Name: Wzbogacanie i wykrywanie toksyn Clostridium perfringens w detalicznych próbkach żywności (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Poznaj metodę wzbogacania i wykrywania toksyn Clostridium perfringens w próbkach żywności detalicznej. Protokół eliminuje potrzebę użycia komór beztlenowych, umożliwiając identyfikację toksynotypów B i D.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie nie otrzymało żadnego konkretnego finansowania od sektora publicznego, komercyjnego czy non-profit.

UWAGA: C. perfringens jest uważany za organizm o poziomie zagrożenia bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2). Chociaż nie wszystkie próbki żywności będą zawierały C. perfringens, wszystkie próbki hodowlane powinny być traktowane jako takie. Przez cały czas należy nosić wszystkie odpowiednie środki ostrożności i środki ochrony osobistej (PPE). Odkaż cały materiał przed utylizacją.
1. Przygotuj zmodyfikowane RPM4,15
<ol>
	<li>Połączyć 30 g/l płynnego tioglikolanu, 60 g/l żelatyny, 5 g/l peptonu, 5 g/l glukozy, 5 g/l dwuzasadowego fosforanu potasu, 3 g/l ekstraktu drożdżowego, 1,5 g/l chlorku sodu, 0,5 g/l siarczanu żelazawego w wodzie dejonizowanej, aż do równomiernego rozproszenia. Zazwyczaj wykonujemy partie o pojemności 1 litra.</li>
	<li>Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 15 min.</li>
	<li>Pozostawić do ostygnięcia do temperatury około 40 °C.</li>
	<li>Gdy RPM ostygnie, dodaj D-cykloserynę do końcowego stężenia 440 mg/L. 
	UWAGA: Podstawowe stężenia D-cykloseryny rozpuszczonej w sterylnej wodzie w stężeniu 50 mg/ml mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
	<li>Przenieść aseptycznie 10 ml prędkości obrotowej na minutę do stożkowych probówek o pojemności 15 ml. RPM można przygotowywać partiami i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.</li>
	<li>Przed użyciem rozgrzać obroty do 37 °C.</li>
</ol>
2. Pobieranie próbek i inkubacja RPM
<ol>
	<li>Żywność należy transportować do laboratorium w temperaturze otoczenia w ciągu 1 godziny. Żywność może być transportowana w oryginalnych opakowaniach lub sterylnych pojemnikach. Jeśli nie zostanie to natychmiast przetestowane, żywność może być przechowywana w temperaturze -20 °C do czasu użycia. Zanotuj rodzaj żywności i kraj pochodzenia zgodnie z etykietą na opakowaniu, jeśli jest dostępna, a także wszelkie inne istotne informacje.</li>
	<li>Usuń około 1,0–2,0 g pokarmu i przenieś na sterylną szalkę Petriego lub równoważną. Drobno zmielić sterylną żyletką lub skalpelem.</li>
	<li>Zaszczepić w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Dobrze wymieszaj.
	<ol>
		<li>Aby wybrać komórki wegetatywne, przenieś 5 ml mieszaniny PBS i żywności do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml RPM. Szczelnie dokręć pokrywę.</li>
		<li>Aby wybrać zarodniki, podgrzej pozostałe 5 ml mieszaniny PBS i żywności w temperaturze 85 °C przez 15 minut, a następnie przenieś do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml obr./min. Szczelnie dokręć pokrywę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wiruj i odwróć kultury żywności-RPM, aby zapewnić całkowite wymieszanie.</li>
	<li>Szczelnie zamknij stożkowe rurki i owiń pokrywki folią parafinową lub folią plastikową, aby zapewnić środowisko beztlenowe.</li>
	<li>Inkubować przez noc (ON) w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Następnego ranka zwróć uwagę na zmętnienie lub fermentację w rurach RPM.</li>
</ol>
3. Poszycie "kanapkowe" TSC
<ol>
	<li>Zaszczepić kultury ON RPM w agarze TSC przy użyciu techniki "kanapkowej" (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2) opisanej poniżej.</li>
	<li>Przygotuj agar TSC zgodnie z instrukcjami producenta.
	<ol>
		<li>Przygotować warstwę bazową płytek TSC, przenosząc 10 ml stopionego agaru TSC na sterylne szalki Petriego i pozostawić do zestalenia. Można je przygotować w stanie zaawansowanym i przechowywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem należy upewnić się, że talerze są ogrzane do temperatury pokojowej.</li>
		<li>W przypadku górnej warstwy płytki TSC utrzymuj pozostały stopiony agar TSC w temperaturze 40 °C. 
		UWAGA: Chociaż temperatura topnienia agaru przekracza 85 °C, stopiony agar krzepnie około 32–45 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostrożnie pobrać kultury ON RPM i przenieść 100 μl na bazę agarową TSC. Z powodu fermentacji niektóre kultury mogą być pod presją. Upewnij się, że nosisz wszystkie odpowiednie środki ochrony osobistej.</li>
	<li>Rozprowadź inokulum RPM za pomocą wysterylizowanych szklanych kulek lub rozsiewacza komórek.</li>
