Name: Pomiar interakcji między sondami fluorescencyjnymi a ligniną w skrawkach roślin za pomocą sFLIM w oparciu o natywną autofluorescencję (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Poznaj metodę sFLIM do pomiaru FRET między ligniną a sondami fluorescencyjnymi w skrawkach roślin. Technika ta umożliwia badanie interakcji enzym-lignina in situ bez konieczności utrwalania próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Fanny Laurent (FARE) serdecznie dziękujemy za przygotowanie figurek. Federacja badawcza FRABio (Uniwersytet w Lille, CNRS) jest uznawana za zapewnienie środowiska technicznego sprzyjającego realizacji tych prac. Finansowanie uzyskano z Francuskiej Narodowej Agencji Badawczej (projekt LIGNOPROG ANR-14-CE05-0026).

1. Przygotowanie próbek
UWAGA: Kolejne etapy przygotowania próbek zostały przedstawione na Rysunku 1.
<ol>
	<li>Przygotowanie próbek roślinnych
	<ol>
		<li>Z pni lub fragmentów drewna wyciąć za pomocą żyletek próbki o długości 1 cm, nie uszkadzając ich struktury.</li>
		<li>Zatopić próbki w medium z glikolem polietylenowym (PEG), zanurzając je w kolejnych roztworach o zwiększonym stężeniu PEG rozpuszczonego w wodzie, aż do osiągnięcia 100% PEG.
		<ol>
			<li>Umieścić próbkę w próżni w celu usunięcia wody.</li>
			<li>Łagodnie mieszać próbki w 30% v/v PEG przez 24 h.</li>
			<li>Łagodnie mieszać próbki w 50% v/v PEG przez 24 h.</li>
			<li>Łagodnie mieszać próbki w 100% PEG przez 24 h w temperaturze 70 °C (czysty PEG jest ciałem stałym w temperaturze pokojowej).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Umieścić próbki w kapsułkach w temperaturze 70 °C (na płycie grzewczej) i stopniowo obniżać temperaturę aż do osiągnięcia temperatury pokojowej.</li>
		<li>Starannie przygotować płaskie skrawki o grubości 30-60 µm z tych bloków PEG, używając mikrotomu i jednorazowych ostrzy.</li>
		<li>Zebrać skrawki i przemyć je w trzech kolejnych kąpielach wodnych po 5 min, aby usunąć PEG ze skrawków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie sondy fluorescencyjnej
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór buforu fosforanowego 30 mM o pH 6.0.</li>
		<li>Odważyć proszek sondy PEG-rodamina i dekstran-rodamina.</li>
		<li>Rozpuścić proszek sondy w buforze przy ciągłym mieszaniu w szklanej fiolce przez 1 h w ciemności do końcowego stężenia 0,1 g/L.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie próbek roślinnych
	<ol>
		<li>Inkubować skrawki z 500 µL sondy fluorescencyjnej (patrz 1.2.3) przez 72 h (bez mieszania) w plastikowej probówce (nie więcej niż 3 skrawki na probówkę) w ciemności.</li>
		<li>Podnieść skrawek pędzelkiem, odsączyć bufor czystym arkuszem (unikając wysuszenia skrawka), a następnie zamontować inkubowane skrawki między szkiełkiem podstawowym a lamelką #1.5H.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Kalibracja systemu pomiarowego czasu życia fluorescencji i widma
UWAGA: Pełny przebieg pomiaru sFLIM przedstawiono na Rysunku 2.
<ol>
	<li>Wyznaczenie szerokości okna widmowego detektora sFLIM.
	<ol>
		<li>Umieść kryształy mocznika w pudełku hodowlanym z dnem szklanym o grubości 0,17 µm.</li>
		<li>Umieść pudełko hodowlane na uchwycie do próbek mikroskopu i wybierz obiektyw 20x.</li>
		<li>Wybierz laser Ti:Sa o długości fali 900 nm i mocy 2%, a następnie włącz skanowanie.</li>
		<li>Zbierz sygnał drugiej harmonicznej na detektorze sFLIM. 
		UWAGA: Sygnał drugiej harmonicznej jest emitowany dokładnie przy połowie długości fali wzbudzenia, tj. 450 nm; pomiar ten, mimo że jest natychmiastowy, dostarcza również funkcji odpowiedzi instrumentalnej układu.</li>
		<li>Stopniowo dostrajaj długość fali wzbudzenia lasera od 900 do 980 nm, aż sygnał drugiej harmonicznej zostanie zarejestrowany w drugim kanale widmowym (462,5 nm).</li>
		<li>Wyznacz długość okna widmowego (12,5 nm).</li>
		<li>Jeśli zakres widmowy różni się od oczekiwanego, przeprowadź rozwiązywanie problemów w następujący sposób.
		<ol>
			<li>Ustaw laser na 910 nm.</li>
			<li>Zmieniaj pozycję siatki za pomocą pokrętła, aby zmierzyć sygnał drugiej harmonicznej wyłącznie na pierwszym kanale (granica pierwszego kanału).</li>
			<li>Ustaw laser na 935 nm.</li>
			<li>Zmieniaj pozycję siatki za pomocą pokrętła, aby zmierzyć sygnał drugiej harmonicznej wyłącznie na pierwszym kanale (granica drugiego kanału).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kalibracja wszystkich kanałów spektrometru
	<ol>
		<li>Wstaw lustro na stole mikroskopu.</li>
		<li>Wybierz laser ciągły z widzialnym zakresem (458 nm, moc 1%).</li>
		<li>Zbierz sygnał odbicia na detektorze sFLIM i sprawdź, czy fotony są mierzone w odpowiednim kanale widmowym.</li>
		<li>Powtórz kroki 2.2.2 i 2.2.3 dla wszystkich dostępnych laserów ciągłych (514 nm, 561 nm i 633 nm).</li>
		<li>Jeśli kanał widmowy różni się od oczekiwanego, zmień pozycję siatki za pomocą pokrętła i powtórz kroki 2.1 i 2.2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Charakterystyka fluorescencji próbki
<ol>
	<li>W spektrofluorometrze wyposażonym w uchwyt do folii (np. urządzenie Jasco FP-8500) umieść próbkę przekroju rośliny (nieinkubowaną z sondą fluorescencyjną).</li>
	<li>Zmierz emisję fluorescencji, zazwyczaj w zakresie 300-600 nm, pobudzając próbkę zazwyczaj w zakresie 250-550 nm.</li>
	<li>Nanieś intensywność fluorescencji w funkcji długości fal pobudzenia i emisji, aby sporządzić trójwymiarową mapę fluorescencji.</li>
	<li>Na podstawie wykresu określ obszar maksymalnego pobudzenia i emisji.</li>
</ol>
4. Pomiar widmowy FRET
<ol>
	<li>Kalibracja autofluorescencji
	<ol>
		<li>Wybierz obiektyw 20x (NA: 0.8).</li>
