Name: Pomiar proliferacji komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych za pomocą chemii Click (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Poznaj metodę pomiaru proliferacji komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych za pomocą chemii Click z wykorzystaniem EdU. Ta technika oferuje czuły, niedrogi i nietoksyczny sposób badania podziału komórkowego bez użycia promieniowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Katie Carroll za pomoc techniczną. Dziękujemy również dr Davidowi Cool i Laboratorium Analiz Proteomicznych za instrukcje i udostępnienie czytnika płytek obrazowych Cytation. Praca ta była wspierana przez grant Wright State Foundation (dla L.E.W.).

1. Wykrywanie EdU za pomocą etykiety fluorescencyjnej
<ol>
	<li>Roztwory podstawowe
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy EdU o stężeniu 5 mM, dodając 12,5 mg EdU do 10 ml podwójnie destylowanegoH2O.</li>
		<li>Przygotować składniki roztworu do znakowania: 200 mM tris(3-hydroksypropylotriolilometylometylo)aminy (THPTA) (100 mg w 1,15 ml H2O), 100 mM CuSO4 (15,95 mg w 1 ml H2O; przygotować świeże), 10 mM Cy3 pikolilo-azydku (1 mg w 95,3 ml H2O, przechowywany w 5 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C), i 1 M askorbinian sodu (200 mg w 1 ml H2O; świeży).</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy rezazuryny o stężeniu 0,15 mg/ml. Przefiltrować, wysterylizować i przechowywać 1 ml porcji w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Azydek pikolilu jest dostępny w połączeniu z kilkoma różnymi fluorami, biotyną i peroksydazą chrzanową (HRP).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznacz komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) za pomocą EdU. 
	UWAGA: Ludzkie VSMC wyizolowano z tętnic biodrowych poprzez wyrostek z eksplantowanych kawałków tkanki. Hodowane w pożywce wolnej od surowicy z insuliną, transferyną, selenem, komórki te wyrażają markery VSMC: smoothelinę, łańcuch ciężki miozyny mięśni gładkich (SM-MHC) i SMC αaktynę13.
	<ol>
		<li>Płytki komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych w 2 x 104/ml w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco w 96-dołkowej płytce. 
		UWAGA: Komórki hoduje się w temperaturze 37 °C w pożywce z komórkami mięśni gładkich z 2% płodową surowicą bydlęcą.</li>
		<li>(Opcjonalnie) Odczekaj kilka godzin do nocy, aby upewnić się, że przestrzega się zaleceń. Dodaj 20 μl bulionu rezazurynowego do każdego dołka. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny. Odczyt sygnału fluorescencji w czytniku płytek (560ex, 594em). Zastąp nośnik nowym DMEM. 
		UWAGA: Ten krok jest opcjonalny. Rezazuryna jest używana do normalizacji liczby komórek i uwzględniania zmienności między źródłami w posiewie14.</li>
		<li>Dodać buforowaną fosforanem sól fizjologiczną (PBS) lub płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF) 30 ng / ml do 3-6 dołków na zabieg na początku okresu hodowli i inkubować przez 72 godziny.</li>
		<li>Rozcieńczyć materiał EdU 5 mM do 1 mM. Dodać 2 μl do każdego dołka (końcowe stężenie 20 μM) przez ostatnie 24 godziny 72-godzinnego okresu hodowli. Nie należy dodawać EdU do jednego zestawu powtórzeń. Studnie te zostaną wykorzystane do wyznaczenia fluorescencji/luminescencji tła. 
		UWAGA: Czas trwania hodowli i znakowania za pomocą EdU jest zoptymalizowany dla komórek mięśni gładkich, ale może wymagać modyfikacji w zależności od typu komórki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwal komórki w paraformaldehydzie (PFA).
	<ol>
		<li>Usuń pożywkę i dodaj 150 μl 4% PFA (w PBS) na studzienkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usuń PFA i dodaj 150 μl 1% eteru tert-oktylofenylowego glikolu polietylenowego (TX-100) (w wodzie) do studzienki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usuń TX-100, myjąc go trzykrotnie PBS. 
		UWAGA: PFA jest toksyczny, należy obchodzić się z nim ostrożnie. 
		UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Stałe komórki mogą być przechowywane w PBS w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykryj wbudowany EdU.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór do etykietowania (10 ml na płytkę 96-dołkową, używając wewnętrznych 60 dołków) tuż przed użyciem, dodając odczynniki z roztworów podstawowych w następującej kolejności: THPTA 20 μL, CuSO4 20 μL, Cy3 azydek pikolylu 5 μL, Askorbinian Na 100 μL do PBS dla całkowitej objętości 10 ml.</li>
		<li>Usunąć PBS ze studzienek i dodać 150 μl roztworu do etykietowania do każdej studzienki. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Aby wykryć wszystkie jądra, dodaj 4′,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) do każdego dołka. Odczyt na czytniku płytek fluorescencyjnych (Cy3 550ex, 570em; DAPI 350ex, 470em) lub obraz pod mikroskopem. 
		UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Utrwalone i wybarwione komórki mogą być przechowywane w PBS w temperaturze 4 °C i obrazowane w późniejszym czasie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wykrywanie EdU za pomocą luminescencji
<ol>
	<li>Proszę wypełnić sekcje 1.1–1.3.</li>
	<li>Przygotować sól fizjologiczną buforowaną trisem z 0,1% polisorbatem 20 (TBST).</li>
	<li>Studnie blokowe.
	<ol>
		<li>Dodać 150 μl buforu blokującego (tabela materiałów) do każdego dołka i inkubować przez 90 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usunąć bufor blokujący i przemyć trzykrotnie 200 μl PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykryj wbudowany EdU.
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór do etykietowania zgodnie z zaleceniami w kroku 1.4.1, zastępując azydek pikolylu biotyny azydkiem pikolylu Cy3</li>.
