Name: Testy aktywności oparte na NMR do określania inhibicji związku, wartości IC50, aktywności artefaktów i aktywności całych komórek rybohydrolaz nukleozydowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Poznaj testy aktywności oparte na NMR do identyfikacji inhibitorów rybohydrolaz nukleozydowych z Trichomonas vaginalis. Ta metoda umożliwia wyznaczanie wartości IC50 i rozwój nowych leków przeciwtrichomonalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Deanowi Brownowi za dostarczenie związków z biblioteki fragmentów AstraZeneca oraz Dr. Davidowi Parkinowi za dostarczenie enzymów AGNH i UNH. Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach nagrody numer R15AI128585 dla B. J. S. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Institutes of Health.Badania były również wspierane przez Horace G. McDonell Summer Research Fellowship przyznane S. N. M., Landesberg Family Fellowship przyznane J. A. G. oraz Faculty Development Grants i Frederick Bettelheim Research Award od Adelphi University dla B. J. S.

1. Wstępne testy związków testowych przy 500 μM i 250 μM
<ol>
	<li>Przygotować substrat i związek badawczy do reakcji.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory podstawowe substratu (adenozyny lub 5-fluorourydyny) w wodzie i 50 mM związku testowego w deuterowanym sulfotlenku dimetylu (DMSO). Zapoznaj się z sekcją wprowadzającą, aby uzyskać informacje na temat stężeń roztworu substratu, który należy zastosować.</li>
		<li>Dodaj 12 μl substratu (adenozyny lub 5-fluorourydyny) do każdej z czterech probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml, 1-4.</li>
		<li>Dodać 6 μl deuterowanego DMSO do probówek 1 (kontrola 0 min) i 4 (kontrola 30 min). Dodać 6 μl badanego związku do probówki 2. Dodać 3 μl badanego związku i 3 μl deuterowanego DMSO do probówki 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować wystarczającą ilość roztworu reakcyjnego. 
	UWAGA: Roztwór podstawowy jest przeznaczony do pięciu reakcji, z których każda zawiera 517 μl buforu, 60 μl tlenku deuteru i 5 μl roztworu enzymatycznego (AGNH lub UNH). Zapoznaj się z sekcją wprowadzającą, aby uzyskać informacje na temat stężeń roztworu enzymu, który należy zastosować.
	<ol>
		<li>Dodać 2,59 ml buforu reakcyjnego (50 mM fosforanu potasu, 0,3 M KCl, pH 6,5) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodać 300 μl tlenku deuteru do stożkowej probówki. Dodać 25 μl roztworu enzymatycznego (AGNH lub UNH) do stożka.</li>
		<li>Delikatnie odwróć stożkową rurkę dwukrotnie, aby wymieszać.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jednocześnie zainicjować i wygasić 0-minutową reakcję kontrolną. Przenieść 582 μl reakcyjnego roztworu podstawowego do czystej probówki do mikrofuge. Dodaj 10 μl 1,5 M HCl do tej probówki do mikrofuge. Przenieś połączone 592 μl do probówki do mikrofugi 1. Odessać i dozować próbkę dwukrotnie, powoli, ale z rozmysłem.</li>
	<li>Zainicjuj i uruchom pozostałe trzy reakcje w sposób rozłożony w czasie. W czasie 0 min przenieść 582 μl reakcyjnego roztworu podstawowego do probówki do mikrofugi 2. Odessać i dozować próbkę dwukrotnie, powoli, ale z rozmysłem. Powtarzaj w odstępach 30 s dla probówek do mikrofug 3 i 4. Poczekaj 30 min.</li>
	<li>Ugasić reakcje. W czasie 30 minut dodaj 10 μl 1,5 M HCl do mikrofuge 2. Powtarzaj w odstępach 30 s dla probówek do mikrofug 3 i 4. Przenieś 600 μl roztworu z każdej mikrorurki do probówek NMR.</li>
	<li>Uzyskaj widmo 1D NMR na każdej próbce. Przetwarzaj dane, aby zapewnić prawidłowe etapy i płaskie linie bazowe.</li>
	<li>Obliczyć procentową konwersję substratu dla widm kontrolnych.
	<ol>
		<li>Nałóż widma na kontrole 0 min i 30 min. Przeskaluj sygnał podłoża w kontrolce 0 min, aby dopasować ją do kontrolki 30 min. Zwróć uwagę na ten procent.</li>
		<li>Oblicz procentową konwersję jako (100 – wartość procentowa określona w kroku 1.7.1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczyć procentową konwersję substratu dla reakcji zawierających badany związek.
	<ol>
		<li>Widma nakładane dla 0-minutowej kontroli i pierwszej reakcji zawierające badany związek o wielkości 500 μM. Przeskaluj sygnał substratu w kontrolie 0 min, aby dopasować widmo do badanego związku. Zwróć uwagę na ten procent. Oblicz procentową konwersję jako (100 – określony procent).</li>
		<li>Powtórzyć dla drugiej reakcji zawierającej badany związek o wielkości 250 μM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczyć procentową zawartość reakcji i procentową inhibicję dla każdego badanego stężenia związku.
	<ol>
		<li>Obliczyć procentową reakcję jako (1.8.1/1.7.2) x 100.</li>
		<li>Oblicz procentową inhibicję jako (100 – procent określony w kroku 1.9.1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wyznaczanie wartości IC50
<ol>
	<li>Przygotować substrat i związek badawczy do reakcji.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory podstawowe substratu (adenozyny lub 5-fluorourydyny) w wodzie i 10 mM związku testowego w deuterowanym DMSO. Zapoznaj się z sekcją wprowadzającą, aby uzyskać informacje na temat stężeń roztworu substratu, który należy zastosować.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować seryjne rozcieńczenia 10 mM badanego związku (w deuterowanym DMSO).
	<ol>
		<li>Dodaj 36 μl deuterowanego DMSO do pięciu probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml, 1–5.</li>
		<li>Dodać 12 μl 10 mM związku testowego do probówki 1 i lekko postukać, aby wymieszać. Badany związek ma teraz 2,5 mM.</li>
		<li>Przenieś 12 μl z probówki 1 do probówki 2 i lekko postukaj, aby wymieszać. Związek testowy wynosi teraz 0,63 mM. Przenieś 12 μl z probówki 2 do probówki 3 i lekko postukaj, aby wymieszać. Związek testowy wynosi teraz 0,16 mM. Przenieś 12 μl z probówki 3 do probówki 4 i lekko postukaj, aby wymieszać. Badany związek wynosi teraz 0,04 mM. Przenieś 12 μl z probówki 4 do probówki 5 i lekko postukaj, aby wymieszać. Związek testowy wynosi teraz 0,01 mM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 14 probówek do mikrofug o pojemności 1,5 ml do reakcji.
	<ol>
		<li>Dodać 12 μl substratu (adenozyny lub 5-fluorourydyny) do każdej z 14 probówek do mikrofuge po 1,5 ml, 1-14.</li>
		<li>Dodać 12 μl deuterowanego DMSO do probówek 1 (kontrola 0 min) i 14 (kontrola 30 min).</li>
		<li>Dodać 12 μl 10 mM badanego związku do probówek 2 i 3. Dodać 12 μl 2,5 mM związku testowego do probówek 4 i 5. Dodać 12 μl 0,63 mM badanego związku do probówek 6 i 7. Dodać 12 μl 0,16 mM związku testowego do probówek 8 i 9. Dodać 12 μl 0,04 mM związku testowego do probówek 10 i 11. Dodać 12 μl 0,01 mM związku testowego do probówek 12 i 13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować wystarczającą ilość roztworu podstawowego do przeprowadzenia 15 reakcji, z których każda zawiera 511 μl buforu, 60 μl tlenku deuteru i 5 μl roztworu enzymatycznego (AGNH lub UNH). Zapoznaj się z sekcją wprowadzającą, aby uzyskać informacje na temat stężeń roztworu enzymu, który należy zastosować.
	<ol>
		<li>Dodać 7,67 ml buforu reakcyjnego (50 mM fosforanu potasu, 0,3 M KCl, pH = 6,5) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodać 900 μl tlenku deuteru do stożkowej probówki. Dodać 75 μl roztworu enzymatycznego (AGNH lub UNH) do stożka.</li>
		<li>Delikatnie odwróć stożkową rurkę 2x, aby wymieszać.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Postępować zgodnie z krokami opisanymi w krokach 1.3–1.9 do (przy użyciu 576 μl roztworu podstawowego do reakcji) w celu określenia procentowej reakcji dla każdego badanego stężenia związku.</li>
	<li>Oblicz wartość IC50 za pomocą GraphPad Prism.
	<ol>
		<li>Utwórz tabelę danych korelującą log stężeń związków testowych reakcji (200 μM, 50 μM, 12,5 μM, 3,13 μM, 0,78 μM, 0,20 μM) z procentem reakcji (po dwie wartości).</li>
		<li>Użyj nieliniowego dopasowania krzywej, aby określić wartość IC50 i błąd standardowy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Testy przesiewowe licznika detergentów przy 100 μM i 50 μM
<ol>
	<li>Przygotować substrat i związek badawczy do reakcji.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory podstawowe substratu (adenozyny lub 5-fluorourydyny) w wodzie i 10 mM związku testowego w deuterowanym DMSO. Zapoznaj się z sekcją wprowadzającą, aby uzyskać informacje na temat stężeń roztworu substratu, który należy zastosować.</li>
		<li>Dodaj 12 μl substratu (adenozyny lub 5-fluorourydyny) do każdej z ośmiu probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml, 1–8.</li>
		<li>Dodaj 6 μl deuterowanego DMSO do probówek 1 i 5 (kontrole 0 min) oraz 4 i 8 (kontrole 30 min). Dodać 6 μl badanego związku do probówek 2 i 6. Dodać 3 μl badanego związku i 3 μl deuterowanego DMSO do probówek 3 i 7.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować wystarczającą ilość roztworu podstawowego do przeprowadzenia pięciu reakcji, z których każda zawiera 517 μl buforu, 60 μl tlenku deuteru i 5 μl roztworu enzymatycznego (AGNH lub UNH). Zapoznaj się z sekcją wprowadzającą, aby uzyskać informacje na temat stężeń roztworu enzymu, który należy zastosować.
	<ol>
		<li>Dodać 2,59 ml buforu reakcyjnego (50 mM fosforanu potasu, 0,3 M KCl, pH = 6,5) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodać 300 μl tlenku deuteru do stożkowej probówki. Dodać 25 μl roztworu enzymatycznego (AGNH lub UNH) do stożka.</li>
		<li>Delikatnie odwróć stożkową rurkę 2x, aby wymieszać.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować wystarczającą ilość reakcyjnego roztworu podstawowego z 0,01% v/v detergentu Triton X-100, aby przeprowadzić pięć reakcji, które zawierają 517 μl buforu, 60 μl tlenku deuteru i 5 μl roztworu enzymatycznego (AGNH lub UNH) każda.
	<ol>
		<li>Dodać 2 μl detergentu Triton X-100 do 20 ml buforu reakcyjnego (50 mM fosforanu potasu, 0,3 M KCl, pH = 6,5). Roztwory detergentów należy zużyć w ciągu 1 dnia.</li>
		<li>Dodać 2,59 ml buforu reakcyjnego zawierającego 0,01% detergentu Triton X-100 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodać 300 μl tlenku deuteru do stożkowej probówki. Dodać 25 μl roztworu enzymatycznego (AGNH lub UNH) do stożka.</li>
