Name: Ocena stanu zapłodnienia poprzez śledzenie morfologii jądra plemnika w podwójnym zapłodnieniu Arabidopsis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 s
Description: Poznaj metodę oceny stanu zapłodnienia u Arabidopsis poprzez analizę morfologii jąder plemników. Technika ta umożliwia szybką analizę statystyczną i identyfikację nieznanych regulatorów zapłodnienia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant KAKENHI Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (JP17H05832 do T. I.) oraz przez finansowanie z Programu Promocji Badań Priorytetowych w Fitochemicznych Naukach Molekularnych, Uniwersytet Chiba (Japonia).

1. Sztuczne zapylanie
UWAGA: Przed rozpoczęciem procesu wymagana jest para kleszczyków nr 5.
<ol>
	<li>Hoduj A. thaliana (Col-0) w temperaturze 22 °C w 16-godzinnym cyklu światła/8-godzinnym ciemnym cyklu w komorze wzrostowej. 
	nuta: Wytnij i usuń pierwszą rozwiniętą łodygę kwiatową nożyczkami, aby wspomóc rozwój pąków pachowych. Do analizy nadają się rośliny silnie rosnące (2-3 tygodnie po ścięciu pierwszej łodygi; wysokość rośliny około 25 cm).</li>
	<li>Aby wykastrować, usuń działkę kielicha (<silna klasa="xfig">Rycina 1B), płatek (<silna klasa="xfig">Rycina 1C) i pręcik (<silna klasa="xfig">Rycina 1D) pąków kwiatowych na etapie 118 (<silna klasa="xfig">Rycina 1A) za pomocą kleszczyków nr 5. Najlepszy jest pączek z kawałkami płatków widocznymi na górze. 
	nuta: Użyj odpowiedniej linii markera gamet żeńskich. W tym protokole użyliśmy rośliny typu dzikiego jako żeńskiego rodzica.</li>
	<li>Piętnaście do osiemnastu godzin po kastracji weź pręcik kwiatu DMP9KD / HTR10-mRFP na etapie 138, ściskając włókno kleszczami.</li>
	<li>Aby zapylić, delikatnie poklep kilkakrotnie piętno wykastrowanego słupka rozchodzącym się pylnikiem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zalążka do obserwacji
UWAGA: Wymagane są następujące elementy: szkło szkiełkowe z dołączoną taśmą dwustronną, kleszczyki nr 5, igła do iniekcji 27 G oraz mikroskop preparacyjny.
<ol>
	<li>7 do 8 godzin po zapyleniu (HAP) zbierz słupek i umieść go na taśmie dwustronnej, a następnie delikatnie dociśnij kleszczami, aby przymocować słupek do taśmy (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A,A'). 
	nuta: Większość zalążków w słupku otrzymuje co najmniej jedną łagiewkę pyłkową 10 HAP9. Jeśli oba plemniki lub którykolwiek z nich z pierwszej łagiewki pyłkowej nie zostanie zapłodniony, druga łagiewka pyłkowa zostanie przyciągnięta przez zalążek ze względu na system odzyskiwania zapłodnienia10. Aby przeanalizować morfologię jąder plemników z pierwszej łagiewki pyłkowej, zaleca się zakończenie przygotowania zalążka najpóźniej do 10 HAP.</li>
	<li>Odetnij górny i dolny koniec jajnika za pomocą igły do wstrzykiwań pod mikroskopem preparacyjnym (<silna klasa="xfig">Ryc. 2B,B').</li>
	<li>Rozciąć ścianę jajnika po obu stronach otworu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C,C'), przesuwając końcówkę igły do wstrzykiwań. 
	nuta: Igłę do wstrzykiwań należy wprowadzić płytko, aby zapobiec oddzieleniu się zalążka od przegrody.</li>
	<li>Obierz ścianę jajnika za pomocą igły do wstrzykiwań (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D,D').</li>
	<li>Ściśnij podstawę przegrody, do której połączone są zalążki, i ostrożnie podnieś ją kleszczami (<silna klasa="xfig">Ryc. 2E).</li>
	<li>Przenieś zalążki do kropli wody na szkiełku podstawowym i delikatnie przykryj szkłem nakrywkowym do obserwacji pod mikroskopem fluorescencyjnym (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2E,E').</li>
</ol>
3. Mikroskopia
UWAGA: W tym protokole użyliśmy mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w kostkę filtra fluorescencyjnego (patrz Tabela materiałów), aparat cyfrowy i dołączone oprogramowanie.
<ol>
	<li>Uzyskaj obrazy zalążków zawierających jądra plemników znakowane mRFP za pomocą obiektywu 20x lub 40x i wyposażonego aparatu cyfrowego.</li>
	<li>Potwierdź liczbę jąder plemników znakowanych mRFP w woreczku zarodkowym. 
	nuta: Zalążki zawierające dwa jądra plemników znakowane mRFP można włączyć do wielkości populacji w celu analizy statystycznej.</li>
	<li>Potwierdź kształt i położenie każdego jądra plemnika znakowanego mRFP w woreczku zarodkowym. 
	nuta: Natychmiast po uwolnieniu z łagiewki pyłkowej para skondensowanych jąder plemników znakowanych mRFP jest zlokalizowana między komórką jajową a komórką centralną. Zdekondensowane jądro plemnika znakowane mRFP wykryte z boku końca gradówki wskazuje na przykład na zapłodnienie komórek centralnych. Używając odpowiedniej linii markera błony błony żeńskiej gamet, jak pokazano w Uzupełniającym <silna klasa="xfig">Rysunek 1, można wyraźnie monitorować, czy plemnik przechodzi plazmogamię (po fuzji błonowej, ale przed kariogamią).</li>
</ol>

