Ocena stanu zapłodnienia poprzez śledzenie morfologii jądra plemnika w podwójnym zapłodnieniu Arabidopsis
29 sierpnia 2019
Pokazujemy metodę określania udanego lub nieudanego zapłodnienia na podstawie morfologii jądra plemnika w podwójnym zapłodnieniu Arabidopsis za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.
Protokół ten umożliwia ocenę udziału pewnego czynnika w podwójnym zapłodnieniu rzodkiewnika. Stan zapłodnienia można na pierwszy rzut oka ocenić na podstawie morfologii jąder plemników, dzięki czemu możliwe jest szybkie uzyskanie danych do analizy statystycznej. Metoda ta jest specyficzna dla oceny fenotypu zapłodnienia u Arabidopsis.
Nadal istnieją nieznane regulatory nawożenia, nawet jeśli występują u Arabidopsis. Metoda ta byłaby przydatna do analizy funkcjonalnej przyszłych nieznanych czynników nawożenia. Opanowanie umiejętności szybkiego i nienaruszonego obchodzenia się z zalążkami jest ważne dla powodzenia tej analizy.
Na początek uprawiaj Arabidopsis thaliana w temperaturze 22 stopni Celsjusza w 16-godzinnym cyklu światła i ośmiogodzinnym ciemnym cyklu w komorze wzrostowej. Wytnij i usuń pierwszą rozwiniętą łodygę kwiatową nożyczkami, aby wspomóc rozwój pąków pachowych. Dwa do trzech tygodni po odcięciu pierwszej łodygi zmierz wysokość rośliny.
Rośliny o wysokości powyżej 25 centymetrów są uważane za rośliny silnie rosnące i nadają się do analizy. Aby wykastrować, poszukaj pąków na etapie 11 z kawałkami płatków widocznymi u góry. Użyj kleszczy numer pięć, aby usunąć działkę, płatek i pręcik pąków kwiatowych.
15 do 18 godzin po kastracji, weź pręcik linii do powalania DMP9 na tle kwiatu HTR10-mRFP na etapie 13, ściskając włókno kleszczami. Aby zapylić, delikatnie poklep kilkakrotnie piętno wykastrowanego słupka rozchodzącym się pylnikiem. Siedem do ośmiu godzin po zapyleniu zbierz słupek i umieść go na taśmie dwustronnej.
Następnie delikatnie dociśnij kleszczami, aby przymocować słupek do taśmy. Pod mikroskopem preparacyjnym odciąć górny i dolny koniec jajnika za pomocą igły do wstrzykiwań. Przesunąć końcówkę igły do wstrzykiwań, aby naciąć ścianę jajnika po obu stronach wrzeciona.
Ciąć ostrożnie, aby nie oddzielać funiculusa od przewodu transmisyjnego. Evert ściany jajnika. Ściśnij podstawę przegrody, do której połączone są zalążki, i ostrożnie podnieś ją kleszczami.
Przenieś zalążki do kropli wody na szkiełku podstawowym i delikatnie przykryj szkiełkiem nakrywkowym do obserwacji pod mikroskopem fluorescencyjnym. W mikroskopie epifluorescencyjnym wyposażonym w kostkę z filtrem fluorescencyjnym ustaw soczewkę obiektywu na 20x lub 40x. Uzyskaj obrazy zalążków zawierających jądra plemników znakowane mRFP.
Potwierdź liczbę jąder plemników znakowanych mRFP w woreczku zarodkowym. Potwierdź kształt i położenie każdego jądra plemnika znakowanego mRFP w woreczku zarodkowym. W tym badaniu fenotypy zapłodnienia oceniano na podstawie morfologii sygnału jądrowego plemnika w zalążku.
Większość zalążków zawierała dwa zdekondensowane, znakowane mRFP jądra plemników po stronie mikropylarnej komórki jajowej i centralnej stronie końcowej komórki charazalnej. Wskazuje to na udane podwójne zapłodnienie. Ponadto obserwowano zalążki zawierające zdekondensowane jądro plemnika znakowane mRFP w centralnym jądrze komórkowym oraz skondensowane jądro plemnika znakowane mRFP na zewnątrz komórki jajowej, co wskazuje na pojedyncze zapłodnienie.
W przypadku nieudanego podwójnego zapłodnienia na granicy komórki jajowej i komórki centralnej obserwowano dwa skondensowane jądra plemników znakowane mRFP. W analizie z użyciem linii knockdown DMP9 z tłem pyłku HTR10-mRFP rzadko obserwowano zalążki zawierające pojedyncze skondensowane jądro plemnika znakowane mRFP lub trzy lub więcej jąder plemników znakowanych mRFP. W połączeniu z wykorzystaniem żeńskich linii markerowych można analizować dokładniejszy stan zapłodnienia.
Na przykład można ocenić stan zapłodnienia po fuzji gamet i przed kariogamią. Tak, proces nawożenia dzieli się na kilka etapów. Pytania, które każdy regulator nawożenia zaangażowany, w jakie kroki można odpowiedzieć za pomocą tej ulepszonej metody.