		<li>Delikatnie odwróć stożkową rurkę 2x, aby wymieszać.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla probówek 1–4, przy użyciu roztworu podstawowego do reakcji BEZ detergentu, należy postępować zgodnie z krokami opisanymi w krokach 1.3–1.9 w celu określenia procentowej inhibicji dla każdego badanego stężenia związku.</li>
	<li>W przypadku probówek 5–8, używając roztworu podstawowego reakcji Z 0,01% v/v detergentu Triton X-100, należy postępować zgodnie z krokami opisanymi w krokach 1.3–1.9 w celu określenia procentowej inhibicji dla każdego badanego stężenia związku.</li>
</ol>
4. Testy licznika rozcieńczeń skokowych
<ol>
	<li>Przygotować substrat i badane związki do reakcji
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory podstawowe substratu (adenozyny lub 5-fluorourydyny) w wodzie i 10 mM związku testowego w deuterowanym DMSO. Zapoznaj się z sekcją wprowadzającą, aby uzyskać informacje na temat stężeń roztworu substratu, który należy zastosować.</li>
		<li>Dodać 53,8 μl buforu reakcyjnego (50 mM fosforanu potasu, 0,3 M KCl, pH = 6,5) do dwóch probówek do mikrofuge po 1,5 ml (każda), 1 i 2. Dodać 5 μl enzymu (AGNH lub UNH) do probówek 1 i 2.</li>
		<li>Dodać 511 μl buforu reakcyjnego do dwóch probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml, 3 i 4 (każda). Dodać 60 μl tlenku deuteru do probówek 3 i 4. Dodać 5 μl enzymu (AGNH lub UNH) do probówek 3 i 4.</li>
		<li>Dodać 1,2 μl deuterowanego DMSO do probówki 1 (kontrola 30 minut). Dodać 1,2 μl badanego związku do probówki 2. Dodać 12 μl deuterowanego DMSO do probówki 3 (kontrola 30 minut). Dodać 12 μl badanego związku do probówki 4. Inkubować przez 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować dwie probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml z roztworem rozcieńczającym.
	<ol>
		<li>Dodać 468 μl buforu reakcyjnego do każdej z dwóch probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml, 5 i 6. Dodać 60 μl tlenku deuteru do każdej probówki (5 i 6).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj cztery probówki do mikrofug o pojemności 1,5 ml do przeprowadzenia reakcji.
	<ol>
		<li>Dodaj 12 μl substratu (adenozyny lub 5-fluorourydyny) do każdej z czterech probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml, 7–10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj skokowe rozcieńczenia i zainicjuj reakcje.
	<ol>
		<li>Przenieść 528 μl roztworu z probówki 5 do probówki 1. Odessać i dozować próbkę dwukrotnie, powoli, ale z rozmysłem. Przenieść 528 μl roztworu z probówki 6 do probówki 2. Odessać i dozować próbkę dwukrotnie, powoli, ale z rozmysłem.</li>
		<li>W czasie 0 min przenieść 588 μl roztworu z probówki 1 do probówki 7. Zasysać i dozować próbkę 2x w powolny, ale przemyślany sposób. W odstępach 30 s przenieść 588 μl roztworu z probówki 2 do probówki 8, probówki 3 do probówki 9 i probówki 4 do probówki 10. Odessać i dozować próbkę dwukrotnie, powoli, ale z rozmysłem. Poczekaj 30 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku probówek 7–10 należy postępować zgodnie z krokami opisanymi w krokach 1.5–1.9 w celu określenia procentowej inhibicji dla każdego badanego stężenia związku.</li>
</ol>
5. Testy złożone w całych komórkach E. coli
<ol>
	<li>Przygotuj 10 ml nocnej hodowli E. coli w dniu poprzedzającym eksperymenty.</li>
	<li>Przygotuj komórki E. coli do eksperymentów NMR.
	<ol>
		<li>Odwirować komórki w podwielokrotnościach o pojemności 1 ml przez 10 minut przy 15 000 x g.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić każdą podwielokrotność komórek w 1 ml buforu reakcyjnego (50 mM fosforanu potasu, 0,3 M KCl, pH = 6,5) przez wirowanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Postępuj zgodnie z sekcjami 1 lub 2 dla żądanego testu z następującymi zmianami:
	<ol>
		<li>Zastąp 280 μl buforu w roztworze podstawowym reakcji 280 μl zawieszonych komórek.</li>
		<li>Zastąp 5 μl enzymu (AGNH lub UNH) w roztworze podstawowym reakcji 5 μl buforu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJardetzky%2C+O+%22NMR+in+Molecular+Biology%22">NMR in Molecular Biology</a>. , Academic Press. New York. (1981).</li>
<li>Evans, J. N. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEvans%2C+JNS+%22Biomolecular+NMR+spectroscopy%22">Biomolecular NMR spectroscopy</a>. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1995).</li>
<li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+NMR+method+for+rapid%2C+efficient%2C+and+reliable+biochemical+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).</li>
<li>Dalvit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-+and+substrate-based+19F+NMR+screening%3A+Principles+and+applications+to+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+NMR+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).</li>
<li>Stockman, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+allosteric+PIF-pocket+ligands+for+PDK1+using+NMR-based+fragment+screening+and+1H-15N+TROSY+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Biology+%26+Drug+Design%22%5BJournal%5D)">Identification of allosteric PIF-pocket ligands for PDK1 using NMR-based fragment screening and 1H-15N TROSY experiments.</a> Chemical Biology & Drug Design. 73, 179-188 (2009).</li>
<li>Hirt, R. P., Sherrard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trichomonas+vaginalis+origins%2C+molecular+pathobiology+and+clinical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Trichomonas vaginalis origins, molecular pathobiology and clinical considerations.</a> Current Opinion in Infectious Diseases. 28, 72-79 (2015).</li>
<li>Conrad, M. D., Bradic, M., Warring, S. D., Gorman, A. W., Carlton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+trichy%3A+Tools+and+approaches+to+interrogating+Trichomonas+vaginalis+in+a+post-genome+world%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world.</a> Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).</li>
<li>Versées, W., Steyaert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalysis+by+nucleoside+hydrolases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Catalysis by nucleoside hydrolases.</a> Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).</li>
<li>Shea, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+proton-pump+inhibitor+drugs+that+inhibit+Trichomonas+vaginalis+uridine+nucleoside+ribohydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).</li>
<li>Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine%2Fguanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase+is+a+distinct%2C+druggable+antitrichomonal+target%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).</li>
<li>Muellers, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-efficient+inhibitors+of+Trichomonas+vaginalis+adenosine%2Fguanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase.</a> ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).</li>
<li>Veronesi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorine+nuclear+magnetic+resonance-based+assay+in+living+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells.</a> Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).</li>
<li>Holzgrabe, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+NMR+spectroscopy+in+pharmaceutical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+NMR+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).</li>
<li>Bharti, S. K., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+1H+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative 1H NMR spectroscopy.</a> Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).</li>
<li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+improvement+in+19F+NMR-based+screening+experiments%3A+Theoretical+considerations+and+experimental+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).</li>
<li>Lambruschini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+fragment-based+n-FABS+NMR+screening+applied+to+the+membrane+enzyme+FAAH%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH.</a> ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).</li>
<li>Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Fluoro-ATP+as+a+versatile+tool+for+19F+NMR-based+activity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).</li>
<li>Aldrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ecstasy+and+agony+of+assay+interference+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">The ecstasy and agony of assay interference compounds.</a> ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).</li>
<li>Feng, B. Y., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detergent-based+assay+for+the+detection+of+promiscuous+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors.</a> Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).</li>
<li>Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+enzyme+concentration+and+residence+time+on+apparent+activity+recovery+in+jump+dilution+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis.</a> Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).</li>
<li>Griveta, J. -P., Delort, A. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+for+microbiology%3A+In+vivo+and+in+situ+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+NMR+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">NMR for microbiology: In vivo and in situ applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).</li>
<li>Nijman, S. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+to+uncover+drug+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional genomics to uncover drug mechanism of action.</a> Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisane protokoły mają ogólne zastosowanie do wielu enzymów, pod warunkiem, że substraty i/lub produkty mają rozdzielalne sygnały w widmie NMR. Jednak bardzo ważne jest, aby stężenie substratu było bliskie wartości Km i wystarczająco wysokie, aby można je było wykryć w eksperymencie NMR w rozsądnym czasie. Stężenie substratu nie wyższe niż 2-3 razy wartość Km jest optymalne do wykrywania konkurencyjnych, niekonkurencyjnych i niekonkurencyjnych inhibitorów4. ...

