Name: Identyfikacja śladów RNA:Kompleksy białkowe poprzez immunoprecypitację RNA w tandemie, a następnie sekwencjonowanie (RIPiT-Seq) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Poznaj metodę RIPiT-Seq do identyfikacji regionów RNA wiążących się z białkami w komórkach ssaków. Technika ta umożliwia wzbogacanie endogennych kompleksów RNA:białko bez zależności od UV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez GM120209 grantowy NIH (GS). Autorzy dziękują OSUCCC Genomics Shared Resources Core za ich usługi (CCC Support Grant, NCI P30 CA16058).

<ol><li>Karousis, E. D., Nasif, S., Mühlemann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense-mediated+mRNA+decay%3A+novel+mechanistic+insights+and+biological+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Nonsense-mediated mRNA decay: novel mechanistic insights and biological impact.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 7 (5), 661-682 (2016).</li>
<li>Ivanov, P. V., Gehring, N. H., Kunz, J. B., Hentze, M. W., Kulozik, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+UPF1%2C+eRFs%2C+PABP+and+the+exon+junction+complex+suggest+an+integrated+model+for+mammalian+NMD+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Interactions between UPF1, eRFs, PABP and the exon junction complex suggest an integrated model for mammalian NMD pathways.</a> The EMBO Journal. 27 (5), 736-747 (2008).</li>
<li>Papasaikas, P., Valcárcel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Spliceosome%3A+The+Ultimate+RNA+Chaperone+and+Sculptor%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The Spliceosome: The Ultimate RNA Chaperone and Sculptor.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41 (1), 33-45 (2016).</li>
<li>Jensen, K. B., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIP%3A+Crosslinking+and+ImmunoPrecipitation+of+In+Vivo+RNA+Targets+of+RNA-Binding+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CLIP: Crosslinking and ImmunoPrecipitation of In Vivo RNA Targets of RNA-Binding Proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 488, Clifton, N.J. 85-98 (2008).</li>
<li>Garzia, A., Morozov, P., Sajek, M., Meyer, C., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-CLIP+for+Discovering+Target+Sites+of+RNA-Binding+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22mRNA+Decay%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">PAR-CLIP for Discovering Target Sites of RNA-Binding Proteins.</a> mRNA Decay: Methods and Protocols. 1720, 55-75 (2018).</li>
<li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP+-+Transcriptome-wide+Mapping+of+Protein-RNA+Interactions+with+Individual+Nucleotide+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2638(2011).</li>
<li>Sibley, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+Nucleotide+Resolution+UV+Cross-Linking+and+Immunoprecipitation+%28iCLIP%29+to+Determine+Protein-RNA+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Detection%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Individual Nucleotide Resolution UV Cross-Linking and Immunoprecipitation (iCLIP) to Determine Protein-RNA Interactions.</a> RNA Detection: Methods and Protocols. 1649, 427-454 (2018).</li>
<li>Wheeler, E. C., Van Nostrand, E. L., Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+challenges+in+the+detection+of+transcriptome%E2%80%90wide+protein-RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Advances and challenges in the detection of transcriptome‐wide protein-RNA interactions.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (1), (2018).</li>
<li>Singh, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cellular+EJC+Interactome+Reveals+Higher-Order+mRNP+Structure+and+an+EJC-SR+Protein+Nexus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Cellular EJC Interactome Reveals Higher-Order mRNP Structure and an EJC-SR Protein Nexus.</a> Cell. 151, 750-764 (2012).</li>
<li>Singh, G., Ricci, E. P., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPiT-Seq%3A+A+high-throughput+approach+for+footprinting+RNA%3Aprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">RIPiT-Seq: A high-throughput approach for footprinting RNA:protein complexes.</a> Methods. 65, 320-332 (2014).</li>
<li>Mabin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Exon+Junction+Complex+Undergoes+a+Compositional+Switch+that+Alters+mRNP+Structure+and+Nonsense-Mediated+mRNA+Decay+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The Exon Junction Complex Undergoes a Compositional Switch that Alters mRNP Structure and Nonsense-Mediated mRNA Decay Activity.</a> Cell Reports. 25 (9), 2431-2446 (2018).</li>
