Mysi model przewlekłego hamowania CDK9 oparty na linii komórkowej w celu zbadania rozległych niegenetycznych wad wydłużenia transkrypcji^{(zdecydowanie TE}) w nowotworach

Biorąc pod uwagę, że nowotwory TEdeff są istotną przeszkodą w immunoterapii, nasz model farmakologiczny jest korzystnym narzędziem, ponieważ odpowiednio naśladuje rozległe defekty transkrypcyjne i epigenetyczne obserwowane w takich nowotworach i pozwala badać te nieprawidłowości niegenetyczne w celu uzyskania nowych spostrzeżeń, znalezienia nowych zastosowań dla istniejących leków lub znalezienia nowych strategii przeciwko takim nowotworom. Jest to łatwy do ustalenia i uogólniony model do badania defektów wydłużenia transkrypcji w nowotworach, umożliwiający badanie interakcji między nowotworem a układem odpornościowym zarówno in vitro, jak i in vivo. Metodę tę można również zastosować do linii raka u ludzi.

Przetestowaliśmy to na T47D i CAL51 przez krótki czas, co dało początek podobnym cechom TEdeff. Protokół, który tutaj opisujemy, daje podstawowe ramy do minimalizacji znanych zmiennych krytycznych dla generowania cech podobnych do TEdeff przez przewlekłe hamowanie CDK9. Należy jednak zachować ostrożność, aby zoptymalizować dokładną subletalną dawkę flawopirydolu dla innych linii mysich.

Wpływ różnic w gęstości posiewu komórek, warunkach hodowli, warunkach stymulacji cytokin może być różny dla różnych linii komórkowych myszy. Zacznij od ekstrakcji poliA-dodatniego RNA z połowy wcześniej zubożonych w rybosomalny RNA próbek za pomocą kulek magnetycznych oligo dT. Ponownie zawiesić kulki w fiolce, wirując przez 30 sekund i przenieść 200 mikrolitrów kulek do probówki.

Dodaj równą objętość buforu wiążącego i wymieszaj zawartość. Umieść probówkę w magnesie na jedną minutę i wyrzuć supernatant. Następnie wyjmij rurkę z magnesu i ponownie zawieś umyte kulki w 100 mikrolitrach buforu wiążącego.

Dostosuj objętość próbki zubożonej w rybosomalne RNA do 100 mikrolitrów za pomocą 10-milimolowego Tris-HCl o pH 7,5. Dodać 100 mikrolitrów buforu wiążącego do próbki. Podgrzej mieszaninę do 65 stopni Celsjusza przez dwie minuty, aby rozbić drugorzędowe struktury RNA, a następnie natychmiast umieść ją na lodzie.

Dodaj 200 mikrolitrów całkowitego RNA do 100 mikrolitrów umytych kulek i dokładnie mieszaj na rotorze przez pięć minut. Umieść probówkę na magnesie na jedną do dwóch minut, ostrożnie usuń cały supernatant, a następnie wyjmij rurkę z magnesu i dodaj 200 mikrolitrów buforu myjącego. Ostrożnie wymieszać próbkę, pipetując kilka razy w górę i w dół, umieścić probówkę z powrotem na magnesie na jedną minutę i usunąć supernatant.

Następnie użyj spektrofotometru, aby zmierzyć czystość i stężenie izolowanego mRNA związanego z kulkami. Użyj pozostałej połowy próbki zubożonej w rybosomalny RNA jako dane wejściowe do kolumn białka A w celu immunoprecypitacji pięciu podstawowych RNA z przeciwciałem monoklonalnym 7-metyloguanozyny. Przemyj kulki magnetyczne białka A z zestawu RIP zgodnie z protokołem producenta w celu wstępnego związania przeciwciała z kulkami, przeciwciała 7-metyloguanozyny z kulką zawieszonej w 100 mikrolitrach buforu do płukania z zestawu.

Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut, obracając się z małą prędkością. Następnie krótko odwiruj probówki i umieść je na separatorze magnetycznym. Usunąć i wyrzucić supernatant, a następnie zdjąć probówki z separatora magnetycznego i ponownie zawiesić kulki za pomocą 500 mikrolitrów buforu do płukania.

Zwirować probówki, krótko je odwirować i umieścić z powrotem na separatorze magnetycznym, a następnie ponownie wyrzucić supernatant. Następnie dodaj 120 nanogramów rybosomalnego RNA zubożonego w RNA do kulek związanych z przeciwciałami wraz z jednym mikrolitrem inhibitora RNazy i inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 60 do 90 minut z łagodnym mieszaniem. Po inkubacji odwirować próbkę z prędkością 300 razy g przez 10 sekund i przenieść supernatant z nieosłoniętym mRNA do nowej probówki do mikrowirówki.

Powtórz płukanie jeszcze dwa razy ze 100 mikrolitrami buforu do płukania i połącz zebrany supernatant. Eluować zasklepione mRNA z kulek, dodając 300 mikrolitrów buforu do lizy mocznika przygotowanego zgodnie z instrukcjami manuskryptu i podgrzewając mieszaninę do 65 stopni Celsjusza przez dwie do trzech minut. Połączyć 300 mikrolitrów eluowanej próbki z 300 mikrolitrami fenolu: chloroformu: alkoholu izoamylowego, odwrócić do wymieszania i pozostawić na 10 minut.

Delikatnie wymieszać próbkę ponownie i odwirować przez dwie minuty. Ostrożnie odpipetować górną warstwę do świeżej probówki i wyrzucić dolną warstwę. Do próbki dodać 300 mikrolitrów 2-propanolu i 30 mikrolitrów trzymolowego octanu sodu, kilkakrotnie odwrócić i umieścić w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na 20 godzin.

