Name: Pomiar względnego wydzielania insuliny za pomocą współwydzielanego surogatu lucyferazy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Poznaj szybką metodę pomiaru wydzielania insuliny z linii komórek beta MIN6 przy użyciu lucyferazy Gaussia. To tanie i niezawodne podejście przyspiesza odkrywanie leków przeciwcukrzycowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują wszystkim obecnym i byłym członkom laboratorium Cobba za cenną pracę i dyskusje, a Dionne Ware za pomoc administracyjną. Michael Kalwat jest wspierany przez Fundację Badań nad Cukrzycą Nieletnich-2019-702-Q-R. Praca ta była możliwa dzięki DK34128 NIH R37 i grantowi I1243 Fundacji Welch dla Melanie Cobb. Wczesne części tej pracy były również wspierane przez NIH F32 DK100113 dla Michaela Kalwata.

1. Przygotowanie odczynników, pożywek i (Tabela 1)
<ol>
	<li>Przygotuj kompletną pożywkę MIN6 w 500 ml modyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy (4,5 g/l) firmy Dulbecco z następującymi dodatkami: 15% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 jednostek/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 292 μg/ml L-glutaminy i 50 μM β-merkaptoetanolu. 
	UWAGA: Stabilna linia komórkowa w tym przypadku jest utrzymywana w 250 μg/ml antybiotyku G418.</li>
	<li>Przygotować bufor wodorowęglanowy Krebsa-Ringera (KRBH), sporządzając roztwór zawierający 5 mM KCl, 120 mM NaCl, 15 mM HEPES (pH 7,4), 24 mM NaHCO3, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 i 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do testu radioimmunologicznego. Glukoza jest dodawana, o ile jest to przewidziane, z 2 M zapasów. 
	UWAGA: KRBH służy do inkubacji komórek ze stymulacją i bez stymulacji w celu oceny wydzielania insuliny i/lub lucyferazy Gausia.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy coelenterazine (CTZ) w następujący sposób. Przygotować zakwaszony metanol, dodając 106 μl stężonego HCl do 10 ml metanolu. Następnie rozpuścić liofilizowany CTZ w zakwaszonym metanolu w stężeniu 1 mg/ml i przechowywać w temperaturze -80 °C w zakrętkach. 
	UWAGA: Zapasy te zachowują wystarczającą aktywność w rutynowych testach lucyferazy, nawet po 1 roku prawidłowego przechowywania.</li>
	<li>Przygotuj bufor testowy lucyferazy Gaussia (GLuc) w oparciu o literaturę9, a także informacje patentowe10, aby pomóc w okresie półtrwania testu lucyferazy Gaussia w formacie płytki 96-dołkowej. Użyj wzoru: 25 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA, 5% glicerol, 1 mg/ml Na2PO4, 300 mM askorbinian sodu, 200 mM Na2SO3 w wodzie. Zamrażać zapasy w temperaturze -20 °C. Po rozmrożeniu przechowywać bufor w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Aby przygotować roztwór roboczy lucyferazy Gaussa, dodać 4,2 μl/ml roztworu podstawowego CTZ o stężeniu 1 mg/ml (2,36 mM) do buforu do oznaczania GLuc. W ten sposób powstaje 2x roztwór roboczy 10 μM CTZ, który będzie miał końcowe stężenie 5 μM w teście.</li>
</ol>
2. Hodowla komórek InsGLuc MIN6 i wysiewanie do testów wydzielania
<ol>
	<li>Aby wyhodować komórki MIN6, trypsynizuj i wysiewaj komórki raz w tygodniu przy użyciu standardowych technik hodowli komórkowych. Zmieniaj pochodne w komórkach co dwa do trzech dni. Dołącz odpowiednio dobrany antybiotyk, taki jak 250 μg/ml G418 w pożywce.
	<ol>
		<li>Aby zapewnić wystarczającą liczbę komórek tygodniowo do eksperymentów, należy utrzymywać komórki w kolbach T75. Wysiew 6 x 106 komórek na T75 w 10 ml pożywki zwykle daje 30 x 106 do 40 x 106 komórek na T75 po 7 dniach hodowli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby przygotować komórki do posiewu na 96-dołkowe płytki, należy dwukrotnie przemyć zlewający się T75 komórek InsGLuc MIN6 PBS i dodać 2 ml trypsyny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez ~5 minut lub do momentu, gdy komórki oddzielą się od kolby. Określ stężenie komórek na mililitr.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć komórki w kompletnej pożywce do 1 x 106 komórek/ml, aby uzyskać 1 x 105 komórek w 100 μl na dołek na płytce 96-dołkowej. Komórki powinny być wystarczająco zlewające się do testu po 3–4 dniach. 
