Identyfikacja śladów RNA:Kompleksy białkowe poprzez immunoprecypitację RNA w tandemie, a następnie sekwencjonowanie (RIPiT-Seq)

Immunoprecypitacja RNA w tandemie, a następnie sekwencjonowanie, czyli RIPiT-Seq, to metoda określania, które regiony RNA są związane przez określoną parę białek wiążących RNA. Najbardziej unikalną zaletą RIPiT jest jego zdolność do celowania w dwa różne białka w dwóch oczyszczaniach. Zapewnia to potężny sposób wzbogacania składu chemicznego kompleksu białkowego RNA od innych kompleksów.

Ponadto RIPiT-Seq jest niezależny od sieciowania UV i może być stosowany do wielu białek, które działają na RNA bez bezpośredniego wiązania go. Chociaż metoda ta nie obejmuje bezpośrednio terapii ani diagnozy, białka wiążące RNA i przetwarzanie RNA są związane z kilkoma chorobami, takimi jak neuropatie i rak. Projekt RIPiT-Seq stanowi narzędzie do badania funkcji białek wiążących RNA związanych z chorobą.

RIPiT-Seq wymaga systemu, w którym może ulegać ekspresji białko znakowane epitopem. Został przetestowany tylko na komórkach HEK293 i jest najbardziej podatny na hodowlę komórkową. Jednak teraz, dzięki naszej możliwości znakowania białek za pomocą CRISPR, RIPiT-Seq może mieć zastosowanie w różnych nowoczesnych systemach.

Powodzenie RIPiT zależy od dwóch skutecznych immunoprecypitacji, dlatego kluczowe znaczenie będzie miała optymalizacja warunków immunoprecypitacji dla stosowanego przeciwciała. Ponadto praca z RNA wymaga odpowiednich środków ostrożności, dlatego w trakcie i po ekstrakcji RNA należy stosować odczynniki wolne od RNaz. Procedurę zademonstruje Lauren Woodward, doktorantka w moim laboratorium.

Zacznij od delikatnego umycia komórek jednowarstwowych 15 mililitrami schłodzonego PBS na 15-centymetrową płytkę. Następnie zeskrob komórki do 30 mililitrów PBS i zbierz je w 50-mililitrowej stożkowej probówce. Granulować komórki, odwirowując przy 400 g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, i wyrzucić supernatant.

Dodaj cztery mililitry lodowatego hipotonicznego buforu do lizy i użyj pipety P1000, aby ponownie zawiesić komórki. Przenieś lizat do pięciomililitrowej probówki i inkubuj na lodzie przez 10 minut. Umieścić lizat w łaźni lodowej i poddać sonizacji zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.

Następnie dodaj 108 mikrolitrów pięciomolowego chlorku sodu, aby dostosować stężenie soli do 150 milimolów. Następnie odwirować lizat o stężeniu 12 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać 20 mikrolitrów supernatantu do analizy western blot. Umyj wstępnie kulki agarozowe FLAG zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i nałóż pozostały supernatant na 750 mikrolitrów kulek w pięciomililitrowej probówce.

Inkubuj kulki agarozy FLAG z ekstraktem komórkowym przez jedną do trzech godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie mieszając. Po inkubacji granulki osadzać przez odwirowanie przy 400 g przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać 20 mikrolitrów supernatantu do analizy western blot. Odrzuć pozostały supernatant i umyj kulki, ponownie je zawieszając w czterech mililitrach buforu do płukania iso.

Ponownie otulić kulki i usunąć supernatant. Rozcieńczyć RNazę I w 750 mikrolitrach buforu do płukania iso zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i dodać go do kulek agarozowych FLAG. Inkubować mieszaninę w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem, a następnie granulować kulki przez odwirowanie.

Zbierz 20 mikrolitrów supernatantu do analizy western blot i wyrzuć resztę. Następnie umyj koraliki buforem do mycia iso, jak opisano wcześniej. Następnie wykonaj elucję powinowactwa, dodając 375 mikrolitrów buforu elucyjnego do kulek i delikatnie wstrząsając mieszaniną w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin.