		<li>Przemyć studzienki pięć razy 200 μl TBST, wstrząsając, 3 minuty na mycie.</li>
		<li>Ugasić endogenne peroksydazy 150 μl 0,3%H2O2przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>UsunąćH2O2i przemyć pięć razy 200 μl TBST, wstrząsając przez 3 minuty na pranie.</li>
		<li>Rozcieńczyć peroksydazę streptawidynowo-chrzanową (SA-HRP; 1:200) w TBST i dodać 50 μl do każdej studzienki. Inkubować 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyć pięć razy 200 μl TBST, wstrząsając, 3 minuty na pranie.</li>
		<li>Dodać 50 μl substratu do testu immunoenzymatycznego (ELISA) (tabela materiałów) do każdego dołka.</li>
		<li>Odczyt natychmiastowy w czytniku płytek zdolny do wykrywania luminescencji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+proliferation+in+atherosclerosis%3A+Insights+from+animal+models+and+human+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies.</a> Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).</li>
<li>Zhu, J., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+cell+growth+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of cell growth and proliferation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).</li>
<li>Cizek, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+for+atherosclerosis+and+the+development+of+preatherosclerotic+intimal+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+pathology+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Risk factors for atherosclerosis and the development of preatherosclerotic intimal hyperplasia.</a> Cardiovascular pathology the Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 16 (6), 344-350 (2007).</li>
<li>Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+techniques+made+simple%3A+Techniques+to+assess+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation.</a> Journal of Investigative Dermatology. 136, e1-e7 (2016).</li>
<li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+%28CFSE%29+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).</li>
<li>Sletten, E., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+Chemistry%3A+Fishing+for+Selectivity+in+a+Sea+of+Functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).</li>
<li>Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Cell+Cycle+Position+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).</li>
<li>Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry+for+Analysis+of+Cell+Proliferation+in+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).</li>
<li>Jiang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+dynamic+glycosylation+in+vivo+using+supersensitive+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).</li>
<li>Izquierdo, E., Delgado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+chemistry+in+sphingolipid+research%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Click chemistry in sphingolipid research.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 215, 71-83 (2018).</li>
<li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo+by+using+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).</li>
<li>Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+Live+Cells+by+Copper-Catalyzed+Alkyne-Azide+Click+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).</li>
<li>Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+Functional+IL-2+Receptor+in+Vascular+Smooth+Muscle+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells.</a> The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).</li>
<li>Stoddart, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStoddart%2C+MJ+%22Mammalian+cell+viability%3A+methods+and+protocols%22">Mammalian cell viability: methods and protocols</a>. , Humana Press. New York, NY. (2011).</li>
<li>Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+Cell-compatible+Click+Chemistry+with+Copper-chelating+Azides+for+Biomolecular+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling.</a> Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).</li>
<li>Bescancy-Webler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raising+the+Efficacy+of+Bioorthogonal+Click+Reactions+for+Bioconjugation%3A+A+Comparative+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte.+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study.</a> Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).</li>
<li>Diermeier-Daucher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+specific+applicability+of+5-ethynyl-2%E2%80%B2-deoxyuridine+%28EDU%29+for+dynamic+proliferation+assessment+in+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).</li>
<li>Cieślar-Pobuda, A., Los, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospects+and+limitations+of+%E2%80%9CClick-Chemistry%E2%80%9D-based+DNA+labeling+technique+employing+5-ethynyl-2%E2%80%B2deoxyuridine+%28EdU%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Prospects and limitations of “Click-Chemistry”-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2′deoxyuridine (EdU).</a> Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Włączenie EdU to prosty, nieskomplikowany sposób pomiaru proliferacji komórek; Jest szczególnie przydatny w przypadku komórek adherentnych13. Nasz protokół wykorzystuje komórki mięśni gładkich, ale ma zastosowanie do każdej przylegającej komórki (nabłonkowej, śródbłonka itp.). Chociaż protokół nie jest skomplikowany, jedynym krytycznym krokiem jest przygotowanie rozwiązania do etykietowania — składniki muszą być dodawane w podanej kolejności. Ponadto, podobnie jak w przypadku chemiluminescencyjnyc...