<li>Gehring, N. H., Lamprinaki, S., Kulozik, A. E., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disassembly+of+Exon+Junction+Complexes+by+PYM%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disassembly of Exon Junction Complexes by PYM.</a> Cell. 137 (3), 536-548 (2009).</li>
<li>Dostie, J., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+Is+Required+to+Remove+Y14+from+mRNAs+in+the+Cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Translation Is Required to Remove Y14 from mRNAs in the Cytoplasm.</a> Current Biology. 12 (13), 1060-1067 (2002).</li>
<li>Zünd, D., Gruber, A. R., Zavolan, M., Mühlemann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation-dependent+displacement+of+UPF1+from+coding+sequences+causes+its+enrichment+in+3%27+UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Translation-dependent displacement of UPF1 from coding sequences causes its enrichment in 3' UTRs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 20 (8), 936-943 (2013).</li>
<li>Gangras, P., Dayeh, D. M., Mabin, J. W., Nakanishi, K., Singh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+Identification+of+Recombinant+Argonaute-Bound+Small+RNAs+Using+Next-Generation+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Argonaute+Proteins%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cloning and Identification of Recombinant Argonaute-Bound Small RNAs Using Next-Generation Sequencing.</a> Argonaute Proteins: Methods and Protocols. 1680, 1-28 (2018).</li>
<li>Heyer, E. E., Ozadam, H., Ricci, E. P., Cenik, C., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+kit-free+method+for+making+strand-specific+deep+sequencing+libraries+from+RNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">An optimized kit-free method for making strand-specific deep sequencing libraries from RNA fragments.</a> Nucleic Acids Research. 43 (1), 2(2015).</li>
<li>Cameron, V., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27-Phosphatase+activity+in+T4+polynucleotide+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">3'-Phosphatase activity in T4 polynucleotide kinase.</a> Biochemistry. 16 (23), 5120-5126 (1977).</li>
<li>Ricci, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staufen1+senses+overall+transcript+secondary+structure+to+regulate+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).</li>
<li>Lackner, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+strategy+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging.</a> Nature Communications. 6, 10237(2015).</li>
<li>Metkar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-Order+Organization+Principles+of+Pre-translational+mRNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Higher-Order Organization Principles of Pre-translational mRNPs.</a> Molecular Cell. 72 (4), 715-726 (2018).</li>
<li>Giudice, G., Sánchez-Cabo, F., Torroja, C., Lara-Pezzi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATtRACT-a+database+of+RNA-binding+proteins+and+associated+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Database%3A+The+Journal+of+Biological+Databases+and+Curation%22%5BJournal%5D)">ATtRACT-a database of RNA-binding proteins and associated motifs.</a> Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).</li>
<li>Paz, I., Kosti, I., Ares, M., Cline, M., Mandel-Gutfreund, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RBPmap%3A+a+web+server+for+mapping+binding+sites+of+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">RBPmap: a web server for mapping binding sites of RNA-binding proteins.</a> Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 361-367 (2014).</li>
<li>Sundararaman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resources+for+the+Comprehensive+Discovery+of+Functional+RNA+Elements%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Resources for the Comprehensive Discovery of Functional RNA Elements.</a> Molecular Cell. 61 (6), 903-913 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Omówiono tutaj kilka kluczowych kwestii, które należy wziąć pod uwagę, aby pomyślnie wykonać RIPiT. Przede wszystkim poszczególne adresy IP muszą być zoptymalizowane, aby osiągnąć najwyższą możliwą wydajność na każdym etapie. Ilość kulek agarozy FLAG w opisanej tutaj liczbie komórek wejściowych okazała się solidna dla szerokiego zakresu badanych przez nas białek. Ponieważ tylko niewielka frakcja białek partnerskich jest współimmunoprecypitowana z białkiem FLAG, ilość przeciwciała potrzebna do skutecznego drugiego IP jest...

