Pomiar interakcji między sondami fluorescencyjnymi a ligniną w skrawkach roślin za pomocą sFLIM w oparciu o natywną autofluorescencję
2 stycznia 2020
Ten protokół opisuje oryginalną konfigurację łączącą pomiary czasu życia widma i fluorescencji w celu oceny transferu energii rezonansu Förstera (FRET) między sondami fluorescencyjnymi na bazie rodaminy a polimerem ligniny bezpośrednio w grubych sekcjach rośliny.
W biomasie lignocelulozowej aktywność enzymów analizujących polisacharydy jest ograniczona przez występowanie niespecyficznych oddziaływań z ligniną. Analiza FRET jest odpowiednim podejściem do ewolucji w skali nano. Uzyskanie wszystkich kolejnych odcinków może być wyzwaniem w zależności od biomasy.
Nie spiesz się z cięciem za pomocą mikrotomu i wykonaj delikatne płukanie. Zestawienie pomiarów czasu życia i widma fluorescencji pozwala na ilościowe, czułe i jednoznaczne określenie FRET między cząsteczkami ligniny i TAG in situ. Metoda ta wykorzystuje skomplikowane techniki, takie jak cięcie próbek na podstawie akwizycji i analizy mikroskopii wielowymiarowej, które można łatwo nauczyć się za pomocą wizualnej demonstracji.
Aby przygotować próbki roślin z drewna, pszenicy, włókien lub fragmentów, użyj żyletek, aby wyciąć próbki o długości jednego centymetra bez uszkadzania struktury materiału i umieść próbki w próżni, aby usunąć powietrze. Zanurz próbki na 24 godziny w kolejnych 30% i 50% stężeniach PEG rozcieńczonych w wodzie o temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając. Następnie przez 24 godziny zanurzany w 100% stężeniu PEG w temperaturze 70 stopni Celsjusza.
Po zanurzeniu w 100% PEG umieść próbki w kapsułkach na płycie grzejnej o temperaturze 70 stopni Celsjusza i stopniowo zmniejszaj temperaturę płytki w krokach co pięć stopni Celsjusza, aż płytka osiągnie temperaturę pokojową. Gdy próbki ostygną, użyj mikrotomu i jednorazowych ostrzy, aby ostrożnie uzyskać płaskie odcinki o grubości od 30 do 60 mikrometrów z każdego bloku PEG. Usuń PEG z sekcji za pomocą trzech pięciominutowych delikatnych płukań wodą.
Po ostatnim praniu inkubować do trzech sekcji na probówkę z 500 mikrolitrami świeżo przygotowanej sondy fluorescencyjnej przez 72 godziny, chroniąc ją przed światłem. Pod koniec inkubacji barwienia użyj pędzla, aby przenieść skrawki na szkiełko przed zamontowaniem sekcji między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym o numerze 1,5H. Aby określić szerokość okna spektralnego detektora sFLIM, umieść kryształy mocznika w pudełku hodowlanym ze szklanym dnem o grubości 0,17 mikrometra i umieść pudełko na uchwycie na próbkę mikroskopu.
Wybierz obiektyw 20X i szafirowy laser domieszkowany tytanem o długości fali 900 nanometrów i mocy 2% i włącz skanowanie. Aby wykonać pomiary sFLIM, przełącz system w tryb sFLIM. Aby zebrać drugi sygnał harmoniczny na detektorze sFLIM, stopniowo dostosowuj długość fali wzbudzenia lasera od 900 do 980 nanometrów, aż drugi sygnał harmoniczny zostanie zebrany w drugim kanale widmowym.
Następnie określ długość okna spektralnego. Przełącz się w tryb skanowania nonD, aby wysłać fotony fluorescencyjne do detektora sFLIM. Ustaw akwizycję sFLIM w trybie włączania, aby umożliwić zliczanie fotonów na liczniku pojedynczych fotonów.
Gdy przyrząd jest gotowy, umieść kontrolny fragment rośliny z samej rodzimej słomy pszennej między szkiełkiem a szkiełkiem nakrywkowym na stoliku mikroskopu i ustaw system w trybie ciągłym, aby umożliwić skanowanie laserowe. Ustaw 30-sekundowy zbiór czasu i sprawdź, czy stały dyskryminator frakcji wynosi od jednego razy 10 do czwartego i jeden razy 10 do szóstego. Następnie wybierz obszar pomiaru na próbce i kliknij przycisk Start.
Na koniec pomiaru zapisz plik sdt i powtórz pomiar dla co najmniej dziewięciu kolejnych próbek. Należy znaleźć równowagę między osiągnięciem wystarczającej ilości zebranych fotonów dla fotonu przy jednoczesnym unikaniu wykupu impulsów i efektów wywołanych zdjęciem, które mogą zmienić czas życia kwiatu. Najpierw przeanalizuj pozyskane dane sFLIM, zaimportuj natywne pliki danych samej słomy pszennej do oprogramowania licznika pojedynczych fotonów i otwórz Opcję i Tryb, aby wybrać Niekompletny wielowykładniczy 12,5 nanosekundy.