<ol><li>Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamete+dialogs+in+green+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Gamete dialogs in green lineages.</a> Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).</li>
<li>Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+mechanisms+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization mechanisms in flowering plants.</a> Current Biology. 26, R125-R139 (2016).</li>
<li>Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GENERATIVE+CELL+SPECIFIC+1+is+essential+for+angiosperm+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization.</a> Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).</li>
<li>von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+HAP2+%28GCS1%29+is+a+sperm-specific+gene+required+for+pollen+tube+guidance+and+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization.</a> Development. 133, 4761-4769 (2006).</li>
<li>Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamete+attachment+requires+GEX2+for+successful+fertilization+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis.</a> Current Biology. 24, 170-175 (2014).</li>
<li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+male+gamete+membrane+protein+DMP9%2FDAU2+is+required+for+double+fertilization+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants.</a> Development. 145, dev170076(2018).</li>
<li>Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+dynamics+of+HISTONE3+variants+between+the+two+fertilization+products+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants.</a> Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+flower+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li>
<li>Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+recovery+system+is+dependent+on+the+number+of+pollen+grains+for+efficient+reproduction+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signaling+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants.</a> Plant Signaling & Behavior. 8, e23690(2013).</li>
<li>Kasahara, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+recovery+after+defective+sperm+cell+release+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis.</a> Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).</li>
<li>Hamamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+of+two+sperm+cells+during+double+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Current Biology. 21, 497-502 (2011).</li>
<li>Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gamete+membrane+dynamics+during+double+fertilization+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis.</a> Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

HTR10-mRFP znakuje ojcowską chromatynę (tj. wizualizuje jądra plemników), a dynamika podwójnego zapłodnienia została opisana7. Natychmiast po uwolnieniu z łagiewki pyłkowej jądra plemników znakowane HTR10-mRFP są nadal zagęszczone. Jednak każde z jąder plemników ulega dekondensacji po połączeniu się z zapłodnionym jądrem żeńskiej gamety podczas kariogamii trzy do czterech godzin po fuzji błony gamet7. Niezapłodnione plemniki pozostają skondensowane, jak pokazano w woreczku ...