W komórkach RNA występuje w kompleksie z białkami, tworząc RNA:kompleksy białkowe (RNP). RNP są składane wokół białek wiążących RNA (RBP, te, które bezpośrednio wiążą RNA), ale zawierają również inne niż RBP (te, które wiążą RBP, ale nie RNA) i często mają charakter dynamiczny. RBP i ich kofaktory funkcjonują wspólnie w RNP w celu wykonywania funkcji regulacyjnych. Na przykład w szlaku rozpadu mRNA za pośrednictwem nonsensu (NMD) białka UPF (UPF1, UPF2 i UPF3b) rozpoznają przedwcześnie zakończony rybosom. Każde z białek UPF może wiązać się z RNA, ale dopiero gdy łączą się ze sobą, zaczyna tworzyć się aktywny kompleks NMD. W tym kompleksie UPF1 jest dalej aktywowany przez fosforylację przez SMG1 inny niż RBP, a taka aktywacja UPF1 ostatecznie prowadzi do rekrutacji czynników indukujących rozpad mRNA1,2. W tym przykładzie RBP wymagają kofaktorów innych niż RBP do rekrutacji i aktywacji kompleksu RNP, który wyzwala NMD. Kolejną właściwością RNP jest ich niejednorodność składowa. Weźmy pod uwagę spliceosom, który występuje w odrębnych kompleksach E, A, B lub C. Różne kompleksy spliceosomów mają nakładające się na siebie i odrębne białka3. Aby zbadać funkcje RNP, ważne jest wyjaśnienie, które RNA są związane przez RBP i związane z nim białka. Istnieje wiele metod, które to umożliwiają, a każde podejście ma swoje wady i zalety4,5,6,7.
Bardzo popularne metody identyfikacji miejsc wiązania RBP - sieciowanie, a następnie immunoprecypitacja (CLIP) i jej różne odmiany - polegają na świetle ultrafioletowym (UV) do sieciowania RBP z RNA8. Nie jest to jednak skuteczne podejście w przypadku nie-RBP w RNP, które nie kontaktują się bezpośrednio z RNA. W tym miejscu opisujemy alternatywne podejście, które ma zastosowanie zarówno do RBP, jak i innych niż RBP, w celu wyizolowania i zidentyfikowania ich miejsc wiązania RNA. To podejście, zwane immunoprecypitacją RNA w tandemie (RIPiT), składa się z dwóch etapów immunoprecypitacji, które pomagają osiągnąć wyższą swoistość w porównaniu z pojedynczym oczyszczaniem (ryc. 1)9,10. Ze względu na to, że poszczególne etapy immunoprecypitacji (IP) mogą być przeprowadzane z mniejszą rygorystycznością w porównaniu z CLIP, RIPiT nie zależy od dostępności przeciwciał, które są odporne na obecność silnych detergentów podczas immunoprecypitacji. Najbardziej unikalną zaletą RIPiT jest możliwość celowania w dwa różne białka w dwóch etapach oczyszczania; Jest to skuteczny sposób na wzbogacenie składu kompleksu RNP różniącego się od innych podobnych kompleksów11.
Małe zmiany w procedurze RIPiT mogą jeszcze bardziej wzbogacić RNP. Na przykład niektóre interakcje RNA-białko lub białko-białko w RNP są przejściowe i może być trudno skutecznie oczyścić ślady takich kompleksów. Aby ustabilizować takie interakcje, RNP mogą być sieciowane w komórkach za pomocą formaldehydu przed lizą komórek i RIPiT. Na przykład zaobserwowaliśmy, że słaba interakcja między czynnikiem rdzeniowym kompleksu złączy eksonowych (EJC), EIF4AIII a czynnikiem demontażu EJC, PYM12 może być ustabilizowana za pomocą obróbki formaldehydem, dzięki czemu wzbogaconych jest więcej śladów RNA (dane nie pokazane). Przed pobraniem komórek i RIPiT komórki można również leczyć lekami w celu ustabilizowania lub wzbogacenia RNP w określonym stanie. Na przykład podczas badania białek, które są usuwane z mRNA podczas translacji (np. EJC13, UPF114), leczenie inhibitorami translacji, takimi jak puromycyna, cykloheksymid lub harringtonina, może prowadzić do zwiększonego zajmowania białek na RNA.
Ilość RNA odzyskanego z RIPiT jest zazwyczaj niska (0,5-10 pmoles, czyli 10-250 ng RNA, biorąc pod uwagę średnią długość RNA wynoszącą 75 nt). Głównym tego powodem jest to, że tylko niewielka część danego białka jest obecna w kompleksie z innymi białkami w RNP (każde "wolne" białko IP wytworzone w pierwszym etapie jest tracone w drugim IP). Aby wygenerować biblioteki RNA-Seq z tego RNA, przedstawiamy tutaj również adaptację wcześniej opublikowanego protokołu odpowiedniego dla tak niskich danych wejściowych RNA15,16 (Rysunek 2), co daje próbki gotowe do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości w ciągu 3 dni.