Proliferacja jest kluczowym elementem funkcji komórkowej1,2. Kontrola proliferacji wpływa na normalne procesy, takie jak rozwój, i procesy patologiczne, takie jak rak i choroby układu krążenia. Na przykład hiperplastyczny wzrost komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych jest uważany za prekursor miażdżycy3. Zmiany w proliferacji komórek są również wykorzystywane do oceny potencjalnej toksyczności nowych leków. Biorąc pod uwagę jego szeroki wpływ, pomiar proliferacji jest podstawą wielu laboratoriów opartych na biologii komórki.
Proliferacja komórek może być mierzona poprzez proste liczenie komórek, jeśli interesująca nas populacja komórek dzieli się dość szybko. W przypadku wolniej rosnących komórek liczba komórek może być mniej wrażliwa. Proliferacja jest często mierzona przez włączenie znakowanych analogów nukleozydów. Chociaż złotym standardem jest inkorporacja 3H-tymidyny, wiele laboratoriów odchodzi od tej metody, biorąc pod uwagę dostępność nowszych, nieradioaktywnych alternatyw. Należą do nich cytoplazmatyczne barwniki fluorescencyjne, wykrywanie białek związanych z cyklem komórkowym oraz włączanie nieradioaktywnych analogów nukleozydów, takich jak 5-bromo-2' deoksyurydyna (BrdU) i 5-etynylo-2′-deoksyurydyna (EdU)4.
Barwniki cytoplazmatyczne, takie jak ester sukcynimidylowy dioctanu karboksyfluoresceiny (CFSE), wykrywają proliferację, ponieważ intensywność barwnika zmniejsza się o połowę za każdym razem, gdy komórka się dzieli5. Technika ta jest powszechnie stosowana w cytometrii przepływowej dla komórek nieprzylegających. Nie był on często stosowany w przypadku komórek przylegających, ale dzięki nowej generacji czytników płytek obrazowych może się to zmienić. Wykrywanie białek związanych z cyklem komórkowym za pomocą technik opartych na przeciwciałach (cytometria przepływowa, immunohistochemia itp.) jest często stosowane w przypadku tkanek lub komórek nieprzylegających. Te komórki/tkanki muszą być utrwalone i przepuszczalne przed barwieniem. Analogi nukleozydów BrdU i EdU są podobne w podejściu do 3H-tymidyny, ale bez niedogodności związanych z radioaktywnością. Włączenie BrdU jest wykrywane przez przeciwciała anty-BrdU, dlatego komórki muszą być utrwalone i przepuszczalne przed barwieniem. Ponadto komórki muszą być traktowane DNazą, aby odsłonić epitop BrdU.
Włączenie EdU jest wykrywane przez chemię kliknięć, w której grupy alkinowe i azydkowe "klikają" razem w obecności katalitycznej miedzi. Każda grupa może służyć jako cząsteczka inkorporowana biosyntetycznie lub cząsteczka wykrywająca4. Dostępne na rynku analogi nukleozydów mają przyłączoną grupę alkinową. Dlatego w testach proliferacji funkcjonalizowany alkinem analog nukleozydu jest wykrywany przez azydek sprzężony z barwnikiem fluorescencyjnym lub innym markerem. Włączenie EdU ma kilka zalet w porównaniu z BrdU. Po pierwsze, ponieważ grupy alkinowe i azydkowe nie występują w komórkach ssaków, ta interakcja jest wysoce specyficzna z niskim tłem6. Ponieważ obie grupy są małe, komórki nie muszą przechodzić denaturacji DNA, aby odsłonić analog nukleozydu, jak jest to wymagane dla BrdU7. Wreszcie, chemia kliknięć jest bardzo wszechstronna i może być używana do metabolicznego znakowania DNA, RNA, białka, kwasów tłuszczowych i węglowodanów8,9,10,11. Jeśli metabolicznie oznaczony cel zainteresowania znajduje się na powierzchni komórki, żywe komórki mogą być oznaczone jako 12. Ponadto komórki mogą być dalej przetwarzane w celu barwienia immunofluorescencyjnego przeciwciałami.
Poniższy protokół opisuje wykorzystanie inkorporacji EdU i chemii kliknięć do pomiaru proliferacji w ludzkich komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Pokazujemy trzy różne sposoby pomiaru inkorporacji EdU, reprezentatywne wyniki z każdego z nich oraz ich zalety i wady. Pomiar proliferacji za pomocą chemii kliknięć jest szczególnie przydatny w przypadku przylegających, wolniej rosnących komórek. Ponadto morfologia komórki jest dobrze zachowana i można również przeprowadzić barwienie na podstawie przeciwciał.