		<li>Ustaw wzbudzenie laserem dwufotonowym na 750 nm.</li>
		<li>Umieść samą sekcję rośliny słomy pszenicznej (WS) pomiędzy szkiełkiem a nakrywekciem.</li>
		<li>Wprowadź następujące parametry w oprogramowaniu. Przełącz do trybu lambda. Wybierz detektor spektralny ChS z rozdzielczością 9.7 nm. Wybierz zakres widmowy od 420 do 722 nm.</li>
		<li>Wykonaj obrazowanie.</li>
		<li>Wyznacz pik emisji donora (w tej konfiguracji 470 nm).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kalibracja akceptora
	<ol>
		<li>Umieść sondy fluorescencyjne na bazie rhodaminy w kasecie hodowlanej z szklanym dnem o grubości 0.17 µm.</li>
		<li>Wykonaj obrazowanie przy tych samych ustawieniach.</li>
		<li>Wyznacz pik emisji akceptora (w tej konfiguracji 570 nm).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyznacz zakres widmowy z maksymalnym sygnałem „samego WS” i brakiem sygnału akceptora jako emisję wyłącznie donora dla pomiarów sFLIM (w tej konfiguracji 460-490 nm).</li>
	<li>Pomiar próbek
	<ol>
		<li>Umieść barwioną sekcję rośliny pomiędzy szkiełkiem a nakrywekciem.</li>
		<li>Wykonaj obrazowanie przy tych samych ustawieniach.</li>
		<li>Zapisz plik lsm.</li>
		<li>Jakościowo powiąż silne zdarzenie FRET ze spadkiem piku emisji donora w porównaniu z „próbką samego WS” oraz wzrostem piku emisji akceptora w porównaniu z próbką rhodaminy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Pomiary sFLIM
UWAGA: W przypadku konfiguracji sFLIM zastosowano system sFLIM w dziedzinie czasu, opisany wcześniej10. Można użyć mikroskopu pionowego oraz różnych kart do zliczania pojedynczych fotonów skorelowanych w czasie i mikroskopów konfokalnych różnych producentów; w takim przypadku protokół należy odpowiednio dostosować.
<ol>
	<li>Przełącz system w tryb sFLIM.
	<ol>
		<li>Skonfiguruj mikroskop konfokalny zgodnie z opisem w punktach 4.1.1 i 4.1.2.</li>
		<li>Przełącz na Bez skanowania (non-descanned) tryb w oprogramowaniu służący do przesyłania fotonów fluorescencyjnych do detektora sFLIM.</li>
		<li>Ustaw akwizycję sFLIM na Włącz tryb umożliwiający zliczanie fotonów w urządzeniu SPC150.</li>
		<li>Wybierz czas poboru prób 30 s w urządzeniu SPC150.</li>
		<li>Sprawdź, czy CFD mieści się w zakresie od 1 x 105 oraz 1 x 106. 
		OSTRZEŻENIE: Należy upewnić się, że liczba fotonów mierzonych przez kartę TCSPC zawsze stanowi mniej niż 1% częstotliwości wzbudzenia lasera (w tej konfiguracji częstotliwość wzbudzenia lasera wynosi 80 MHz, a szybkość detekcji w żadnym pikselu nie może przekroczyć 800 kHz, aby uniknąć efektu spiętrzania impulsów).11).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść przekrój rośliny „WS alone” pomiędzy preparatem a szkiełkiem nakrywkowym.
	<ol>
		<li>Skonfiguruj oprogramowanie na Ciągły tryb umożliwiający skanowanie laserem.</li>
		<li>Wybierz obszar pomiarowy na próbce.</li>
		<li>Kliknij Start na urządzeniu SPC150.</li>
		<li>Zapisz plik sdt.</li>
		<li>Powtórz proces dla co najmniej 10 próbek na każdą warunkiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść zbarwiony przekrój rośliny pomiędzy szkiełkiem a lamellką.
	<ol>
		<li>Powtórz kroki 5.2.1 – 5.2.5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Analiza sFLIM
<ol>
	<li>Wybierz plik z nabytymi danymi sFLIM dla „WS alone” i zaimportuj go do oprogramowania SPCImage, korzystając z opcji File | Import.</li>
	<li>Wybierz parametry dopasowania.
	<ol>
		<li>Z menu Option | Model wybierz Incomplete multi-exponentials: 12.5 ns.</li>
		<li>Z menu Option | Preferences wybierz Calculate Instrumental Response automatically.</li>
		<li>Z menu prawego panelu głównego wybierz model dopasowania dwueksponencjalny: 
		<img alt="Wzór na absorpcję przejściową, \( F(t) = IRF \otimes \left( a_1 e^{-\frac{t}{t_1}} + a_2 e^{-\frac{t}{t_2}} \right) \), schemat." src="/files/ftp_upload/59925/59925equ01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"></li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla każdego kanału zastosuj model dopasowania i zapisz parametry dopasowania w arkuszu kalkulacyjnym (a1, a2, t1, t2).</li>
	<li>W celu porównania kanałów i eksperymentów oblicz w arkuszu kalkulacyjnym średni czas życia fluorescencji (Tm): 
	<img alt="Wzór na równowagę termiczną, równanie Tm, obliczenia analityczne, schemat do badania." src="/files/ftp_upload/59925/59925equ02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 2"></li>
	<li>Oblicz średni czas życia dla wszystkich próbek (co najmniej 10) we wszystkich kanałach.
	<ol>
		<li>Przeanalizuj Tm w kanałach donora (od kanału 1 do 3: 460-490 nm) i wyznacz dedykowany kanał (kanał 2 odpowiadający przedziałowi 467.5 - 480 nm), który wykazuje najwyższą liczbę fotonów i odpowiada maksimum emisji ligniny. Wartości z kanału 2 muszą zostać użyte w kroku 6.7.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz plik z nabytymi danymi sFLIM dla barwionego WS i zaimportuj go do oprogramowania SPCImage.
	<ol>
		<li>Powtórz kroki 6.1-6.4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz wydajność FRET EFRET dla donora w wcześniej wybranym kanale WS Alone (TmD) oraz dla barwionej próbki roślinnej (TmDA): 
	<img alt="Wzór na wydajność FRET, \(E_{\text{FRET}} = 1 - \frac{T_{mDA}}{T_{mD}}\), stosowany w badaniach fluorescencyjnych." src="/files/ftp_upload/59925/59925equ03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 3"></li>
	<li>Porównaj wartości sFLIM i EFRET pomiędzy WS a próbką.
	<ol>
		<li>Pozytywną wartość EFRET powiązaną z jednorodnym spadkiem czasu życia pomiędzy WS a próbką należy analizować jako zdarzenie FRET (szczegóły znajdują się w reprezentatywnych wynikach oraz pracach Spriet i wsp.12 oraz Terryn i wsp.10).</li>