<table><tbody><tr><td>Anti-FLAG Affinity Gel</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>ATP, [&gamma;-32P]- 3,000 Ci/mmol 10 mCi/mL EasyTide, 250 &mikro; Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A250UC</td><td></td></tr><tr><td>BD Jednorazowe strzykawki z końcówkami Luer-Lok (200)</td><td>Fisher</td><td>14-823-435</td><td></td></tr><tr><td>Betaina 5M</td><td>Sigma</td><td>B0300</td><td></td></tr><tr><td>biotyna-dATP</td><td>TriLink</td><td>N-5002</td><td></td></tr><tr><td>biotyna-dCTP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL540001EA</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier Branson, model SSE-1</td><td>Branson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CircLigase I</td><td>VWR</td><td>76081-606</td><td>Ligaza ssDNA I</td></tr><tr><td>DMEM, wysoka zawartość glukozy</td><td>ThermoFisher</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Bufor obciążenia DNA NEB</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Białko A</td><td>LifeTech</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Flp-In-T-REx 293 Linia komórkowa</td><td>ThermoFisher</td><td>R78007</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler Drabina</td> <td>DNA niskiego zasięguThermoScientific</td><td>FERSM1203</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycyna B</td><td>ThermoFisher</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TBE Gel 10 dołków</td><td>Bio-Rad</td><td>4565013</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>4566033</td><td></td></tr><tr><td>miRCAT-33 adapter 5&prime;-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3&prime;</td><td>Każdy</td><td></td><td>ten protokół jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina</td></tr>, <tr><td>odczynnikiem do transfekcji Mirus transIT-X2</td>, <td>ligazą Mirus</td><td>MIR 6004</td><td></td></tr><tr><td>Mth</td>, <td>NEB</td><td>E2610S,</td><td></td></tr><tr><td>PE1.0, 5&prime;-AATGATACGGCGACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3&prime;</td><td>Każdy</td><td></td><td>z tych protokołów jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina</td></tr><tr><td>PE2.0 5&prime;-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3&prime;</td><td>Każdy</td><td></td><td>ten protokół jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina</td></tr><tr><td>Fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (25:24:1, pH 6,7, 100 mLl)</td><td>Fisher</td><td>BP1752I-100</td><td></td></tr><tr><td>Purple Gel Loading Dye (6x)</td><td>NEB</td><td>NEB #7025</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Polimeraza DNA</td><td>NEB</td><td>M0491S/L</td><td></td></tr><tr><td>RNase I, E. coli, 1,000</td><td>U Eppicenter</td><td>N6901K</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna SPIN-X</td><td>Corning</td><td>CLS8160-24EA</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki streptawidyny</td><td>ThermoFisher</td><td>60210</td><td></td></tr><tr><td>Indeks górny III (SSIII)</td><td>ThermoScientific</td><td>18080044</td><td>enzym odwrotnej transkryptazy</td></tr><tr><td>SybrGold ThermoFisher</td><td></td><td>S11494</td><td>złoty barwnik żelowy kwasu nukleinowego</td></tr><tr><td>T4 Kinaza polinukleotydowa-2500U</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T4RNL2 Tr. K227Q</td><td>NEB</td><td>M0351S Tetracyklina</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>87128</td><td></td></tr><tr><td>Termostabilna 5&acute; App DNA/RNA Ligaza</td><td>NEB</td><td>M0319S</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq_SE1 5&prime;-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTGT 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>Każdy</td><td></td><td>ten protokół jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE10 5&prime;-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTGT 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>Każdy</td><td></td><td>z tych protokołów jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE11 5&prime;-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTGT 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>Każdy</td><td></td><td>z tych protokołów jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE12 5&prime;-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTGT 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>Każdy</td><td></td><td>z tych protokołów jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE2 5&prime;-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>Każdy</td><td></td><td>z tych protokołów jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE35&prime;-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTGT 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>Każdy</td><td></td><td>z tych protokołów jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE4 5&prime;-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>Każdy</td><td></td><td>ten protokół jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE5 5&prime;-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTGT 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>Każdy</td><td></td><td>z tych protokołów jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE6 5&prime;-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>Każdy</td><td></td><td>z tych protokołów jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE7 5&prime;-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTGT 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTCTCT TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>Każdy</td><td></td><td>z tych protokołów jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE8 5&prime;-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTGT 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>Każdy</td><td></td><td>z tych protokołów jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE9 5&prime;-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTGT 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>Każdy</td><td></td><td>z tych protokołów jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina,</td></tr><tr><td>Typhoon 5, Bimolecular Imager</td>, <td>GE Healthcare, Life Science</td><td>, 29187191</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja śladów rna:kompleksy białkowe poprzez immunoprecypitację rna w tandemie, a następnie sekwencjonowanie (ripit-seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Immunoprecypitacja RNA w tandemie (RIPiT) to metoda wzbogacania śladów RNA pary białek w kompleksie RNA:białko (RNP). RIPiT wykorzystuje dwa etapy oczyszczania. Po pierwsze, po immunoprecypitacji znakowanej podjednostki RNP następuje łagodne trawienie RNazy, a następnie elucja powinowactwa bez denaturacji. Druga immunoprecypitacja innej podjednostki RNP pozwala na wzbogacenie zdefiniowanego kompleksu. Po denaturującej elucji RNA i białek, ślady RNA są przekształcane w wysokoprzepustowe biblioteki sekwencjonowania DNA. W przeciwieństwie do bardziej popularnego sieciowania ultrafioletowego (UV), a następnie podejścia immunoprecypitacyjnego (CLIP) w celu wzbogacenia miejsc wiązania RBP, RIPiT jest niezależny od sieciowania UV. W związku z tym RIPiT może być stosowany do wielu białek obecnych w interaktomie RNA i poza nim, które są niezbędne do regulacji RNA, ale nie stykają się bezpośrednio z RNA lub wiązaniem UV z RNA. Dwa etapy oczyszczania w RIPiT zapewniają dodatkową zaletę polegającą na identyfikacji miejsc wiązania, w których białko będące przedmiotem zainteresowania działa w partnerstwie z innym kofaktorem. Strategia podwójnego oczyszczania służy również wzmocnieniu sygnału poprzez ograniczenie tła. W tym miejscu przedstawiamy krok po kroku procedurę wykonywania RIPiT i generowania wysokoprzepustowych bibliotek sekwencjonowania z izolowanych śladów RNA. Przedstawiamy również zalety i zastosowania RIPiT oraz omawiamy niektóre z jego ograniczeń.