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) jest dobrze znana w charakterystyce i monitorowaniu reakcji enzymatycznych1,2. Różnice w przesunięciach chemicznych i wzorcach sprzężeń są wykorzystywane do rozróżnienia rezonansów substratu i produktu, a względne intensywności rezonansu są wykorzystywane do ilościowego określenia procentu reakcji. Zarówno zużycie substratu, jak i tworzenie produktu są bezpośrednio obserwowane w widmie NMR. Kontrastuje to ze spektrofotometrią lub spektroskopią fluorescencyjną, w których przebieg czasu reakcji jest wskazywany przez zmianę absorbancji, którą można przypisać zużyciu lub wytwarzaniu niektórych związków chemicznych. Podobnie jak w przypadku innych metod, NMR można wykorzystać do badania reakcji enzymatycznych w funkcji temperatury, pH lub innych warunków roztworu, a także można określić działanie inhibitorów.
Niedawno, testy aktywności enzymatycznej oparte na NMR zostały zademonstrowane dla badań przesiewowych fragmentów3,4. Testy oparte na NMR idealnie nadają się do pracy przy wyższych stężeniach badanych związków (często nawet 1 mM) wymaganych do wykrycia tych słabszych inhibitorów. Zakres dynamiki i dyspersja przesunięcia chemicznego w eksperymencie NMR mogą z łatwością rozwiązać rezonanse z podłoża, produktu i związków testowych. Wypada to korzystnie w porównaniu z testami spektrofotometrycznymi, w których problemy z zakłóceniami odczytu często wynikają ze związków o nakładających się profilach absorpcji UV-vis. Ponadto, ponieważ brakuje im enzymów reporterowych, testy NMR z pojedynczym enzymem nie są podatne na fałszywie dodatnie wyniki testów sprzężonych. Ta zaleta sprawia, że są one przydatne jako testy ortogonalne, uzupełniające tradycyjne wysokoprzepustowe testy przesiewowe i testy triażowe na stole5.
W naszym laboratorium badawczym, testy aktywności oparte na NMR są używane do identyfikacji i oceny inhibitorów rybohydrolaz nukleozydowych Trichomonas vaginalis. Pasożyt T. vaginalis powoduje najbardziej rozpowszechnioną niewirusową chorobę przenoszoną drogą płciową6. Rosnąca oporność na istniejące terapie7 napędza zapotrzebowanie na nowatorskie, oparte na mechanizmach terapie, z niezbędnymi enzymami szlaku ratunkowego nukleozydów reprezentującymi główne cele8. Testy aktywności oparte na NMR zostały opracowane zarówno dla enzymów specyficznych dla pirymidyny, jak i puryny, rybohydrolazy nukleozydowej urydyny (UNH)9 oraz adenozyny/guanozyny preferującej rybohydrolazę nukleozydową (AGNH)10. Reakcje katalizowane przez te dwa enzymy pokazano na rysunku 1. Testy NMR są wykorzystywane do przesiewania bibliotek fragmentów pod kątem chemicznych punktów początkowych, określania wartości IC50 i eliminowania inhibitorów wiązania opartego na agregacji lub kowalencyjności11. Te same testy są również tłumaczone w celu oceny aktywności enzymatycznej w całych komórkach12.
Szczegółowe protokoły są dostępne dla wstępnych testów związków chemicznych przy 500 μM i 250 μM, testów dawka-odpowiedź do określania wartości IC50, testów przesiewowych licznika detergentów, testów licznika rozcieńczeń skokowych i testów w całych komórkach E. coli. Protokoły mają ogólne zastosowanie do każdego enzymu, w którym rezonanse substratu i produktu można zaobserwować i odróżnić za pomocą spektroskopii NMR. Dla uproszczenia przyjęto trzy założenia. Po pierwsze, podłoże nie jest określone. Aby testy aktywności oparte na NMR były użyteczne, końcowe stężenie substratu nie powinno być większe niż 2-3 razy wartość Km 4. W przedstawionych przykładach końcowe stężenia adenozyny i 5-fluorourydyny wynoszą odpowiednio 100 μM (Km = 54 μM) i 50 μM (Km = 15 μM). W protokołach osiągnięcie tych stężeń odpowiada 12 μl 5 mM adenozyny lub 12 μl 2,5 mM 5-fluorourydyny.
Po drugie, ilość enzymu przewidziana w protokołach, 5 μL, została wybrana tak, aby odpowiadała ilości wymaganej do uzyskania około 75% konwersji substratu do produktu w ciągu 30 minut. Ilość ta zazwyczaj odpowiada dużemu rozcieńczeniu z oczyszczonego preparatu enzymatycznego, a rozcieńczenie musi być określone z wyprzedzeniem dla każdego enzymu. Oczyszczone roztwory podstawowe enzymów AGNH i UNH są przechowywane w temperaturze -80 °C w podwielokrotnościach, które dostarczają wystarczającą ilość enzymu na kilka tysięcy reakcji. W związku z tym idealnie byłoby, gdyby współczynnik rozcieńczenia był określany lub zatwierdzany tylko co kilka miesięcy. Po trzecie, konkretny eksperyment 1D NMR nie jest określony. W reprezentatywnych wynikach 1H NMR jest pokazany dla AGNH10 i 19F NMR jest pokazany dla UNH9, z eksperymentem NMR opisanym w odpowiednich odniesieniach. Wybór eksperymentu NMR zależy od dostępnej reakcji enzymatycznej i substratów, a także od dostępnego oprzyrządowania NMR. Na koniec należy wskazać, że opisane podejście eksperymentalne nie spełnia ścisłych wymagań ilościowego NMR (qNMR)13,14. W protokole procentową reakcję określa się na podstawie względnych zmian intensywności tego samego rezonansu w każdym spektrum, a nie poprzez określenie stężeń bezwzględnych. Takie podejście eliminuje konieczność akwizycji i modyfikacji przetwarzania danych, a także wewnętrznych lub zewnętrznych standardów, które są wymagane dla qNMR.