W obszarze Opcje i preferencje wybierz opcję Oblicz odpowiedź instrumentalną automatycznie i wybierz model dopasowania wykładniczego. Dla każdego kanału zastosuj model dopasowania i zapisz parametry dopasowania w arkuszu kalkulacyjnym. Aby porównać kanały i eksperymenty, oblicz czas życia głównej fluorescencji w arkuszu kalkulacyjnym.
Aby obliczyć średni czas życia dla co najmniej 10 próbek we wszystkich kanałach, przeanalizuj czas życia głównej fluorescencji w kanałach donorowych, aby określić wartość dedykowanego kanału, która wybrała najwyższą liczbę fotonów i odpowiada maksymalnej emisji ligniny. Aby porównać wartości sFLIM i EFRET między kontrolną próbką natywnej słomy pszennej a próbką eksperymentalną, należy rozważyć dodatni EFRET związany z jednorodnym spadkiem czasu życia między próbkami kontrolnymi a eksperymentalnymi, które mają być analizowane, jako zdarzenie FRET. W tym reprezentatywnym eksperymencie krzywe sFLIM pokazują niektóre modyfikacje, które można osiągnąć między próbką referencyjną a dwoma przypadkami interakcji.
Rzeczywiście, wzrost fluorescencji w obszarach widmowych odpowiadających zakresowi emisji rodaminy jest łatwy do wizualizacji. Uważna obserwacja trzech krzywych rozpadu fotonów w pierwszym kanale ujawnia również silniejsze przegięcie dla rodzimej słomy pszennej z dekstryną oznaczoną rodaminą, niż dla rodzimej słomy pszennej inkubowanej z PEG oznaczonym rodaminą. Po dopasowaniu krzywych rozpadu fotonów i obliczeniu czasu życia fluorescencji głównej każdego kanału, sygnatura FRET staje się bardziej oczywista.
Na przykład, podczas gdy czas życia fluorescencji naprzemiennie zwiększa się i zmniejsza wzdłuż spektrum fluorescencji dla rodzimej próbki słomy pszennej, wyraźną sygnaturę FRET obserwuje się zarówno dla rodzimych odcinków słomy pszennej inkubowanych z PEG oznakowanym rodaminą, jak i rodzimej słomy pszennej z dekstryną oznaczonej próbkami rodaminy. W kontekście hydrolizy biomasy lignocelulozowej metodę tę można łatwo przenieść do badań interakcji enzymatycznych w różnych próbkach biomasy, co wymaga rygorystycznej charakterystyki każdej nowej biomasy. Ponieważ sFLIM nie wymaga utrwalania próbki, toruje to drogę do dynamicznych badań interakcji enzymatycznych ligniny i prawdopodobnie ukierunkuje strategie inżynierii enzymatycznej i wstępną obróbkę biomasy.
Jak w większości przypadków, pomiary żywotności wymagają użycia impulsowych źródeł laserowych w podczerwieni. W związku z tym należy podjąć odpowiednie środki ostrożności.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje nowatorskie podejście łączące pomiary widmowe oraz pomiary czasu życia fluorescencji w celu oceny transferu energii rezonansowej Förstera (FRET) pomiędzy sondami fluorescencyjnymi opartymi na rodaminie a ligniną w grubych przekrojach roślinnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia roślin
- Mikroskopia fluorescencyjna
Wstęp
- Biomasa lignocelulozowa stwarza problemy ze względu na niespecyficzne oddziaływania z ligniną.
- Analiza FRET jest przydatna do badania oddziaływań w skali nano.
- Przygotowanie i sekcjonowanie próbek są kluczowe dla uzyskania dokładnych pomiarów.
- Pomiary czasu życia fluorescencji dostarczają informacji o oddziaływaniach molekularnych.
Cel badania
- Opracowanie metody oceny FRET pomiędzy ligniną a sondami fluorescencyjnymi in situ.
- Ułatwienie prowadzenia badań nad interakcjami enzymatycznymi w różnych próbkach biomasy.
- Pogłębienie zrozumienia dynamicznych oddziaływań między enzymami a ligniną.
Zastosowane metody
- Przygotowanie próbek obejmujące infiltrację PEG i cięcie mikrotomem.
- Inkubacja z sondami fluorescencyjnymi do analizy FRET.
- Zastosowanie sFLIM do pomiarów widmowych oraz czasów życia fluorescencji.
- Analiza danych z wykorzystaniem modeli dopasowania w celu wyznaczenia czasów życia fluorescencji.