Pomyślne RIPiT skutkuje immunoprecypitacją zarówno białek zainteresowania, jak i innych znanych białek oddziałujących, przy jednoczesnym braku białek nieoddziałujących. Jak widać na Rysunku 3A, w elucie RIPiT wykryto zarówno Magoh, jak i EIF4AIII, natomiast nie wykryto HNRNPA1 (ścieżka 6). Równolegle, za pomocą autoradiografii (Rysunek 3B) lub bioanalizatora (Rysunek 3C) wykryto śla...

Tutaj prezentujemy protokół wzbogacania endogennych miejsc wiązania RNA lub "śladów" kompleksów RNA:białko (RNP) z komórek ssaków. Podejście to obejmuje dwie immunoprecypitacje podjednostek RNP i dlatego nazywa się immunoprecypitacją RNA w tandemie (RIPiT).

Identyfikacja śladów RNA:Kompleksy białkowe poprzez immunoprecypitację RNA w tandemie, a następnie sekwencjonowanie (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Immunoprecypitacja RNA w tandemie, a następnie sekwencjonowanie, czyli RIPiT-Seq, to metoda określania, które regiony RNA są związane przez określoną parę białek wiążących RNA. Najbardziej unikalną zaletą RIPiT jest jego zdolność do celowania w dwa różne białka w dwóch oczyszczaniach. Zapewnia to potężny sposób wzbogacania składu chemicznego kompleksu białkowego RNA od innych kompleksów.Ponadto RIPiT-Seq jest niezależny od sieciowania UV i może być stosowany do wielu białek, które działają na RNA bez bezpośredniego wiązania go. Chociaż metoda ta nie obejmuje bezpośrednio terapii ani diagnozy, białka wiążące RNA i przetwarzanie RNA są związane z kilkoma chorobami, takimi jak neuropatie i rak. Projekt RIPiT-Seq stanowi narzędzie do badania funkcji białek wiążących RNA związanych z chorobą.RIPiT-Seq wymaga systemu, w którym może ulegać ekspresji białko znakowane epitopem. Został przetestowany tylko na komórkach HEK293 i jest najbardziej podatny na hodowlę komórkową. Jednak teraz, dzięki naszej możliwości znakowania białek za pomocą CRISPR, RIPiT-Seq może mieć zastosowanie w różnych nowoczesnych systemach.Powodzenie RIPiT zależy od dwóch skutecznych immunoprecypitacji, dlatego kluczowe znaczenie będzie miała optymalizacja warunków immunoprecypitacji dla stosowanego przeciwciała. Ponadto praca z RNA wymaga odpowiednich środków ostrożności, dlatego w trakcie i po ekstrakcji RNA należy stosować odczynniki wolne od RNaz. Procedurę zademonstruje Lauren Woodward, doktorantka w moim laboratorium.Zacznij od delikatnego umycia komórek jednowarstwowych 15 mililitrami schłodzonego PBS na 15-centymetrową płytkę. Następnie zeskrob komórki do 30 mililitrów PBS i zbierz je w 50-mililitrowej stożkowej probówce. Granulować komórki, odwirowując przy 400 g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, i wyrzucić supernatant.Dodaj cztery mililitry lodowatego hipotonicznego buforu do lizy i użyj pipety P1000, aby ponownie zawiesić komórki. Przenieś lizat do pięciomililitrowej probówki i inkubuj na lodzie przez 10 minut. Umieścić lizat w łaźni lodowej i poddać sonizacji zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.Następnie dodaj 108 mikrolitrów pięciomolowego chlorku sodu, aby dostosować stężenie soli do 150 milimolów. Następnie odwirować lizat o stężeniu 12 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać 20 mikrolitrów supernatantu do analizy western blot. Umyj wstępnie kulki agarozowe FLAG zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i nałóż pozostały supernatant na 750 mikrolitrów kulek w pięciomililitrowej probówce.Inkubuj kulki agarozy FLAG z ekstraktem komórkowym przez jedną do trzech godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie mieszając. Po inkubacji granulki osadzać przez odwirowanie przy 400 g przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać 20 mikrolitrów supernatantu do analizy western blot. Odrzuć pozostały supernatant i umyj kulki, ponownie je zawieszając w czterech mililitrach buforu do płukania iso.Ponownie otulić kulki i usunąć supernatant. Rozcieńczyć RNazę I w 750 mikrolitrach buforu do płukania iso zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i dodać go do kulek agarozowych FLAG. Inkubować mieszaninę w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem, a następnie granulować kulki przez odwirowanie.Zbierz 20 