Pomiar proliferacji komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych za pomocą chemii Click
30 października 2019
Proliferacja jest kluczowym elementem funkcji komórkowej i powszechnym odczytem używanym do oceny potencjalnej toksyczności nowych leków. Pomiar proliferacji jest zatem często stosowanym testem w biologii komórki. Poniżej przedstawiamy prostą, wszechstronną metodę pomiaru proliferacji, którą można zastosować w komórkach adherentnych i nieadherentnych.
Proliferacja jest ważną miarą funkcji komórek. Protokół ten pozwala badaczom na opracowanie czułego testu proliferacji w swoich laboratoriach bez wysokich kosztów dostępnych na rynku zestawów. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala uniknąć surowego traktowania komórek i/lub stosowania radioaktywności.
Tę technikę zademonstruje Vicky Wong, kierowniczka mojego laboratorium. Aby oznaczyć proliferację, usuń komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych z kolby z pożywką dla komórek mięśni gładkich w 2% płodowej surowicy bydlęcej i płytce w ilości 20 000 komórek na mililitr w DMEM na 96-dołkowej płytce. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.
Dodaj 30 nanogramów na mililitr czynnika wzrostu pochodzącego z płytek krwi do trzech do sześciu studzienek jako pozytywną kontrolę w celu stymulacji proliferacji. Następnie dodać PBS do tej samej liczby studzienek, co kontrola ujemna. Inkubować przez 72 godziny.
Rozcieńczyć wcześniej przygotowane pięć milimolowych zapasów EdU do jednego milimola i dodać dwa mikrolitry do każdego dołka przez ostatnie 24 godziny 72-godzinnego okresu hodowli. Zachowaj jeden zestaw powtórzeń bez EdU, aby określić fluorescencję tła i luminescencję. Dwadzieścia cztery godziny później napraw komórki, usuwając pożywkę, a następnie dodając 150 mikrolitrów na studzienkę 4% paraformaldehydu i inkubuj 10 minut w temperaturze pokojowej.
Usuń paraformaldehyd i dodaj 150 mikrolitrów 1%TX-100 do wody na studzienkę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Umyj trzy razy PBS, aby usunąć TX-100. Aby wykryć włączony EdU za pomocą fluorescencji, należy przygotować 10 mililitrów roztworu do znakowania na 96-dołkową płytkę tuż przed użyciem, dodając odczynniki z roztworów podstawowych w odpowiedniej kolejności: 20 mikrolitrów THPTA, 20 mikrolitrów siarczanu miedzi, pięć mikrolitrów pikolylo-azydku fluoresceiny i 100 mikrolitrów askorbinianu sodu do PBS, co daje łączną objętość 10 mililitrów.
Najważniejszym krokiem jest wykonanie rozwiązania do etykietowania tuż przed użyciem. Usunąć PBS ze studzienek, dodać 150 mikrolitrów roztworu do etykietowania do każdej studzienki i inkubować 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby wykryć wszystkie jądra, dodaj DAPI do każdej studzienki i zobrazuj na mikroskopie fluorescencyjnym lub czytniku płytek obrazowych.
Aby uniknąć ręcznego liczenia i gdy czytnik płytek obrazowych nie jest dostępny, protokół ten można zmodyfikować do odczytu luminescencji przy użyciu azydku HRP i podłoża ELISA. Aby wykryć EdU za pomocą luminescencji, najpierw przygotuj tris-buforowaną sól fizjologiczną z 0,1% polisorbatem 20. Następnie dodaj 150 mikrolitrów buforu blokującego do każdej studzienki i inkubuj przez 90 minut w temperaturze pokojowej.
Po usunięciu buforu blokującego przemyć komórki trzykrotnie 200 mikrolitrami PBS. Aby wykryć wbudowaną EdU, najpierw przygotuj 10 mililitrów roztworu do etykietowania na płytkę 96-dołkową, dodając odczynniki z roztworów podstawowych w odpowiedniej kolejności. Najpierw 20 mikrolitrów THPTA, następnie 20 mikrolitrów siarczanu miedzi, pięć mikrolitrów biotyny pikolylo-azydku, 100 mikrolitrów askorbinianu sodu do PBS na łączną objętość 10 mililitrów.
Umyj studzienki pięć razy po trzy minuty 200 mikrolitrami TBST z potrząsaniem. Ugasić endogenne peroksydazy 150 mikrolitrami 0,3% nadtlenku wodoru przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po usunięciu nadtlenku wodoru przemyć pięć razy po trzy minuty 200 mikrolitrami TBST z potrząsaniem.
Dodaj 50 mikrolitrów rozcieńczonej peroksydazy streptawidynowo-chrzanowej w TBST do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę. Umyć pięć razy po trzy minuty 200 mikrolitrami TBST z potrząsaniem. Dodać 50 mikrolitrów chemiluminescencyjnego podłoża ELISA do każdej studzienki i natychmiast odczytać w czytniku płytek zdolnym do wykrywania luminescencji.