Kwitnące rośliny wytwarzają nasiona poprzez podwójne zapłodnienie, proces, który jest bezpośrednio kontrolowany przez interakcje między białkami zlokalizowanymi na błonie plazmatycznej gamet1,2. Kwitnące męskie gamety rośliny, para plemników, rozwijają się w pyłku. Łagiewka pyłkowa, która rośnie po zapyleniu, dostarcza parę plemników do żeńskich gamet, komórki jajowej i komórki centralnej, które rozwijają się w woreczku zarodkowym. Po spotkaniu gamet męskich i żeńskich białka na powierzchni gamet sprzyjają rozpoznawaniu, przyłączaniu i fuzji w celu zakończenia podwójnego zapłodnienia. W poprzednich badaniach męskie białka błony gametowej GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2)3,4 i GAMETE EXPRESSED 2 (GEX2)5 zostały zidentyfikowane jako regulatory zapłodnienia zaangażowane odpowiednio w fuzję i przyłączanie gamet. Niedawno zidentyfikowaliśmy męskie białko błonowe specyficzne dla gamet, DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9), jako regulator zapłodnienia zaangażowany w interakcję gamet. Odkryliśmy, że spadek ekspresji DMP9 powoduje znaczne zahamowanie zapłodnienia komórek jajowych podczas podwójnego zapłodnienia u A. thaliana6.
Ponieważ podwójne zapłodnienie występuje w woreczku zarodkowym, który jest osadzony w zalążku, który jest dalej owinięty tkanką jajnika, trudno jest obserwować i analizować stany procesów podwójnego zapłodnienia. Z tego powodu nadal istnieje wiele niejasnych punktów, które utrudniają pełne zrozumienie całego mechanizmu podwójnej kontroli nawożenia. Opracowanie technik obserwacyjnych w celu śledzenia zachowania gamet podczas podwójnego zapłodnienia w warunkach in vivo jest niezbędne do analizy funkcjonalnej potencjalnych kandydatów na regulatory zapłodnienia. Ostatnie badania przyniosły linie markerowe, w których struktury subkomórkowe gamet są znakowane białkami fluorescencyjnymi. W tym artykule przedstawiamy prosty i szybki protokół obserwacji podwójnego zapłodnienia, które nastąpiło w woreczku zarodkowym pochodzącym ze sztucznie zapylonych słupków. Korzystając z linii markera jądra plemnika plemnika HTR10-mRFP7, można rozróżnić stan zapłodnienia każdej żeńskiej gamety na podstawie morfologii sygnału jądrowego plemnika. Nasz protokół skupiający się na takiej zmianie morfologicznej jąder plemników podczas zapłodnienia może skutecznie uzyskać wystarczającą ilość danych do dowodu statystycznego. Linia DMP9-knockdown z tłem HTR10-mRFP (DMP9KD/HTR10-mRFP) została użyta jako rośliny męskie, aby pokazać pojedynczy wzór nawożenia. Protokół nadaje się również do analizy funkcjonalnej innych regulatorów nawożenia.

<table><tbody><tr><td>BX51</td><td>Olympus</td><td></td><td>Mikroskop epifluorescencyjny</td></tr><tr><td>Szkło osłonowe</td><td>Szkło Matsunami</td><td>C018181</td><td></td></tr><tr><td>DMP9KD/HTR10-mRFP</td><td></td><td></td><td>Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP tło Takahashi et al. (2018)6</td></tr><tr><td>Taśma</td> <td>dwustronnaNichiban</td><td>NW-15S</td><td>Szerokość 15 mm</td></tr><tr><td>DP72</td><td>Olympus</td><td></td><td>Degital</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Vigor</td><td></td><td>Dostępne są dowolne kleszcze nr 5</td></tr><tr><td>Komora wzrostowa</td><td>Nihonika</td><td>LPH-411PFQDT-SP</td><td></td></tr><<tr><td>em>HTR10-mRFP</td><td></td><td></td><td>Arabidopsis thaliana, ekotyp Columbia-0 (Col-0) tło Ingouff i in. ( 2007)7</td></tr><tr><td>Igła iniekcyjna</td><td>Terumo</td><td>NN-2719S</td><td>27 G</td></tr><tr><td>Szkło</td><td>ślizgowe Szkło Matsunami</td><td>S9443</td><td></td></tr><tr><td>SZX9</td> Mikroskop <td>preparacyjny</td><td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>U-MRFPHQ</td><td>Olympus</td><td></td><td>Kostka filtra fluorescencyjnego (wzbudzenie: BP535-555, emisja: BA570-625, Lustro dichromatyczne: DM565)</td></tr><tr><td>UPlanFL N 40x</td><td>Olympus</td><td></td><td>Soczewka obiektywu (NA 1.3), zanurzenie w oleju</td></tr><tr><td>UPlanSApo 20x</td><td>Olympus</td><td></td><td>Soczewka obiektywowa (NA 0.75), sucha</td></tr></tbody></table>

ocena stanu zapłodnienia poprzez śledzenie morfologii jądra plemnika w podwójnym zapłodnieniu arabidopsis