<table><tbody><tr><td>5-etynylo-2'-deoksyurydyna</td><td>Karbosynter</td><td>NE08701</td><td></td></tr><tr><td>biotyna azydek pikolylu</td><td>Kliknij Narzędzia chemiczne</td><td>1167-5</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>C1297-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 azydek pikolylu</td><td>Click Narzędzia chemiczne</td><td>1178-1</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek cytacyjnych Mikroskop</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EVOS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór nadtlenku wodoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>Na askorbinian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11140-250G</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Fixed Cell Stain Ready Sondy</td><td>Invitrogen</td><td>R37606</td><td>DAPI Nuclear Stain</td></tr><tr><td>Odyssey</td><td>Blocking Buffer</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Li-Cor 927-40000</td><td>Usługi mikroskopii elektronowej</td> paraformaldehydu <td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma Life Science</td><td>S3014-5kg</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna Sprzężona peroksydaza chrzanowa</td> Life <td>Technologies</td><td>S911</td><td></td></tr><tr><td>Super Signal ELISA Femto</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI137075</td><td>Podłoże ELISA</td></tr><tr><td>Synergy Plate Reader</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>THPTA</td><td>Click Narzędzia chemiczne</td><td>1010-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris Chlorowodorek hydroksymetyloaminometanu (Tris-HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Bio-Rad</td><td>1610407</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar proliferacji komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych za pomocą chemii click