Chociaż jądra fluorescencyjne mogą być wykrywane przez standardowy czytnik płytek fluorescencyjnych, przy użyciu protokołu luminescencji, skan fluorescencyjny jest przekształcany w jednorodny odczyt cieczy wykrywany za pomocą peroksydazy streptawidynowo-chrzanowej i standardowego substratu ELISA. Zaletą tej metody w porównaniu z odczytem fluorescencyjnym jest bardziej jednorodny odczyt, a płytkę można odczytać w ciągu kilku sekund, jak pokazano tutaj, gdy mierzono proliferację VSMC w odpowiedzi na PDGF. Wadą jest to, że tło jest wyższe niż w przypadku fluorescencji, dlatego kontrole ujemne są zwykle wyższe.
Próbując zmniejszyć zmienność, wyniki znormalizowano do początkowej liczby komórek. Jednak w osobnym zestawie eksperymentów wykazano, że metoda ta nie jest wystarczająco czuła, aby wykryć niewielkie różnice w liczbie komórek. Najbardziej wydajnym i dokładnym sposobem liczenia dodatnich i całkowitych komórek EdU jest użycie czytnika płytek obrazowych.
Jeśli ten typ czytnika płytek nie jest dostępny, ręczne liczenie również przyniesie dokładne wyniki. Porównując te dwie metody, dodatnie liczenie ręczne EdU było identyczne z liczeniem automatycznym, podobnie jak całkowite zliczanie bez stymulacji. Zaletą tych dwóch metod jest widoczność komórek, które mają być policzone, lepsza dokładność oraz to, że można zobaczyć niespecyficzne barwienie zanieczyszczeń i uniknąć go.
Główną wadą ręcznej metody liczenia jest czas. Pamiętaj, aby roztwór do etykietowania był świeży tuż przed użyciem i dodawać składniki w kolejności podanej w pisemnym protokole. Jeśli intensywność barwienia jest niska, spróbuj dostosować stosunek chelatora do miedzi.
Pamiętaj, że paraformaldehyd jest toksyczny. Powinien być używany w dygestorium w rękawiczkach. Sama procedura nie jest trudna, ale może wymagać optymalizacji poprzez dostosowanie proporcji chelatora do miedzi w roztworze do etykietowania.
Ponadto czas inkubacji i długość leczenia EdU można dostosować w zależności od typu komórki i konkretnego zadawanego pytania. Technika ta jest zgodna z barwieniem powierzchni komórek i wewnątrzkomórkowym, dzięki czemu można określić charakterystykę komórek dzielących się i niedzielących. Chociaż chemia kliknięć jest powszechnie stosowana do pomiaru proliferacji, może być również stosowana do metabolicznego znakowania RNA, białek, kwasów tłuszczowych i węglowodanów.
Jeśli interesujący nas cel metaboliczny znajduje się na powierzchni komórki, żywe komórki można oznaczyć.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia czuły i niskokosztowy test proliferacji, który eliminuje konieczność stosowania agresywnych zabiegów oraz substancji radioaktywnych, umożliwiając badaczom pomiar proliferacji zarówno w komórkach adherentnych, jak i nieadherentnych. Metoda ta wykorzystuje chemię klikalną z użyciem EdU do wizualizacji podziałów komórkowych, co wspomaga oceny toksykologiczne nowych leków.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Biologia komórki
- Ocena toksyczności nowych leków
- Techniki pomiaru proliferacji
Wstęp
- Proliferacja jest powszechnie stosowanym testem w biologii komórki.
- Istniejące metody mogą wymagać użycia kosztownych zestawów oraz bardziej agresywnych zabiegów.
- Celem niniejszego badania jest przedstawienie wszechstronnego i prostego rozwiązania.
Zastosowane metody
- Zastosowanie EdU do pomiaru proliferacji
- Wykorzystanie komórek mięśni gładkich naczyń (VSMCs)
- Fluorescencyjne i luminescencyjne metody detekcji
Główne wyniki
- Test skutecznie wykrywa wbudowywanie EdU w dzielących się komórkach.
- Kontrole pozytywne i negatywne walidują odpowiedź proliferacyjną na bodźce.
- Metoda zapewnia ilościowy pomiar podziałów komórkowych.
Wnioski
- Technika ta oferuje kosztowo efektywne podejście do testów proliferacji.
- Zwiększa ona możliwość badania odpowiedzi komórkowych w badaniach biologicznych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Pomiar proliferacji komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych za pomocą wbudowywania EdU i chemii kliknięć zapewnia ekonomiczną, nieradiacyjną metodę oceny odpowiedzi komórkowych na bodźce mitogenne. Podejście to wspiera walidację celów w procesie odkrywania leków sercowo-naczyniowych, umożliwiając ilościowe odczyty szlaków proliferacyjnych. Kompatybilność testu z detekcją fluorescencyjną i luminescencyjną pozwala na jego integrację z różnymi procesami przesiewowymi, zwiększając pewność prognostyczną w wczesnych badaniach mechanistycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie proliferacyjnych szlaków sygnalizacyjnych w komórkach mięśni gładkich naczyń, co wspiera testowanie hipotez dotyczących celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Pozwala uniknąć stosowania radioaktywności i agresywnych metod traktowania, zachowując integralność komórek do późniejszych analiz funkcjonalnych.
