Name: Mysi model przewlekłego hamowania CDK9 oparty na linii komórkowej w celu zbadania rozległych niegenetycznych wad wydłużenia transkrypcji(zdecydowanie TE) w nowotworach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Poznaj model mysiej linii komórkowej z przewlekłym hamowaniem CDK9 do badania niegenetycznych wad wydłużenia transkrypcji w nowotworach. Metoda umożliwia analizę interakcji nowotworowo-immunologicznych in vitro i in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez NCI (CA193549) i CCHMC Research Innovation Pilot Award dla Kakajana Komurova oraz nagrodę Departamentu Obrony (BC150484) dla Navneet Singh. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Cancer Institute lub Departamentu Obrony. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji ani przygotowaniu manuskryptu.

<ol><li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II%3A+emerging+roles+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (10), (2012).</li>
<li>Margaritis, T., Holstege, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poised+RNA+polymerase+II+gives+pause+for+thought%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Poised RNA polymerase II gives pause for thought.</a> Cell. 133 (4), 581-584 (2008).</li>
<li>Modur, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+transcription+elongation+in+a+subset+of+cancers+confers+immunotherapy+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Defective transcription elongation in a subset of cancers confers immunotherapy resistance.</a> Nature Communications. 9 (1), 4410(2018).</li>
<li>Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+inducible+gene+expression+by+signal-dependent+transcriptional+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation.</a> Cell. 138 (1), 129-145 (2009).</li>
<li>Adelman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+mediators+of+the+inflammatory+response+are+poised+for+gene+activation+through+RNA+polymerase+II+stalling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Immediate mediators of the inflammatory response are poised for gene activation through RNA polymerase II stalling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (43), 18207-18212 (2009).</li>
<li>van Stipdonk, M. J., Lemmens, E. E., Schoenberger, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%C3%AFve+CTLs+Require+a+Single+Brief+Period+of+Antigenic+Stimulation+for+Clonal+Expansion+and+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Naïve CTLs Require a Single Brief Period of Antigenic Stimulation for Clonal Expansion and Differentiation.</a> Nature Immunology. 2 (5), 423-429 (2001).</li>
<li>Gilchrist, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulating+the+regulators%3A+the+pervasive+effects+of+Pol+II+pausing+on+stimulus-responsive+gene+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Regulating the regulators: the pervasive effects of Pol II pausing on stimulus-responsive gene networks.</a> Genes & Development. 26 (9), 933-944 (2012).</li>
<li>Danko, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+differentially+affect+RNA+polymerase+II+initiation%2C+pausing%2C+and+elongation+rate+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways differentially affect RNA polymerase II initiation, pausing, and elongation rate in cells.</a> Molecular Cell. 50 (2), 212-222 (2013).</li>
<li>Nechaev, S., Adelman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pol+II+waiting+in+the+starting+gates%3A+Regulating+the+transition+from+transcription+initiation+into+productive+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Gene+Regulatory+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Pol II waiting in the starting gates: Regulating the transition from transcription initiation into productive elongation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms. 1809 (1), 34-45 (2011).</li>
<li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tat+modifies+the+activity+of+CDK9+to+phosphorylate+serine+5+of+the+RNA+polymerase+II+carboxyl-terminal+domain+during+human+immunodeficiency+virus+type+1+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tat modifies the activity of CDK9 to phosphorylate serine 5 of the RNA polymerase II carboxyl-terminal domain during human immunodeficiency virus type 1 transcription.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5077-5086 (2000).</li>
<li>Palancade, B., Bensaude, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+RNA+polymerase+II+carboxyl%E2%80%90terminal+domain+%28CTD%29+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Investigating RNA polymerase II carboxyl‐terminal domain (CTD) phosphorylation.</a> European Journal of Biochemistry. 270 (19), 3859-3870 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kontrola elongacji RNA Pol II stała się decydującą dźwignią do regulacji ekspresji genów reagujących na bodźce z korzyścią dla komórek nowotworowych 5,7,8. Pokonanie proksymalnej pauzy promotora do elongacji i późniejszej produkcji mRNA wymaga aktywności kinazy P-TEFb 9,10,11. Nasz model wykorzystuje flawopirydol (25 nM), inhibitor niez...