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

Zdolność komórki do proliferacji jest integralną częścią normalnego funkcjonowania większości komórek, a rozregulowanie proliferacji jest sercem wielu procesów chorobowych. Z tych powodów pomiar proliferacji jest powszechnym narzędziem stosowanym do oceny funkcji komórek. Proliferację komórek można zmierzyć po prostu przez liczenie; Jest to jednak pośredni sposób pomiaru proliferacji. Jednym z powszechnych sposobów bezpośredniego wykrywania komórek przygotowujących się do podziału jest włączenie znakowanych analogów nukleozydów. Należą do nich radioaktywny analog nukleozydu 3H-tymidyna oraz nieradioaktywne analogi nukleozydów, takie jak 5-bromo-2' deoksyurydyna (BrdU) i 5-etynylo-2′-deoksyurydyna (EdU). Włączenie EdU jest wykrywane przez chemię kliknięć, która ma kilka zalet w porównaniu z BrdU. W tym raporcie przedstawiamy protokół pomiaru proliferacji przez włączenie EdU. Protokół ten zawiera opcje różnych odczytów, wraz z zaletami i wadami każdego z nich. Omawiamy również miejsca, w których protokół może zostać zoptymalizowany lub zmieniony w celu spełnienia konkretnych potrzeb planowanego eksperymentu. Na koniec poruszamy kwestię sposobów, w jakie ten podstawowy protokół może być modyfikowany w celu pomiaru innych metabolitów komórkowych.

W Rycina 2wykazujemy wyniki trzech różnych eksperymentów mierzących proliferację VSMC w odpowiedzi na PDGF. Po hodowli komórek w pożywce sformułowanej dla SMC, przeprowadziliśmy eksperyment w bezzserwatkowym DMEM, aby wyeliminować potencjalny wpływ surowicy lub czynników wzrostu na proliferację. W Rycina 2A porównujemy wyniki z tego samego eksperymentu, stosując odczyt fluorescencyjny oraz luminescencyjny. Do odczytu płytek wykorzystaliśmy multimodalny czytnik m...

Proliferacja jest kluczowym elementem funkcji komórkowej i powszechnym odczytem używanym do oceny potencjalnej toksyczności nowych leków. Pomiar proliferacji jest zatem często stosowanym testem w biologii komórki. Poniżej przedstawiamy prostą, wszechstronną metodę pomiaru proliferacji, którą można zastosować w komórkach adherentnych i nieadherentnych.

Pomiar proliferacji komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych za pomocą chemii Click