- Wartość prognostyczna: Zapewnia bezpośredni pomiar syntezy DNA, zwiększając pewność co do zaangażowania celu i modulacji szlaku.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe dane dotyczące proliferacji za pomocą odczytów fluorescencyjnych lub luminescencyjnych, co umożliwia analizę zależności dawka-odpowiedź dla związków takich jak PDGF.
- Wartość operacyjna: Kompatybilność z formatami płytek 96-dołkowych i standardowymi czytnikami płytek wspiera przesiewy o średniej przepustowości.
- Gotowość testu: Wykrywanie wbudowania EdU za pomocą chemii klikowej pozwala na multipleksowanie z markerami powierzchniowymi lub wewnątrzkomórkowymi w celu odróżnienia komórek dzielących się od niedzielących się.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Proliferacja mięśni gładkich naczyń jest kluczowym procesem w restenozie i nadciśnieniu, co wiąże wyniki analizy z mechanizmami istotnymi dla przebiegu choroby.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia ocenę wpływu związków na odpowiedzi proliferacyjne, wspierając decyzje typu go/no-go w modelach przedklinicznych.
- Zgodność z biomarkerami: Metryki proliferacji mogą korelować z translacyjnymi biomarkerami przebudowy naczyniowej i tworzenia się neointimy.
Integracja potoków i przepływów pracy
Test ten wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po optymalizację wiodącej cząsteczki, szczególnie w obszarze chorób układu sercowo-naczyniowego oraz chorób proliferacyjnych. Wspiera on przesiewy oparte na hipotezach, wiążąc działanie związku z mierzalnymi zmianami w syntezie DNA. Możliwość dostosowania metody do odczytów fluorescencyjnych lub luminescencyjnych pozwala na jej zastosowanie w różnych infrastrukturach laboratoryjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez pomiar wbudowywania EdU w odpowiedzi na czynniki wzrostu lub modulatory farmakologiczne.
- Przesiewanie: Umożliwia ustandaryzowane, powtarzalne ilościowe określanie odpowiedzi proliferacyjnych w komórkach mięśni gładkich naczyń.
- Analityka: Generuje ilościowe odczyty (intensywność fluorescencji lub luminescencji), które umożliwiają porównanie statystyczne między różnymi warunkami eksperymentalnymi.
- Badania translacyjne: Odnosi się do przedklinicznych modeli patologii naczyniowej, w których proliferacja mięśni gładkich napędza progresję choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oznakowanie EdU oparte na chemii klik jest platformą wielokrotnego użytku, którą można zastosować do wielu typów komórek oraz do śledzenia metabolitów poza samą proliferacją.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Bezpośrednia detekcja syntezy DNA zmniejsza zależność od pośrednich wskaźników proliferacji, zwiększając przejrzystość mechanizmów.
- Wartość operacyjna: Eliminuje konieczność stosowania izotopów promieniotwórczych lub gotowych zestawów komercyjnych, redukując koszty i wymogi bezpieczeństwa.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie wiarygodnych, ilościowych danych na temat proliferacji komórkowej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków celujących w szlaki proliferacyjne w chorobach układu sercowo-naczyniowego z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu hodowli komórkowych, obsługi chemii klik (click chemistry) oraz detekcji fluorescencyjnej i luminescencyjnej.
- Niezbędny jest dostęp do roztworów zapasowych EdU, siarczanu miedzi, THPTA, barwników sprzężonych z azydkiem oraz czytników płytek z możliwością pomiaru fluorescencji lub luminescencji.
- Standaryzacja między zespołami wymaga zachowania spójnego czasu impulsu EdU, warunków fiksacji oraz czasu przygotowania roztworu do znakowania.
- Adaptacja do różnych typów komórek może wymagać optymalizacji stężenia EdU, czasu inkubacji oraz warunków permeabilizacji.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wyższe tło w odczytach luminescencyjnych oraz konieczność przygotowania świeżego roztworu do znakowania w celu zapewnienia spójności sygnału.
Najczęściej zadawane pytania z zakresu biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:30
Vascular Smooth Muscle Cell Labelling with EdU and Fixing with PFA
1:53
Detection of EdU Using Fluorescence
2:50
Detection of EdU Using Luminescence
4:40
Results: Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Measurements
6:06
Conclusion
![Opracowanie i charakterystyka sieci mikronaczyń in vitro oraz pomiary ilościowe produkcji śródbłonka [Ca2+]i i tlenku azotu](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F54014.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A18.166Z&w=384&q=75)