		<li>Spadek czasu życia rozłożony w inny sposób należy uznać za wynik mieszanki FRET i stopnia upakowania ligniny i nie interpretować go jako oddziaływań molekularnych.</li>
		<li>Brak modyfikacji czasu życia należy uznać za brak mierzalnego sygnału FRET, a nie za brak oddziaływania z ligniną.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Inouye, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+deconstruction+of+molecular+architecture+in+corn+stover%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Multiscale deconstruction of molecular architecture in corn stover.</a> Scientific Reports. 4, 3756(2014).</li>
<li>Li, X., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin-enzyme+interaction%3A+Mechanism%2C+mitigation+approach%2C+modeling%2C+and+research+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Lignin-enzyme interaction: Mechanism, mitigation approach, modeling, and research prospects.</a> Biotechnology Advances. 35 (4), 466-489 (2017).</li>
<li>Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+aspects+of+the+grass+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Unique aspects of the grass cell wall.</a> Current Opinion in Plant Biology. 11 (3), 301-307 (2008).</li>
<li>Lynd, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+grand+challenge+of+cellulosic+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The grand challenge of cellulosic biofuels.</a> Nature Biotechnology. 35, 912(2017).</li>
<li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer.</a> Current Opinion in Biotechnology. 6, 103-110 (1995).</li>
<li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+fluorescence+microscopy+techniques-FRAP%2C+FLIP%2C+FLAP%2C+FRET+and+FLIM%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li>
<li>Pietraszewska-Bogiel, A., Gadella, T. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+microscopy%3A+from+principle+to+routine+technology+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">FRET microscopy: from principle to routine technology in cell biology.</a> Journal of Microscopy. 241 (2), 111-118 (2011).</li>
<li>Herbaut, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+analysis+of+pretreated+biomass+species+highlights+generic+markers+of+lignocellulose+recalcitrance%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Multimodal analysis of pretreated biomass species highlights generic markers of lignocellulose recalcitrance.</a> Biotechnology for Biofuels. 11, 52(2018).</li>
<li>Chabbert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+techniques+can+reveal+cell+wall+organization+and+predict+saccharification+in+pretreated+wood+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22Industrial+Crops+and+Products%22%5BJournal%5D)">Fluorescence techniques can reveal cell wall organization and predict saccharification in pretreated wood biomass.</a> Industrial Crops and Products. 123, 84-92 (2018).</li>
<li>Terryn, C., Paës, G., Spriet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-SLiM+on+native+autofluorescence%3A+a+fast+and+reliable+method+to+study+interactions+between+fluorescent+probes+and+lignin+in+plant+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">FRET-SLiM on native autofluorescence: a fast and reliable method to study interactions between fluorescent probes and lignin in plant cell wall.</a> Plant Methods. 14 (1), 74(2018).</li>
<li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJovin%2C+TM+%22Cell+Structure+and+Function+by+Microspectrofluorometry%22">Cell Structure and Function by Microspectrofluorometry</a>. Kohen, E. , Academic Press. 99-117 (1989).</li>
<li>Spriet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+fluorescence+lifetime+and+spectral+measurements+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Correlated fluorescence lifetime and spectral measurements in living cells.</a> Microscopy Research and Technique. 70 (2), 85-94 (2007).</li>
<li>Donaldson, L. A., Newman, R. H., Vaidya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+interactions+of+polyethylene+glycol+with+thermo-mechanically+pre-treated+Pinus+radiata+biofuel+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Nanoscale interactions of polyethylene glycol with thermo-mechanically pre-treated Pinus radiata biofuel substrate.</a> Biotechnology and Bioengineering. 111 (4), 719-725 (2014).</li>
<li>Herbaut, M., Zoghlami, A., Paës, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamical+assessment+of+fluorescent+probes+mobility+in+poplar+cell+walls+reveals+nanopores+govern+saccharification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Dynamical assessment of fluorescent probes mobility in poplar cell walls reveals nanopores govern saccharification.</a> Biotechnology for Biofuels. 11 (1), 271(2018).</li>
<li>Paës, G., Chabbert, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+arabinoxylan+%2F+cellulose+nanocrystals+gels+to+investigate+fluorescent+probes+mobility+in+bio-inspired+models+of+plant+secondary+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Characterization of arabinoxylan / cellulose nanocrystals gels to investigate fluorescent probes mobility in bio-inspired models of plant secondary cell wall.</a> Biomacromolecules. 13, 206-214 (2012).</li>
<li>Donaldson, L. A., Radotic, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging+of+lignin+autofluorescence+in+normal+and+compression+wood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging of lignin autofluorescence in normal and compression wood.</a> Journal of Microscopy. 251 (2), 178-187 (2013).</li>