		UWAGA: Aby przedłużyć okres hodowli, można posiać połowę stężenia komórek. Zmiany pożywki nie są wymagane przed dniem testu, chyba że komórki mają zostać poddane obróbce doświadczalnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test wydzielania lucyferazy Gaussia stymulowany glukozą
<ol>
	<li>W dniu testu należy przygotować wystarczającą ilość KRBH do przeprowadzenia eksperymentu (krok 1.2). Wymagane jest co najmniej 50 ml KRBH na płytkę 96-dołkową, dlatego należy przygotować co najmniej 75 ml, aby zapewnić wystarczający bufor do eksperymentu. Należy przygotować dodatkowy bufor, jeśli różne kombinacje warunków leczenia farmakologicznego będą wymagały KRBH do rozcieńczenia.</li>
	<li>Przygotuj zbiornik z KRBH bez glukozy. Zdekantować pożywkę z 96-dołkowej płytki (płytek), szybko odwracając płytkę nad zlewem laboratoryjnym, a następnie mocno osuszyć na stosie ręczników papierowych, aby usunąć nadmiar pożywki.</li>
	<li>Używając pipety elektronicznej lub ręcznej 8-kanałowej, odpipetuj 100 μl/studzienka KRBH ze zbiornika przez 96-dołkową płytkę. Powtórz w sumie dwa prania.</li>
	<li>(Fakultatywny etap leczenia ostrego związku) Jeśli nie wykonujesz leczenia farmakologicznego, postępuj zgodnie z krokami 3.5 i 3.6 bez modyfikacji. Aby przetestować wpływ małych cząsteczek na wydzielanie insuliny, związki mogą być dodawane do komórek w okresie preinkubacji, okresie stymulacji lub w obu tych okresach.
	<ol>
		<li>Jedną z technik jest dodawanie związków w partii do KRBH w probówkach o pojemności 1,5 ml i użycie regulowanej 8-kanałowej pipety cyfrowej do przeniesienia leku-KRBH z probówek do komórek w 96-dołkowych płytkach. 
		UWAGA: Jeśli pipeta regulowana nie jest dostępna, można wykonać replikę 96-dołkowej płytki leku-KRBH, a do transferu buforu można użyć standardowej pipety 8-kanałowej. Dalsze modyfikacje paradygmatu leczenia można wprowadzić w celu traktowania komórek przez 24 godziny w pożywce przed testem, jak opisano wcześniej1,8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 100 μl KRBH zawierającego pożądane stężenie glukozy lub związków i umieścić naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 1 h. 
	UWAGA: W zależności od układu eksperymentalnego, niezwykle pomocne jest posiadanie elektronicznej pipety wielokanałowej, która umożliwia przejście odległości kanałów od kolumny ośmiu probówek o pojemności 1,5 ml do 8 rzędów płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Po 1 godzinie wstępnej inkubacji zdekantować bufor do zlewu i mocno osuszyć na ręczniku papierowym. Dodaj 100 μl bezglukozowego KRBH do dołka, aby zmyć nagromadzone tło lucyferazy Gaussa. Ponownie zdekantować płytkę i dodać do niej warunki kontrolne i stymulujące w ilości 100 μl na studzienkę. Umieść naczynie w inkubatorze w temperaturze 37°C na 1 godzinę.</li>
	<li>Ostrożnie zebrać 50 μl supernatantu za pomocą pipety wielokanałowej, w razie potrzeby zmieniając końcówki między warunkami obróbki, i przenieść supernatant na czystą, nieprzezroczystą, białą, 96-dołkową płytkę testową. 
	UWAGA: W razie potrzeby można użyć płyt o przezroczystych ściankach o białych ściankach, chociaż znaczna ilość sygnału lucyferazy zostanie utracona.</li>
	<li>Po pobraniu 50 μl supernatantu KRBH próbkę można natychmiast oznaczyć. W razie potrzeby należy zapieczętować i przechowywać próbki w temperaturze 4 °C przez kilka dni (okres półtrwania aktywności GLuc ~6 dni) lub -20 °C przez okres do jednego miesiąca11,12.</li>
</ol>
4. Test lucyferazy wydzielanej Gaussia
<ol>
	<li>Aby przygotować roztwór roboczy do oznaczania GLuc, należy odpipetować wymaganą ilość roztworu podstawowego CTZ (4,2 μL/ml) do buforu do testu GLuc. Aby zapobiec podgrzaniu CTZ, należy szybko odpipetować CTZ w zamrażarce o temperaturze -80 °C lub trzymać probówkę na suchym lodzie.</li>
	<li>Za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej szybko dodaj 50 μl roztworu roboczego do testu GLuc na studzienkę przez 96-dołkową szalkę zawierającą zebrane supernatanty KRBH. Jeśli po bokach studzienek znajdują się kropelki, krótko obróć płytkę w wirówce stołowej z wiadrem wahadłowym.</li>
	<li>Odczytaj luminescencję w odpowiednim czytniku płytek w ciągu kilku minut i odczytaj każdą studzienkę z czasem całkowania 0,1 s.</li>
</ol>