Kluczowym krokiem ograniczającym szybkość ekspresji prawie wszystkich aktywnych genów jest przejście polimerazy RNA II (RNA Pol II) od promotora-proksymalnej pauzy do produktywnego wydłużenia1,2. Biorąc pod uwagę, że epigenetyczna dysregulacja wydłużenia transkrypcji pomaga w progresji wielu ludzkich nowotworów złośliwych definiowanych jako TEdefinitywnie, prowadząc do nieoptymalnej sygnalizacji w szlakach odpowiedzi pro-zapalnej, co oznacza słabą odpowiedź i wynik immunoterapii3, nadrzędnym celem tego protokołu jest ustanowienie użytecznego modelu in vitro do badania tych powszechnych niegenetycznych nieprawidłowości transkrypcyjnych w nowotworach. W tym świetle zastosowanie przewlekłego farmakologicznego hamowania CDK9 jest skuteczną strategią tworzenia uogólnionego modelu niegenetycznego powszechnego zakłócenia w wydłużaniu transkrypcji i defektach przetwarzania mRNA. Uzasadnieniem stosowania przewlekłego hamowania CDK9 jest to, że znosi on fosforylację reszty seryny 2 na C-końcowej domenie powtórzeń (CTD) RNA Pol II, hamując w ten sposób uwalnianie RNA Pol II do produktywnego wydłużania transkrypcji. Również nowotwory TE, opisane wcześniej przez naszą grupę3, nie są klasyfikowane do żadnej konkretnej mutacji somatycznej. Dlatego korzystny jest model niegenetyczny (farmakologiczny), który najlepiej naśladuje obserwowane w nich powszechne defekty transkrypcyjne i epigenetyczne. Przedstawiona w niniejszym dokumencie metoda szczegółowo opisuje generowanie i charakterystykę modelu przewlekłego leczenia flawopirydolem mysich komórek rakowych. Metoda ta w sposób oczywisty zakłóca wydłużanie transkrypcji wzdłuż genów charakteryzujących się dłuższymi długościami genomu, z przygotowanymi promotorami i indukowalnymi ekspresjami, takimi jak TNF/NF-κB i sygnalizacja interferonu/STAT, głęboko kontrolowanymi na poziomie wydłużenia transkrypcji3,4,5. Ogólnie rzecz biorąc, ten zoptymalizowany model defektów wydłużenia transkrypcji linii komórkowej myszy – jedyny model, o którym wiemy, do badania nowo opisanych guzów TE– napędza oporność na przeciwnowotworowy atak immunologiczny, tworząc użyteczny system do wykorzystywania i badania podatności niegenetycznych wad w podstawowej maszynerii transkrypcyjnej w nowotworach w porównaniu z atakiem komórek za pośrednictwem układu immunologicznego.