<li>Auxenfans, T., Terryn, C., Paës, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+biomass+recalcitrance+through+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Seeing biomass recalcitrance through fluorescence.</a> Scientific Reports. 7, 8838(2017).</li>
<li>Waharte, F., Spriet, C., Héliot, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setup+and+characterization+of+a+multiphoton+FLIM+instrument+for+protein-protein+interaction+measurements+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Setup and characterization of a multiphoton FLIM instrument for protein-protein interaction measurements in living cells.</a> Cytometry A. 4, 299-306 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Korelacja czasu życia fluorescencji i pomiarów widma emisyjnego pozwala na połączenie zalet obu metod. Rzeczywiście, same pomiary spektralne nie są czułe i pozostają jakościowe. Z drugiej strony, czas trwania fluorescencji jest metodą z wyboru dla tradycyjnych ilościowych pomiarów FRET, ale wykazano, że autofluorescencja ligniny może się różnić w zależności od składu ligniny i środowiska16. W związku z tym nie można rozróżnić interakcji ligniny z akceptorem lub zmian strukturalnych ligniny, ponieważ oba powodują skrócenie czasu życia. Jak wykazano, opracowana metoda zapewnia jednoznaczny, czuły i ilościowy pomiar oddziaływań między ligniną a cząsteczkami akceptorowymi w sekcjach roślinnych. Nawet jeśli poszczególne etapy metody zostały rygorystycznie zoptymalizowane, należy szczególnie zachować ostrożność w odniesieniu do następujących punktów.
Jeśli chodzi o próbki, jakość sekcji roślinnej ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia obrazowania w ostrości. Należy ściśle przestrzegać różnych kroków osadzania PEG. Ostatni etap mycia jest niezbędny, aby upewnić się, że PEG nie pozostaje w próbkach. Ponadto stężenie buforu i pH powinny być ściśle takie same dla wszystkich pomiarów, ponieważ każda zmiana może mieć silny wpływ na właściwości fluorescencyjne.
Pomiar żywotności może być również delikatny. Czas życia fluorescencji dawcy może być niestabilny, na przykład z powodu dużego wzbudzenia. W takim przypadku dostrojenie mocy lasera i zoomu może rozwiązać problem. Innym dobrze znanym źródłem artefaktów w pomiarach TCSPC jest nawarstwianie się impulsów fotonowych. Rzeczywiście, TCSPC nie może zmierzyć prędkości dwóch fotonów emitowanych między tymi samymi dwoma impulsami laserowymi. Podczas gdy próbki roślinne są wysoce ustrukturyzowane, fluorescencja nie jest jednorodna i może prowadzić do ukrytego efektu nawarstwiania się impulsów. Podczas gdy liczba fotonów na sekundę pozostaje poniżej 1% limitu wzbudzenia, może być wyższa w niektórych obszarach próbki. Aby upewnić się, że nie ma eksperymentów z pileupem, można rozważyć pomiar czasu życia fluorescencji dawcy przy innym strumieniu fotonów. Jeśli czas życia wzrasta, a strumień maleje, oznacza to, że pomiary zmieniają efekt pileup. Optymalny strumień fotonów jest osiągany przy stabilności życia donora.
Jeśli chodzi o analizę krzywej zaniku sFLIM, zalecamy poleganie na każdym indywidualnym dopasowaniu krzywej, aby upewnić się, że model dokładnie opisuje pomiary. Jeśli tak nie jest, najpierw upewnij się, że żaden z wcześniej wymienionych artefaktów nie uszkodził danych. Następnie, krok 2.1.4 zapewnia funkcję odpowiedzi instrumentalnej (IRF) systemu. Jeśli IRF wykazuje pewne anomalie, zoptymalizuj ścieżkę optyczną, aby je zminimalizować. Można również użyć zmierzonego IRF do montażu w kroku 6.2. Wreszcie, stopnie swobody modelu dopasowania można zwiększyć do trzywykładniczego rozpadu w kroku 6.2. Jednak liczba fotonów wymagana do indywidualnego czasu życia i określenia proporcji jest wysoka i dlatego zaleca się ich stosowanie wyłącznie w celu osiągnięcia bardziej stabilnego średniego czasu życia z kroku 6.4. Bardziej wyczerpujące informacje na temat FLIM, jego charakterystyki18, sFLIM i jego zastosowania12 , w szczególności do ligniny10, można znaleźć w literaturze.
Chociaż jest to trudne, pomiar FRET w tkankach roślinnych przy użyciu natywnej autofluorescencji wykazuje pewne zalety. W porównaniu z pomiarami FRET wykonywanymi na żywych tkankach, w których badania interakcji między biomolekułami często wymagają inżynierii genetycznej w celu ekspresji wewnętrznych markerów fluorescencyjnych, zdrewniałe tkanki roślinne, takie jak te przedstawione tutaj, oferują naturalną autofluorescencję, a zewnętrzne sondy fluorescencyjne mogą być łatwo dodane, oszczędzając dużo czasu. Jednak w zależności od analizowanych gatunków roślin i możliwych przeprowadzonych zabiegów wstępnych, autofluorescencja może zostać zmodyfikowana, tak że będzie musiała być dokładnie scharakteryzowana, a fluorofor używany jako sondy może wymagać adaptacji.
Metodę sFLIM należy stosować do sond fluorescencyjnych pozbawionych aktywności katalitycznej (PEG i dekstran). W ramach hydrolizy lignocelulozy roślinnej można przeprowadzić oddziaływania enzymów w różnych próbkach biomasy, co może prowadzić do określenia wpływu lokalizacji (komórek i tkanek) na siłę oddziaływania. Kolejnym krokiem optymalizacyjnym będzie automatyzacja kroku analizy. Rzeczywiście, przy wystarczającej ilości przeanalizowanych danych, procedura analizy oparta na uczeniu maszynowym może zostać wdrożona do zautomatyzowanej analizy fenotypu, co zwiększyłoby jej zdolność do szybkiego badania przesiewowego wydajności enzymów i biomasy. Ponadto sFLIM nie wymaga utrwalania próbki i może być łatwo stosowany do dynamicznych badań interakcji enzym-lignina. Taka unikalna metoda prawdopodobnie ukierunkuje strategię inżynierii enzymatycznej i wstępną obróbkę biomasy w celu optymalizacji waloryzacji lignocelulozy.