<ol><li>Kalwat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+promoter-driven+Gaussia+luciferase-based+insulin+secretion+biosensor+assay+for+discovery+of+beta-cell+glucose-sensing+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sensors%22%5BJournal%5D)">Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways.</a> ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).</li>
<li>Burns, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+luminescent+reporter+of+insulin+secretion+for+discovering+regulators+of+pancreatic+Beta-cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function.</a> Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).</li>
<li>Rajan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+processing+and+secretion+of+mutant+insulin+proteins+that+cause+permanent+neonatal+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).</li>
<li>Watkins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Secretory+Vesicles+by+Fluorescent+Protein+Insertion+in+Propeptide+Rather+Than+Mature+Secreted+Peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide.</a> Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).</li>
<li>Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiply+mutated+Gaussia+luciferases+provide+prolonged+and+intense+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence.</a> Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).</li>
<li>Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Codon-optimized+Gaussia+luciferase+cDNA+for+mammalian+gene+expression+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therarpy%22%5BJournal%5D)">Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo.</a> Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).</li>
<li>Compounds and methods for regulating insulin secretion. World patent. , WO2018175324A1 (2018).</li>
<li>Kalwat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromomycin+A2+potently+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+from+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells.</a> Journal of General Physiology. , (2018).</li>
<li>Luft, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Gaussia+luciferase+in+bicistronic+and+non-conventional+secretion+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs.</a> BMC Biochemistry. 15 (1), 14(2014).</li>
<li>Ohmiya, Y., Wu, C. Stabilizing composition and stabilizing method of coelenterazine solution for high-throughput measurement of luciferase activity. U.S. Patent. , 7,718,389 B2 (2010).</li>
<li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (4), 582-591 (2009).</li>
<li>Wurdinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+luciferase+for+ex+vivo+monitoring+of+in+vivo+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes.</a> Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).</li>
<li>Henquin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+and+amplifying+pathways+of+regulation+of+insulin+secretion+by+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose.</a> Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).</li>
<li>Mourad, N. I., Nenquin, M., Henquin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+insulin+secretion+by+acetylcholine+or+phorbol+ester+is+independent+of+beta-cell+microfilaments+and+distinct+from+metabolic+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Amplification of insulin secretion by acetylcholine or phorbol ester is independent of beta-cell microfilaments and distinct from metabolic amplification.</a> Molecular & Cellular Endocrinology. 367 (1-2), 11-20 (2013).</li>
<li>Straub, S. G., Sharp, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+insights+regarding+mechanisms+for+the+inhibition+of+insulin+release+by+norepinephrine+and+heterotrimeric+G+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evolving insights regarding mechanisms for the inhibition of insulin release by norepinephrine and heterotrimeric G proteins.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (12), C1687-C1698 (2012).</li>
<li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+passage+MIN6+cells+have+impaired+insulin+secretion+with+impaired+glucose+and+lipid+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation.</a> PLoS One. 7 (7), e40868(2012).</li>
<li>Head, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin-36+Gap+Junctions+Regulate+In+Vivo+First-+and+Second-Phase+Insulin+Secretion+Dynamics+and+Glucose+Tolerance+in+the+Conscious%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Connexin-36 Gap Junctions Regulate In Vivo First- and Second-Phase Insulin Secretion Dynamics and Glucose Tolerance in the Conscious.</a> Diabetes. 61 (7), 1700-1707 (2012).</li>
<li>Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+and+other+mechanisms+of+cell-cell+communication+regulate+basal+insulin+secretion+in+the+pancreatic+islet%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet.</a> The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).</li>
<li>Konstantinova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA-Ephrin-A-mediated+beta+cell+communication+regulates+insulin+secretion+from+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets.</a> Cell. 129 (2), 359-370 (2007).</li>
<li>Jaques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+effect+of+cell-cell+contact+disruption+on+cytosolic+calcium+and+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion.</a> Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).</li>
<li>Calabrese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+36+Controls+Synchronization+of+Ca2%2B+Oscillations+and+Insulin+Secretion+in+MIN6+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells.</a> Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).</li>
<li>Bielefeld-Sevigny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AlphaLISA+immunoassay+platform-+the+%26%2334%3Bno-wash%26%2334%3B+high-throughput+alternative+to+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">AlphaLISA immunoassay platform- the &#34;no-wash&#34; high-throughput alternative to ELISA.</a> Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).</li>
<li>Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+Time-resolved+Forster+Resonance+Energy+Transfer-based+Assay+for+Detection+of+Insulin+Secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).</li>
<li>Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+colorimetric+assay+using+insulin+G-quadruplex+aptamer+arrays+on+DNA+nanotubes+coupled+with+magnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Sociecy+Open+Science%22%5BJournal%5D)">Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles.</a> Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835(2018).</li>
<li>Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+cell-based+Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+identifying+modulators+of+fibulin-3+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).</li>
<li>Frank, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tools+for+understanding+the+complexity+of+beta-cell+signalling+and+insulin+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release.</a> Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+C-Peptide+Storage+and+Secretion+in+Islet+beta-Cells+In+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet beta-Cells In Vitro and In Vivo.</a> Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym artykule przedstawiono metodę szybkiej oceny stymulowanych glukozą odpowiedzi komórek β na wydzielanie insuliny przez komórki MIN6. Aby uzyskać najlepsze odpowiedzi w teście, ważne jest, aby wysiać komórki MIN6 o odpowiedniej gęstości i pozwolić im na zlewanie się w 85-95%. Poprawia to β odpowiedzi komórek na glukozę ze względu na poprawę kontaktów komórka-komórka i synchronizacji, która występuje zarówno w pierwotnych wyspach trzustkowych 17,18,19,20,21, jak i komórkach MIN6 </s...