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

Proliferacja jest ważną miarą funkcji komórek. Protokół ten pozwala badaczom na opracowanie czułego testu proliferacji w swoich laboratoriach bez wysokich kosztów dostępnych na rynku zestawów. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala uniknąć surowego traktowania komórek i/lub stosowania radioaktywności.Tę technikę zademonstruje Vicky Wong, kierowniczka mojego laboratorium. Aby oznaczyć proliferację, usuń komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych z kolby z pożywką dla komórek mięśni gładkich w 2% płodowej surowicy bydlęcej i płytce w ilości 20 000 komórek na mililitr w DMEM na 96-dołkowej płytce. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.Dodaj 30 nanogramów na mililitr czynnika wzrostu pochodzącego z płytek krwi do trzech do sześciu studzienek jako pozytywną kontrolę w celu stymulacji proliferacji. Następnie dodać PBS do tej samej liczby studzienek, co kontrola ujemna. Inkubować przez 72 godziny.Rozcieńczyć wcześniej przygotowane pięć milimolowych zapasów EdU do jednego milimola i dodać dwa mikrolitry do każdego dołka przez ostatnie 24 godziny 72-godzinnego okresu hodowli. Zachowaj jeden zestaw powtórzeń bez EdU, aby określić fluorescencję tła i luminescencję. Dwadzieścia cztery godziny później napraw komórki, usuwając pożywkę, a następnie dodając 150 mikrolitrów na studzienkę 4% paraformaldehydu i inkubuj 10 minut w temperaturze pokojowej.Usuń paraformaldehyd i dodaj 150 mikrolitrów 1%TX-100 do wody na studzienkę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Umyj trzy razy PBS, aby usunąć TX-100. Aby wykryć włączony EdU za pomocą fluorescencji, należy przygotować 10 mililitrów roztworu do znakowania na 96-dołkową płytkę tuż przed użyciem, dodając odczynniki z roztworów podstawowych w odpowiedniej kolejności: 20 mikrolitrów THPTA, 20 mikrolitrów siarczanu miedzi, pięć mikrolitrów pikolylo-azydku fluoresceiny i 100 mikrolitrów askorbinianu sodu do PBS, co daje łączną objętość 10 mililitrów.Najważniejszym krokiem jest wykonanie rozwiązania do etykietowania tuż przed użyciem. Usunąć PBS ze studzienek, dodać 150 mikrolitrów roztworu do etykietowania do każdej studzienki i inkubować 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby wykryć wszystkie jądra, dodaj DAPI do każdej studzienki i zobrazuj na mikroskopie fluorescencyjnym lub czytniku płytek obrazowych.Aby uniknąć ręcznego liczenia i gdy czytnik płytek obrazowych nie jest dostępny, protokół ten można zmodyfikować do odczytu luminescencji przy użyciu azydku HRP i podłoża ELISA. Aby wykryć EdU za pomocą luminescencji, najpierw przygotuj tris-buforowaną sól fizjologiczną z 0,1% polisorbatem 20. Następnie dodaj 150 mikrolitrów buforu blokującego do każdej studzienki i inkubuj przez 90 minut w temperaturze pokojowej.Po usunięciu buforu blokującego przemyć komórki trzykrotnie 200 mikrolitrami PBS. Aby wykryć wbudowaną EdU, najpierw przygotuj 10 mililitrów roztworu do etykietowania na płytkę 96-dołkową, dodając odczynniki z roztworów podstawowych w odpowiedniej kolejności. Najpierw 20 mikrolitrów THPTA, następnie 20 mikrolitrów siarczanu miedzi, pięć mikrolitrów biotyny pikolylo-azydku, 100 mikrolitrów askorbinianu sodu do PBS na łączną objętość 10 mililitrów.Umyj studzienki pięć razy po trzy minuty 200 mikrolitrami TBST z potrząsaniem. Ugasić endogenne peroksydazy 150 mikrolitrami 0,3% nadtlenku wodoru przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po usunięciu nadtlenku wodoru przemyć pięć razy po trzy minuty 200 mikrolitrami TBST z potrząsaniem.Dodaj 50 mikrolitrów rozcieńczonej peroksydazy streptawidynowo-chrzanowej w TBST do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę. Umyć pięć razy po trzy minuty 200 mikrolitrami TBST z potrząsaniem. Dodać 50 mikrolitrów chemiluminescencyjnego podłoża ELISA do każdej studzienki i natychmiast odczytać w czytniku płytek zdolnym do wykrywania luminescencji.Chociaż jądra fluorescencyjne mogą być wykrywane przez standardowy czytnik płytek fluorescencyjnych, przy użyciu protokołu luminescencji, skan fluorescencyjny jest przekształcany w jednorodny odczyt cieczy wykrywany za pomocą peroksydazy streptawidynowo-chrzanowej i standardowego substratu ELISA. Zaletą tej metody w porównaniu z odczytem fluorescencyjnym jest bardziej jednorodny odczyt, a płytkę można odczytać w ciągu kilku sekund, jak pokazano tutaj, gdy mierzono proliferację VSMC w odpowiedzi na PDGF. Wadą jest to, że tło jest wyższe niż w przypadku fluorescencji, dlatego kontrole ujemne są zwykle wyższe.Próbując zmniejszyć zmienność, wyniki znormalizowano do początkowej liczby komórek. Jednak w osobnym zestawie eksperymentów wykazano, że metoda ta nie jest wystarczająco czuła, aby wykryć niewielkie różnice w liczbie komórek. Najbardziej wydajnym i dokładnym sposobem liczenia dodatnich i całkowitych komórek EdU jest użycie czytnika płytek obrazowych.Jeśli ten typ czytnika płytek nie jest dostępny, ręczne liczenie również przyniesie dokładne wyniki. Porównując te dwie metody, dodatnie liczenie ręczne EdU było identyczne z liczeniem automatycznym, podobnie jak całkowite zliczanie bez stymulacji. Zaletą tych dwóch metod jest widoczność komórek, które mają być policzone, lepsza dokładność oraz to, że można zobaczyć niespecyficzne barwienie zanieczyszczeń i uniknąć go.Główną wadą ręcznej metody liczenia jest czas. Pamiętaj, aby roztwór do etykietowania był świeży tuż przed użyciem i dodawać składniki w kolejności podanej w pisemnym protokole. Jeśli intensywność barwienia jest niska, spróbuj dostosować stosunek chelatora do miedzi.Pamiętaj, że paraformaldehyd jest toksyczny. Powinien być używany w dygestorium w rękawiczkach. Sama procedura nie jest trudna, ale może wymagać optymalizacji poprzez dostosowanie proporcji chelatora do miedzi w roztworze do etykietowania.Ponadto czas inkubacji i długość leczenia EdU można dostosować w zależności od typu komórki i konkretnego zadawanego pytania. Technika ta jest zgodna z barwieniem powierzchni komórek i wewnątrzkomórkowym, dzięki czemu można określić charakterystykę komórek dzielących się i niedzielących. Chociaż chemia kliknięć jest powszechnie stosowana do pomiaru proliferacji, może być również stosowana do metabolicznego znakowania RNA, białek, kwasów tłuszczowych i węglowodanów.Jeśli interesujący nas cel metaboliczny znajduje się na powierzchni komórki, żywe komórki można oznaczyć.