<table><tbody><tr><td>AGNH</td><td>Oczyszczane we własnym zakresie</td><td>Nie dotyczy</td><td>TVAG_213720</td></tr><tr><td>UNH</td><td>Oczyszczane we własnym zakresie</td><td>Nie dotyczy</td><td>TVAG_092730</td></tr><tr><td>Adenozyna</td><td>Sigma</td><td>A9251</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluorourydyna</td><td>Sigma</td><td>F5130</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek-D6</td><td>Cambridge Isotope Labs</td><td>DLM-10-100</td><td>D, 99,9%</td></tr> <tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek deuteru</td><td>Cambridge Isotope Labs</td><td>DLM-4-100</td><td>D, 99,9%</td></tr> <tr><td>Kwas solny</td><td>Fisher Chemical</td><td>A144212</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa kwasu 3-(trimetylosililo)propiono-2,2,3,-d4 (TSP)</td><td>Sigma</td><td>269913</td><td>D, 98%</td></tr><tr><td>2,2,2-trifluoroetanol-1,1-d2</td><td>Sigma</td><td>612197</td><td>D, 99,5%</td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td>Pipeta do PIPETMAN Classic P1000</td></tr><tr><td>Pipeta</td> do pipety <td>Gilson</td><td>F123601</td><td>do pipety do PIPETMAN Classic P200</td></tr><tr><td>do pipety</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td>do pipety do pipet do pipet do herbaty z tworzywa sztucznego Pipetman Classic P20</td></tr><tr><td>Rurki do mikrofuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Rurki stożkowe</td><td>Corning</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5418</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>02215365</td><td></td></tr><tr><td>Probówki</td><td>NMR Norell</td><td>502-7</td><td>Lub odpowiednio do</td></tr><tr><td>spektrometru NMR NMR</td><td>Bruker</td><td>N/ Oprogramowanie</td><td>AvanceIII500</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td>N/A</td><td>Wersja 5.04</td></tr></tbody></table>