mikrolitrów supernatantu do analizy western blot i wyrzuć resztę. Następnie umyj koraliki buforem do mycia iso, jak opisano wcześniej. Następnie wykonaj elucję powinowactwa, dodając 375 mikrolitrów buforu elucyjnego do kulek i delikatnie wstrząsając mieszaniną w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin.Po inkubacji osadzać kulki i zbierać 15 mikrolitrów podwielokrotności elucji do analizy western blot. Podczas elucji powinowactwa należy przeprowadzić koniugację przeciwciał z kulkami magnetycznymi. Zacznij od umycia 50 mikrolitrów kulek magnetycznych w jednym mililitrze bufora do mycia iso.Zawiesić kulki w 100 mikrolitrach buforu koniugacyjnego i dodać odpowiednią ilość przeciwciała. Następnie inkubuj koraliki przez co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej. Umyj kulki magnetyczne dwukrotnie buforem koniugacyjnym i ponownie zawieś je w 375 mikrolitrach buforu rozcieńczającego RIPiT.Przechowuj kulki na lodzie do momentu immunoprecypitacji. Zastosować elucję powinowactwa FLAG do kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami i inkubować z delikatnym mieszaniem przez jedną do dwóch godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Uchwyć kulki magnetyczne za pomocą magnesu i zbierz 15 mikrolitrów supernatantu do analizy western blot.Następnie umyj koraliki siedmiokrotnie buforem do mycia iso. Kontynuować denaturację elucji, ponownie zawieszając kulki magnetyczne w 100 mikrolitrach klarownego buforu do próbek i inkubując zawiesinę na lodzie przez 10 minut. Podczas inkubacji okresowo przesuwaj koraliki, aby je ponownie zawiesić.Uchwyć kulki magnetyczne na magnesie i zbierz 15 mikrolitrów elucji do analizy western blot. Przenieś pozostałą elucję do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Aby wyekstrahować RNA, dodaj 320 mikrolitrów wody wolnej od RNaz i 400 mikrolitrów alkoholu fenolowo-chloroformowego izoamylu do elucji RIPiT.Mieszaninę należy odwirować, a następnie odwirować przy stężeniu 12 000 g przez pięć minut. Zebrać 350 mikrolitrów fazy wodnej do osobnej probówki. Do pobranej próbki dodać octan sodu, chlorek magnezu, glikogen i etanol i inkubować mieszaninę przez noc w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza.Następnego dnia osadzaj RNA przez wirowanie w temperaturze 12 000 g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i umyj go w 70% etanolu. Po płukaniu etanolem potraktuj RNA kinazą polinukleotydową T4 lub PNK, bez ATP i przeprowadź oczyszczanie fenolowo-chloroformowe zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Ponownie zawiesić czyste RNA w 4,5 mikrolitrze wody wolnej od RNaz.Aby określić ilościowo wydajność RNA, znakuj radioaktywnie RNA za pomocą PNK i ATP znakowanych 32P zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Użyj drabiny DNA o niskim zakresie i syntetycznego oligo od 20 do 40 nukleotydów dla standardów wielkości i ilości. Rozpuścić znakowany RNA w 26% żelu mocznikowo-poliakryloamidowym.Wysuszyć żel zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i wystawić żel na działanie fosfoekranu do momentu wykrycia odpowiedniego sygnału. Technika ta została wykorzystana do zbadania interakcji kompleksu złączy eksonowych lub EJC. Analiza Western blot białek oczyszczonych z każdego głównego etapu procedury RIPiT pokazuje, że oczyszczony EJC zawiera zarówno EIF4A3, jak i MAGOH.Kontrola ujemna, HNRNPA1, nie jest wykrywana w elucji. Siła sygnału śladu RNA koreluje z ilością interakcji białka RNA. Silniejszy ślad obserwuje się, gdy RIPiT wykonano na komórkach traktowanych puromycyną, co zwiększa zajętość EJC na RNA.Aby upewnić się, że RIPiT był skuteczny, ważne jest, aby przetestować skuteczność IP za pomocą western blot. Ważne jest również, aby ocenić ilość i jakość RNA przed przystąpieniem do głębokiego sekwencjonowania. W 2018 roku laboratorium Singh z powodzeniem wykorzystało tę technikę do oczyszczenia dwóch odrębnych składowo wariantów kompleksu złączy eksonów i zidentyfikowania wzorców wiązania RNA.Jeśli badacze zdecydują się na wykrycie śladów RNA za pomocą autoradiografii, należy przestrzegać wszystkich odpowiednich procedur i protokołów bezpieczeństwa radiacyjnego.

