Testy aktywności oparte na NMR do określania inhibicji związku, wartości IC₅₀, aktywności artefaktów i aktywności całych komórek rybohydrolaz nukleozydowych

Testy aktywności oparte na NMR stanowią skuteczną metodę identyfikacji, oceny i walidacji inhibitorów danego enzymu. Szczególnie dobrze nadają się do przesiewania fragmentów. Testy NMR są podatne na wyższe stężenia związków wymagane dla słabszych inhibitorów.

Ponadto brak enzymów reporterowych sprawia, że są one mniej podatne na fałszywe alarmy. W naszym laboratorium używamy testów NMR do identyfikacji i charakterystyki inhibitorów dwóch enzymów z Trichomonas vaginalis. Oba enzymy stanowią nowe cele dla nowych leków przeciwrzęsistkowych.

Testy NMR mają ogólne zastosowanie w każdym obszarze badań, który obejmuje enzymy, a nawet mogą być wykorzystywane do badania enzymów wewnątrz komórek. Najważniejszym aspektem tej techniki jest zapewnienie, że pipetowane są odpowiednie objętości odczynników, a składniki reakcji są dokładnie wymieszane. Aby przygotować substrat i badane związki, dodaj 12 mikrolitrów substratu do każdej z czterech 1,5-mililitrowych probówek do mikrofuge i dodaj sześć mikrolitrów zdeuterowanego DMSO do zero-minutowych probówek kontrolnych i 30-minutowych probówek kontrolnych.

Dodać sześć mikrolitrów badanego związku do pierwszej probówki doświadczalnej i trzy mikrolitry badanego związku i trzy mikrolitry deuterowanego DMSO do drugiej probówki doświadczalnej. Następnie dodaj 300 mikrolitrów tlenku deuteru do 15-mililitrowej probówki zawierającej 2,59 mililitra buforu reakcyjnego, a następnie 25 mikrolitrów roztworu enzymatycznego. Delikatnie odwróć probówkę dwa razy, aby wymieszać podstawowy roztwór reakcyjny i dodać 10 mikrolitrów 1,5-molowego kwasu solnego do 1,5-mililitrowej probówki zawierającej 582 mikrolitry reakcyjnego roztworu podstawowego.

Następnie przenieś całą objętość roztworu podstawowego reakcji i kwasu do rurki kontrolnej o długości zero minut, aby jednocześnie zainicjować i wygasić reakcję kontrolną w ciągu jednej minuty. Dwukrotne zasysanie i dozowanie próbki w powolny, ale przemyślany sposób. Zainicjuj i przeprowadź pozostałe trzy reakcje w sposób rozłożony w czasie, natychmiast przenosząc 582 mikrolitry podstawowego roztworu reakcyjnego do pierwszej probówki doświadczalnej i mieszając próbkę dwa razy, jak właśnie pokazano.

Staranne zasysanie i dozowanie zapewnia całkowite wymieszanie podczas etapów inicjacji. Bądź konsekwentny w stosunku do każdej próbki, aby upewnić się, że mieszanie różnicowe nie jest zmienne. Po 30 sekundach przenieś 582 mikrolitry reakcyjnego roztworu podstawowego do drugiej probówki doświadczalnej i wymieszaj, a następnie dodaj kolejne 582 mikrolitry podstawowego roztworu reakcyjnego do 30-minutowej probówki kontrolnej 30 sekund po zainicjowaniu reakcji w drugiej probówce doświadczalnej.

Po 30 minutach dodaj 10 mikrolitrów 1,5-molowego kwasu solnego do pierwszej probówki doświadczalnej, powtarzając hartowanie w odstępach 30-sekundowych dla drugiej probówki doświadczalnej i 30-minutowej probówki kontrolnej. Gdy wszystkie reakcje zostaną wygaszone, przenieś 600 mikrolitrów roztworu z każdej reakcji do probówek NMR. Aby obliczyć procentową konwersję substratu dla widm kontrolnych, załaduj próbki do spektrometru, zbierz widma NMR i nałóż widma dla kontroli zerowej i 30-minutowej.

Przeskaluj sygnał substratu w kontrolce zero-minutowej, aby dopasować ją do kontrolki 30-minutowej i zanotuj tę wartość procentową. Następnie oblicz konwersję procentową jako 100 minus procent od dopasowania sygnałów substratu. Aby obliczyć procentową konwersję substratu dla reakcji zawierających badany związek, należy nałożyć widma dla kontroli zero-minutowej i pierwszej reakcji zawierającej 500-mikromolowy związek testowy i przeskalować sygnał substratu w kontroli zero-minutowej, aby dopasować widmo do badanego związku.

Zanotuj ten procent i użyj go do obliczenia konwersji procentowej, jak pokazano poniżej. Następnie nałóż widma dla kontroli zero-minutowej i pierwszej reakcji zawierającej 250-mikromolowy związek testowy i przeskaluj sygnał substratu w kontroli zero-minutowej, aby dopasować widmo do badanego związku. Po zanotowaniu wartości procentowej użyj jej do obliczenia konwersji procentowej.