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Rośliny kwitnące mają unikalny system rozmnażania płciowego zwany 'podwójnym zapłodnieniem', w którym każda z plemników precyzyjnie łączy się z komórką jajową lub komórką centralną. W ten sposób dwa niezależne zdarzenia zapłodnienia odbywają się prawie jednocześnie. Zapłodniona komórka jajowa i komórka centralna rozwijają się odpowiednio w zygotę i bielmo. Dlatego precyzyjna kontrola podwójnego nawożenia jest niezbędna dla późniejszego rozwoju nasion. Podwójne zapłodnienie zachodzi w żeńskim gametoficie (woreczku zarodkowym), który jest głęboko ukryty i pokryty grubymi tkankami zalążka i jajnika. Ta budowa tkanki słupkowej sprawia, że obserwacja i analiza podwójnego zapłodnienia jest dość trudna i stworzyła obecną sytuację, w której wiele pytań dotyczących mechanizmu podwójnego zapłodnienia pozostaje bez odpowiedzi. Dla funkcjonalnej oceny potencjalnego kandydata na regulator nawożenia ważna jest analiza fenotypowa nawożenia. Aby ocenić zakończenie zapłodnienia u Arabidopsis thaliana, jako wskaźniki stosuje się kształty sygnałów fluorescencyjnych znakujących jądra plemników. Plemnik, który nie zapłodni, jest wskazywany przez skondensowany sygnał fluorescencyjny poza żeńskimi gametami, podczas gdy plemnik, który pomyślnie zapładnia, jest wskazywany przez zdekondensowany sygnał z powodu kariogamii z jądrem gamet żeńskich. Opisana tutaj metoda stanowi narzędzie do określenia udanego lub nieudanego nawożenia w warunkach in vivo.

Zaleczniki z słupka zapylonego DMP9KD/HTR10-mRFP zebrano w 7-8 HAP i poddano obserwacji.
Większość zalążków zawierała dwa zdekondensowane jądra plemników znakowane mRFP, odpowiednio w pozycjach jądra komórki jajecznej (strona mikropilarna) i komórki centralnej (strona chalazalna) (Rysunek 3A), co wskazuje na przebieg prawidłowej podwójnej zapłodnienia. Ponadto zaobserwowano zaląż...

Pokazujemy metodę określania udanego lub nieudanego zapłodnienia na podstawie morfologii jądra plemnika w podwójnym zapłodnieniu Arabidopsis za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.

Ocena stanu zapłodnienia poprzez śledzenie morfologii jądra plemnika w podwójnym zapłodnieniu Arabidopsis