Przedstawiona tutaj metoda pozwala na szybkie i niedrogie badanie wydzielania insuliny z genetycznie zmodyfikowanej linii komórek beta w formacie 96-dołkowej. Kluczem do tego protokołu jest zmodyfikowana wersja insuliny z naturalnie wydzielaną lucyferazy Gaussia (GLuc, ~18 kDa) wprowadzoną (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1) do peptydu C w celu wytworzenia insuliny-Gaussia (InsGLuc)1,2. Inne większe białka, takie jak GFP (~25 kDa), zostały z powodzeniem wprowadzone do peptydu C insuliny i wykazały oczekiwane przetwarzanie potranslacyjne z proinsuliny-GFP na insulinę i GFP-C-peptide3,4. Na potrzeby testu w tym protokole GLuc został zoptymalizowany pod kątem kodonów pod kątem ekspresji ssaków i wprowadzono dwie mutacje w celu poprawy kinetyki podobnej do świecenia5,6. Wiele kombinacji i powtórzeń warunków leczenia można łatwo przetestować w formacie płytki 96-dołkowej, a wyniki wydzielania można uzyskać natychmiast po eksperymencie.
Główną zaletą, jak wcześniej wspomniano2, jest niski koszt tego pomiaru wydzielania opartego na lucyferazie (< 0,01 USD/odwiert), co odróżnia go od stosunkowo wyższych kosztów i technicznych aspektów testów immunoenzymatycznych (ELISA) (> $2/odwiert) i jednorodnej fluorescencji czasowo-rozdzielczej (HTRF) lub innych testów opartych na przeciwciałach opartych na rezonansie Förstera (FRET) (> $1/studzienkę). W porównaniu z tymi testami opartymi na przeciwciałach, które mierzą stężenie insuliny poprzez odniesienie do krzywej wzorcowej, test InsGLuc mierzy aktywność wydzielniczą jako względne porównanie z dołkami kontrolnymi na płytce. Z tego powodu każdy eksperyment wymaga włączenia odpowiednich kontroli. To rozróżnienie jest kompromisem, który umożliwia szybkie i niedrogie pomiary. Wykazano jednak, że wydzielanie InsGLuc jest silnie skorelowane z wydzielaniem insuliny, mierzonym za pomocą ELISA1,2. Technologia ta została rozbudowana pod kątem wysokoprzepustowych badań przesiewowych1,2,7 i doprowadziła do zidentyfikowania nowych modulatorów wydzielania insuliny, w tym bramkowanego napięciem inhibitora kanału potasowego7 oraz naturalnego inhibitora funkcji komórek β, chromomycyny A28. Stosowanie InsGLuc jest najbardziej odpowiednie dla badaczy, którzy planują ciągłe testowanie wielu różnych warunków leczenia pod kątem ich wpływu na wydzielanie insuliny. W dalszych eksperymentach konieczne jest powtórzenie kluczowych wyników w linii komórkowej β rodzicielskiej, a optymalnie w mysich lub ludzkich wyspach trzustkowych, a także pomiar wydzielania insuliny za pomocą testu opartego na przeciwciałach.