Aby obliczyć procentową reakcję i procentową inhibicję dla każdego badanego stężenia związku, najpierw oblicz procentową reakcję jako procentową konwersję badanego związku, podzieloną przez procentową konwersję kontrolnej razy 100. Następnie oblicz procentową inhibicję jako 100 minus procent reakcji. Aby wykonać test przesiewowy detergentu, dodaj 300 mikrolitrów tlenku deuteru i 25 mikrolitrów roztworu enzymatycznego do 15-mililitrowej probówki zawierającej 2,59 mililitra buforu reakcyjnego.

Delikatnie odwróć probówkę dwa razy, aby wymieszać podstawowy roztwór reakcyjny i dodaj dwa mikrolitry detergentu Triton X-100 do 20 mililitrów buforu reakcyjnego. Następnie dodaj 2,59 mililitra buforu reakcyjnego, zawierającego 0,01% detergentu Triton X-100 do nowej 15-mililitrowej stożkowej probówki. Następnie dodaj 300 mikrolitrów tlenku deuteru i 25 mikrolitrów roztworu enzymatycznego do probówki.

Delikatnie odwróć probówkę dwa razy, aby wymieszać podstawowy roztwór reakcyjny. Następnie określ procentową inhibicję dla 100-mikromolowych i 50-mikromolowych związków testowych, jak właśnie pokazano. Używając podstawowego roztworu reakcyjnego bez detergentu, dla jednego zestawu czterech probówek, i reakcyjnego roztworu podstawowego z detergentem dla drugiego zestawu czterech probówek.

Aby przeprowadzić rozcieńczanie skokowe, przenieś 468 mikrolitrów buforu reakcyjnego i 60 mikrolitrów tlenku deuteru do probówki zawierającej 53,8 mikrolitrów buforu reakcyjnego, pięć mikrolitrów roztworu enzymatycznego i 1,2 mikrolitra DMSO, który inkubował przez 30 minut. Zassać i dozować mieszaninę dwa razy w powolny, ale przemyślany sposób. Przed przeniesieniem 468 mikrolitrów buforu reakcyjnego i 60 mikrolitrów tlenku deuteru do probówki zawierającej 53,8 mikrolitrów buforu reakcyjnego, pięć mikrolitrów roztworu enzymatycznego i 1,2 mikrolitra badanego związku, który inkubował przez 30 minut.

Wymieszaj drugą reakcję dwa razy, jak pokazano. I natychmiast przenieść 588 mikrolitrów roztworu z probówki kontrolnej DMSO do rozcieńczania skokowego do probówki zawierającej 12 mikrolitrów substratu z mieszaniem. Kontynuuj przenoszenie 588 mikrolitrów z probówki do badania rozcieńczania skokowo, nierozcieńczonej probówki kontrolnej DMSO i nierozcieńczonej probówki ze związkiem testowym do każdej z trzech probówek o pojemności 1,5 mililitra, zawierających 12 mikrolitrów substratu na probówkę, mieszając następnie w odstępach 30-sekundowych.

Następnie odczekaj 30 minut przed wygaszeniem reakcji, zebraniem widm NMR i obliczeniem procentowej inhibicji dla każdego związku, jak właśnie pokazano. Tutaj pokazano wyniki testowania dwóch związków przeciwko AgNH we wstępnym teście związku testowego przy użyciu protonowego NMR, jak pokazano. Reakcję enzymatyczną najłatwiej zaobserwować i określić ilościowo poprzez zanik rezonansów adenozyny singletowej i dubletowej przy odpowiednio 8,48 i 6,09 części na milion.

I pojawienie się miejsca zamieszkania z adeninowym singletem na poziomie 8,33 części na milion, jak zaobserwowano w 30-minutowym spektrum kontrolnym. Na tym rysunku przedstawiono wyniki badania związku w dwóch stężeniach przeciwko AgNH w teście przeciwprzesiewowym detergentu przy użyciu protonowego NMR, jak pokazano. Obserwuje się tylko minimalne różnice w intensywności sygnałów substratu i produktu przy użyciu tych dwóch warunków, co wskazuje, że obserwowane hamowanie enzymu nie jest artefaktem agregacji związków.

Należy pamiętać, że rezonanse powstające od badanego związku i detergentu nie zakłócają rezonansów podłoża ani produktu. Wyniki badania związku w teście rozcieńczania skokowego przeciwko AGNH przy użyciu protonowego NMR, jak wykazano, ujawniają zmniejszoną intensywność sygnału substratu w reakcji 20-mikromolowej w porównaniu z reakcją 200-mikromolową, co wskazuje, że zahamowanie jest odwracalne. Kluczowe znaczenie ma pełne wymieszanie próbki podczas inicjacji każdej reakcji i dla rozcieńczeń skokowych.

Wymagane jest staranne i konsekwentne zasysanie i dozowanie. Testy oparte na NMR mogą być również stosowane do pomiaru aktywności enzymu w całych komórkach, przy użyciu roztworu zawierającego zawieszone komórki zamiast buforu reakcyjnego i enzymu. Nasze wysiłki w zakresie odkrywania leków przeciw rzęsistkowi nadal opierają się na tych testach w celu zmierzenia siły działania nowo zsyntetyzowanych związków na enzymy rybohydrolazy.

Mimo że jest stosowany tylko w bardzo małych ilościach, kwas solny używany do gaszenia reakcji jest niebezpieczny i powinien być stosowany z odpowiednimi środkami ochrony osobistej.