Pomiar względnego wydzielania insuliny za pomocą współwydzielanego surogatu lucyferazy
25 czerwca 2019
Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić szybkie, tanie testy lucyferazy przy średniej przepustowości przy użyciu lucyferazy Gaussia połączonej z insuliną jako wskaźnika wydzielania insuliny z komórek beta. Test można wykonać za pomocą większości czytników płytek luminescencyjnych i pipet wielokanałowych.
Protokół ten opisuje alternatywne szybkie podejście do oznaczania wydzielania insuliny z linii komórek beta w celu przyspieszenia odkrywania i charakteryzowania leków. Takie podejście jest przydatne, ponieważ wiele terapii może być testowanych jednocześnie, wyniki są dostępne natychmiast po eksperymencie, a ten test jest tańszy niż inne. Zastosowanie tej metody do badań przesiewowych w kierunku nowych małocząsteczkowych modulatorów wydzielania insuliny może zidentyfikować związki wiodące dla przyszłych terapii cukrzycy.
Zwiększona wiedza na temat funkcji komórek beta może przyczynić się do lepszego zrozumienia wydzielania białek lub neuroprzekaźników w ogóle. Ten reporter wydzielania insuliny został uznany do pracy w układzie lentiwirusowym w innych liniach komórek beta oraz w ludzkich wyspach trzustkowych. Ten test powinien być bardzo prosty dla osób zaznajomionych z hodowlą komórkową i obsługą pipet wielokanałowych.
Przed zaplanowaniem jakichkolwiek eksperymentów sprawdź, czy Twoje rodzicielskie lub stabilne linie komórkowe beta prawidłowo reagują na glukozę za pomocą testu ELISA insuliny. Rozpocznij od przygotowania buforu wodorowęglanowego Krebsa-Ringera lub KRBH i roztworu roboczego lucyferazy gaussia zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Hodować komórki MIN6 w kolbach T75 przy użyciu standardowych technik hodowli komórkowych.
Przygotować komórki InsGLuc MIN6 do posiewu, przemywając dwukrotnie kolbę komórek PBS i dodając dwa mililitry trypsyny. Inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około pięć minut lub do momentu, gdy komórki oddzielą się od kolby. Określ stężenie komórek i rozcieńcz komórki w kompletnych pożywkach do miliona komórek na mililitr, co odpowiada 100 000 komórek na 100 mikrolitrów w każdym dołku płytki 96-dołkowej.
Komórki powinny być wystarczająco zlewające się do testu po trzech do czterech dniach. W dniu testu przygotuj wystarczającą ilość KRBH wolnego od glukozy do eksperymentu i ustaw zbiornik. Zdekantować pożywkę z płytki 96-dołkowej, szybko odwracając ją nad zlewem laboratoryjnym, a następnie mocno osuszając na stosie ręczników papierowych, aby usunąć nadmiar pożywki.
Umyj płytkę dwukrotnie 100 mikrolitrami KRBH bez glukozy na studzienkę, a w przypadku wykonywania leczenia farmakologicznego dodaj leki do KRBH zgodnie ze wskazówkami rękopisu. Następnie dodaj 100 mikrolitrów KRBH bez glukozy do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Po inkubacji zdekantować bufor i osuszyć płytkę na ręczniku papierowym.
Dodaj 100 mikrolitrów KRBH bez glukozy do dołka, aby zmyć nagromadzone tło, a następnie zdekantuj płytkę. Dodaj warunki kontrolne i stymulujące z leczeniem farmakologicznym lub bez niego w ilości 100 mikrolitrów na studzienkę i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Ważne jest, aby na każdej płytce umieścić podstawowe i stymulowane kontrole, aby określić reakcję komórek w danym eksperymencie.
Jeśli komórki z czasem utraciły odpowiedź, należy je ponownie wyhodować ze świeżego ciekłego azotu. Ostrożnie zebrać 50 mikrolitrów supernatantu za pomocą pipety wielokanałowej, przenieść go na nieprzezroczystą białą płytkę testową 96 dołków i przechowywać próbkę w temperaturze pokojowej na stole do momentu, gdy będzie gotowa do testu lucyferazy. Przygotować roztwór roboczy do testu gaussia lucyferazy, pipetując wymaganą ilość roztworu CTZ do buforu do testu GLuc, uważając, aby zapobiec rozgrzaniu CTZ.