testy aktywności oparte na nmr do określania inhibicji związku, wartości ic50, aktywności artefaktów i aktywności całych komórek rybohydrolaz nukleozydowych

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

Spektroskopia NMR jest często używana do identyfikacji i charakterystyki inhibitorów enzymów w odkrywaniu leków, szczególnie w kontekście badań przesiewowych fragmentów. Testy aktywności oparte na NMR idealnie nadają się do pracy przy wyższych stężeniach badanych związków wymaganych do wykrycia tych słabszych inhibitorów. Zakres dynamiki i dyspersja przesunięcia chemicznego w eksperymencie NMR mogą z łatwością rozwiązać rezonanse z podłoża, produktu i związków testowych. Kontrastuje to z testami spektrofotometrycznymi, w których problemy z zakłóceniami odczytu często wynikają ze związków o nakładających się profilach absorpcji UV-vis. Ponadto, ponieważ brakuje im enzymów reporterowych, testy NMR z pojedynczym enzymem nie są podatne na fałszywie dodatnie wyniki testów sprzężonych. Ta cecha sprawia, że są one przydatne jako testy ortogonalne, uzupełniające tradycyjne wysokoprzepustowe testy przesiewowe i laboratoryjne testy triażowe. Przedstawiono szczegółowe protokoły dla wstępnych testów związków chemicznych przy 500 μM i 250 μM, testów dawka-odpowiedź do oznaczania wartości IC50, testów przesiewowych licznika detergentów, testów przesiewowych licznika rozcieńczeń skokowych oraz testów w całych komórkach E. coli. Metody te zademonstrowano przy użyciu dwóch enzymów rybohydrolazy nukleozydowej. Zastosowanie 1H NMR pokazano dla enzymu specyficznego dla puryny, podczas gdy 19F NMR pokazano dla enzymu specyficznego dla pirymidyny. Protokoły mają ogólne zastosowanie do każdego enzymu, w którym rezonanse substratu i produktu można zaobserwować i odróżnić za pomocą spektroskopii NMR. Aby być najbardziej użytecznym w kontekście odkrywania leków, końcowe stężenie substratu nie powinno przekraczać 2-3 razy jego wartości Km m. Wybór eksperymentu NMR zależy od dostępnej reakcji enzymatycznej i substratów, a także od dostępnego oprzyrządowania NMR.

