nośniki błonowe, aby ułatwić badanie bezkontaktowej sygnalizacji parakrynnej używanej przez komórki nowotworowe do tłumienia odpowiedzi immunologicznej. System jest podatny na badanie roli czynników wydzielanych przez nowotwór w tłumieniu aktywacji makrofagów.

Badanie wpływu ligandów parakrynnych wydzielanych przez guz na aktywację makrofagów przy użyciu kokultury z przepuszczalnymi nośnikami błonowymi

Tutaj prezentujemy protokół do badania interakcji pierwotnych ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów z sferoidą guza w trójwymiarowej (3D) matrycy kolagenu I, z możliwością porównania wpływu rozpuszczalnych i fizycznych właściwości mikrośrodowiska na inwazję komórek.

Test koinwazji sferoidów makrofagów i guzów

Biorąc pod uwagę ograniczone modele ksenoprzeszczepów dostępne do badania interakcji między ludzkim CART-em a komórkami szpikowymi, stworzyliśmy modele in vitro i in vivo , aby zrozumieć wpływ ludzkich makrofagów na komórki CART. Wyniki można potencjalnie uogólnić, aby ocenić rolę makrofagów w mikrośrodowisku guza i przetestować immunoterapie ukierunkowane na makrofagi.

Badanie interakcji między komórkami szpikowymi a limfocytami CAR T in vitro i in vivo

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół zastosowania rodaminy 123 do identyfikacji potencjału błony mitochondrialnej (MMP) i badania indukowanej przez CLIC4 apoptozy komórek HN4 in vitro. Pod zwykłym mikroskopem fluorescencyjnym i konfokalnym laserowym skaningowym mikroskopem fluorescencyjnym zarejestrowano zmianę MMP w czasie rzeczywistym.

Wykrywanie potencjału błony mitochondriów w celu badania apoptozy komórek HN4 indukowanej knockdownem CLIC4 in vitro

Test komet jest skuteczną metodą wykrywania uszkodzeń DNA, w tym jedno- i dwuniciowych pęknięć DNA. Opisujemy alkaliczne i neutralne testy komet w celu zmierzenia uszkodzeń DNA w komórkach nowotworowych w celu oceny efektu terapeutycznego chemioterapii.

Ocena uszkodzeń DNA in vitro za pomocą testu komety

Ten protokół opisuje odwrócony test inwazji pionowej, który może być użyty do ilościowego określenia zdolności migracji i inwazji komórek w trójwymiarowym otoczeniu, przy jednoczesnym zachowaniu mikrośrodowiska komórki. Ten test jest odpowiedni dla rzadkich i/lub wrażliwych komórek.

Ruch w górę: prosty i elastyczny protokół trójwymiarowego testu inwazyjnego in vitro

Ten artykuł przedstawia kompleksową procedurę oceny in vitro, czy klasyczna angiogeneza nowotworów występuje w naczyniakach zarodkowych (HBs) i jaka jest jej rola w HBs. Wyniki podkreślają złożoność neowaskularyzacji HB i sugerują, że ta powszechna forma angiogenezy jest jedynie mechanizmem uzupełniającym w neowaskularyzacji HB.

Kompleksowa procedura oceny wydajności in vitro przypuszczalnego neowaskularyzmu naczyniaka zarodkowego przy użyciu testu kiełkowania sferoidalnego

Poznaj metodę in vitro do oceny przyciągania makrofagów przez komórki nowotworowe. To badanie pomaga zrozumieć interakcje w mikrośrodowisku guza i wspiera rozwój spersonalizowanych terapii przeciwnowotworowych.

Test in vitro w celu zbadania interakcji między guzem a makrofagami

Przeglądaj więcej filmów