	<li>Pozostaw RPM do "wchłonięcia" przez agar TSC przez 5–10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie przenieść 20 ml stopionego agaru TSC o temperaturze 40 °C na płytkę za pomocą pipety serologicznej.</li>
	<li>Załóż pokrywkę szalki Petriego i pozwól, aby agar TSC całkowicie zestalił się w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwrócić szalkę Petriego i inkubować w temperaturze 37 °C ON.</li>
	<li>Jeśli pożądane są seryjne rozcieńczenia, należy przeprowadzić rozcieńczenia kultur ON RPM do świeżego, wstępnie podgrzanego RPM przed inokulacją do agaru TSC.</li>
</ol>
4. Hodowla cząstkowa kolonii redukujących siarczyny
<ol>
	<li>Następnego ranka wyjmij płytki z inkubatora i sprawdź, czy nie rozwijają się bakterie. Bakterie tlenowe mogą być obecne na powierzchni agaru. Bakterie beztlenowe rosną w agarze i są osadzone w agarze . Bakterie redukujące siarczyny zmienią otaczający agar na. Możliwe kolonie C. perfringens będą czarne i osadzone w agarze .</li>
	<li>Podejrzewane kolonie C. perfringens będą dodatnie pod względem redukcji siarczynów i będą wyglądać na czarne, osadzone w agarze . Za pomocą sterylnego, jednorazowego zakraplacza "zerw" czarne kolonie z agaru i przenieś do 10 ml świeżej prędkości obrotowej w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Ważne jest, aby powietrze z zakraplacza zostało usunięte przed przekłuciem agaru.</li>
	<li>Jeśli na powierzchni płytki znajduje się gęsta ilość bakterii tlenowych, użyj sterylnego skrobaka do komórek, aby usunąć kolonie z wybranych obszarów. Z wielu kolonii podejrzanych o zakażenie C. perfringens można pobrać próbki z tej samej płytki TSC do oddzielnych kultur RPM.</li>
	<li>Szczelnie zabezpiecz stożkowe pokrywki tubek i zawiń w folię parafinową lub folię spożywczą. Inkubować w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
5. Ekstrakcja DNA
<ol>
	<li>Usuń kultury ON RPM i sprawdź oznaki wzrostu, w tym zmętnienie i fermentację.</li>
	<li>Delikatnie odwróć kulturę RPM, aby rozproszyć osiadłe bakterie i ostrożnie otwórz. Przenieść 1 ml kultury do probówki mikrowirówkowej.</li>
	<li>Wirować z maksymalną prędkością (około 15 000 x g) przez 10 minut, aby osadzać bakterie.</li>
	<li>Przemyć granulat 1 ml sterylnego PBS.
	<ol>
		<li>W niektórych okolicznościach niestrawiona żelatyna osiada na wierzchu granulowanych bakterii. Aby usunąć żelatynę, należy ją "spulchnić", delikatnie mieszając z PBS za pomocą mikropipety. Spowoduje to "spulchnienie" żelatynę, pozostawiając nienaruszoną osadkę bakteryjną.</li>
		<li>Usunąć mieszaninę PBS i żelatyny z delikatnym zasysaniem. Ponownie zawiesić pozostały osad bakteryjny w 1 ml świeżego PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować zawieszony osad bakteryjny z maksymalną prędkością przez 10 minut i ostrożnie odessać supernatant.</li>
	<li>Natychmiast wykonaj ekstrakcję DNA przy użyciu zestawu do ekstrakcji DNA i protokołu stworzonego specjalnie do ekstrakcji DNA z bakterii Gram-dodatnich (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Wyekstrahowane DNA należy natychmiast zużyć lub przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu analizy PCR.</li>
</ol>
6. Wykrywanie C. perfringens za pomocą genotypowania PCR
<ol>
	<li>Aby ustalić, czy kultury są dodatnie dla toksnotypów C. perfringens, zbadaj wyekstrahowane DNA pod kątem różnych genów toksyn za pomocą PCR. 
	UWAGA: Ponieważ najbardziej interesują nas szczepy typu B i D C. perfringens wytwarzające toksynę epsilon, oceniamy obecność genów toksyny alfa, beta i epsilon. Startery wymieniono w tabeli 2. Startery dla 16s rybosomalnego DNA są stosowane jako kontrola ekstrakcji DNA. Dodatkowe startery mogą być używane do testowania na obecność toksynotypów od A do G i można je znaleźć w opublikowanej literaturze2,12,13.</li>
	<li>Użyć wcześniej wyekstrahowanego DNA C. perfringens jako kontroli pozytywnej. Kontrola ta zapewnia, że wszystkie składniki reakcji PCR działają. Jako kontrolę pozytywną używamy DNA wyekstrahowanego z C. perfringens typu B (ATCC 3626). Hodować ATCC 3636 ON w prędkościach obrotowych w temperaturze 37 °C i ekstrahować DNA przy użyciu tych samych metod, które opisano w krokach 5.1–5.7. Wyekstrahowane DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Ustaw warunki PCR w następujący sposób: 94,0 °C przez 3 min; 94,0 °C przez 30 s; 47,9 °C przez 30 s, 72,0 °C przez 1 min (powtórz kroki 2–4 przez 35 cykli); 72,0 °C przez 10 min.</li>
	<li>Aby potwierdzić produkty PCR, należy przeprowadzić reakcje PCR na żelu agarozowym o stężeniu 1,8 g/100 ml przy użyciu standardowych technik. Oczekiwane rozmiary produktów do PCR podano w tabeli 2. Typowe wyniki PCR są wyświetlane w <silna klasa="xfig">Rysunek 3.</li>
</ol>