Rysunek 2 przedstawia wyniki testowania dwóch związków przeciwko AGNH z wykorzystaniem 1H NMR zgodnie z sekcją 1. Reakcję enzymatyczną najłatwiej zaobserwować i określić ilościowo poprzez zanikanie sygnałów singletu i dubletu adenozyny przy 8,48 ppm i 6,09 ppm odpowiednio oraz pojawienie się sygnału singletu adeniny przy 8,3 ppm, co zaobserwowano w widmie kontrolnym po 30 min. W obecności 50 μM związku 1 nie powstaje produkt, o czym świadczy brak sygnału adeniny przy 8,3 ppm. W ob...

Testy aktywności oparte na NMR zostały opracowane w celu identyfikacji i scharakteryzowania inhibitorów dwóch nukleozydowych enzymów rybohydrolazy. Przedstawiono protokoły dla początkowych testów związków chemicznych przy 500 μM i 250 μM, testów dawka-odpowiedź do oznaczania wartości IC50, testów przesiewowych licznika detergentów, testów przesiewowych licznika rozcieńczeń skokowych oraz testów w całych komórkach E. coli.

Testy aktywności oparte na NMR do określania inhibicji związku, wartości IC50, aktywności artefaktów i aktywności całych komórek rybohydrolaz nukleozydowych

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...