<table><tbody><tr><td>Materiały do hodowli komórkowych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>rIns-GLuc stabilne komórki</td><td></td><td></td> MIN6 <td>Rodzicielska linia komórkowa MIN6 stabilnie eksprymująca pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc i utrzymywana w 250 ug/ml G418</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>4,5 g/l pożywka glukozowa</td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca, inaktywowana termicznie</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/ Streptomycyna</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>beta-merkaptoetanol</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>BP 176-100</td><td></td></tr><tr><td>glutamina</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>BP379-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T3924-500</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Gold Biotechnology</td><td>G418-10</td><td>Roztwór podstawowy 250 mg/ml w wodzie. Zamroź podwielokrotności w temperaturze -20C.</td></tr><tr><td>Kolby do hodowli tkankowych T75</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-202-000</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>Celltreat</td><td>229196</td><td></td></tr><tr><td>Zbiorniki na odczynniki (50 ml)</td><td>Corning</td><td>4870</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Odczynniki do oznaczania wydzielania</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA (klasa RIA)</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>50-146-952</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Hepes, pH 7,4</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>50-213-365</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>15568414</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>M9272-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C-7902</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Opcjonalne leki do eksperymentów stymulacyjnych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diazoxide</td><td>Sigma</td><td>D9035</td><td>Roztwór podstawowy: 50 mM w 0,1N NaOH. Dodać równą ilość 0,1 N HCl do dowolnego buforu, do którego dodaje się diazoksyd.</td></tr><tr><td>epinefryna (sól dwuwinianowa)</td><td>Sigma</td><td>E4375</td><td>Roztwór podstawowy: 5 mM w wodzie</td></tr><tr><td>PMA (12-mirystynian forbolu)</td><td>Sigma</td><td>P1585</td><td>Roztwór podstawowy: 100 &mikro; M w DMSO</td></tr><<tr><td>silny>Nazwa</silny><</td><td>silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</strong</td></tr><tr><td>>Guassia materiały testowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosforan disodowy (Na2HPO4)</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>G334</td><td></td></tr><tr><td>Bromek sodu</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>AC44680-1000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>AC44608-5000</td><td>Roztwór podstawowy: 0,5 M pH 8</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>RPI</td><td>T60040-1000.0</td><td>Roztwór podstawowy: 1 M pH 8</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1775922</td><td>Amerykański patent US7718389 sugerował, że askorbinian może zwiększać stabilność celendrazyny.</td></tr><tr><td>Na2SO3</td><td>Sigma</td><td>S0505-250G</td><td>Sugerowany US8367357 patentowy USA siarczyn może zmniejszać tło z powodu BSA</td></tr><tr><td>Coelenterazine (natywny)</td><td>Nanolight / Prolume</td><td>3035MG</td><td>Roztwór podstawowy: 1 mg / ml w zakwaszonym MeOH (2,36 mM)</td></tr><tr><td>OptiPlate-96, biała nieprzezroczysta 96-dołkowa mikropłytka</td><td>Perkin Elmer</td><td>6005290</td><td>Każda nieprzezroczysta biała płytka 96-dołkowa powinna wystarczyć. Przezroczyste płyty dolne również będą działać, jednak część sygnału zostanie utracona.</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</strong</td><td>>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 Hybrydowy czytnik płytek lub równoważny</td><td>BioTek</td><td>8041000</td><td>Wymagany jest czytnik płytek z detekcją luminescencji i możliwością stosowania płytek 96-dołkowych.</td></tr><tr><td>Pipeta 8-kanałowa VOYAGER (50-1250 &micro; L)</td><td>Integra</td><td>4724</td><td>Automatyczna pipeta wielokanałowa jest niezwykle przydatna do szybkiego dodawania odczynników lucyferazy i komórek galwanicznych w formacie 96-dołkowym</td></tr><tr><td>8-kanałowym 200 &mikro; Pipeta L</td><td>Transferpette S 20-200 &micro; L</td><td>2703710</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar względnego wydzielania insuliny za pomocą współwydzielanego surogatu lucyferazy

Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate

Wykonywanie testów opartych na przeciwciałach do pobierania wydzielanej insuliny po pobraniu próbki zwykle wymaga od kilku godzin do jednego dnia czasu testu i może być kosztowne, w zależności od konkretnego testu. Testy wydzielanej lucyferazy przyspieszają wyniki i znacznie obniżają koszt testu na próbkę. Tutaj przedstawiamy stosunkowo rzadko stosowane podejście do oceny aktywności wydzielania insuliny z komórek β trzustki za pomocą lucyferazy Gaussia genetycznie wstawionej do peptydu C. Podczas proteolitycznego przetwarzania proinsuliny peptyd C jest wycinany, uwalniając lucyferazy w pęcherzyku wydzielniczym insuliny, gdzie jest współwydzielany z insuliną. Wyniki można uzyskać w ciągu kilku minut po pobraniu próbki ze względu na szybkość testów lucyferazy. Ograniczeniem testu jest to, że jest to względny pomiar wydzielania insuliny, a nie bezwzględna ocena ilościowa. Protokół ten jest jednak ekonomiczny, skalowalny i może być wykonywany przy użyciu większości standardowych czytników płytek luminescencyjnych. Analogowe i cyfrowe pipety wielokanałowe ułatwiają wykonywanie wielu etapów testu. Jednocześnie można testować wiele różnych wariantów eksperymentalnych. Po ustaleniu ukierunkowanego zestawu warunków, stężenia insuliny powinny być mierzone bezpośrednio za pomocą testów opartych na przeciwciałach ze standardowymi krzywymi, aby potwierdzić wyniki testu lucyferazy.

Aby ocenić wydajność testu w warunkach kontrolnych, można sporządzić prostą krzywą odpowiedziami na dawkę glukozy lub przeprowadzić stymulację zgodnie z paradygmatem diazoksydu. W pierwszym przypadku inkubacja wstępna komórek przez 1 h w warunkach bezglukozowych, a następnie traktowanie przez 1 h rosnącymi stężeniami glukozy, powinna skutkować bardzo niską aktywnością wydzielniczą przy stężeniu 5 mM i poniżej, podczas gdy zwiększone wydzielanie obserwuje się powyżej 8 mM glukozy (<strong ...

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić szybkie, tanie testy lucyferazy przy średniej przepustowości przy użyciu lucyferazy Gaussia połączonej z insuliną jako wskaźnika wydzielania insuliny z komórek beta. Test można wykonać za pomocą większości czytników płytek luminescencyjnych i pipet wielokanałowych.

Pomiar względnego wydzielania insuliny za pomocą współwydzielanego surogatu lucyferazy

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, ...