Po inkubacji odwirować próbkę przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie wyrzuć supernatant i susz osad w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Zawiesić osad w wodzie wolnej od nukleaz i zmierzyć czystość i stężenie RNA za pomocą spektrofotometru.

Wyizolować komórki CD8-dodatnie zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, a następnie ponownie zawiesić komórki w dostępnym na rynku buforze systemu separacji magnetycznej. Dodaj 100 mikrolitrów koktajlu przeciwciał na każdy mililitr komórek i inkubuj komórki na lodzie przez 15 minut. Następnie dodaj 100 mikrolitrów kulek magnetycznych na każde 100 mikrolitrów koktajlu przeciwciał i pozostaw komórki na lodzie na kolejne 15 minut.

Po inkubacji dodaj siedem mililitrów buforu do separacji magnetycznej do komórek, podwielokrotność trzech do czterech mililitrów do świeżej probówki i umieść probówkę na magnesie na pięć minut. Zdekantować ciecz z komórkami CD8-dodatnimi do świeżej probówki na lodzie. Następnie dodaj pozostałe trzy do czterech mililitrów komórek do kulek magnetycznych i umieść rurkę na magnesie na pięć minut.

Zdekantować drugą partię komórek CD8-dodatnich do probówki z pierwszą partią. Nasiona zmodyfikowały przylegające komórki fibroblastów SAMBOK wraz z cząsteczką kostymulującą w ilości 75 000 komórek na studzienkę na 24-dołkowych płytkach i hodowały je w inkubatorze nawilżanym dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5%. Po 24 godzinach przemyj monowarstwę APC raz zmodyfikowanym pożywką Dulbecco firmy Iscove i dodaj 0,5 razy 10 do sześciu naiwnych komórek w dwóch mililitrach pożywki uzupełnionej zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.

Hoduj komórki przez 20 godzin, a następnie delikatnie zbierz nieprzylegające komórki OT-I, zbierając pożywkę i granulując komórki w temperaturze 191 razy g przez dwie minuty. Policz komórki i zasiej je w stosunku jeden do jednego we wspólnej hodowli z komórkami B16/F10, nietraktowanymi komórkami B16/F10-OVA i B16/F10-OVA wstępnie potraktowanymi flawopirydolem. Hoduj komórki przez 20 godzin w inkubatorze nawilżanym dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5%, a następnie usuń komórki OT-I CD8-dodatnie i umyj przylegające komórki B16 / F10-OVA w PBS.

Trypsynizować trzy grupy przyłączonych komórek w 05% EDTA trypsyną przez pięć minut, a następnie granulować je w ilości 191 razy g przez pięć minut. Inkubować pobrane komórki B16 / F10-OVA w zimnym PBS z barwnikiem żywotności i odpowiednimi znakowanymi przeciwciałami, a następnie przeanalizować żywotność za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół ten został wykorzystany do ustanowienia wadliwego modelu komórkowego z wydłużeniem transkrypcji, który wykazuje głęboką utratę fosforylacji w pozycji seryny 2 na C-końcowej domenie powtórzeń polimerazy RNA II i znaczny spadek H3K36me3, co jest związane z definiowaniem granic eksonów i hamowaniem niekontrolowanych transkrypcji kryptycznych.

Komórki wykazują krytyczne defekty przetwarzania mRNA z rosnącymi proporcjami nieprawidłowo zamkniętych i niepoliadenylowanych mRNA. Ponadto w tym modelu komórkowym obserwuje się specyficzną represję kluczowych genów szlaku odpowiedzi zapalnej i śmierć komórki, w której pośredniczy FasL. Test eksploracyjny mający na celu sprawdzenie, czy model komórkowy nadaje odporność na cytotoksyczny atak limfocytów T, pokazuje, że przewlekłe defekty wydłużenia transkrypcji wywołane flawopirydolem mogą zapewnić sposób ucieczki przed przeciwnowotworowym atakiem immunologicznym.

Komórki B16 / F10 traktowane flawopirydolem stabilnie z nadekspresją genu OVA nie były podatne na cytotoksyczne limfocyty T CD8-dodatnie, które mają selektywną toksyczność w stosunku do komórek wykazujących ekspresję OVA. Komórki, które nie były wcześniej leczone flawopirydolem, uległy znacznej śmierci komórkowej, podczas gdy rodzicielskie B16/F10, które nie wykazują ekspresji antygenu OVA, przeżyły. Należy pamiętać, że obniżenie poziomu trimetylacji fosfoseryny 2 i H3K36 po leczeniu flawopirydolem 25-nanomolowym nie gwarantuje obniżenia zarówno poziomu fosfoseryny2, jak i fosfo-NF-kappaB.

Każda linia raka myszy jest unikalna, a JAK1 i CCNT1 mogą uratować działanie flawopirydolu. Ponadto model ten może być stosowany in vivo do monitorowania oporności nowotworów TEdeff na wrodzone i adaptacyjne przeciwnowotworowe odpowiedzi immunologiczne. Na przykład terapie anty-asialo mogą być stosowane do regulowania aktywności komórek NK, a terapia immunologicznych punktów kontrolnych może być podawana myszom z guzem TEdeff.

Obciążenie limfocytami naciekającymi nowotwór lub TIL jest wskaźnikiem sukcesu w immunoterapii. Nasz model utorował nam drogę do zbadania zakresu aktywacji i wyczerpania TIL w mikrośrodowisku raka TEdeff zarówno przed, jak i po immunoterapii.