Testy aktywności oparte na NMR stanowią skuteczną metodę identyfikacji, oceny i walidacji inhibitorów danego enzymu. Szczególnie dobrze nadają się do przesiewania fragmentów. Testy NMR są podatne na wyższe stężenia związków wymagane dla słabszych inhibitorów.Ponadto brak enzymów reporterowych sprawia, że są one mniej podatne na fałszywe alarmy. W naszym laboratorium używamy testów NMR do identyfikacji i charakterystyki inhibitorów dwóch enzymów z Trichomonas vaginalis. Oba enzymy stanowią nowe cele dla nowych leków przeciwrzęsistkowych.Testy NMR mają ogólne zastosowanie w każdym obszarze badań, który obejmuje enzymy, a nawet mogą być wykorzystywane do badania enzymów wewnątrz komórek. Najważniejszym aspektem tej techniki jest zapewnienie, że pipetowane są odpowiednie objętości odczynników, a składniki reakcji są dokładnie wymieszane. Aby przygotować substrat i badane związki, dodaj 12 mikrolitrów substratu do każdej z czterech 1,5-mililitrowych probówek do mikrofuge i dodaj sześć mikrolitrów zdeuterowanego DMSO do zero-minutowych probówek kontrolnych i 30-minutowych probówek kontrolnych.Dodać sześć mikrolitrów badanego związku do pierwszej probówki doświadczalnej i trzy mikrolitry badanego związku i trzy mikrolitry deuterowanego DMSO do drugiej probówki doświadczalnej. Następnie dodaj 300 mikrolitrów tlenku deuteru do 15-mililitrowej probówki zawierającej 2,59 mililitra buforu reakcyjnego, a następnie 25 mikrolitrów roztworu enzymatycznego. Delikatnie odwróć probówkę dwa razy, aby wymieszać podstawowy roztwór reakcyjny i dodać 10 mikrolitrów 1,5-molowego kwasu solnego do 1,5-mililitrowej probówki zawierającej 582 mikrolitry reakcyjnego roztworu podstawowego.Następnie przenieś całą objętość roztworu podstawowego reakcji i kwasu do rurki kontrolnej o długości zero minut, aby jednocześnie zainicjować i wygasić reakcję kontrolną w ciągu jednej minuty. Dwukrotne zasysanie i dozowanie próbki w powolny, ale przemyślany sposób. Zainicjuj i przeprowadź pozostałe trzy reakcje w sposób rozłożony w czasie, natychmiast przenosząc 582 mikrolitry podstawowego roztworu reakcyjnego do pierwszej probówki doświadczalnej i mieszając próbkę dwa razy, jak właśnie pokazano.Staranne zasysanie i dozowanie zapewnia całkowite wymieszanie podczas etapów inicjacji. Bądź konsekwentny w stosunku do każdej próbki, aby upewnić się, że mieszanie różnicowe nie jest zmienne. Po 30 sekundach przenieś 582 mikrolitry reakcyjnego roztworu podstawowego do drugiej probówki doświadczalnej i wymieszaj, a następnie dodaj kolejne 582 mikrolitry podstawowego roztworu reakcyjnego do 30-minutowej probówki kontrolnej 30 sekund po zainicjowaniu reakcji w drugiej probówce doświadczalnej.Po 30 minutach dodaj 10 mikrolitrów 1,5-molowego kwasu solnego do pierwszej probówki doświadczalnej, powtarzając hartowanie w odstępach 30-sekundowych dla drugiej probówki doświadczalnej i 30-minutowej probówki kontrolnej. Gdy wszystkie reakcje zostaną wygaszone, przenieś 600 mikrolitrów roztworu z każdej reakcji do probówek NMR. Aby obliczyć procentową konwersję substratu dla widm kontrolnych, załaduj próbki do spektrometru, zbierz widma NMR i nałóż widma dla kontroli zerowej i 30-minutowej.Przeskaluj sygnał substratu w kontrolce zero-minutowej, aby dopasować ją do kontrolki 30-minutowej i zanotuj tę wartość procentową. Następnie oblicz konwersję procentową jako 100 minus procent od dopasowania sygnałów substratu. Aby obliczyć procentową konwersję substratu dla reakcji zawierających badany związek, należy nałożyć widma dla kontroli zero-minutowej i pierwszej reakcji zawierającej 500-mikromolowy związek testowy i przeskalować sygnał substratu w kontroli zero-minutowej, aby dopasować widmo do badanego związku.Zanotuj ten procent i użyj go do obliczenia konwersji procentowej, jak pokazano poniżej. Następnie nałóż widma dla kontroli zero-minutowej i pierwszej reakcji zawierającej 250-mikromolowy związek testowy i przeskaluj sygnał substratu w kontroli zero-minutowej, aby dopasować widmo do badanego związku. Po zanotowaniu wartości procentowej użyj jej do obliczenia konwersji procentowej.Aby obliczyć procentową reakcję i procentową inhibicję dla każdego badanego stężenia związku, najpierw oblicz procentową reakcję jako procentową konwersję badanego związku, podzieloną przez procentową konwersję kontrolnej razy 100. Następnie oblicz procentową inhibicję jako 100 minus procent reakcji. Aby wykonać test przesiewowy detergentu, dodaj 300 mikrolitrów tlenku deuteru i 25 mikrolitrów roztworu enzymatycznego do 15-mililitrowej probówki zawierającej 2,59 mililitra buforu reakcyjnego.Delikatnie odwróć probówkę dwa razy, aby wymieszać podstawowy roztwór reakcyjny i dodaj dwa mikrolitry detergentu Triton X-100 do 20 mililitrów buforu reakcyjnego. Następnie dodaj 2,59 mililitra buforu reakcyjnego, zawierającego 0,01% detergentu Triton X-100 do nowej 15-mililitrowej stożkowej probówki. Następnie dodaj 300 mikrolitrów tlenku deuteru i 25 mikrolitrów roztworu enzymatycznego do probówki.Delikatnie odwróć probówkę dwa razy, aby wymieszać podstawowy roztwór reakcyjny. Następnie określ procentową inhibicję dla 100-mikromolowych i 50-mikromolowych związków testowych, jak właśnie pokazano. Używając podstawowego roztworu reakcyjnego bez detergentu, dla jednego zestawu czterech probówek, i reakcyjnego roztworu podstawowego z detergentem dla drugiego zestawu czterech probówek.Aby przeprowadzić rozcieńczanie skokowe, przenieś 468 mikrolitrów buforu reakcyjnego i 60 mikrolitrów tlenku deuteru do probówki zawierającej 53,8 mikrolitrów buforu reakcyjnego, pięć mikrolitrów roztworu enzymatycznego i 1,2 mikrolitra DMSO, który inkubował przez 30 minut. Zassać i dozować mieszaninę dwa razy w powolny, ale przemyślany sposób. Przed przeniesieniem 468 mikrolitrów buforu reakcyjnego i 60 mikrolitrów tlenku deuteru do probówki zawierającej 53,8 mikrolitrów buforu reakcyjnego, pięć mikrolitrów roztworu enzymatycznego i 1,2 mikrolitra badanego związku, który inkubował przez 30 minut.Wymieszaj drugą reakcję dwa razy, jak pokazano. I natychmiast przenieść 588 mikrolitrów roztworu z probówki kontrolnej DMSO do rozcieńczania skokowego do probówki zawierającej 12 mikrolitrów substratu z mieszaniem. Kontynuuj przenoszenie 588 mikrolitrów z probówki do badania rozcieńczania skokowo, nierozcieńczonej probówki kontrolnej DMSO i nierozcieńczonej probówki ze związkiem testowym do każdej z trzech probówek o pojemności 1,5 mililitra, zawierających 12 mikrolitrów substratu na probówkę, mieszając następnie w odstępach 30-sekundowych.Następnie odczekaj 30 minut przed wygaszeniem reakcji, zebraniem widm NMR i obliczeniem procentowej inhibicji dla każdego związku, jak właśnie pokazano. Tutaj pokazano wyniki testowania dwóch związków przeciwko AgNH we wstępnym teście związku testowego przy użyciu protonowego NMR, jak pokazano. Reakcję enzymatyczną najłatwiej zaobserwować i określić ilościowo poprzez zanik rezonansów adenozyny singletowej i dubletowej przy odpowiednio 8,48 i 6,09 części na milion.I pojawienie się miejsca zamieszkania z adeninowym singletem na poziomie 8,33 części na milion, jak zaobserwowano w 30-minutowym spektrum kontrolnym. Na tym rysunku przedstawiono wyniki badania związku w dwóch stężeniach przeciwko AgNH w teście przeciwprzesiewowym detergentu przy użyciu protonowego NMR, jak pokazano. Obserwuje się tylko minimalne różnice w intensywności sygnałów substratu i produktu przy użyciu tych dwóch warunków, co wskazuje, że obserwowane hamowanie enzymu nie jest artefaktem agregacji związków.Należy pamiętać, że rezonanse powstające od badanego związku i detergentu nie zakłócają rezonansów podłoża ani produktu. Wyniki badania związku w teście rozcieńczania skokowego przeciwko AGNH przy użyciu protonowego NMR, jak wykazano, ujawniają zmniejszoną intensywność sygnału substratu w reakcji 20-mikromolowej w porównaniu z reakcją 200-mikromolową, co wskazuje, że zahamowanie jest odwracalne. Kluczowe znaczenie ma pełne wymieszanie próbki podczas inicjacji każdej reakcji i dla rozcieńczeń skokowych.Wymagane jest staranne i konsekwentne zasysanie i dozowanie. Testy oparte na NMR mogą być również stosowane do pomiaru aktywności enzymu w całych komórkach, przy użyciu roztworu zawierającego zawieszone komórki zamiast buforu reakcyjnego i enzymu. Nasze wysiłki w zakresie odkrywania leków przeciw rzęsistkowi nadal opierają się na tych testach w celu zmierzenia siły działania nowo zsyntetyzowanych związków na enzymy rybohydrolazy.Mimo że jest stosowany tylko w bardzo małych ilościach, kwas solny używany do gaszenia reakcji jest niebezpieczny i powinien być stosowany z odpowiednimi środkami ochrony osobistej.

nmr-based-activity-assays-for-determining-compound-inhibition-ic50

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Trzy testy, w tym test oparty na działaniu cytopatycznym (CPE), test dawka-odpowiedź i test czasu dodania (ToA) zostały opracowane, zoptymalizowane, zatwierdzone i wykorzystane do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka (BTV), a także do określenia możliwego mechanizmu działania (MoA) dla nowo zidentyfikowanych leków przeciwwirusowych.