<table><tbody><tr><td>hhis6FasL</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>5452</td><td></td></tr><tr><td>10X TBS</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6435</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowe płytki</td><td>Falcon</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>20% metanolu</td><td>Fisher Chemical</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki</td><td>Falcon</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 18% SDS żel poliakrylamidowy</td><td>Bio-Rad</td><td>4561086</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>5% mleczko w proszku</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało 7-metyloguanozynowe</td><td>BioVision</td><td>6655-30T</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe</td><td>Cellstar</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>AF647-skoniugowana mysz CD8</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>100727</tr><tr><td>antybiotyk i antybiotyk przeciwgrzybiczy</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-He</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>2366&thinsp; Sygnalizacja</td> komórkowa P <td></td></tr><tr><td>Anti-Rabit</td><td></td><td>7074</td><td>Rozcieńczenie 1:5000</td></tr><tr><td>Sygnalizacja</td><td>komórkowa przeciw szczurom</td><td>Rozcieńczenie 7077S</td><td>1:5000</td></tr><tr><td>Zestaw testowy Bradforda</td><td>Bio-Rad</td><td>5000121</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>ACROS Organics</td><td>24040-0100</td><td></td></tr><tr><td>BV421-sprzężona mysz CD45</td><td>Biolegend</td><td>109831</td><td></td></tr><tr><td>krystaliczny fiolet</td><td>Sigma</td><td>C3886-100G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Oligo (dT)25</td><td>Ambion</td><td>61002</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>45015</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Live/Dead baring dye e780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>Flavopiridol</td><td>Selleckchem</td><td>S1230</td><td></td></tr><tr><td>H3k36me3</td><td>Abcam</td><td>ab9050</td><td>Rozcieńczenie 1:2000</td></tr><tr><td>IFN-&alpha;</td><td>R& Systemy D</td><td>12100-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&gamma;</td><td>R& D systems</td><td>485-MI-100</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Western Chemiluminescencyjny substrat HRP</td><td>Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>MojoSort Mouse CD8 Zestaw do izolacji komórek T</td><td>Biolegend</td><td>480007</td><td></td></tr><tr><td>NF-&kappa; Sygnalizacja</td><td>komórkowa</td> B <td>8242s</td><td>Rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>p-NF-&kappa; Sygnalizacja</td><td>komórkowa</td> B <td>3033s</td><td>Rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>p-Ser2-RNAPII</td><td>Aktywny motyw</td><td>61083</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>p-Ser5-RNAPII</td><td>Aktywny motyw</td><td>61085</td><td>Rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>p-STAT1</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>7649s</td><td>Rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>Zestaw eukariotów RiboMinu</td><td>Ambion A10837-08</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor RIPA</td><td>Santa Cruz Biotechnologia</td><td>sc-24948</td><td></td></tr><tr><td>RNAPII</td><td>Aktywny motyw</td><td>61667</td><td>Rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>STAT1</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>9175s</td><td>Rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>TNF-&alfa;</td><td>R& Systemy D</td><td>410-MT-010</td><td></td></tr><tr>całkowita <td>sygnalizacja komórkowa</td><td>H3</td><td>4499</td><td>Rozcieńczenie 1:2000</td></tr><tr><td>Tri odczynnik</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>AA Hoefer</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Sygnalizacja komórkowa aktyny</td><td></td><td>12620S</td><td>Rozcieńczenie 1:5000</td></tr><tr><td>&beta;-ME</td><td>G Nauki biologiczne</td><td>BC98</td><td></td></tr></tbody></table>

mysi model przewlekłego hamowania cdk9 oparty na linii komórkowej w celu zbadania rozległych niegenetycznych wad wydłużenia transkrypcji(zdecydowanie te) w nowotworach

A Murine Cell Line Based Model of Chronic CDK9 Inhibition to Study Widespread Non-Genetic Transcriptional Elongation Defects (TEdeff) in Cancers