Główne wyniki
- Zaobserwowano wyraźne sygnatury FRET między ligniną a próbkami z oznakowaną rodaminą.
- Zmienność czasu życia fluorescencji wskazuje na zajście zjawiska FRET.
- Metoda umożliwia analizę porównawczą próbek kontrolnych i doświadczalnych.
- Uzyskano nową wiedzę na temat oddziaływań enzymów z biomasą lignocelulozową.
Wnioski
- Opracowana metoda jest skuteczna w badaniu oddziaływań enzym-lignina.
- Badania dynamiczne są możliwe bez utrwalania próbek.
- Podejście to może dostarczyć informacji przydatnych w inżynierii enzymatycznej oraz strategiach wstępnej obróbki biomasy.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niespecyficzne oddziaływania enzym-lignina ograniczają efektywność hydrolizy biomasy lignocelulozowej, tworząc wąskie gardło w produkcji biopaliw i biochemią. Ilościowe określanie tych oddziaływań za pomocą FRET opartego na sFLIM pozwala na mechanistyczne ograniczenie ryzyka w inżynierii enzymów i optymalizacji wstępnego przetwarzania. Umożliwia to uzyskanie predykcyjnej pewności w walidacji celów i identyfikacji wiodących kandydatów wśród enzymów degradujących biomasę.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez pomiar powinowactwa wiązania enzymu z ligniną w naturalnych macierzach roślinnych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez ilościowe sygnatury FRET bez konieczności egzogennego znakowania ligniny.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację wariantów enzymów o zredukowanych niespecyficznych oddziaływaniach z ligniną.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowanie zwalidowanych przekrojów roślinnych do wysokoczułego przesiewania oddziaływań między sondami fluorescencyjnymi a ligniną.
- Powtarzalność: Standaryzacja pomiarów widmowych i czasów życia w celu zapewnienia spójnej detekcji FRET dla różnych typów biomasy.
- Skalowalność: Umożliwienie ponownego wykorzystania platformy do analiz porównawczych kandydackich enzymów w kontrolowanych warunkach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy dane dotyczące oddziaływań z fazy odkryć z przedklinicznymi ocenami skuteczności enzymów w odniesieniu do złożonych substratów.
- Korelacja biomarkerów: Koreluje przesunięcia czasu życia fluorescencji z funkcjonalnymi zdarzeniami wiązania enzymu z ligniną.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez redukcję niepewności mechanistycznej w szlakach hydrolizy.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów badawczych, umożliwiając ilościową ocenę oddziaływań enzym-lignina przed optymalizacją wiodących cząsteczek, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego oraz zwiększa pewność prognostyczną w wyborze kandydackich enzymów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących swoistości enzymów poprzez ilościowe oznaczanie FRET pomiędzy ligniną a sondami znakowanymi rodamyną in situ.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy przekroje roślinne ze zestandaryzowaną akwizycją sFLIM, co pozwala na wiarygodną ocenę oddziaływań między związkiem a enzymem.
- Analityka: Generuje odczyty czasu życia fluorescencji oraz widma, które umożliwiają porównanie siły oddziaływań pomiędzy różnymi wariantami enzymów.
- Badania translacyjne: Łączy dane o oddziaływaniach molekularnych z ciągłością badań przedklinicznych, dostarczając informacji dla strategii inżynierii enzymatycznej w celu poprawy hydrolizy biomasy.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość wielokrotnego wykorzystania metody do przesiewania oddziaływań ligniny w różnych surowcach biomasowych i bibliotekach enzymów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w oddziaływaniach enzym-lignina dzięki bezpośrednim pomiarom w nanoskali.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność poprzez skorelowane obrazowanie widmowe i czasu życia.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), dostarczając ilościowych danych o oddziaływaniach dla efektywnego kosztowo przesiewania enzymów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów enzymatycznych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o profile oddziakiwań z ligniną.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie obrazowania czasu życia fluorescencji oraz analizy spektralnej w celu dokładnej interpretacji danych sFLIM.
- Zależność od impulsowych źródeł laserowych w podczerwieni oraz infrastruktury do zliczania pojedynczych fotonów w celu pomiaru czasu życia.
- Konieczność standaryzacji protokołów przygotowania próbek, infiltracji PEG oraz sekcjonowania pomiędzy zespołami.
- Konieczność uwzględnienia adaptacji ze względu na zmienną autofluorescencję ligniny w zależności od rodzaju biomasy, takiej jak drewno, pszenica i włókna.
- Obejmuje praktyczne ograniczenia związane z zarządzaniem budżetem fotonów, aby uniknąć zjawiska spiętrzania impulsów (pulse pile-up) oraz artefaktów indukowanych światłem podczas akwizycji.