Hydroliza lignocelulozy do cukrów monomerycznych, takich jak glukoza, wymaga enzymów. Wiadomo, że ich aktywność jest ograniczona przez ustanowienie niespecyficznych interakcji między enzymami a ligniną1,2, przy czym ten ostatni jest hydrofobowym polimerem i głównym składnikiem lignocelulozy3. W związku z tym ilościowy pomiar takich interakcji bezpośrednio na skali komórkowej jest wyzwaniem, z którym należy się zmierzyć, aby zoptymalizować aktywność katalityczną enzymu i wstępną obróbkę lignocelulozą4.
Förster (lub fluorescencyjny) pomiar rezonansowego transferu energii (FRET) jest metodą z wyboru do oceny interakcji biomolekuł in situ. Ten nieradiacyjny transfer energii może zachodzić między dawcą a akceptorem fluoroforu, jeśli spełniają one różne warunki. Widmo emisji donorowej musi się pokrywać, przynajmniej częściowo, na widmo wzbudzenia akceptorów. Wybór fluoroforów jest więc kluczowy dla takich eksperymentów. Następnie wydajność transferu zmniejsza się wraz z szóstą potęgą ich odległości5 i występuje tylko wtedy, gdy obie cząsteczki znajdują się w bliskim sąsiedztwie (zwykle w zakresie nanometrów). Inne nieprzewidziane sytuacje mogą zmienić wydajność transferu, takie jak orientacja dipol-dipol, ale są łagodzone, jeśli fluorofory mają elastyczność.
FRET można mierzyć różnymi technikami, a szczegółowe opisy można znaleźć w literaturze6,7. Krótko mówiąc, główne metody opierają się na: i) emisji uczulonej, w której śledzi się zmianę fluorescencji emisji akceptorowej i które zapewniają głównie wyniki jakościowe; ii) fotowybielanie akceptorowe, w którym mierzy się fluorescencję emisji donorowej przed i po fotowybielaniu akceptorowym (w tym przypadku można uzyskać bardziej precyzyjne oszacowania FRET, ale wymagają one zastosowania dużej mocy lasera do utrwalonych próbek); oraz iii) pomiar czasu życia, który zmniejsza się dla dawcy w obecności akceptora. Metoda ta wymaga specjalnych przyrządów i pozwala na precyzyjne i czułe pomiary interakcji między fluoroforami. Biorąc pod uwagę pomiar FRET między sondami fluorescencyjnymi a lignocelulozą, główna trudność polega na tym, że lignoceluloza nie jest pojedynczym, dobrze scharakteryzowanym fluoroforem: ma silną natywną i spektralnie szeroką autofluorescencję, pochodzącą głównie z ligniny i zależną od gatunków biomasy8,9.
W tym artykule proponujemy nową i oryginalną procedurę dostosowaną do przekrojów próbek drewna/roślin. Ta metoda oparta na sFLIM otwiera drogę do ilościowych pomiarów FRET między sondami fluorescencyjnymi a ligniną w natywnych próbkach lignocelulozy.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>ZEISS</td><td>LSM 710 NLO</td><td>do obrazowania konfokalnego</td></tr><tr><td>cienka szczoteczka</td><td></td><td></td><td>do pobierania skrawków</td></tr><tr><td>szklane fiolki</td><td></td><td></td><td>do inkubacji</td></tr><tr><td>mikroskop o wysokiej precyzji okulary nakrywkowe 170 +/- 5 i mikro; m n&deg; 1,5#</td><td>Marienfeld</td><td>0107032</td><td>wystawiony przez Dutscher s.a. we Francji</td></tr><tr><td>Laser impulsowy na podczerwień</td><td>KOHERENT</td><td>CHAMELEON VISION</td><td>Do wzbudzenia próbki</td></tr><tr><td>Mikropipeta Research Plus jednokanałowa 20-200&mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>z odpowiednimi końcówkami</td></tr><tr><td>Mikropipeta Research Plus jednokanałowa 2-20&micro; L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>z odpowiednimi</td></tr><tr><td>końcówkami Szkiełka mikroskopowe ok. 76 x 26 mm szlifowane krawędzie matowa</td><td>końcówka Thermo Fisher Scientific</td><td>LR45D</td><td></td></tr><tr><td>ostrza mikrotomu jednorazowe (opakowanie 50 szt.)</td><td>Agar Scientific</td><td>T5024</td><td>sprzedany przez Oxford Instruments we Francji</td></tr><tr><td>mPEG-Rhodamine, 10 kDa</td><td>Creative Peg Works</td><td>PSB-2263</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-Rhodamine, 20 kDa</td><td>Creative Peg Works</td><td>PSB-22642</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-Rhodamine, 5 kDa</td><td>Creative Peg Works</td><td>PSB-2264</td><td></td></tr><tr><td>lakier</td><td></td><td></td><td>do paznokci do montażu</td></tr><tr><td>pH-metru pięć easy plus</td><td>Mettler</td><td>toledo FEP20</td><td>z elektrodą</td></tr><tr><td>poli(glikol etylenowy) średnia mol wt 1450</td><td>Merck (sigma-Aldrich)</td><td>P5402-1kg</td><td>do zatapiania próbki</td></tr><tr><td>żyletki, ostrza jednoostrzowe, stal nierdzewna, pudełko 100</td><td>sztuk Agar Scientific</td><td>T586</td><td>do przygotowania fragmentów sprzedawany przez Oxford Instruments we Francji</td></tr><tr><td>mikrotom rotacyjny</td><td>Microm Microtech</td><td>HM 360</td><td></td></tr><tr><td>sFLim detektor</td><td>BECKER-HICKL</td><td>SPC 150</td><td>do dożywotniego pozyskiwania</td></tr><tr><td>diwodorofosforanu sodu dwuwodny NaH2PO4, 2H2O</td><td>Merck (sigma-Aldrich)</td><td>71500</td><td>dla roztwór buforowy</td></tr><tr><td>fosforan sodu dwuzasadowy dwuwodny Na2HPO4,2H2O</td><td>Merck (sigma-Aldrich)</td> <td>30435-1kg</td><td>do roztworu buforowego, stare odniesienie, nowe to 71643-1kg</td></tr><tr><td>izotiocyjanian tetrametylu rodaminy-dekstran 10 k Da</td><td>Merck (sigma-Aldrich)</td> <td>R8881-100mg</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar interakcji między sondami fluorescencyjnymi a ligniną w skrawkach roślin za pomocą sflim w oparciu o natywną autofluorescencję