Wcześniej informowaliśmy, że podzbiór nowotworów jest definiowany przez globalne deregulacje transkrypcji z powszechnymi niedoborami w wydłużaniu transkrypcji mRNA (TE) - takie nowotwory nazywamyzdecydowanie TE. Warto zauważyć, że nowotwory TEzdecydowanie charakteryzują się fałszywą transkrypcją i wadliwym przetwarzaniem mRNA w dużym zestawie genów, takich jak szlaki interferonu/JAK/STAT i TNF/NF-κB, co prowadzi do ich supresji. Zdecydowanie podtyp TE nowotworów u pacjentów z rakiem nerkowokomórkowym i czerniakiem z przerzutami istotnie koreluje ze słabą odpowiedzią i wynikami immunoterapii. Biorąc pod uwagę znaczenie badania TEzdecydowanie nowotworów - ponieważ zwiastuje to istotną przeszkodę na drodze do immunoterapii - celem tego protokołu jestustanowienie zdecydowanie mysiego modelu TE in vitro w celu zbadania tych powszechnych, niegenetycznych nieprawidłowości transkrypcji w nowotworach i uzyskania nowych spostrzeżeń, nowych zastosowań istniejących leków lub znalezienia nowych strategii przeciwko takim nowotworom. Szczegółowo opisujemy zastosowanie przewlekłego hamowania CDK9 za pośrednictwem flawopirydolu w celu zniesienia fosforylacji reszty seryny 2 na C-końcowej domenie powtórzeń (CTD) polimerazy RNA II (RNA Pol II), hamując uwalnianie RNA Pol II do produktywnego wydłużania transkrypcji. Biorąc pod uwagę, że nowotworyTE zdecydowanie nie są klasyfikowane do żadnej konkretnej mutacji somatycznej, model farmakologiczny jest korzystny i najlepiej naśladuje obserwowane w nich powszechne defekty transkrypcyjne i epigenetyczne. Zastosowanie zoptymalizowanej subletalnej dawki flawopirydolu jest jedyną skuteczną strategią w tworzeniu uogólnionego modelu niegenetycznego powszechnego zaburzenia wydłużania transkrypcji i defektów przetwarzania mRNA, ściśle naśladując klinicznie obserwowanecechy zdecydowanie TE. Dlatego ten model TEzdecydowanie może być wykorzystany do analizy, autonomicznych czynników komórkowych, umożliwiając im oparcie się atakowi komórkowemu za pośrednictwem układu immunologicznego.

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy szczegółowy schemat (Rycina 1) ustanowienia modelu komórkowego TEdeff, otrzymanego poprzez chroniczną subletalną (Rycina 2) terapię flavopiridolem w stężeniu 25 nM. Na Rycynie 3 widać, że po 3 dniach traktowania flavopiridolem komórki B16 OVA wykazują częściowe cechy TEdeff, natomiast po tygodniu terapii komórki B16/F10 OVA wykazują głęboki...

Protokół szczegółowo opisuje model raka mysiego in vitro o niegenetycznym wadliwym wydłużeniu transkrypcji. W tym przypadku przewlekłe hamowanie CDK9 jest wykorzystywane do tłumienia produktywnego wydłużania RNA Pol II wzdłuż genów odpowiedzi prozapalnej w celu naśladowania i badania klinicznie obserwowanego zjawiska zdecydowanie TE, obecnego w około 20% wszystkich typów raka.

Mysi model przewlekłego hamowania CDK9 oparty na linii komórkowej w celu zbadania rozległych niegenetycznych wad wydłużenia transkrypcji(zdecydowanie TE) w nowotworach

We have previously reported that a subset of cancers is defined by global transcriptional deregulations with widespread deficiencies in mRNA transcription ...