<ol><li>Petit, L., Gibert, M., Popoff, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+perfringens%3A+toxinotype+and+genotype%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Clostridium perfringens: toxinotype and genotype.</a> Trends in Microbiology. 7, 104-110 (1999).</li>
<li>Rood, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+the+Clostridium+perfringens+toxin-based+typing+scheme%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Expansion of the Clostridium perfringens toxin-based typing scheme.</a> Anaerobe. , (2018).</li>
<li>Murrell, T. G., O'Donoghue, P. J., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+sheep-multiple+sclerosis+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Hypotheses%22%5BJournal%5D)">A review of the sheep-multiple sclerosis connection.</a> Medical Hypotheses. 19, 27-39 (1986).</li>
<li>Rumah, K. R., Linden, J., Fischetti, V. A., Vartanian, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Clostridium+perfringens+type+B+in+an+individual+at+first+clinical+presentation+of+multiple+sclerosis+provides+clues+for+environmental+triggers+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation of Clostridium perfringens type B in an individual at first clinical presentation of multiple sclerosis provides clues for environmental triggers of the disease.</a> PLoS One. 8, 76359(2013).</li>
<li>Wagley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+Clostridium+perfringens+epsilon+toxin+associated+with+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis%22%5BJournal%5D)">Evidence of Clostridium perfringens epsilon toxin associated with multiple sclerosis.</a> Multiple Sclerosis. , 1352458518767327 (2018).</li>
<li>Linden, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+perfringens+Epsilon+Toxin+Causes+Selective+Death+of+Mature+Oligodendrocytes+and+Central+Nervous+System+Demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Clostridium perfringens Epsilon Toxin Causes Selective Death of Mature Oligodendrocytes and Central Nervous System Demyelination.</a> MBio. 6, 02513(2015).</li>
<li>Popoff, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epsilon+toxin%3A+a+fascinating+pore-forming+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Epsilon toxin: a fascinating pore-forming toxin.</a> FEBS Journal. 278, 4602-4615 (2011).</li>
<li>Lee, C. A., Labbe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+Enterotoxin-+and+Epsilon-Positive+Clostridium+perfringens+Spores+in+U.S.+Retail+Spices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Distribution of Enterotoxin- and Epsilon-Positive Clostridium perfringens Spores in U.S. Retail Spices.</a> Journal of Food Protection. 81, 394-399 (2018).</li>
<li>Wen, Q., McClane, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+enterotoxigenic+Clostridium+perfringens+type+A+isolates+in+American+retail+foods%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens type A isolates in American retail foods.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70, 2685-2691 (2004).</li>
<li>Cooper, K. K., Bueschel, D. M., Songer, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+Clostridium+perfringens+in+retail+chicken+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Presence of Clostridium perfringens in retail chicken livers.</a> Anaerobe. 21, 67-68 (2013).</li>
<li>Strong, D. H., Canada, J. C., Griffiths, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+Clostridium+perfringens+in+American+foods%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Incidence of Clostridium perfringens in American foods.</a> Applied and Environmental Microbiology. 11, 42-44 (1963).</li>
<li>Buogo, C., Capaul, S., Hani, H., Frey, J., Nicolet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+Clostridium+perfringens+type+C+enteritis+in+pigs+using+a+DNA+amplification+technique+%28PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Medicine%2C+Series+B%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of Clostridium perfringens type C enteritis in pigs using a DNA amplification technique (PCR).</a> Journal of Veterinary Medicine, Series B. 42, 51-58 (1995).</li>
<li>Yamagishi, T., Sugitani, K., Tanishima, K., Nakamura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction+test+for+differentiation+of+five+toxin+types+of+Clostridium+perfringens%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction test for differentiation of five toxin types of Clostridium perfringens.</a> Microbiology and Immunology. 41, 295-299 (1997).</li>
<li>Johansson, A., Engstrom, B. E., Frey, J., Johansson, K. E., Baverud, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+clostridium+perfringens+during+simulated+transport+and+stability+of+some+plasmid-borne+toxin+genes+under+aerobic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Veterinaria+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Survival of clostridium perfringens during simulated transport and stability of some plasmid-borne toxin genes under aerobic conditions.</a> Acta Veterinaria Scandinavica. 46, 241-247 (2005).</li>
<li>Erickson, J. E., Deibel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+medium+for+rapid+screening+and+enumeration+of+Clostridium+perfringens+in+foods%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New medium for rapid screening and enumeration of Clostridium perfringens in foods.</a> Applied and Environmental Microbiology. 36, 567-571 (1978).</li>
<li>Regan, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+epsilon+toxin-producing+Clostridium+perfringens+strains+in+American+retail+food%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Identification of epsilon toxin-producing Clostridium perfringens strains in American retail food.</a> Anaerobe. 54, 124-127 (2018).</li>
</ol>