Po inkubacji osadzać kulki i zbierać 15 mikrolitrów podwielokrotności elucji do analizy western blot. Podczas elucji powinowactwa należy przeprowadzić koniugację przeciwciał z kulkami magnetycznymi. Zacznij od umycia 50 mikrolitrów kulek magnetycznych w jednym mililitrze bufora do mycia iso.

Zawiesić kulki w 100 mikrolitrach buforu koniugacyjnego i dodać odpowiednią ilość przeciwciała. Następnie inkubuj koraliki przez co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej. Umyj kulki magnetyczne dwukrotnie buforem koniugacyjnym i ponownie zawieś je w 375 mikrolitrach buforu rozcieńczającego RIPiT.

Przechowuj kulki na lodzie do momentu immunoprecypitacji. Zastosować elucję powinowactwa FLAG do kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami i inkubować z delikatnym mieszaniem przez jedną do dwóch godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Uchwyć kulki magnetyczne za pomocą magnesu i zbierz 15 mikrolitrów supernatantu do analizy western blot.

Następnie umyj koraliki siedmiokrotnie buforem do mycia iso. Kontynuować denaturację elucji, ponownie zawieszając kulki magnetyczne w 100 mikrolitrach klarownego buforu do próbek i inkubując zawiesinę na lodzie przez 10 minut. Podczas inkubacji okresowo przesuwaj koraliki, aby je ponownie zawiesić.

Uchwyć kulki magnetyczne na magnesie i zbierz 15 mikrolitrów elucji do analizy western blot. Przenieś pozostałą elucję do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Aby wyekstrahować RNA, dodaj 320 mikrolitrów wody wolnej od RNaz i 400 mikrolitrów alkoholu fenolowo-chloroformowego izoamylu do elucji RIPiT.

Mieszaninę należy odwirować, a następnie odwirować przy stężeniu 12 000 g przez pięć minut. Zebrać 350 mikrolitrów fazy wodnej do osobnej probówki. Do pobranej próbki dodać octan sodu, chlorek magnezu, glikogen i etanol i inkubować mieszaninę przez noc w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza.

Następnego dnia osadzaj RNA przez wirowanie w temperaturze 12 000 g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i umyj go w 70% etanolu. Po płukaniu etanolem potraktuj RNA kinazą polinukleotydową T4 lub PNK, bez ATP i przeprowadź oczyszczanie fenolowo-chloroformowe zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Ponownie zawiesić czyste RNA w 4,5 mikrolitrze wody wolnej od RNaz.

Aby określić ilościowo wydajność RNA, znakuj radioaktywnie RNA za pomocą PNK i ATP znakowanych 32P zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Użyj drabiny DNA o niskim zakresie i syntetycznego oligo od 20 do 40 nukleotydów dla standardów wielkości i ilości. Rozpuścić znakowany RNA w 26% żelu mocznikowo-poliakryloamidowym.

Wysuszyć żel zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i wystawić żel na działanie fosfoekranu do momentu wykrycia odpowiedniego sygnału. Technika ta została wykorzystana do zbadania interakcji kompleksu złączy eksonowych lub EJC. Analiza Western blot białek oczyszczonych z każdego głównego etapu procedury RIPiT pokazuje, że oczyszczony EJC zawiera zarówno EIF4A3, jak i MAGOH.

Kontrola ujemna, HNRNPA1, nie jest wykrywana w elucji. Siła sygnału śladu RNA koreluje z ilością interakcji białka RNA. Silniejszy ślad obserwuje się, gdy RIPiT wykonano na komórkach traktowanych puromycyną, co zwiększa zajętość EJC na RNA.

Aby upewnić się, że RIPiT był skuteczny, ważne jest, aby przetestować skuteczność IP za pomocą western blot. Ważne jest również, aby ocenić ilość i jakość RNA przed przystąpieniem do głębokiego sekwencjonowania. W 2018 roku laboratorium Singh z powodzeniem wykorzystało tę technikę do oczyszczenia dwóch odrębnych składowo wariantów kompleksu złączy eksonów i zidentyfikowania wzorców wiązania RNA.

Jeśli badacze zdecydują się na wykrycie śladów RNA za pomocą autoradiografii, należy przestrzegać wszystkich odpowiednich procedur i protokołów bezpieczeństwa radiacyjnego.