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

Protokół ten umożliwia ocenę udziału pewnego czynnika w podwójnym zapłodnieniu rzodkiewnika. Stan zapłodnienia można na pierwszy rzut oka ocenić na podstawie morfologii jąder plemników, dzięki czemu możliwe jest szybkie uzyskanie danych do analizy statystycznej. Metoda ta jest specyficzna dla oceny fenotypu zapłodnienia u Arabidopsis.Nadal istnieją nieznane regulatory nawożenia, nawet jeśli występują u Arabidopsis. Metoda ta byłaby przydatna do analizy funkcjonalnej przyszłych nieznanych czynników nawożenia. Opanowanie umiejętności szybkiego i nienaruszonego obchodzenia się z zalążkami jest ważne dla powodzenia tej analizy.Na początek uprawiaj Arabidopsis thaliana w temperaturze 22 stopni Celsjusza w 16-godzinnym cyklu światła i ośmiogodzinnym ciemnym cyklu w komorze wzrostowej. Wytnij i usuń pierwszą rozwiniętą łodygę kwiatową nożyczkami, aby wspomóc rozwój pąków pachowych. Dwa do trzech tygodni po odcięciu pierwszej łodygi zmierz wysokość rośliny.Rośliny o wysokości powyżej 25 centymetrów są uważane za rośliny silnie rosnące i nadają się do analizy. Aby wykastrować, poszukaj pąków na etapie 11 z kawałkami płatków widocznymi u góry. Użyj kleszczy numer pięć, aby usunąć działkę, płatek i pręcik pąków kwiatowych.15 do 18 godzin po kastracji, weź pręcik linii do powalania DMP9 na tle kwiatu HTR10-mRFP na etapie 13, ściskając włókno kleszczami. Aby zapylić, delikatnie poklep kilkakrotnie piętno wykastrowanego słupka rozchodzącym się pylnikiem. Siedem do ośmiu godzin po zapyleniu zbierz słupek i umieść go na taśmie dwustronnej.Następnie delikatnie dociśnij kleszczami, aby przymocować słupek do taśmy. Pod mikroskopem preparacyjnym odciąć górny i dolny koniec jajnika za pomocą igły do wstrzykiwań. Przesunąć końcówkę igły do wstrzykiwań, aby naciąć ścianę jajnika po obu stronach wrzeciona.Ciąć ostrożnie, aby nie oddzielać funiculusa od przewodu transmisyjnego. Evert ściany jajnika. Ściśnij podstawę przegrody, do której połączone są zalążki, i ostrożnie podnieś ją kleszczami.Przenieś zalążki do kropli wody na szkiełku podstawowym i delikatnie przykryj szkiełkiem nakrywkowym do obserwacji pod mikroskopem fluorescencyjnym. W mikroskopie epifluorescencyjnym wyposażonym w kostkę z filtrem fluorescencyjnym ustaw soczewkę obiektywu na 20x lub 40x. Uzyskaj obrazy zalążków zawierających jądra plemników znakowane mRFP.Potwierdź liczbę jąder plemników znakowanych mRFP w woreczku zarodkowym. Potwierdź kształt i położenie każdego jądra plemnika znakowanego mRFP w woreczku zarodkowym. W tym badaniu fenotypy zapłodnienia oceniano na podstawie morfologii sygnału jądrowego plemnika w zalążku.Większość zalążków zawierała dwa zdekondensowane, znakowane mRFP jądra plemników po stronie mikropylarnej komórki jajowej i centralnej stronie końcowej komórki charazalnej. Wskazuje to na udane podwójne zapłodnienie. Ponadto obserwowano zalążki zawierające zdekondensowane jądro plemnika znakowane mRFP w centralnym jądrze komórkowym oraz skondensowane jądro plemnika znakowane mRFP na zewnątrz komórki jajowej, co wskazuje na pojedyncze zapłodnienie.W przypadku nieudanego podwójnego zapłodnienia na granicy komórki jajowej i komórki centralnej obserwowano dwa skondensowane jądra plemników znakowane mRFP. W analizie z użyciem linii knockdown DMP9 z tłem pyłku HTR10-mRFP rzadko obserwowano zalążki zawierające pojedyncze skondensowane jądro plemnika znakowane mRFP lub trzy lub więcej jąder plemników znakowanych mRFP. W połączeniu z wykorzystaniem żeńskich linii markerowych można analizować dokładniejszy stan zapłodnienia.Na przykład można ocenić stan zapłodnienia po fuzji gamet i przed kariogamią. Tak, proces nawożenia dzieli się na kilka etapów. Pytania, które każdy regulator nawożenia zaangażowany, w jakie kroki można odpowiedzieć za pomocą tej ulepszonej metody.Zapewniłoby to głębszy wgląd w rozmnażanie płciowe rośliny.

evaluation-fertilization-state-tracing-sperm-nuclear-morphology

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Imprinting jest zjawiskiem występującym w reprodukcji roślin i ssaków. Metylacja DNA odgrywa istotną rolę w mechanizmach imprintingu. Izolacja endospermy oraz określenie stanu metylacji genów podlegających imprintingowi u Arabidopsis mogą być trudne. W niniejszym protokole opisujemy, jak izolować endospermę i określać poziom metylacji za pomocą sekwencjonowania z bisulfitem.

Wyznaczanie metylacji DNA genów imprintowanych w endospermie Arabidopsis

Fundamentalnym celem biologii komórki jest zdefiniowanie mechanizmów leżących u podstaw tożsamości organelli tworzących komórki eukariotyczne. W niniejszej pracy proponujemy metodę identyfikacji genów odpowiedzialnych za integralność morfologiczną i funkcjonalną organelli roślinnych, wykorzystując mikroskopię fluorescencyjną oraz narzędzia sekwencjonowania następnej generacji.

Przesiew mikroskopii fluorescencyjnej i sekwencjonowanie następnej generacji: użyteczne narzędzia do identyfikacji genów zaangażowanych w integralność organelli

Informujemy o skutecznej i prostej metodzie izolowania zarodków we wczesnych stadiach rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana. W ciągu 1 godziny do 4 godzin można wyizolować do 40 zarodków, w zależności od dalszej aplikacji. Procedura jest odpowiednia do transkryptomu, metylacji DNA, ekspresji genów reporterowych, barwienia immunologicznego i fluorescencyjnych analiz hybrydyzacji in situ.