Brak ujawniania informacji.

W niniejszym artykule opisano metodę identyfikacji występowania C. perfringens w detalicznych próbkach żywności z ograniczoną subkulturą i bez użycia systemu komór beztlenowych. Metoda ta wykorzystuje kombinację technik w celu zwiększenia identyfikacji C. perfringens w próbkach żywności. Stosując zmodyfikowaną wersję pożywki RPM, umożliwiamy selektywny wzrost C. perfringens. Umieszczając zaszczepiony RPM pomiędzy warstwami agaru TSC, jesteśmy w stanie zidentyfikować i wyizolować beztlenowe bakterie redukujące siarczyny charakterystyczne dla C. perfringens. Aby potwierdzić obecność C. perfringens, kolonie redukujące siarczyny są subhodowane do świeżego RPM. Zmodyfikowana wersja lub RPM pozwala nam w łatwy sposób wyodrębnić DNA z kultur, umożliwiając potwierdzenie PCR określonych genów toksyn. Potwierdzenie skażonych C. perfringens próbek żywności można uzyskać w ciągu trzech dni.
We wczesnych eksperymentach próbki żywności były po prostu zaszczepiane w RPM i DNA ekstrahowane z kultur ON. Metoda ta doprowadziła do wykrycia C. perfringens w ograniczonej liczbie próbek (dane nie pokazane). Chociaż RPM jest selektywny dla wzrostu C. perfringens, nie jest wyłączny dla wzrostu C. perfringens. Inne, Gram-dodatnie, oporne na D-cykloserynę bakterie mogą nadal rosnąć w RPM. Postawiliśmy hipotezę, że zanieczyszczenie innymi gatunkami bakterii mogło zmniejszyć wykrywalność szczepów C. perfringens poprzez zmniejszenie czułości naszej analizy PCR w naszej pierwszej hodowli ON RPM. Kluczowym krokiem w zwiększeniu wykrywalności C. perfringens było włączenie techniki "kanapkowej" z agarem TSC. Pozwoliło nam to na rozróżnienie i selekcję kolonii beztlenowych, redukujących siarczyny, charakterystycznych dla C. perfringens. Kluczowym krokiem w tym procesie jest upewnienie się, że górna warstwa stopionego agaru TSC ma temperaturę 40 °C. Chociaż niektóre szczepy C. perfringens mogą rosnąć w podwyższonych temperaturach (46–48 °C)15,16, dodanie stopionego agaru w podwyższonych temperaturach znacznie zmniejsza ilość odzyskiwanych kultur, głównie z powodu śmierci komórki.
Istnieje kilka potencjalnych ograniczeń tej metody. Jak wspomniano wcześniej, ani agar RPM, ani agar TSC nie selekcjonują ani nie różnicują wyłącznie C. perfringens , co pozwala na wzrost innych gatunków bakterii obecnych w próbkach żywności. Może to zmniejszyć czułość testu w celu selekcji tylko dla C. perfringens . Jest to jednak powszechne ograniczenie w prawie wszystkich technikach hodowli. Potwierdzenie genotypowania oczyszczonych izolatów jest najlepszą metodą ostatecznej identyfikacji C. perfringens i innych gatunków bakterii. Kolejnym ograniczeniem tego badania jest to, że nie testujemy oczyszczonych izolatów. Celowo zrobiliśmy to, aby ograniczyć ilość subkulturacji, ponieważ obawia się, że powtarzające się subkulturowanie spowoduje utratę plazmidu. Ponieważ nie izolujemy do czystości, możliwe jest, że wiele toksnotypów C. perfringens może być obecnych w tej samej próbce lub subkulturze. Jeżeli badacze chcą otrzymać oczyszczone izolaty, standardowe metody oczyszczania mogą być stosowane na ostatniej kulturze RPM opisanej tą metodą; Zazwyczaj wymaga to użycia komór beztlenowych. Chociaż pierwotnie stosowana do izolowania C. perfringens z żywności, metoda ta może być stosowana do identyfikacji i izolowania C. perfringens z wielu źródeł. W szczególności jednym z takich zastosowań tej metody jest badanie próbek kału od ludzi (lub zwierząt), co do których istnieje podejrzenie, że są zakażone C. perfringens i toksnotypowanie bakterii, aby lepiej zrozumieć źródło infekcji.

Clostridium perfringens (C. perfringens) to Gram-dodatnia, beztlenowa, tworząca przetrwalniki, pałeczkowata bakteria, która jest powszechnie występująca w środowisku. Ten gatunek bakterii jest nosicielem genów kodujących ponad 17 toksyn i historycznie został scharakteryzowany w pięciu toksinotypach (A-E) w oparciu o obecność czterech różnych genów toksyn: alfa, beta, epsilon i toksyny jota (Tabela 1)1. Ostatnio zasugerowano, że ten schemat typowania powinien zostać rozszerzony o typy F i G, które zawierają odpowiednio enterotoksynę C. perfringens (CPE) i toksynę NetB2. Potrzebne są jednak dalsze badania, zanim ten system intryg zostanie formalnie zaakceptowany. Podczas gdy gen toksyny alfa jest ściśle zlokalizowany chromosomalnie, gen CPE można znaleźć zarówno na chromosomie, jak i plazmidach. Dla porównania, geny pozostałych toksyn znajdują się na różnych plazmidach o różnej wielkości. Jesteśmy szczególnie zainteresowani występowaniem C. perfringens typu B i D, ponieważ szczepy te wytwarzają toksynę epsilon, niezwykle silną, tworzącą pory toksynę, która, jak sugeruje się, odgrywa rolę w wywoływaniu stwardnienia rozsianego (MS) u ludzi3,4,5,6,7. Nie wiadomo, w jaki sposób ludzie zarażają się lub kolonizują te szczepy. Jednym z możliwych wyjaśnień jest spożywanie skażonych produktów spożywczych. Aby odpowiedzieć na to pytanie, staraliśmy się określić częstość występowania różnych toksnotypów C. perfringens w amerykańskich próbkach żywności.
Obecność toxinotypów C. perfringens w amerykańskich próbkach żywności jest niedostatecznie zbadana i często wymaga użycia beztlenowych systemów pojemników i licznych etapów hodowli pod8,9,10,11. Chociaż do uzyskania oczyszczonych izolatów potrzebne są liczne etapy hodowli, metoda ta może z czasem prowadzić do utraty plazmidów12,13,14, co może mieć wpływ na wykrywanie genów toksyn plazmidowych, w tym genu toksyny epsilon. Staraliśmy się opracować łatwą metodę, z mniejszą liczbą etapów hodowli cząstkowej, do selektywnej hodowli C. perfringens bez użycia komór beztlenowych, słoików lub worków. Krótko mówiąc, próbki żywności są inokulowane w pożywce Rapid Perfringens (RPM) przez noc (ON), a następnie "umieszczane" w agarze TSC i inkubowane ON. Kolonie podejrzane o bycie C. perfringens są następnie subhodowane do RPM i ponownie inkubowane ON. DNA jest ekstrahowane i przeprowadzany PCR w celu określenia genotypu (<silna klasa = "xfig">Figura 1). Zdecydowaliśmy się użyć RPM, ponieważ wykazano, że zwiększa on odzysk szczepów C. perfringens z próbek żywności w porównaniu z innymi, bardziej standardowymi podłożami15. Ponadto RPM został z powodzeniem wykorzystany do wyizolowania szczepu typu B wytwarzającego toksynę epsilon od pacjenta ze stwardnieniem rozsianym4. Używamy zmodyfikowanej wersji RPM zamiast oryginalnej wersji, aby umożliwić łatwą ekstrakcję DNA. Chociaż metoda ta pozwala na łatwą identyfikację genów toksyn w próbkach, możliwe jest, że pojedyncza próbka będzie zawierać więcej niż jeden toksynotyp C. perfringens. Ponieważ nasza metoda nie izoluje oczyszczonych szczepów przy użyciu wielu rund oczyszczania, identyfikacja wielu toksynotypów z jednej próbki nie jest możliwa. Jednak standardowe techniki oczyszczania (zazwyczaj smugi na płytkach TSC lub płytkach z agarem z krwią) mogą być stosowane pod koniec naszego protokołu, aby uzyskać oczyszczone kultury.