Protokół ten opisuje alternatywne szybkie podejście do oznaczania wydzielania insuliny z linii komórek beta w celu przyspieszenia odkrywania i charakteryzowania leków. Takie podejście jest przydatne, ponieważ wiele terapii może być testowanych jednocześnie, wyniki są dostępne natychmiast po eksperymencie, a ten test jest tańszy niż inne. Zastosowanie tej metody do badań przesiewowych w kierunku nowych małocząsteczkowych modulatorów wydzielania insuliny może zidentyfikować związki wiodące dla przyszłych terapii cukrzycy.Zwiększona wiedza na temat funkcji komórek beta może przyczynić się do lepszego zrozumienia wydzielania białek lub neuroprzekaźników w ogóle. Ten reporter wydzielania insuliny został uznany do pracy w układzie lentiwirusowym w innych liniach komórek beta oraz w ludzkich wyspach trzustkowych. Ten test powinien być bardzo prosty dla osób zaznajomionych z hodowlą komórkową i obsługą pipet wielokanałowych.Przed zaplanowaniem jakichkolwiek eksperymentów sprawdź, czy Twoje rodzicielskie lub stabilne linie komórkowe beta prawidłowo reagują na glukozę za pomocą testu ELISA insuliny. Rozpocznij od przygotowania buforu wodorowęglanowego Krebsa-Ringera lub KRBH i roztworu roboczego lucyferazy gaussia zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Hodować komórki MIN6 w kolbach T75 przy użyciu standardowych technik hodowli komórkowych.Przygotować komórki InsGLuc MIN6 do posiewu, przemywając dwukrotnie kolbę komórek PBS i dodając dwa mililitry trypsyny. Inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około pięć minut lub do momentu, gdy komórki oddzielą się od kolby. Określ stężenie komórek i rozcieńcz komórki w kompletnych pożywkach do miliona komórek na mililitr, co odpowiada 100 000 komórek na 100 mikrolitrów w każdym dołku płytki 96-dołkowej.Komórki powinny być wystarczająco zlewające się do testu po trzech do czterech dniach. W dniu testu przygotuj wystarczającą ilość KRBH wolnego od glukozy do eksperymentu i ustaw zbiornik. Zdekantować pożywkę z płytki 96-dołkowej, szybko odwracając ją nad zlewem laboratoryjnym, a następnie mocno osuszając na stosie ręczników papierowych, aby usunąć nadmiar pożywki.Umyj płytkę dwukrotnie 100 mikrolitrami KRBH bez glukozy na studzienkę, a w przypadku wykonywania leczenia farmakologicznego dodaj leki do KRBH zgodnie ze wskazówkami rękopisu. Następnie dodaj 100 mikrolitrów KRBH bez glukozy do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Po inkubacji zdekantować bufor i osuszyć płytkę na ręczniku papierowym.Dodaj 100 mikrolitrów KRBH bez glukozy do dołka, aby zmyć nagromadzone tło, a następnie zdekantuj płytkę. Dodaj warunki kontrolne i stymulujące z leczeniem farmakologicznym lub bez niego w ilości 100 mikrolitrów na studzienkę i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Ważne jest, aby na każdej płytce umieścić podstawowe i stymulowane kontrole, aby określić reakcję komórek w danym eksperymencie.Jeśli komórki z czasem utraciły odpowiedź, należy je ponownie wyhodować ze świeżego ciekłego azotu. Ostrożnie zebrać 50 mikrolitrów supernatantu za pomocą pipety wielokanałowej, przenieść go na nieprzezroczystą białą płytkę testową 96 dołków i przechowywać próbkę w temperaturze pokojowej na stole do momentu, gdy będzie gotowa do testu lucyferazy. Przygotować roztwór roboczy do testu gaussia lucyferazy, pipetując wymaganą ilość roztworu CTZ do buforu do testu GLuc, uważając, aby zapobiec rozgrzaniu CTZ.Użyj pipety wielokanałowej, aby szybko dodać roztwór roboczy do testu GLuc do płytki z supernatantami KRBH. Jeśli po bokach studzienek znajdują się kropelki, krótko obróć płytkę w wirówce z wiadrem wahadłowym. Następnie włóż płytkę do czytnika płytek i odczytaj luminescencję z czasem całkowania 0,1 sekundy.Test ten został przetestowany w warunkach kontrolnych poprzez pomiar wydzielania insuliny w odpowiedzi na rosnące stężenie glukozy. Bardzo małą aktywność wydzielniczą obserwuje się poniżej pięciu milimolowych glukozy, a zwiększone wydzielanie obserwuje się powyżej ośmiu milimolowych. Komórki wykazują oczekiwaną odpowiedź wydzielniczą po podaniu próbie paradygmatu diazoksydu.Leczenie diazoksydem blokuje wydzielanie insuliny, jeśli nie ma zewnątrzkomórkowego chlorku potasu. Gdy obecny jest chlorek potasu, wydzielanie może być wzmocnione przez dalsze dodawanie glukozy. Wykazano również, że komórki InsGLuc MIN6 reagują zgodnie z oczekiwaniami na związki modulujące wydzielanie, takie jak chlorek potasu, diazoksyd, PMA i epinefryna.Po tej procedurze należy potwierdzić krytyczne wyniki poprzez analizę supernatantów KRBH w testach ELISA lub HTRF opartych na przeciwciałach, które pozwalają na określenie stężeń insuliny. Wiele pionierskich prac zostało wykonanych przez grupę z Broad Institute, co utorowało mi drogę do coraz częstszego stosowania tego testu w moich badaniach. Wiele grup badawczych, w tym my i grupa z Broad, stosuje to podejście w wysiłkach związanych z odkrywaniem leków w dziedzinie cukrzycy.

measuring-relative-insulin-secretion-using-co-secreted-luciferase

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszej pracy opisujemy procedury badania zmian w ekspresji genów indukowanej fagocytozą z wykorzystaniem podejścia opartego na genach reporterowych lucyferazy, stosując system Dual-GloTM Luciferase Assay System firmy Promega.

Badanie biogenezy błon za pomocą testu z genem reporterowym opartym na lucyferazie

Komórki guza piersi wykazujące ekspresję lucyferazy są wszczepiane myszom podskórnie i obrazowane za pomocą obrazowania optycznego w celu nieinwazyjnego monitorowania wzrostu i rozwoju guza w badaniu podłużnym.

In vivo obrazowanie bioluminescencyjne guzów piersi z użyciem systemu IVIS Spectrum

W niniejszej pracy opisujemy metody konstruowania, wizualizacji i kwantyfikacji reakcji bioluminescencyjnych enzymów lucyferazy świetlikowej oraz renilla, wykazujących ekspresję w komórkach przerzutowego raka piersi podczas ich wzrostu i przerzutowania in vivo.