Skuteczna i szybka izolacja zarodków we wczesnym stadium rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana

Zapewniamy tutaj skuteczny i niezawodny protokół barwienia immunologicznego, fluorescencji hybrydyzacji in situ, barwienia DNA, a następnie ilościowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości w zalążkach Arabidopsis thaliana. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej.

Skuteczna metoda ilościowej, jednokomórkowej analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej w zalążkach z całą górą u Arabidopsis

Ten protokół przedstawia metodę obserwacji embriogenezy u Arabidopsis poprzez usuwanie zalążków, a następnie kontrolę tworzenia się wzorów zarodków pod mikroskopem.

Metoda charakteryzowania embriogenezy u Arabidopsis

Ten manuskrypt opisuje metodę hodowli jajników in vitro, która umożliwia obrazowanie żywych komórek zygot i zarodków Arabidopsis. Metoda ta jest wykorzystywana do wizualizacji dynamiki wewnątrzkomórkowej podczas polaryzacji zygoty i specyfikacji losu komórki w rozwijających się zarodkach.

In vitro Hodowla zalążków do obrazowania żywymi komórkami polaryzacji zygoty i wzorca zarodka u Arabidopsis thaliana

W tym protokole opisujemy techniki prawidłowego preparowania kwiatów i krzemionek Arabidopsis, niektóre podstawowe techniki oczyszczania oraz wybrane procedury barwienia dla obserwacji struktur rozrodczych na całej powierzchni.

Całościowe oczyszczanie i barwienie organów kwiatowych Arabidopsis i krzemianek

Tutaj opisujemy ulepszenie metody semi-in vitro (SIV) do obserwacji naprowadzania i odbioru łagiewki pyłkowej u Arabidopsis thaliana, co zwiększa podatność zalążków. Wysokoprzepustowa metoda SIV cum septum może być połączona z liniami markerowymi gametofitów i genetycznie kodowanymi biosensorami w celu monitorowania dynamicznego procesu zapłodnienia.

Obrazowanie na żywo odbioru łagiewki pyłkowej rzodkiewnika i podwójnego zapłodnienia metodą semi-in vitro cum septum

Ulepszona metoda pomiaru profili nawodnienia pyłku u Arabidopsis thaliana jest opisana tutaj. Nowa metoda oferuje wyższą rozdzielczość, jest nieinwazyjna i wysoce odtwarzalna. Protokół stanowi nowe narzędzie do dokładniejszej analizy procesów regulujących wczesne etapy zapylania.

Jednoziarnisty test biologiczny uwodnienia pyłku in vivo o wysokiej rozdzielczości dla Arabidopsis thaliana

Ten protokół opisuje przygotowanie nienaruszonych próbek warstwy komórek bielma w nasionach Arabidopsis thaliana. Metoda wymaga jedynie powszechnego sprzętu laboratoryjnego, takiego jak igła do wstrzykiwań i precyzyjne kleszcze, i umożliwia obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek bielma w wysokiej rozdzielczości zarówno w rozwijających się, jak i dojrzałych nasionach.

Przygotowanie nienaruszonej tkanki do analizy mikroskopowej warstwy komórek bielma w rozwijających się i dojrzałych nasionach Arabidopsis

Ruch chromosomów podczas profazy mejotycznej to słabo poznane zjawisko, które jest fundamentalne dla powstawania zarodników. Protokół ten opisuje metodę pozyskiwania, analizy i ilościowego określania ruchów centromerów podczas profazy mejotycznej w męskich meiocytach Arabidopsis thaliana .

Charakterystyka obrazowania na żywo ruchów centromerów podczas męskiej profazy mejotycznej u Arabidopsis thaliana

Poznaj metodę oceny stanu zapłodnienia u Arabidopsis poprzez analizę morfologii jąder plemników. Technika ta umożliwia szybką analizę statystyczną i identyfikację nieznanych regulatorów zapłodnienia.

Ocena stanu zapłodnienia poprzez śledzenie morfologii jądra plemnika w podwójnym zapłodnieniu Arabidopsis

Przeglądaj więcej filmów