Testy do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka

Testy in vitro do pomiaru replikacji wirusa zostały znacznie ulepszone dzięki rozwojowi rekombinowanych wirusów RNA wyrażających lucyferazy lub inne enzymy zdolne do bioluminescencji. W tym miejscu szczegółowo opisujemy wysokoprzepustową linię badań przesiewowych, która łączy takie rekombinowane szczepy wirusów odry i chikungunya w celu wyizolowania leków przeciwwirusowych o szerokim spektrum działania z bibliotek chemicznych.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku chemicznych inhibitorów wirusów RNA o szerokim spektrum działania

W tym manuskrypcie opisujemy protokół do funkcjonalnego badania transkrypcji i hamującej aktywności środków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na bakteryjną transkrypcję.

In vitro Testy transkrypcji i ich zastosowanie w odkrywaniu leków

Opracowaliśmy modułowy, wysokoprzepustowy system przesiewowy do odkrywania nowych związków przeciwko Mycobacterium tuberculosis, ukierunkowanych na bakterie rosnące wewnątrzkomórkowo i w bulionie, a także cytotoksyczność wobec komórki gospodarza ssaków.

System badań przesiewowych skuteczności i cytotoksyczności inhibitorów ukierunkowanych na wewnątrzkomórkowe prątki gruźlicy

Opisujemy użycie fenotypowego testu hamowania neuraminidazy opartego na fluorescencji do oceny podatności wirusów grypy A i B na inhibitory neuraminidazy klasy leków przeciwwirusowych.

Test hamowania neuraminidazy oparty na fluorescencji w celu oceny wrażliwości wirusów grypy na grupę inhibitorów neuraminidazy leków przeciwwirusowych

Zmieniona aktywność nukleazy jest związana z różnymi schorzeniami ludzkimi, co potwierdza jej potencjał jako biomarkera. Modułowa i łatwa do wdrożenia metodologia badań przesiewowych przedstawiona w tym artykule pozwala na wybór konkretnych sond kwasów nukleinowych do wykorzystania aktywności nukleazy jako biomarkera choroby.

Kinetyczne badanie przesiewowe aktywności nukleazy za pomocą sond kwasów nukleinowych

Test ATPazy sprzężony z dinukleotydem nikotynamidoadeninowym (NADH) został dostosowany do półwysokoprzepustowych badań przesiewowych małocząsteczkowych inhibitorów miozyny. Ten test kinetyczny jest przeprowadzany w 384-dołkowym formacie mikropłytki, przy całkowitej objętości reakcji wynoszącej zaledwie 20 μl na dołek. Platforma powinna mieć zastosowanie do praktycznie każdego enzymu wytwarzającego ADP.

Adaptacja półwysokoprzepustowa testu ATPazy sprzężonej z NADH do badań przesiewowych inhibitorów małocząsteczkowych

SAMHD1 to trifosfohydrolaza deoksynukleozydowo-trifosforanowa, odgrywająca kluczową rolę w ludzkim zdrowiu i chorobie. Tutaj przedstawiamy wszechstronny test aktywności SAMHD1 sprzężony z enzymami, zastosowany w 384-dołkowym formacie mikropłytki, który pozwala na ocenę małych cząsteczek i analogów nukleotydów jako substratów, aktywatorów i inhibitorów SAMHD1.

Wysokoprzepustowy test aktywności sprzężony z enzymami do badania interakcji małych cząsteczek z dNTPazą SAMHD1

Metylotransferazy DNA są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny małych cząsteczek pod kątem hamowania metylotransferazy DNA. Test ten wykorzystuje endonukleazę do sprzężenia metylacji DNA z generowaniem fluorescencji i pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.

Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA

Tutaj przedstawiono protokół oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe, na przykładzie enzymów ligazy, nukleazy i polimerazy. Test wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie i nieznakowane oligonukleotydy, które można łączyć w dupleksy naśladujące uszkodzenia RNA i / lub DNA lub pośrednie szlaki, co pozwala na scharakteryzowanie zachowania enzymu.

Wykorzystanie zmodyfikowanych syntetycznych oligonukleotydów do oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe

W tym badaniu wykorzystano strategie in-silico, aby zidentyfikować enumerowaną etrawirynę jako obiecujący środek terapeutyczny dla HIV. Nasze odkrycia dotyczące interakcji molekularnych i dynamiki wspierają racjonalne projektowanie nowych NNRTI jako możliwych alternatyw leczenia HIV.

Ilościowa zależność struktura-aktywność, przewidywanie aktywności i dynamika molekularna nienukleotydowych inhibitorów odwrotnej transkryptazy

Poznaj testy aktywności oparte na NMR do identyfikacji inhibitorów rybohydrolaz nukleozydowych z Trichomonas vaginalis. Ta metoda umożliwia wyznaczanie wartości IC50 i rozwój nowych leków przeciwtrichomonalnych.

Testy aktywności oparte na NMR do określania inhibicji związku, wartości IC50, aktywności artefaktów i aktywności całych komórek rybohydrolaz nukleozydowych (Wideo) | JoVE Journal

Testy aktywności oparte na NMR do określania inhibicji związku, wartości IC₅₀, aktywności artefaktów i aktywności całych komórek rybohydrolaz nukleozydowych

Przeglądaj więcej filmów