In vivo dwusubstratowe obrazowanie bioluminescencyjne

Film demonstruje test lucyferazy używany do ilościowego oznaczania białek znakowanych lucyferazy. W teście wykorzystuje zmodyfikowany enzym lucyferazy składający się z dużego fragmentu, który wiąże się z małym fragmentem, który jest sprzężony z interesującym białkiem. Związane podjednostki tworzą aktywny enzym, który w obecności substratu uwalnia sygnał luminescencyjny. Sygnał ten jest następnie oznaczany ilościowo za pomocą luminometru.

Test lucyferazy: wysokoprzepustowy test do pomiaru sygnałów luminescencyjnych przy użyciu zaprojektowanych bioreporterów opartych na systemie nanolucyferazy

Transkomórkowe interakcje białkowe są ważnymi determinantami funkcji komórek beta trzustki. Szczegółowo opisano tutaj metodę - zaadaptowaną z modelu synaptogenezy - do badania, w jaki sposób określone białka transbłonowe wpływają na wydzielanie insuliny. Transfekowane komórki HEK293 wyrażają białka będące przedmiotem zainteresowania; Komórki beta nie muszą być transfekowane ani w inny sposób bezpośrednio zaburzone.

Analiza kokulturowa interakcji białek zewnątrzkomórkowych wpływających na wydzielanie insuliny przez komórki beta trzustki

Osiągnięcie zrozumienia procesów komórkowych na poziomie systemowym jest celem współczesnej biologii komórki. Opisujemy tutaj strategie multipleksowania reporterów lucyferazy różnych punktów końcowych funkcji komórkowych w celu zbadania funkcji genów przy użyciu bibliotek RNAi w skali genomu.

Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

Tutaj opisujemy ustawienia do równoległego monitorowania bioluminescencji okołodobowej i aktywności wydzielniczej ludzkich komórek wysp trzustkowych i pierwotnych miotub. W tym celu zastosowaliśmy dostarczanie genu lentiwirusowego za pomocą reportera zegara rdzeniowego lucyferazy, a następnie synchronizację in vitro i zbieranie pożywki odpływowej przez ciągłą peryfuzję komórek.

Równoległy pomiar ekspresji genów zegara okołodobowego i wydzielania hormonów w pierwotnych hodowlach komórkowych człowieka

Tutaj prezentujemy jednorodny FRET (HTRF) jako skuteczną metodę szybkiego wykrywania insuliny wydzielanej przez komórki.

Jednorodny, rozdzielczy w czasie test rezonansowy oparty na transferze energii Förstera do wykrywania wydzielania insuliny

Ten protokół przedstawia metodę oceny aktywności proteolitycznej proteazy o niskiej aktywności i pojedynczej rotacji w kontekście komórkowym. W szczególności metoda ta jest stosowana do oceny aktywności proteolitycznej PCSK9, kluczowego czynnika napędzającego metabolizm lipidów, którego aktywność proteolityczna jest wymagana do jego ostatecznej funkcji hipercholesterolemicznej.

Wysokoprzepustowy test lucyferazy do oceny proteolizy proteazy jednoobrotowej PCSK9

Ten protokół opisuje prostą i minimalnie inwazyjną metodę przeszczepiania i obrazowania komórek NIT-1 u myszy z nieotyłym cukrzycą (NOD) z ciężkim niedoborem odporności, którym podano splenocyty oczyszczone z myszy NOD z spontaniczną cukrzycą.

Bioluminescencyjne monitorowanie przeżywalności przeszczepu w adoptywnym modelu transferowym cukrzycy autoimmunologicznej u myszy

Ten protokół opisuje metodę synchronicznego pozyskiwania i korejestracji wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych oraz wydzielania insuliny i glukagonu przez pierwotne ludzkie pseudowyspy za pomocą adenowirusowego dostarczania cyklicznego biosensora monofosforanu adenozyny (cAMP), detektora różnic cAMP in situ (cADDis) oraz systemu mikroperyfuzji.

Ludzki system pseudowysp do synchronicznej oceny dynamiki biosensorów fluorescencyjnych i profili wydzielania hormonów

Poznaj szybką metodę pomiaru wydzielania insuliny z linii komórek beta MIN6 przy użyciu lucyferazy Gaussia. To tanie i niezawodne podejście przyspiesza odkrywanie leków przeciwcukrzycowych.

Pomiar względnego wydzielania insuliny za pomocą współwydzielanego surogatu lucyferazy

Przeglądaj więcej filmów