identification-footprints-rnaprotein-complexes-via-rna

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ze względu na przejściowy charakter pre-mRNA, jego izolacja i badanie in vivo mogą być trudne. Przedstawiamy tutaj nowatorskie podejście in vitro do badania oddziaływań RNA-białko z wykorzystaniem syntetycznej puli oligonukleotydów, która pokrywa wybrane regiony pre-mRNA.

Szybka metoda wysokoprzepustowa mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkim pre-mRNA

Transkrypty RNA podlegają rozległej regulacji potranskrypcyjnej, w której pośredniczy wiele trans-działających białek wiążących RNA (RBP). W tym miejscu przedstawiamy uogólnioną metodę precyzyjnej identyfikacji w skali całego transkryptomu miejsc wiązania RNA RBP.

PAR-CliP - metoda identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących RNA w całym transkryptomie

Przestrzenne rozmieszczenie białek wiążących RNA na transkrypcie jest kluczowym czynnikiem regulacji potranskrypcyjnej. Opracowaliśmy zatem metodę sieciowania promieniami UV i immunoprecypitacji z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu (iCLIP), która umożliwia precyzyjne mapowanie w całym genomie miejsc wiązania białka wiążącego RNA.

iCLIP – Mapowanie oddziaływań białko-RNA w całym transkryptomie z rozdzielczością pojedynczych nukleotydów

Protokół krok po kroku dotyczący izolacji i identyfikacji kompleksów związanych z RNA za pomocą metody RIP-Chip.

Metoda izolacji i identyfikacji mRNA, mikroRNA oraz komponentów białkowych kompleksów rybonukleoproteinowych z ekstraktów komórkowych z wykorzystaniem techniki RIP-Chip

Ten manuskrypt opisuje podejście do izolacji wybranych pokrewnych RNP powstałych w komórkach eukariotycznych poprzez specyficzne wzbogacenie ukierunkowane na oligonukleotydy. Wykazujemy możliwość zastosowania tego podejścia poprzez wyizolowanie pokrewnego RNP związanego z retrowirusowym regionem 5' bez translacji, który składa się z helikazy DHX9 / RNA A.

Izolacja pokrewnych kompleksów RNA-białko z komórek za pomocą elucji kierowanej oligonukleotydami

Regulacja translacyjna odgrywa ważną rolę w kontroli obfitości białek. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową metodę ilościowej analizy translacji w pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae.

Kwantyfikacja translacji w całym genomie u pączkujących drożdży za pomocą profilowania rybosomów

Toeprinting ma na celu zmierzenie zdolności transkrybowanego RNA in vitro do tworzenia kompleksów inicjujących translację z rybosomami w różnych warunkach. Protokół ten opisuje metodę odciskania palca RNA ssaków i może być stosowany do badania translacji zarówno zależnej od czapeczki, jak i sterowanej przez IRES.

Analiza odcisków palców u nóg tworzenia kompleksu inicjacji translacji na mRNA ssaków

Opisano procedurę tandemowej izolacji RNA (TRIP) w celu odzyskania endogennie utworzonych kompleksów mRNA-białko. W szczególności kompleksy RNA-białko są sieciowane in vivo, poliadenylowane RNA są izolowane z ekstraktów z kulkami oligo(dT), a poszczególne mRNA są wychwytywane za pomocą zmodyfikowanych oligonukleotydów antysensownych RNA. Białka związane z mRNA są wykrywane za pomocą analizy immunoblot.

Procedura izolacji tandemowego RNA oparta na oligonukleotydach w celu odzyskania eukariotycznych kompleksów mRNA-białko

Interakcje kotranslacyjne odgrywają kluczową rolę w modyfikacjach powstających łańcuchów, celowaniu, składaniu i ścieżkach montażu. W tym miejscu opisujemy selektywne profilowanie rybosomów, metodę bezpośredniej analizy in vivo tych interakcji w modelu eukarionta Saccharomyces cerevisiae.

Globalna identyfikacja sieci oddziaływań kotranslacyjnych poprzez selektywne profilowanie rybosomów

Prezentujemy zmodyfikowaną metodologię sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny natywnej (ChIP-seq) do generowania zestawów danych sekwencji odpowiednich dla struktury analitycznej gęstości nukleosomów ChIP-seq integrującej dostępność nukleazy mikrokokowej (MNazy) z pomiarami modyfikacji histonów.

Generowanie bibliotek sekwencjonowania immunoprecypitacji natywnej chromatyny do analizy gęstości nukleosomów

Poznaj metodę RIPiT-Seq do identyfikacji regionów RNA wiążących się z białkami w komórkach ssaków. Technika ta umożliwia wzbogacanie endogennych kompleksów RNA:białko bez zależności od UV.

Identyfikacja śladów RNA:Kompleksy białkowe poprzez immunoprecypitację RNA w tandemie, a następnie sekwencjonowanie (RIPiT-Seq)

Przeglądaj więcej filmów