<table><tbody><tr><td>D-Cycloserine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6880</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Sigma Life Science</td><td>D9434-250G</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety transferowe</td><td>dowolnej marki</td><td></td><td>Wybierz jeden z cienką końcówką, taki jak jednorazowe pipety transferowe Thermo Scientific 137116M/EMD</td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Zestawy tkanek</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>Uwaga: oceniono liczne zestawy do ekstrakcji DNA i plazmidu, ten zestaw dał najbardziej pożądane wyniki.</td></tr><tr><td>Suchy inkubator</td><td>dowolnej marki</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płynne podłoże tioglikolanowe</td><td>Remel</td><td>R453452</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry świni</td><td>Sigma Life Science</td><td>G1890-500G</td><td></td></tr><tr><td>Indywidualne podkłady</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siarczan żelaza (II) siedmiowodny</td><td>Sigma Life Science</td><td>F8633-250 G</td><td></td></tr><tr><td>Lizozym z białka jaja kurzego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>Potrzebny do ekstrakcji DNA, brak w zestawie</td></tr><tr><td>probówka do mikrowirówki</td><td>dowolnej marki</td><td></td><td></td></tr><tr><td>parafilm lub folia</td><td>dowolnej marki</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepton z kazeiny i innych białek zwierzęcych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70173-100G</td><td></td></tr><tr><td>Perfringens Agar Base (TSC + SFP)</td> <td>Oxoid</td><td>CM0587</td><td>Wykonaj agar TSC zgodnie z instrukcją</td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2222-100G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-7653</td><td></td></tr><tr><td>Skrobak do sterylnych komórek</td><td>dowolnej marki</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylny rozsiewacz komórek</td><td>dowolnej marki</td> Sterylne szalki Petriego dowolnej marki <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiały eksploatacyjne i sprzęt do elektroforezy żelowej</td>wirówka stołowa <td>dowolnej marki</td><td></td><td></td></tr> dowolnej <tr><td></td><td>marki</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taq&nbsp; PCR Master Mix Kit</td><td>Qiagen</td><td>201443</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler do reakcji PCR</td><td>kąpiel</td> wodna dowolnej marki <td></td><td></td></tr> dowolnej <tr><td></td><td>marki</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70161-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

wzbogacanie i wykrywanie toksyn clostridium perfringens w detalicznych próbkach żywności

Enrichment and Detection of Clostridium perfringens Toxinotypes in Retail Food Samples

Clostridium perfringens (C. perfringens) jest płodnym producentem toksyn i powoduje szeroki zakres chorób u różnych gospodarzy. C. perfringens dzieli się na pięć różnych toksnotypów, od A do E, w oparciu o nosicielstwo czterech głównych genów toksyn. Rozpowszechnienie i dystrybucja tych różnych toksnotypów jest niedostatecznie zbadana, zwłaszcza ich wszechobecność w amerykańskiej żywności detalicznej. Szczególnie interesujące są dla nas szczepy typu B i D, które wytwarzają toksynę epsilon, niezwykle śmiertelną toksynę, o której sugeruje się, że jest środowiskowym czynnikiem wywołującym stwardnienie rozsiane u ludzi. Aby ocenić obecność różnych toksnotypów C. perfringens w różnych próbkach żywności, opracowaliśmy łatwą metodę selektywnej hodowli tych bakterii bez użycia beztlenowego systemu pojemników obejmującego tylko trzy etapy hodowli. Żywność jest kupowana w lokalnych sklepach spożywczych i transportowana do laboratorium w warunkach otoczenia. Próbki są mielone i zaszczepiane na zmodyfikowane szybkie podłoża perfringens (RPM) i inkubowane przez noc w temperaturze 37 °C w szczelnej, hermetycznej stożkowej probówce. Nocne kultury są zaszczepiane na dolnej warstwie stałego agaru z cykloseryną siarczynu tryptozy (TSC), a następnie nakładane na górną warstwę stopionego agaru TSC, tworząc "warstwowe", beztlenowe środowisko. Płytki agarowe inkubuje się przez noc w temperaturze 37 °C, a następnie ocenia się pod kątem pojawienia się czarnych kolonii redukujących siarczyny. Kolonie C. perfringens są usuwane z agaru TSC za pomocą sterylnych zakraplaczy do oczu, a następnie inokulowane do RPM i hodowane przez noc w temperaturze 37 °C w hermetycznej stożkowej probówce. DNA jest ekstrahowane z subkultury RPM, a następnie analizowane pod kątem obecności genów toksyny C. perfringens za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). W zależności od rodzaju pobranej żywności, zazwyczaj 15–20% próbek daje wynik pozytywny na obecność C. perfringens.