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

W biomasie lignocelulozowej (LB) aktywność enzymów jest ograniczona przez pojawienie się niespecyficznych interakcji z ligniną podczas procesu hydrolizy, co utrzymuje enzymy z dala od ich substratu. Charakterystyka tych złożonych oddziaływań jest zatem wyzwaniem w przypadku złożonych substratów, takich jak LB. Metoda ta mierzy interakcje molekularne między cząsteczkami znakowanymi fluoroforem a natywną ligniną autofluorescencyjną, które zostaną ujawnione przez rezonansowy transfer energii Förstera (FRET). W przeciwieństwie do pomiarów FRET w żywych komórkach przy użyciu dwóch egzogennych fluoroforów, pomiary FRET w roślinach wykorzystujących ligninę nie są trywialne ze względu na jej złożoną autofluorescencję. Opracowaliśmy autorski potok akwizycji i analizy ze skorelowaną obserwacją dwóch uzupełniających się właściwości fluorescencji: emisji fluorescencji i czasu życia. sFLIM (spectral and fluorescent lifetime imaging microscopy) zapewnia ilościowe określenie tych interakcji z wysoką czułością, ujawniając różne poziomy interakcji między biomolekułami a ligniną.

Aby zademonstrować zdolność sFLIM do analizy oddziaływań molekularnych między ligniną a cząsteczkami znakowanymi fluorescencyjnie, w pierwszej kolejności wykorzystano trzy różne próbki (Rycina 3): natywną słomę pszenną (WS), natywną słomę pszenną inkubowaną z PEG znakowanym rodaminą (PR10) oraz natywną słomę pszenną z dekstranem znakowanym rodaminą (DR10). Wiadomo, że PR10 oddziałuje z ligniną, podczas gdy DR10 powinien być obojętny13,14,15. Krzywe sFLIM (Rycina 3, góra) wykazują pewne modyfikacje, jakie można zaobserwować między próbką referencyjną (WS) a dwoma przypadkami oddziaływań (DR10 i PR10). Rzeczywiście, w pierwszej kolejności można łatwo zauważyć wzrost fluorescencji w obszarach spektralnych odpowiadających zakresowi emisji rodaminy. Uważna obserwacja krzywych zaniku fotonów w trzech pierwszych kanałach ujawnia również silniejsze ugięcie dla DR10 niż dla PR10. Po dopasowaniu krzywych zaniku fotonów i obliczeniu średniego czasu życia fluorescencji dla każdego kanału, sygnatura FRET staje się bardziej wyraźna (Rycina 3, dół). W rzeczywistości, podczas gdy czas życia fluorescencji w próbce WS naprzemiennie rośnie i maleje wzdłuż widma fluorescencji, dla PR10 i DR10 obserwuje się wyraźną sygnaturę FRET z: 1) stałą wartością czasu życia w kanale emisji samego donora (3 pierwsze kanały, na niebiesko); oraz 2) rosnącym czasem życia fluorescencji w kanale spektralnym odpowiadającym rosnącemu wkładowi fluoroforu donora o długim czasie życia.
Po jednoznacznym określeniu FRET, porównanie czasu życia fluorescencji ligniny (kanał 2) pozwala na ilościowe określenie skrócenia czasu życia pomiędzy WS (0,47 ns), DR10 (0,42 ns) a PR10 (0,36 ns), co ujawnia oddziaływania molekularne między ligniną a PR10 i DR10, przy czym silniejsze powinowactwo wykazuje PR10.
Aby zilustrować przydatność tej metody do ilościowego określania różnych poziomów oddziaływań, wybraliśmy trzy inne próbki, imitujące dostępność enzymatyczną w potraktowanych próbkach roślinnych: WS poddany działaniu kwasu (AWS) oraz kombinacje PR o dwóch przeciwstawnych masach cząsteczkowych 5 kDa i 20 kDa (PR5 i PR20). Po dokładnej analizie sygnatur sFLIM wyznaczono czas życia fluorescencji ligniny (Rysunek 4). Jak stwierdzono wcześniej, czas życia fluorescencji ligniny może ulegać zmianom pod wpływem otoczenia16,17. Po traktowaniu kwasem czas życia fluorescencji zmierzony w AWS (0.28 ns) stał się niższy niż wcześniej zmierzony dla WS (0.47 ns), co potwierdza konieczność stosowania procedury sFLIM dla jednoznacznej interpretacji skrócenia czasu życia oraz potrzebę stosowania kontroli negatywnych dla każdego badanego warunku. Zgodnie z oczekiwaniami, po dodaniu PR do AWS zaobserwowano silny spadek czasu życia w wyniku oddziaływania z ligniną. Ponadto oddziaływanie jest silniejsze w przypadku PR5 (0.14 ns) w porównaniu do PR20 (0.16 ns), co jest zgodne z pomiarami ich promienia hydrodynamicznego (odpowiednio 2.3 nm dla PR5 i 4.8 nm dla PR20), co indukuje różne ograniczenia steryczne i tym samym zwiększa dostępność PR5 do ligniny.
Oba eksperymenty wykazują przydatność tej metody do precyzyjnej oceny oddziaływań ligniny z enzymami, w zależności od ich wielkości oraz od obróbki wstępnej próbek roślinnych.
<img alt="Analiza tkanek roślinnych: mikroskopia i przygotowanie próbek do spektroskopii absorpcyjnej; przekroje histologiczne, probówka." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59925/59925fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Różne etapy przygotowania próbek. Słoma pszenna (WS) (A) jest najpierw rozdrabniana (B), aby można było ją zatopić w medium PEG (C). Blok jest cięty za pomocą mikrotomu wyposażonego w jednorazowe ostrza (D). Po przemyciu otrzymane przekroje (E) są umieszczane do inkubacji w roztworze rhodaminy znakowanej PEG lub dekstranem (F). Znakowane przekroje są montowane do pomiarów sFLIM (G). Paski skali wynoszą 2 cm (A), 1 cm (B i C), 200 µm (E i G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59925/59925fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat obrazowania czasu życia widmowego: układ sFLIM, wielofotonowy mikroskop konfokalny, analiza fluorescencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59925/59925fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Pełny schemat pomiarów oddziaływań opartych na spektralnym FRET.** Rysunek przedstawia układ łączący pomiary natężenia i czasu życia fluorescencji spektralnej. Obrazy fluorescencji spektralnej są pozyskiwane za pomocą mikroskopu konfokalnego, a następnie czasy życia fluorescencji dla każdego zakresu widmowego są mierzone detektorem sFLIM. Analiza krzywych zaniku fotonów pozwala na dokładne określenie oddziaływań między próbką a badanymi cząsteczkami. W celu uniknięcia artefaktów należy przeprowadzić kalibracje. Po pierwsze, detektor sFLIM musi zostać skalibrowany spektralnie, a jego instrumentalna funkcja odpowiedzi musi zostać sprawdzona. Po drugie, złożony sygnał autofluorescencji musi zostać precyzyjnie skalibrowany dla każdej próbki, aby określić czas życia fluorescencji w każdym kanale przed dodaniem cząsteczki akceptora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59925/59925fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza czasu życia fluorescencji; wykresy widm 3D; długość fali względem czasu; porównanie na wykresie słupkowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59925/59925fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Reprezentatywne pomiary sFLIM. Krzywe sFLIM (górny panel) uzyskano dla naturalnej słomy pszennej (WS), WS inkubowanej z PEG znakowanym rodaminą (WS+PEG) oraz naturalnej słomy pszennej z dekstranem znakowanym rodaminą (WS+DEX). Dla każdej próbki krzywe sFLIM dopasowano do modelu zaniku bieksponecjalnego i obliczono średni czas życia fluorescencji dla każdego kanału (dolny panel). Próbki WS+PEG i WS+DEX wykazują spadek czasu życia fluorescencji w kanale odpowiadającym wyłącznie autofluorescencji (trzy pierwsze słupki), co wiąże się ze wzrostem czasu życia w kanale odpowiadającym mieszanej emisji autofluorescencji i rodaminy. Zachowanie to jest charakterystyczne dla zjawiska FRET pomiędzy ligniną a cząsteczkami znakowanymi rodaminą. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59925/59925fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres analizy czasu życia fluorescencji, przedstawiający struktury molekularne i czasy życia dla wariantów AWS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59925/59925fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Analiza czasu życia fluorescencji kanału odpowiadającego autofluorescencji ligniny. Po potwierdzeniu zdarzenia FRET na podstawie sygnatury sFLIM, zmierzono średni czas życia fluorescencji dla WS traktowanego kwasem (AWS) w kombinacji z PR5 lub PR20 (odpowiednio 5 kDa i 20 kDa). Podczas gdy obie próbki PR wykazują skrócenie czasu życia, mniejsza z nich charakteryzuje się silniejszą redukcją czasu życia, co wskazuje na silniejszą oddziaływanie molekularne z ligniną. Metoda ta jest zatem wystarczająco czuła, aby odróżnić obie próbki (przedstawiono wartość średnią i błąd standardowy, n&gt;10 na warunek). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59925/59925fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje oryginalną konfigurację łączącą pomiary czasu życia widma i fluorescencji w celu oceny transferu energii rezonansu Förstera (FRET) między sondami fluorescencyjnymi na bazie rodaminy a polimerem ligniny bezpośrednio w grubych sekcjach rośliny.