Użyj pipety wielokanałowej, aby szybko dodać roztwór roboczy do testu GLuc do płytki z supernatantami KRBH. Jeśli po bokach studzienek znajdują się kropelki, krótko obróć płytkę w wirówce z wiadrem wahadłowym. Następnie włóż płytkę do czytnika płytek i odczytaj luminescencję z czasem całkowania 0,1 sekundy.
Test ten został przetestowany w warunkach kontrolnych poprzez pomiar wydzielania insuliny w odpowiedzi na rosnące stężenie glukozy. Bardzo małą aktywność wydzielniczą obserwuje się poniżej pięciu milimolowych glukozy, a zwiększone wydzielanie obserwuje się powyżej ośmiu milimolowych. Komórki wykazują oczekiwaną odpowiedź wydzielniczą po podaniu próbie paradygmatu diazoksydu.
Leczenie diazoksydem blokuje wydzielanie insuliny, jeśli nie ma zewnątrzkomórkowego chlorku potasu. Gdy obecny jest chlorek potasu, wydzielanie może być wzmocnione przez dalsze dodawanie glukozy. Wykazano również, że komórki InsGLuc MIN6 reagują zgodnie z oczekiwaniami na związki modulujące wydzielanie, takie jak chlorek potasu, diazoksyd, PMA i epinefryna.
Po tej procedurze należy potwierdzić krytyczne wyniki poprzez analizę supernatantów KRBH w testach ELISA lub HTRF opartych na przeciwciałach, które pozwalają na określenie stężeń insuliny. Wiele pionierskich prac zostało wykonanych przez grupę z Broad Institute, co utorowało mi drogę do coraz częstszego stosowania tego testu w moich badaniach. Wiele grup badawczych, w tym my i grupa z Broad, stosuje to podejście w wysiłkach związanych z odkrywaniem leków w dziedzinie cukrzycy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje szybki i niskokosztowy test wydzielania insuliny z wykorzystaniem lucyferazy Gaussia połączonej z insuliną w liniach komórek beta, co może przyspieszyć procesy odkrywania leków. Metoda ta umożliwia testowanie o średniej przepustowości, zapewniając natychmiastowe wyniki przy jednoczesnym obniżeniu kosztów w porównaniu z tradycyjnymi testami.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Badania nad cukrzycą
- Poszukiwanie leków
- Wydzielanie insuliny
Wstęp
- Metoda koncentruje się na testowaniu wielokrotnych wariantów traktowania oraz szybkim uzyskiwaniu wyników.
- Głębsze zrozumienie funkcji komórek beta wspomaga badania nad sekrecją białek i neuroprzekaźników.
- Ustanowione systemy operacyjne obejmują metodologie lentiwirusowe w różnych liniach komórek beta oraz w ludzkich wysepkach.
Zastosowane metody
- Test lucyferazy
- Linia komórkowa beta MIN6
- Pipetowanie wielokanałowe z użyciem czytników płytek luminescencyjnych
Główne wyniki
- Wydzielanie insuliny koreluje ze stężeniami glukozy, co potwierdza oczekiwane reakcje komórek.
- Diazoksyd oraz inne związki wpływają na wydzielanie insuliny w sposób odpowiedni, co wykazuje niezawodność testu.
- Wyniki sugerują, że metoda ta może prowadzić do identyfikacji nowych kandydatów na leki do terapii cukrzycy.
Wnioski
- Badanie dostarcza prostego i skutecznego testu wydzielania insuliny, istotnego dla badań nad cukrzycą.
- Podejście to może przyczynić się do identyfikacji związków wiodących dla przyszłych terapii cukrzycy.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia szybki i kosztowo efektywny screening aktywności wydzielniczej insuliny w komórkach beta, wspierając wczesne etapy opracowywania leków na cukrzycę poprzez zapewnienie natychmiastowych odczytów wpływu związków na sekrecję. Test oparty na względnej aktywności lucyferazy stanowi skalowalną alternatywę o średniej przepustowości dla metod opartych na przeciwciałach, redukując czas i koszt analizy pojedynczej próbki przy zachowaniu istotności biologicznej. Metoda ta wpisuje się w proces discovery jako funkcjonalny odczyt angażowania celu oraz mechanistyczna weryfikacja ryzyka dla kandydatów modulujących insulinę.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez pomiar funkcjonalnego wydzielania insuliny w odpowiedzi na glukozę oraz modulatory farmakologiczne.