Stosując tę metodę, w 15–20% naszych pobranych próbek żywności uzyskano wynik dodatni w kierunku C. perfringens. Chociaż większość szczepów wykazuje dodatni wynik dla toksynotypu A, w próbkach żywności skutecznie wykryto również typy B i D. W wcześniej opublikowanej pracy przebadzano łącznie 216 próbek żywności zakupionych w sklepach detalicznych w Nowym Jorku16 (Tabela 3). Próbki te obejmowały różne rodzaje mięsa (wołowinę, jagnięcinę, wieprzowinę i baraninę), próbki drobiu (kurczaka i indyka) oraz owoce morza i ryby (dorsza, łososia, skorupiaki, czerwonego snapsa, flundrę, kalmary, tilapię, tuńczyka oraz różne inne ryby). Przebadano również warzywa i owoce oraz produkty mleczne. Z 216 próbek 34 (16%) okazały się dodatnie pod kątem C. perfringens. Z 34 próbek dodatnich na C. perfringens, 31 (91,2%) zawierało toksynę alfa, jedna próbka (2,9%) zawierała toksyny alfa, beta i epsilon, a dwie próbki (5,9%) zawierały toksyny alfa i epsilon.
Co ciekawe, odkryliśmy również, że C. perfringens występował częściej w formie komórek wegetatywnych niż przetrwalników. Porównano 25 próbek pod kątem obecności wegetatywnych komórek C. perfringens lub przetrwalników. Przetrwalniki wyselekcjonowano poprzez szok termiczny próbek w 85 °C przez 15 min. Z 25 przebadanych próbek 16% było dodatnich pod kątem wegetatywnych szczepów C. perfringens, w porównaniu do 4% w przypadku przetrwalników. Wskazuje to, że bardziej efektywne kosztowo może być testowanie wyłącznie komórek wegetatywnych zamiast obu form.
<img alt="Proces mikrobiologii żywności, schemat analizy PCR; ekstrakcja DNA; komórki wegetatywne, przetrwalniki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59931/59931fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd procedury. 
Próbki żywności są rozdrabniane i rozcieńczane w sterylnym PBS. Połowę próbki żywności w PBS szczepia się w RPM w celu selekcji komórek wegetatywnych. Pozostałą część próbki żywności w PBS poddaje się szokowi termicznemu w 85 °C przez 15 min w celu wyselekcjonowania przetrwalników przed inokulacją w RPM. Kultury inkubowano przez noc w 37 °C następnie wysiano na agar TSC. Agar TSC inkubowano przez noc w temperaturze 37 °C a czarne, redukujące siarczyny kultury są przesiewane do świeżej pożywki RPM. Przesiane kultury w pożywce RPM są inkubowane przez noc w 37 °C Następnie ekstrahuje się DNA w celu przeprowadzenia genotypowania za pomocą PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59931/59931fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Warstwowy schemat równowagi statycznej; 20 ml górnego TSC, RPM w środkowej warstwie, 10 ml dolnego TSC, do celów edukacyjnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59931/59931fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schemat techniki kanapki z agarem TSC. 
pożywka RPM zawierająca C. perfringens Bakterie wysiewa się pomiędzy dwie warstwy agaru TSC, aby stworzyć środowisko beztlenowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59931/59931fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki elektroforezy żelowej przedstawiające prążki DNA dla różnych próbek owoców morza i mięsa, analiza 16S rRNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59931/59931fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Wybrane wyniki PCR. 
Przykładowe obrazy wyników genotypowania C. perfringens z siedmiu różnych rodzajów żywności oraz kontroli pozytywnej w postaci C. perfringens typ B. W celu przybliżenia rozmiaru produktów PCR w parach zasad (bp) wykorzystano drabinę mas cząsteczkowych (pierwsza ścieżka każdego żelu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59931/59931fig03large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td colspan="2">Toksynotyp</td>
			<td >Alfa</td>
			<td >Beta</td>
			<td >Epsilon</td>
			<td >Iota</td>
			<td >CPE</td>
			<td >NetB</td>
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="5">Ustanowione</td>
			<td >A</td>
			<td >+</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >B</td>
			<td >+</td>
			<td >+</td>
			<td >+</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >C</td>
			<td >+</td>
			<td >+</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >+</td>
			<td >-</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >D</td>
			<td >+</td>
			<td >-</td>
			<td >+</td>
			<td >-</td>
			<td >+</td>
			<td >-</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >E</td>
			<td >+</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >+</td>
			<td >+</td>
			<td >-</td>
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="2">Proponowane</td>
			<td >F</td>
			<td >+</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >+</td>
			<td >-</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >G</td>
			<td >+</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >+</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="8"></td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="8">+ obecny 
			- nieobecny 
			+/- może być obecny lub nieobecny</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Przegląd genotypów C. perfringens. Tabela przedstawiająca kombinacje toksyn produkowanych przez każdy toksynotyp C. perfringens.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cel</td>
			<td>bất cặp starterów</td>
			<td>Oczekiwany produkt PCR (bp)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alfa</td>
			<td>F: GCT AAT GTT ACT GCC GTT GA 
			R: CCT CTG ATA CAT CGT GTA AG</td>
			<td>325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta</td>
			<td>F: GCG AAT ATG CTG AAT CAT CTA 
			R: GCA GGA ACA TTA GTA TAT CTT C</td>
			<td>196</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epsilon</td>