Pomiar interakcji między sondami fluorescencyjnymi a ligniną w skrawkach roślin za pomocą sFLIM w oparciu o natywną autofluorescencję

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

W biomasie lignocelulozowej aktywność enzymów analizujących polisacharydy jest ograniczona przez występowanie niespecyficznych oddziaływań z ligniną. Analiza FRET jest odpowiednim podejściem do ewolucji w skali nano. Uzyskanie wszystkich kolejnych odcinków może być wyzwaniem w zależności od biomasy.Nie spiesz się z cięciem za pomocą mikrotomu i wykonaj delikatne płukanie. Zestawienie pomiarów czasu życia i widma fluorescencji pozwala na ilościowe, czułe i jednoznaczne określenie FRET między cząsteczkami ligniny i TAG in situ. Metoda ta wykorzystuje skomplikowane techniki, takie jak cięcie próbek na podstawie akwizycji i analizy mikroskopii wielowymiarowej, które można łatwo nauczyć się za pomocą wizualnej demonstracji.Aby przygotować próbki roślin z drewna, pszenicy, włókien lub fragmentów, użyj żyletek, aby wyciąć próbki o długości jednego centymetra bez uszkadzania struktury materiału i umieść próbki w próżni, aby usunąć powietrze. Zanurz próbki na 24 godziny w kolejnych 30% i 50% stężeniach PEG rozcieńczonych w wodzie o temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając. Następnie przez 24 godziny zanurzany w 100% stężeniu PEG w temperaturze 70 stopni Celsjusza.Po zanurzeniu w 100% PEG umieść próbki w kapsułkach na płycie grzejnej o temperaturze 70 stopni Celsjusza i stopniowo zmniejszaj temperaturę płytki w krokach co pięć stopni Celsjusza, aż płytka osiągnie temperaturę pokojową. Gdy próbki ostygną, użyj mikrotomu i jednorazowych ostrzy, aby ostrożnie uzyskać płaskie odcinki o grubości od 30 do 60 mikrometrów z każdego bloku PEG. Usuń PEG z sekcji za pomocą trzech pięciominutowych delikatnych płukań wodą.Po ostatnim praniu inkubować do trzech sekcji na probówkę z 500 mikrolitrami świeżo przygotowanej sondy fluorescencyjnej przez 72 godziny, chroniąc ją przed światłem. Pod koniec inkubacji barwienia użyj pędzla, aby przenieść skrawki na szkiełko przed zamontowaniem sekcji między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym o numerze 1,5H. Aby określić szerokość okna spektralnego detektora sFLIM, umieść kryształy mocznika w pudełku hodowlanym ze szklanym dnem o grubości 0,17 mikrometra i umieść pudełko na uchwycie na próbkę mikroskopu.Wybierz obiektyw 20X i szafirowy laser domieszkowany tytanem o długości fali 900 nanometrów i mocy 2% i włącz skanowanie. Aby wykonać pomiary sFLIM, przełącz system w tryb sFLIM. Aby zebrać drugi sygnał harmoniczny na detektorze sFLIM, stopniowo dostosowuj długość fali wzbudzenia lasera od 900 do 980 nanometrów, aż drugi sygnał harmoniczny zostanie zebrany w drugim kanale widmowym.Następnie określ długość okna spektralnego. Przełącz się w tryb skanowania nonD, aby wysłać fotony fluorescencyjne do detektora sFLIM. Ustaw akwizycję sFLIM w trybie włączania, aby umożliwić zliczanie fotonów na liczniku pojedynczych fotonów.Gdy przyrząd jest gotowy, umieść kontrolny fragment rośliny z samej rodzimej słomy pszennej między szkiełkiem a szkiełkiem nakrywkowym na stoliku mikroskopu i ustaw system w trybie ciągłym, aby umożliwić skanowanie laserowe. Ustaw 30-sekundowy zbiór czasu i sprawdź, czy stały dyskryminator frakcji wynosi od jednego razy 10 do czwartego i jeden razy 10 do szóstego. Następnie wybierz obszar pomiaru na próbce i kliknij przycisk Start.Na koniec pomiaru zapisz plik sdt i powtórz pomiar dla co najmniej dziewięciu kolejnych próbek. Należy znaleźć równowagę między osiągnięciem wystarczającej ilości zebranych fotonów dla fotonu przy jednoczesnym unikaniu wykupu impulsów i efektów wywołanych zdjęciem, które mogą zmienić czas życia kwiatu. Najpierw przeanalizuj pozyskane dane sFLIM, zaimportuj natywne pliki danych samej słomy pszennej do oprogramowania licznika pojedynczych fotonów i otwórz Opcję i Tryb, aby wybrać Niekompletny wielowykładniczy 12,5 nanosekundy.W obszarze Opcje i preferencje wybierz opcję Oblicz odpowiedź instrumentalną automatycznie i wybierz model dopasowania wykładniczego. Dla każdego kanału zastosuj model dopasowania i zapisz parametry dopasowania w arkuszu kalkulacyjnym. Aby porównać kanały i eksperymenty, oblicz czas życia głównej fluorescencji w arkuszu kalkulacyjnym.Aby obliczyć średni czas życia dla co najmniej 10 próbek we wszystkich kanałach, przeanalizuj czas życia głównej fluorescencji w kanałach donorowych, aby określić wartość dedykowanego kanału, która wybrała najwyższą liczbę fotonów i odpowiada maksymalnej emisji ligniny. Aby porównać wartości sFLIM i EFRET między kontrolną próbką natywnej słomy pszennej a próbką eksperymentalną, należy rozważyć dodatni EFRET związany z jednorodnym spadkiem czasu życia między próbkami kontrolnymi a eksperymentalnymi, które mają być analizowane, jako zdarzenie FRET. W tym reprezentatywnym eksperymencie krzywe sFLIM pokazują niektóre modyfikacje, które można osiągnąć między próbką referencyjną a dwoma przypadkami interakcji.Rzeczywiście, wzrost fluorescencji w obszarach widmowych odpowiadających zakresowi emisji rodaminy jest łatwy do wizualizacji. Uważna obserwacja trzech krzywych rozpadu fotonów w pierwszym kanale ujawnia również silniejsze przegięcie dla rodzimej słomy pszennej z dekstryną oznaczoną rodaminą, niż dla rodzimej słomy pszennej inkubowanej z PEG oznaczonym rodaminą. Po dopasowaniu krzywych rozpadu fotonów i obliczeniu czasu życia fluorescencji głównej każdego kanału, sygnatura FRET staje się bardziej oczywista.Na przykład, podczas gdy czas życia fluorescencji naprzemiennie zwiększa się i zmniejsza wzdłuż spektrum fluorescencji dla rodzimej próbki słomy pszennej, wyraźną sygnaturę FRET obserwuje się zarówno dla rodzimych odcinków słomy pszennej inkubowanych z PEG oznakowanym rodaminą, jak i rodzimej słomy pszennej z dekstryną oznaczonej próbkami rodaminy. W kontekście hydrolizy biomasy lignocelulozowej metodę tę można łatwo przenieść do badań interakcji enzymatycznych w różnych próbkach biomasy, co wymaga rygorystycznej charakterystyki każdej nowej biomasy. Ponieważ sFLIM nie wymaga utrwalania próbki, toruje to drogę do dynamicznych badań interakcji enzymatycznych ligniny i prawdopodobnie ukierunkuje strategie inżynierii enzymatycznej i wstępną obróbkę biomasy.Jak w większości przypadków, pomiary żywotności wymagają użycia impulsowych źródeł laserowych w podczerwieni. W związku z tym należy podjąć odpowiednie środki ostrożności.