Zapewniłoby to głębszy wgląd w rozmnażanie płciowe rośliny.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia metodę oceny stanu zapłodnienia u Arabidopsis poprzez analizę morfologii jąder plemników. Pozwala ona na szybkie gromadzenie danych do analizy statystycznej, co wspomaga analizę funkcjonalną nieznanych czynników zapłodnienia.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia roślin
- Biologia rozrodu
- Biologia komórki
Wprowadzenie
- Podwójne zapłodnienie jest kluczowym procesem u roślin kwitnących.
- Zrozumienie mechanizmów zapłodnienia może ujawnić nieznane regulatory.
- Arabidopsis służy jako organizm modelowy do badania reprodukcji roślin.
- Ocena morfologii jąder plemników może wskazywać na sukces zapłodnienia.
Cel badania
- Opracowanie metody określania sukcesu zapłodnienia u Arabidopsis.
- Ułatwienie identyfikacji nieznanych regulatorów zapłodnienia.
- Umożliwienie szybkiego gromadzenia danych do dalszych analiz.
Zastosowane metody
- Mikroskopia epifluorescencyjna w celu wizualizacji jąder plemników.
- Ocena morfologii jąder w celu określenia stanu zapłodnienia.
- Analiza statystyczna zgromadzonych danych.
- Szkolenie z technik manipulacji prątkami zalążnymi w celu uzyskania dokładnych wyników.
Główne wyniki
- Pomyślna identyfikacja stanu zapłodnienia na podstawie morfologii plemników.
- Wykazana efektywność w gromadzeniu danych do analizy.
- Stworzenie podstaw do badania nieznanych czynników zapłodnienia.
- Podkreślenie znaczenia obchodzenia się z zalążkami w zastosowanej metodologii.
Wnioski
- Ta metoda jest skuteczna w ocenie zapłodnienia u Arabidopsis.
- Otwiera ona możliwości badania nieznanych regulatorów zapłodnienia.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym protokole w celu przeprowadzenia analiz funkcjonalnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładna ocena stanu zapłodnienia u Arabidopsis poprzez analizę morfologii jąder plemników zapewnia szybki, ilościowy odczyt do analizy funkcjonalnej regulatorów zapłodnienia. Podejście to umożliwia wysokoprzepustowe screenowanie fenotypowe oraz statystyczną ocenę genów kandydackich lub czynników zaangażowanych w podwójne zapłodnienie. Metoda ta wspiera wczesne odkrycia i mechanistyczną weryfikację ryzyk na styku biologii rozrodu roślin i procesów inżynierii cech.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę fenotypową potencjalnych regulatorów zapłodnienia in vivo.
- Wspiera weryfikację mechanizmów poprzez rozróżnienie udanych, częściowych i nieudanych zdarzeń zapłodnienia.
- Ułatwia szybką selekcję zaburzeń genetycznych lub chemicznych wpływających na podwójne zapłodnienie.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowany test oparty na fluorescencji do ilościowego określania wyników zapłodnienia.
- Dostarcza powtarzalnych punktów końcowych opartych na obrazowaniu, odpowiednich do analizy statystycznej i porównań między badaniami.
- Umożliwia skalowalny screening linii mutantów lub transgenicznych pod kątem fenotypów zapłodnienia.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z celami translacyjnymi poprzez powiązanie interwencji molekularnych z wynikami rozrodu w systemie modelowym.
- Wspiera ciągłość procesów od odkrycia po przedkliniczną walidację celów związanych z zapłodnieniem.
- Oferuje wartość prognostyczną dla strategii ulepszania cech w biotechnologii roślin uprawnych po odpowiednim dostosowaniu.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od odkrycia do walidacji w zakresie inżynierii cech reprodukcyjnych roślin oraz genomiki funkcjonalnej.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących regulatorów zapłodnienia oraz komponentów szlaków sygnałowych.
- Przesiewanie: Zapewnia ilościowe, powtarzalne odczyty niezbędne do opracowania testów i przesiewania mutantów.
- Analityka: Wspiera statystyczne porównywanie fenotypów zapłodnienia w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia mechanistyczne z przedkliniczną walidacją cech w systemach modelowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do prowadzenia ciągłych analiz funkcjonalnych nowych czynników zapłodnienia.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów i zmniejsza niejednoznaczność mechanizmów zapłodnienia.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje ocenę fenotypową i umożliwia szybkie, skalowalne gromadzenie danych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań nad potencjalnymi regulatorami oraz optymalizuje alokację zasobów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację interwencji genetycznych lub chemicznych w ramach potoków badawczych w biologii rozrodu, z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z Arabidopsis oraz w zakresie mikroskopii fluorescencyjnej.
- Wymaga dostępu do obrazowania epifluorescencyjnego i infrastruktury analizy obrazu.
- Wymaga stosowania standaryzowanych protokołów sekcji zalążków i przygotowania próbek.
- Może wymagać adaptacji do zastosowania w innych gatunkach roślin lub systemach modelowych.
- Zależne od dostępności linii z markerami fluorescencyjnymi do znakowania jąder plemników.