			<td>F: GCG GTG ATA TCC ATC TAT TC 
			R: CCA CTT ACT TGT CCT ACT AAC</td>
			<td>655</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16S rRNA</td>
			<td>F: AGA GTT TGA TCC TGG CTC A 
			R: GGT TAC CTT GTT ACG ACT T</td>
			<td>~1300</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Primery i oczekiwane produkty PCR dla wybranych genów toksyn. Primery wykorzystane w etapie genotypowania metodą PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3" rowspan="2">Rodzaj żywności</td>
			<td colspan="2">Typ A</td>
			<td colspan="2">Typ B</td>
			<td colspan="2">Typ C</td>
			<td colspan="2">Typ D</td>
			<td colspan="2">C. perf +</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">dodatni w kierunku toksyny alfa</td>
			<td colspan="2">dodatni wynik w kierunku toksyny alfa, beta i epsilon</td>
			<td colspan="2">dodatni wynik w kierunku toksyny alfa i beta</td>
			<td colspan="2">dodatni wynik w kierunku toksyny alfa i epsilon</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
			<td>n</td>
			<td>n</td>
			<td>%</td>
			<td>n</td>
			<td>%</td>
			<td>n</td>
			<td>%</td>
			<td>n</td>
			<td>%</td>
			<td>n</td>
			<td>%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Mięso</td>
			<td>wołowina</td>
			<td>38</td>
			<td>8</td>
			<td>21%</td>
			<td>1</td>
			<td>3%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>9</td>
			<td>24%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jagnię</td>
			<td>10</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wieprzowina</td>
			<td>15</td>
			<td>2</td>
			<td>13%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>2</td>
			<td>13%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mieszany</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>100%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>1</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suma częściowa</td>
			<td>64</td>
			<td>11</td>
			<td>17%</td>
			<td>1</td>
			<td>2%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>12</td>
			<td>19%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Drób</td>
			<td>kurczak</td>
			<td>19</td>
			<td>5</td>
			<td>26%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>5</td>
			<td>26%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indyk</td>
			<td>7</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suma częściowa</td>
			<td>26</td>
			<td>5</td>
			<td>19%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>5</td>
			<td>19%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="11">Owoce morza</td>
			<td>COD (chemiczne zapotrzebowanie na tlen)</td>
			<td>4</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mieszany</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>łosoś</td>
			<td>11</td>
			<td>2</td>
			<td>18%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>2</td>
			<td>18%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>owoce morza</td>
			<td>32</td>
			<td>1</td>
			<td>3%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>1</td>
			<td>3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>snapper</td>
			<td>4</td>
			<td>3</td>
			<td>75%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>3</td>
			<td>75%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flądra</td>
			<td>12</td>
			<td>4</td>
			<td>33%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>4</td>
			<td>33%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kałamarnica</td>
			<td>4</td>
			<td>1</td>
			<td>25%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>1</td>
			<td>25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tilapia</td>
			<td>21</td>
			<td>2</td>
			<td>10%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>2</td>
			<td>10%</td>
			<td>4</td>
			<td>19%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuńczyk</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inne</td>
			<td>8</td>
			<td>1</td>
			<td>13%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>1</td>
			<td>13%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suma częściowa</td>
			<td>100</td>
			<td>14</td>
			<td>14%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>2</td>
			<td>2%</td>
			<td>16</td>
			<td>16%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Produkty mleczne</td>
			<td>krowa</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>koza</td>
			<td>4</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mleko</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suma częściowa</td>
			<td>10</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.</td>
			<td>warzywo</td>
			<td>12</td>
			<td>1</td>
			<td>8%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>1</td>
			<td>8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>owoc</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zioło</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suma częściowa</td>
			<td>16</td>
			<td>1</td>
			<td>6%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>1</td>
			<td>6%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suma</td>
			<td></td>
			<td>216</td>
			<td>31</td>
			<td>14%</td>
			<td>1</td>
			<td>0.50%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>2</td>
			<td>0.90%</td>
			<td>34</td>
			<td>16%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Częstość występowania różnych toksynotypów C. perfringens w 216 próbkach żywności. Przykład wyników uzyskanych przy zastosowaniu tej metody do badania żywności detalicznej pod kątem obecności C. perfringens. Tabela ta została zmodyfikowana na podstawie wcześniej opublikowanej pracy Regana i wsp.16.