measuring-interactions-between-fluorescent-probes-lignin-plant

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiono metodę opartą na konfokalnej mikroskopii Ramanowskiej, która umożliwia bezznakową wizualizację ligniny w ścianach komórkowych roślin oraz porównanie procesu lignifikacji w różnych tkankach, próbkach lub gatunkach.

Bez znakowania in situ Obrazowanie lignifikacji w ścianach komórkowych roślin

W tym filmie opisujemy technikę barwienia Maule do barwienia ligniny syringylowej obecnej w wyspecjalizowanych komórkach roślinnych. Ta technika barwienia pomaga scharakteryzować rozkład ligniny we włóknach ksylemu i międzypęczkowych.

Barwienie ligniny: technika charakteryzowania dystrybucji ligniny w skrawkach łodyg Arabidopsis thaliana

Tworzenie kompleksów białkowych in vivo można wizualizować za pomocą dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Partnerzy interakcji są łączeni z komplementarnymi częściami znaczników fluorescencyjnych i przejściowo ulegają ekspresji w liściach tytoniu, co skutkuje odtworzonym sygnałem fluorescencyjnym po bliskim zbliżeniu dwóch białek.

Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

Prezentujemy otwarty instrument do analizy wysokiej zawartości (HCA) wykorzystujący automatyczne obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) do oznaczania interakcji białek za pomocą odczytów opartych na transferze energii rezonansu Förstera (FRET). Akwizycja danych dla tego urządzenia openFLIM-HCA jest kontrolowana przez oprogramowanie napisane w μManager, a analiza danych odbywa się w FLIMfit.

Analiza Open Source o wysokiej zawartości z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Ten protokół ma na celu przedstawienie ogólnej metody wizualizacji ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianach komórkowych roślin za pomocą obrazowania Ramana i analizy wielowymiarowej.

Połączenie obrazowania ramanowskiego i analizy wielowymiarowej w celu wizualizacji ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianie komórkowej rośliny

Defensyny roślinne odgrywają ważną rolę w obronie roślin przed patogenami. Aby skutecznie wykorzystać te peptydy przeciwgrzybicze jako środki przeciwgrzybicze, zrozumienie ich sposobów działania (MOA) ma kluczowe znaczenie. W tym miejscu opisano metodę obrazowania żywych komórek w celu zbadania krytycznych aspektów MOA tych peptydów.

Obrazowanie żywych komórek grzybów w celu zbadania sposobów wnikania i lokalizacji subkomórkowej przeciwgrzybiczych defensyn roślinnych

BLISS, protokół podwójnego etykietowania do badania dynamiki lignifikacji, został opracowany. Wykorzystując syntetyczne reportery monolignolu i sekwencyjną kombinację bioortogonalnych reakcji klikania SPAAC i CuAAC, metodologia ta toruje drogę do dogłębnej analizy czynników regulujących biogenezę lignin w planta.

Wizualizacja dynamiki zdrewniałości w roślinach za pomocą chemii kliknięć: Podwójne etykietowanie to BŁOGOŚĆ!

Opisujemy nowe techniczne podejście do badania reakcji fotosyntezy u wyższych roślin, obejmujące jednoczesne pomiary fluorescencji chlorofilu a i reflektancji liści za pomocą PAM i radiometru spektralnego do wykrywania sygnałów z tego samego obszaru liści u Arabidopsis.

Ocena zachowań fotosyntetycznych poprzez jednoczesne pomiary współczynnika odbicia liści i analizy fluorescencji chlorofilu

Tutaj prezentujemy metodę wizualizacji tworzenia się kompleksu trójskładnikowego między trzema partnerami białkowymi za pomocą białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą testu FRET-FLIM opartego na BiFC. Metoda ta jest cenna w badaniu kompleksów interakcji białko-białko in vivo.

Oznaczanie trójstronnej interakcji między dwoma monomerami czynnika transkrypcyjnego MADS-box i białka czujnika wapnia za pomocą testu BiFC-FRET-FLIM

Tutaj opisujemy różne metody tworzenia wielokomórkowych sferoidów, aby przeprowadzić następczą wieloparametrową mikroskopię żywych komórek. Wykorzystując mikroskopię obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM), autofluorescencję komórkową, barwniki barwiące i nanocząstki, przedstawiono podejście do analizy metabolizmu komórkowego, niedotlenienia i śmierci komórki w żywych trójwymiarowych (3D) nowotworach i sferoidach pochodzących z komórek macierzystych.

Produkcja i wieloparametrowa mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji żywych komórek (FLIM) sferoid wielokomórkowych

Poznaj metodę sFLIM do pomiaru FRET między ligniną a sondami fluorescencyjnymi w skrawkach roślin. Technika ta umożliwia badanie interakcji enzym-lignina in situ bez konieczności utrwalania próbek.

Pomiar interakcji między sondami fluorescencyjnymi a ligniną w skrawkach roślin za pomocą sFLIM w oparciu o natywną autofluorescencję (Wideo) | JoVE Journal

Pomiar interakcji między sondami fluorescencyjnymi a ligniną w skrawkach roślin za pomocą sFLIM w oparciu o natywną autofluorescencję

Przeglądaj więcej filmów