Biorąc pod uwagę, że nowotwory TEdeff są istotną przeszkodą w immunoterapii, nasz model farmakologiczny jest korzystnym narzędziem, ponieważ odpowiednio naśladuje rozległe defekty transkrypcyjne i epigenetyczne obserwowane w takich nowotworach i pozwala badać te nieprawidłowości niegenetyczne w celu uzyskania nowych spostrzeżeń, znalezienia nowych zastosowań dla istniejących leków lub znalezienia nowych strategii przeciwko takim nowotworom. Jest to łatwy do ustalenia i uogólniony model do badania defektów wydłużenia transkrypcji w nowotworach, umożliwiający badanie interakcji między nowotworem a układem odpornościowym zarówno in vitro, jak i in vivo. Metodę tę można również zastosować do linii raka u ludzi.Przetestowaliśmy to na T47D i CAL51 przez krótki czas, co dało początek podobnym cechom TEdeff. Protokół, który tutaj opisujemy, daje podstawowe ramy do minimalizacji znanych zmiennych krytycznych dla generowania cech podobnych do TEdeff przez przewlekłe hamowanie CDK9. Należy jednak zachować ostrożność, aby zoptymalizować dokładną subletalną dawkę flawopirydolu dla innych linii mysich.Wpływ różnic w gęstości posiewu komórek, warunkach hodowli, warunkach stymulacji cytokin może być różny dla różnych linii komórkowych myszy. Zacznij od ekstrakcji poliA-dodatniego RNA z połowy wcześniej zubożonych w rybosomalny RNA próbek za pomocą kulek magnetycznych oligo dT. Ponownie zawiesić kulki w fiolce, wirując przez 30 sekund i przenieść 200 mikrolitrów kulek do probówki.Dodaj równą objętość buforu wiążącego i wymieszaj zawartość. Umieść probówkę w magnesie na jedną minutę i wyrzuć supernatant. Następnie wyjmij rurkę z magnesu i ponownie zawieś umyte kulki w 100 mikrolitrach buforu wiążącego.Dostosuj objętość próbki zubożonej w rybosomalne RNA do 100 mikrolitrów za pomocą 10-milimolowego Tris-HCl o pH 7,5. Dodać 100 mikrolitrów buforu wiążącego do próbki. Podgrzej mieszaninę do 65 stopni Celsjusza przez dwie minuty, aby rozbić drugorzędowe struktury RNA, a następnie natychmiast umieść ją na lodzie.Dodaj 200 mikrolitrów całkowitego RNA do 100 mikrolitrów umytych kulek i dokładnie mieszaj na rotorze przez pięć minut. Umieść probówkę na magnesie na jedną do dwóch minut, ostrożnie usuń cały supernatant, a następnie wyjmij rurkę z magnesu i dodaj 200 mikrolitrów buforu myjącego. Ostrożnie wymieszać próbkę, pipetując kilka razy w górę i w dół, umieścić probówkę z powrotem na magnesie na jedną minutę i usunąć supernatant.Następnie użyj spektrofotometru, aby zmierzyć czystość i stężenie izolowanego mRNA związanego z kulkami. Użyj pozostałej połowy próbki zubożonej w rybosomalny RNA jako dane wejściowe do kolumn białka A w celu immunoprecypitacji pięciu podstawowych RNA z przeciwciałem monoklonalnym 7-metyloguanozyny. Przemyj kulki magnetyczne białka A z zestawu RIP zgodnie z protokołem producenta w celu wstępnego związania przeciwciała z kulkami, przeciwciała 7-metyloguanozyny z kulką zawieszonej w 100 mikrolitrach buforu do płukania z zestawu.Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut, obracając się z małą prędkością. Następnie krótko odwiruj probówki i umieść je na separatorze magnetycznym. Usunąć i wyrzucić supernatant, a następnie zdjąć probówki z separatora magnetycznego i ponownie zawiesić kulki za pomocą 500 mikrolitrów buforu do płukania.Zwirować probówki, krótko je odwirować i umieścić z powrotem na separatorze magnetycznym, a następnie ponownie wyrzucić supernatant. Następnie dodaj 120 nanogramów rybosomalnego RNA zubożonego w RNA do kulek związanych z przeciwciałami wraz z jednym mikrolitrem inhibitora RNazy i inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 60 do 90 minut z łagodnym mieszaniem. Po inkubacji odwirować próbkę z prędkością 300 razy g przez 10 sekund i przenieść supernatant z nieosłoniętym mRNA do nowej probówki do mikrowirówki.Powtórz płukanie jeszcze dwa razy ze 100 mikrolitrami buforu do płukania i połącz zebrany supernatant. Eluować zasklepione mRNA z kulek, dodając 300 mikrolitrów buforu do lizy mocznika przygotowanego zgodnie z instrukcjami manuskryptu i podgrzewając mieszaninę do 65 stopni Celsjusza przez dwie do trzech minut. Połączyć 300 mikrolitrów eluowanej próbki z 300 mikrolitrami fenolu: chloroformu: alkoholu izoamylowego, odwrócić do wymieszania i pozostawić na 10 minut.Delikatnie wymieszać próbkę ponownie i odwirować przez dwie minuty. Ostrożnie odpipetować górną warstwę do świeżej probówki i wyrzucić dolną warstwę. Do próbki dodać 300 mikrolitrów 2-propanolu i 30 mikrolitrów trzymolowego octanu sodu, kilkakrotnie odwrócić i umieścić w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na 20 godzin.Po inkubacji odwirować próbkę przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie wyrzuć supernatant i susz osad w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Zawiesić osad w wodzie wolnej od nukleaz i zmierzyć czystość i stężenie RNA za pomocą spektrofotometru.Wyizolować komórki CD8-dodatnie zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, a następnie ponownie zawiesić komórki w dostępnym na rynku buforze systemu separacji magnetycznej. Dodaj 100 mikrolitrów koktajlu przeciwciał na każdy mililitr komórek i inkubuj komórki na lodzie przez 15 minut. Następnie dodaj 100 mikrolitrów kulek magnetycznych na każde 100 mikrolitrów koktajlu przeciwciał i pozostaw komórki na lodzie na kolejne 15 minut.Po inkubacji dodaj siedem mililitrów buforu do separacji magnetycznej do komórek, podwielokrotność trzech do czterech mililitrów do świeżej probówki i umieść probówkę na magnesie na pięć minut. Zdekantować ciecz z komórkami CD8-dodatnimi do świeżej probówki na lodzie. Następnie dodaj pozostałe trzy do czterech mililitrów komórek do kulek magnetycznych i umieść rurkę na magnesie na pięć minut.Zdekantować drugą partię komórek CD8-dodatnich do probówki z pierwszą partią. Nasiona zmodyfikowały przylegające komórki fibroblastów SAMBOK wraz z cząsteczką kostymulującą w ilości 75 000 komórek na studzienkę na 24-dołkowych płytkach i hodowały je w inkubatorze nawilżanym dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5%. Po 24 godzinach przemyj monowarstwę APC raz zmodyfikowanym pożywką Dulbecco firmy Iscove i dodaj 0,5 razy 10 do sześciu naiwnych komórek w dwóch mililitrach pożywki uzupełnionej zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.Hoduj komórki przez 20 godzin, a następnie delikatnie zbierz nieprzylegające komórki OT-I, zbierając pożywkę i granulując komórki w temperaturze 191 razy g przez dwie minuty. Policz komórki i zasiej je w stosunku jeden do jednego we wspólnej hodowli z komórkami B16/F10, nietraktowanymi komórkami B16/F10-OVA i B16/F10-OVA wstępnie potraktowanymi flawopirydolem. Hoduj komórki przez 20 godzin w inkubatorze nawilżanym dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5%, a następnie usuń komórki OT-I CD8-dodatnie i umyj przylegające komórki B16 / F10-OVA w PBS.Trypsynizować trzy grupy przyłączonych komórek w 05% EDTA trypsyną przez pięć minut, a następnie granulować je w ilości 191 razy g przez pięć minut. Inkubować pobrane komórki B16 / F10-OVA w zimnym PBS z barwnikiem żywotności i odpowiednimi znakowanymi przeciwciałami, a następnie przeanalizować żywotność za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół ten został wykorzystany do ustanowienia wadliwego modelu komórkowego z wydłużeniem transkrypcji, który wykazuje głęboką utratę fosforylacji w pozycji seryny 2 na C-końcowej domenie powtórzeń polimerazy RNA II i znaczny spadek H3K36me3, co jest związane z definiowaniem granic eksonów i hamowaniem niekontrolowanych transkrypcji kryptycznych.Komórki wykazują krytyczne defekty przetwarzania mRNA z rosnącymi proporcjami nieprawidłowo zamkniętych i niepoliadenylowanych mRNA. Ponadto w tym modelu komórkowym obserwuje się specyficzną represję kluczowych genów szlaku odpowiedzi zapalnej i śmierć komórki, w której pośredniczy FasL. Test eksploracyjny mający na celu sprawdzenie, czy model komórkowy nadaje odporność na cytotoksyczny atak limfocytów T, pokazuje, że przewlekłe defekty wydłużenia transkrypcji wywołane flawopirydolem mogą zapewnić sposób ucieczki przed przeciwnowotworowym atakiem immunologicznym.Komórki B16 / F10 traktowane flawopirydolem stabilnie z nadekspresją genu OVA nie były podatne na cytotoksyczne limfocyty T CD8-dodatnie, które mają selektywną toksyczność w stosunku do komórek wykazujących ekspresję OVA. Komórki, które nie były wcześniej leczone flawopirydolem, uległy znacznej śmierci komórkowej, podczas gdy rodzicielskie B16/F10, które nie wykazują ekspresji antygenu OVA, przeżyły. Należy pamiętać, że obniżenie poziomu trimetylacji fosfoseryny 2 i H3K36 po leczeniu flawopirydolem 25-nanomolowym nie gwarantuje obniżenia zarówno poziomu fosfoseryny2, jak i fosfo-NF-kappaB.Każda linia raka myszy jest unikalna, a JAK1 i CCNT1 mogą uratować działanie flawopirydolu. Ponadto model ten może być stosowany in vivo do monitorowania oporności nowotworów TEdeff na wrodzone i adaptacyjne przeciwnowotworowe odpowiedzi immunologiczne. Na przykład terapie anty-asialo mogą być stosowane do regulowania aktywności komórek NK, a terapia immunologicznych punktów kontrolnych może być podawana myszom z guzem TEdeff.Obciążenie limfocytami naciekającymi nowotwór lub TIL jest wskaźnikiem sukcesu w immunoterapii. Nasz model utorował nam drogę do zbadania zakresu aktywacji i wyczerpania TIL w mikrośrodowisku raka TEdeff zarówno przed, jak i po immunoterapii.