- Wartość operacyjna: Umożliwia szybką ocenę bibliotek związków przy użyciu standardowych czytników płytek luminescencyjnych i pipet wielokanałowych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera identyfikację związków wiodących poprzez korelację sygnału lucyferazy ze znanymi odpowiedziami wydzielniczymi na diazoksyd, chlorek potasu, PMA i epinefrynę.
Przesiew i opracowanie testu
- Gotowość analizy: Generuje ilościowe odczyty luminescencji w ciągu kilku minut od pobrania próbek, co ułatwia podejmowanie decyzji w tym samym dniu.
- Powtarzalność: Wykazuje spójną odpowiedź na dawkę glukozy oraz oczekiwane wzorce sekrecyjne w komórkach MIN6 i ludzkich wysepkach.
- Skalowalność: Kompatybilny z formatami 96-dołkowymi i przyjazny dla automatycznego dozowania cieczy w celu równoległego testowania związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Zwalidowane w ludzkich wysepkach, co potwierdza istotność w odniesieniu do fizjologii ludzkich komórek beta.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Potwierdza efekty specyficzne dla danej ścieżki poprzez uznane kontrole farmakologiczne (np. blokada diazydem).
- Zgodność przedkliniczna: Służy jako funkcjonalny wskaźnik uwalniania insuliny, umożliwiając priorytetyzację związków do późniejszej walidacji metodą ELISA.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza ta służy jako narzędzie do wczesnego etapu odkrywania w procesie optymalizacji hitów do leadów, pozycjonowana przed potwierdzającym ilościowym oznaczaniem insuliny metodami przeciwciał, a po wstępnym przesiewaniu związków.
- Biologia odkrywcza: Testowanie hipotez dotyczących modulacji szlaków wydzielania insuliny w genetycznie zmodyfikowanych komórkach beta.
- Przesiewy: Umożliwienie oceny wpływu związków na dynamikę wydzielania przy średniej przepustowości z natychmiastowym odczytem luminescencji.
- Analityka: Dostarczenie relatywnych wyników ilościowych, odpowiednich do porównywania warunków traktowania oraz obliczania krotności zmian względem wydzielania podstawowego.
- Badania translacyjne: Wykorzystanie raportora lucyferazy kompatybilnego z ludzkimi wysepkami w celu powiązania wyników uzyskanych na liniach komórkowych gryzoni z systemami istotnymi dla ludzi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stworzenie wielokrotnego użytku platformy opartej na luminescencji, którą można dostosować do innych raportorów współwydzielanych poza insuliną.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez powiązanie aktywności reportera genetycznego z fizjologicznym wydzielaniem insuliny.
- Wartość operacyjna: Obniża koszt analizy pojedynczej próbki i przyspiesza harmonogram badań w porównaniu do testów ELISA lub HTRF.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) dzięki szybkiej walidacji funkcjonalnej modulatorów wydzielania.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie profili wydzielania zależnych od dawki.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie hodowli komórek beta, transdukcji lentiwirusem oraz przeprowadzania analiz luminescencyjnych.
- Metoda zależy od zastosowania standardowych czytników płytek z wtryskiwaczami lub możliwości ręcznego dodawania substratu lucyferazy.
- Konieczna jest standaryzacja obchodzenia się z supernatanten oraz czasu pomiaru pomiędzy zespołami w celu zminimalizowania zmienności.
- Adaptacja do pierwotnych wysepek lub komórek beta pochodzących z komórek macierzystych może wymagać optymalizacji kinetyki ekspresji i sekrecji.
- Ograniczenie: Metoda zapewnia względną, a nie bezwzględną kwantyfikację insuliny; do walidacji wiodących związków wymagane jest potwierdzenie za pomocą ortogonalnego testu ELISA.