measuring-proliferation-vascular-smooth-muscle-cells-using-click

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje pomiar skurczu komórek mięśni gładkich aorty (SMC) za pomocą wykrywania impedancji elektrycznej komórki-substratu (ECIS). ECIS mierzy lokomocję komórek i jest wiarygodną metodą pomiaru skurczów.

Pomiar skurczu SMC in vitro: nieinwazyjna metoda oceny skurczu komórek mięśni gładkich za pomocą wykrywania impedancji elektrycznego podłoża ogniwa

Ta metoda opisuje użycie chemii kliknięć do pomiaru zmian w transkrypcji komórek gospodarza po zakażeniu wirusem gorączki doliny Rift (RVFV) szczepem MP-12. Wyniki można wizualizować jakościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub uzyskiwać ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej. Ta metoda można dostosować do użytku z innymi wirusami.

Wykorzystanie chemii kliknięć do pomiaru wpływu infekcji wirusowej na syntezę RNA komórki gospodarza

Ten protokół omawia Wykrywanie Impedancji Elektrycznej Komórki, metodę rejestrowania i analizy widma impedancji przylegających komórek do ilościowego określenia przyczepienia, proliferacji, ruchliwości i reakcji komórkowych na bodźce farmakologiczne i toksyczne. Położono nacisk na wykrywanie przepuszczalności śródbłonka oraz ocenę kontaktów komórka-komórka i komórka-substrat.

Wykrywanie impedancji substratu elektrycznego podłoża komórkowego w celu ilościowego określenia proliferacji śródbłonka, funkcji bariery i ruchliwości

Nasz raport opisuje unikalną metodę wizualizacji i analizy interakcji CTC/EC w raku prostaty w warunkach fizjologicznego przepływu.