a-murine-cell-line-based-model-chronic-cdk9-inhibition-to-study

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Szybki i prosty sposób na wygenerowanie ludzkich linii komórkowych z indukowalną i odwracalną nadekspresją cDNA lub nokautem za pośrednictwem shRNA interesującego genu. Metoda ta umożliwia naukowcom wiarygodne i wysoce powtarzalne manipulowanie liniami komórkowymi, które są trudne do zmiany za pomocą przejściowych metod transfekcji lub konwencjonalnych strategii knockdown/knockout.

Generowanie stabilnych linii komórek ludzkich z ekspresją shRNA lub cDNA indukowaną tetracykliną (Tet-on)

Aktywacja utajonych mutacji z adenowirusem-Cre w systemie przewodowym sutka powoduje klinicznie istotny przerzutowy rak piersi. Włączenie promotora YFP umożliwia śledzenie dystalnych komórek nowotworowych z przerzutami. Model ten jest przydatny do badania utajonych przerzutów, odporności przeciwnowotworowej oraz do projektowania nowych immunoterapii w leczeniu raka piersi.

Inicjacja przerzutowego raka piersi poprzez celowanie w nabłonek przewodowy za pomocą Adenovirus-Cre: nowy transgeniczny mysi model raka piersi

Telomery i telomeraza odgrywają istotną rolę w procesie starzenia się i nowotworzenia. Celem tego protokołu jest pokazanie, w jaki sposób wygenerować dwa mysie indukowane allele knock-in telomerazy i jak je wykorzystać w badaniach nad degeneracją/regeneracją tkanek i rakiem.

Wykorzystanie mysich indukowanych alleli telomerazy w badaniach nad degeneracją/regeneracją tkanek i rakiem

Tutaj opisujemy metodę długoterminowej mikroskopii poklatkowej do długotrwałego śledzenia pojedynczych komórek w odpowiedzi na terapie przeciwnowotworowe.

Po drugiej stronie lustra: mikroskopia poklatkowa i podłużne śledzenie pojedynczych komórek w celu zbadania terapii przeciwnowotworowych

Ksenoprzeszczepy ludzkich nowotworów są unaczyniane i infiltrowane przez komórki pochodzenia mysiego podczas fazy wzrostu in vivo. Aby obejść odchylenia spowodowane przez te zanieczyszczające komórki podczas dalszej analizy, opracowaliśmy metodę pozwalającą na kompleksowe zubożenie wszystkich komórek myszy poprzez magnetyczne sortowanie komórek.

Zubożenie komórek myszy z ludzkich ksenoprzeszczepów nowotworowych znacznie poprawia dalszą analizę komórek docelowych

Ten manuskrypt zawiera procedurę techniczną, która może być użyta do scharakteryzowania hodowli komórek C1498 in vitro oraz ostrej białaczki wywołanej u myszy po ich wstrzyknięciu. Analizy fenotypowe i funkcjonalne wykonywane są za pomocą cytometrii przepływowej, mikroskopii immunofluorescencyjnej, cytochemii i barwienia Maya-Grünwalda Giemsy.

Szczegółowy protokół charakteryzujący mysią linię komórkową C1498 i związany z nią mysi model białaczki

Tutaj opisujemy protokoły genetycznej i chemicznej walidacji c-Fos i Dusp1 jako celu terapeutycznego w białaczce, używając genetycznych i humanizowanych modeli mysich in vitro i in vivo. Metodę tę można zastosować do dowolnego celu walidacji genetycznej i rozwoju terapeutycznego.

Metody oceny roli c-fos i dusp1 w zależności onkogenu

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju dominująco-ujemnego systemu indukcyjnego, w którym każde białko może być warunkowo dezaktywowane przez odwracalną nadekspresję jego dominująco-ujemnej wersji zmutowanej.

Indukowalne i odwracalne hamowanie białka dominująco-ujemnego (DN)

terapia miRNA ma znaczący potencjał w regulowaniu progresji raka. Zademonstrowano tu podejścia analityczne stosowane do identyfikacji aktywności kombinatorycznego leczenia miRNA w zatrzymywaniu cyklu komórkowego i angiogenezie.

Analiza skojarzonych zabiegów miRNA w celu regulacji cyklu komórkowego i angiogenezy

Rozwój modeli mysich z specyficznymi genami zmutowanymi u pacjentów z rakiem głowy i szyi jest niezbędny do zrozumienia nowotworów. W tym miejscu przedstawiamy protokół transformacji in vitro pierwotnych komórek języka myszy przy użyciu systemu Cas9 związanego z adenowirusem do generowania mysich linii komórkowych HNC ze specyficznymi zmianami genomowymi.

Ustanowienie in vitro genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej mysiego raka głowy i szyi przy użyciu systemu Cas9 związanego z adenowirusem

Protokół ten przedstawia metody hodowli, manipulowania i analizowania mysich CAF, w tym testy funkcjonalne in vitro/in vivo , transkryptomikę i analizę obliczeniową. Ponadto opisano w nim platformę internetową opracowaną w celu analizy publicznie dostępnych transkryptomów mikrowypreparowanych składników zrębu i nabłonka z kolekcji ludzkich nowotworów raka piersi.

Fibroblasty związane z rakiem z guzów sutka myszy jako narzędzia do badań molekularnych i obliczeniowych

Poznaj model mysiej linii komórkowej z przewlekłym hamowaniem CDK9 do badania niegenetycznych wad wydłużenia transkrypcji w nowotworach. Metoda umożliwia analizę interakcji nowotworowo-immunologicznych in vitro i in vivo.

Mysi model przewlekłego hamowania CDK9 oparty na linii komórkowej w celu zbadania rozległych niegenetycznych wad wydłużenia transkrypcji(zdecydowanie TE) w nowotworach (Wideo) | JoVE Journal

Mysi model przewlekłego hamowania CDK9 oparty na linii komórkowej w celu zbadania rozległych niegenetycznych wad wydłużenia transkrypcji^{(zdecydowanie TE}) w nowotworach

Przeglądaj więcej filmów