Metody in vitro Metoda obserwacji interakcji za pośrednictwem selektyny E między krążącymi komórkami nowotworowymi prostaty pochodzącymi od pacjentów a ludzkimi komórkami śródbłonka

Opisujemy test czopa matrigelowego, aby zilustrować potencjał angiogenny puli czynników wydzielanych przez komórki nowotworowe za pomocą dwóch uzupełniających się metod obrazowania, ultradźwięków i endomikroskopii. Matrigel, żel naśladujący macierz zewnątrzkomórkową (ECM), jest wykorzystywany do wprowadzenia gospodarza (myszy) z czynnikami angiogennymi wydzielanymi do kondycjonowanego podłoża (CM).

Monitorowanie funkcjonalności i morfologii układu krwionośnego rekrutowanego przez czynniki wydzielane przez szybko rosnące komórki nowotworowe

Funkcja komórek naczyniowych zależy od aktywności przekaźników wewnątrzkomórkowych.  Opisana jest metoda obrazowania dwufotonowego ex vivo, która umożliwia pomiar wewnątrzkomórkowych poziomów wapnia i tlenku azotu w odpowiedzi na bodźce fizjologiczne i farmakologiczne w poszczególnych komórkach śródbłonka i mięśni gładkich izolowanej aorty.

Obrazowanie dwufotonowe wewnątrzkomórkowego obchodzenia się z Ca2+ i produkcji tlenku azotu w komórkach śródbłonka i mięśni gładkich izolowanej aorty szczurzej

Badanie wczesnej migracji komórek śródbłonka (EEC) jest ważne dla zrozumienia patofizjologii niektórych chorób i potencjalnego zidentyfikowania nowych strategii interwencji terapeutycznej. Poniższy protokół opisuje techniki oceny migracji komórek, które zostały dostosowane do badania EWG.

Ocena migracji komórek śródbłonka po ekspozycji na toksyczne chemikalia

Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) zostały wyhodowane do zbiegu w mikroprzepływowym urządzeniu sieciowym. Zilustrowano połączenie komórkowe śródbłonka i rozkład F-aktyny, a zmiany w wewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia i produkcji tlenku azotu w odpowiedzi na adenozynotrójfosforan (ATP) określono ilościowo w czasie rzeczywistym na poszczególnych poziomach komórek.

Opracowanie i charakterystyka sieci mikronaczyń in vitro oraz pomiary ilościowe produkcji śródbłonka [Ca2+]i i tlenku azotu

Ten manuskrypt przedstawia metodę formowania wtryskowego do inżynierii mikronaczyń, które podsumowują fizjologiczne właściwości śródbłonka. Proces oparty na mikroprzepływach tworzy opatentowane sieci naczyniowe 3D z dostosowanymi warunkami, takimi jak przepływ, skład komórkowy, geometria i gradienty biochemiczne. Opisano proces wytwarzania i przykłady potencjalnych zastosowań.

Mikrowzorowanie i montaż trójwymiarowych mikonaczyń

Przedstawiamy protokół do badania interakcji między ludzkim śródbłonkiem a perycytami u myszy za pomocą wariantu testu angiogenezy z zatyczką żelową macierzy.

In vivo (in vivo) Badanie interakcji śródbłonka człowieka z perycytami za pomocą testu Matrix Gel Plug u myszy

Obecny protokół opisuje przygotowanie i wykorzystanie precyzyjnie wyciętych plastrów płuc myszy do oceny kurczliwości dróg oddechowych i mięśni gładkich tętnic wewnątrzpłucnych w środowisku prawie in vivo.

Wykorzystanie precyzyjnie wyciętego wycinka płuc do badania regulacji skurczowej dróg oddechowych i mięśni gładkich tętnic śródpłucnych

Poznaj metodę pomiaru proliferacji komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych za pomocą chemii Click z wykorzystaniem EdU. Ta technika oferuje czuły, niedrogi i nietoksyczny sposób badania podziału komórkowego bez użycia promieniowania.

Pomiar proliferacji komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych za pomocą chemii Click

Przeglądaj więcej filmów