Celem tego protokołu jest wykrycie różnych toksnotypów Clostridium perfringens w lokalnie zakupionej żywności, szczególnie w przypadku szczepów B i D wytwarzających toksynę epsilon, bez użycia komór beztlenowych.

Wzbogacanie i wykrywanie toksyn Clostridium perfringens w detalicznych próbkach żywności

Clostridium perfringens (C. perfringens) is a prolific toxin producer and causes a wide range of diseases in various hosts. C. perfringens is categorized ...

Opracowaliśmy łatwą metodę badania próbek żywności pod kątem różnych toksynotytypów C. perfringens. Szczególnie interesuje nas występowanie toksnotypów B i D, które wytwarzają toksynę epsilon. Nasz protokół pozwala na łatwe wzbogacenie i wykrycie różnych toksnotypów C. perfringens bez użycia komór beztlenowych lub inkubatorów z ograniczoną subkulturą.Ta metoda może być również stosowana do badania gleby, wody, próbek kału i innych. Procedurę zademonstrują Zuha Anwar i Samantha Regan, technicy z laboratorium. Zacznij od przygotowania zmodyfikowanego podłoża do szybkich perfringens lub RPM.Połącz składniki zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i sterylizuj mieszaninę w autoklawie w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 15 minut. Pozostaw podłoże do ostygnięcia do około 40 stopni Celsjusza, a następnie dodaj D-cykloserynę do końcowego stężenia 440 miligramów na litr. W asepcie przenieś obroty do 15-mililitrowych stożkowych rurek i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego miesiąca.Przed użyciem podgrzej podłoże do 37 stopni Celsjusza. Podczas pobierania próbek do badania należy przenieść żywność do laboratorium zgodnie ze wskazówkami zawartymi w rękopisie. Jeśli nie przetestujesz natychmiast, żywność można przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Zanotuj rodzaj żywności i kraj pochodzenia, a także wszelkie inne istotne informacje. Aby przetestować żywność, przenieś około jednego do dwóch gramów na sterylną szalkę Petriego i drobno zmielić ją sterylną żyletką lub skalpelem. Zaszczep go w 10 mililitrach PBS w 15-mililitrowej stożkowej probówce i dobrze wymieszaj.Wybierz komórki wegetatywne, przenosząc pięć mililitrów mieszanki spożywczej PBS do 15-mililitrowej stożkowej rurki o 10 mililitrach prędkości obrotowej i szczelnie zamykając pokrywkę. Wybierz zarodniki, podgrzewając pozostałe pięć mililitrów mieszaniny do 85 stopni Celsjusza przez 15 minut. A następnie przeniesienie go do rurki z prędkościami obrotowymi i szczelne zamknięcie pokrywy.Aby zapewnić całkowite wymieszanie, odwiruj i odwróć kultury RPM żywności. Następnie szczelnie zamknij stożkowe rurki i owiń pokrywki folią parafinową, aby stworzyć środowisko beztlenowe. Inkubuj probówki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i zwróć uwagę na zmętnienie lub fermentację następnego ranka.Przygotuj cykloserynę siarczynu tryptozy lub agar TSC zgodnie ze wskazówkami producenta, a następnie użyj techniki kanapkowej, aby zaszczepić ją nocnymi kulturami RPM. Przygotuj warstwę podstawową płytek, przenosząc 10 mililitrów stopionego agaru na sterylne szalki Petriego i pozwalając mu zestalić się. Utrzymuj pozostały agar TSC w temperaturze 40 stopni Celsjusza dla górnej warstwy i ostrożnie przenieś 100 mikrolitrów kultury RPM przez noc na podstawę agaru.Niektóre kultury mogą być pod presją z powodu fermentacji, dlatego należy nosić wszystkie odpowiednie środki ochrony osobistej. Rozprowadzić inokulinę za pomocą sterylnych szklanych kulek lub rozsiewacza komórek i pozostawić na wchłonięcie RPM do agaru przez pięć do 10 minut. Następnie za pomocą pipety serologicznej ostrożnie przenieś 20 mililitrów stopionego agaru TSC na płytkę.Załóż pokrywkę szalki Petriego i pozwól agarowi TSC całkowicie zestalić się w temperaturze pokojowej, a następnie odwróć naczynie i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. W razie potrzeby należy wykonać seryjne rozcieńczenia kultury RPM przed inokulacją do agaru TSC. Po inkubacji zbadaj płytki pod kątem rozwoju bakterii.Bakterie tlenowe mogą być obecne na powierzchni agaru, podczas gdy bakterie beztlenowe będą osadzone w agarze . Bakterie redukujące siarczyny zmienią otaczający agar na, a ewentualne kolonie C perfringens będą czarne i osadzone w agarze . Jeśli na powierzchni płytki znajduje się gęsta ilość bakterii tlenowych, użyj skrobaka do komórek, aby usunąć kolonie z wybranych obszarów.Użyj sterylnego jednorazowego zakraplacza do oczu, aby zerwać podejrzane kolonie C perfringens z agaru, upewniając się, że wydaliłeś powietrze przed przekłuciem agaru. Przenieś kolonie do 10 mililitrów świeżej prędkości obrotowej w 15-mililitrowej stożkowej probówce. Próbki wielu kolonii można pobrać z tej samej płytki do oddzielnych kultur RPM.Szczelnie zabezpiecz stożkowe pokrywki probówek, zawiń je w folię parafinową i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. C perfringens jest dwuorganizmem BSL. Ważne jest, aby przez cały czas stosować odpowiednie środki ostrożności, zwłaszcza podczas otwierania nocnych kultur RPM oraz ostrożnie odkazać i zutylizować zużyte podłoża.Następnego dnia usuń nocne kultury i zbadaj je pod kątem zmętnienia i fermentacji, a następnie przystąp do ekstrakcji DNA. Delikatnie odwróć kulturę RPM, aby rozproszyć osiadłe bakterie i ostrożnie otwórz probówkę. Przenieś jeden mililitr do probówki mikrowirówkowej i osadź bakterie przez odwirowanie.Umyj granulki jednym mililitrem sterylnego PBS. Jeśli niestrawiona żelatyna osiadła na wierzchu bakterii, spulchnij ją, mieszając z PBS. Delikatnie odessać żelatynę i PBS i ponownie zawiesić pozostały granulat bakteryjny z jednym mililitrem świeżego PBS.Ważne jest, aby usunąć wszelkie granulowane żelatyny przy ograniczonym zakłóceniu osadu komórkowego. Nieusunięcie żelatyny może zahamować ekstrakcję DNA i PCR. Wirować bakterie przez 10 minut i ostrożnie odessać supernatant.Następnie wykonaj ekstrakcję DNA za pomocą zestawu zaprojektowanego specjalnie dla bakterii Gram-dodatnich. Użyj DNA natychmiast lub przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Wykonaj PCR na wyekstrahowanym DNA, aby określić, czy kultury są dodatnie dla toksynotypów C perfringens.Użyj DNA C perfringens jako kontroli pozytywnej, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki PCR działają. Przeprowadź PCR zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i przeanalizuj produkty za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Protokół ten został wykorzystany do przetestowania łącznie 216 próbek żywności zakupionych w nowojorskich sklepach detalicznych.Próbki obejmowały różne próbki mięsa, próbki drobiu i próbki owoców morza. Jako kontrolę pozytywną zastosowano C perfringens typu B. Stwierdzono, że od 15 do 20% pobranych próbek żywności daje wynik pozytywny na obecność C perfringens.Spośród 34 próbek dodatnich, 31 próbek zawierało toksynę alfa, jedna próbka zawierała toksynę alfa, beta i epsilon. Dwie próbki zawierały toksynę alfa i epsilon. Opracowaliśmy łatwą metodę badania próbek żywności pod kątem różnych toksynotytypów C. perfringens.Szczególnie interesuje nas występowanie toksnotypów B i D, które wytwarzają toksynę epsilon.

enrichment-detection-clostridium-perfringens-toxinotypes-retail-food

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Przedstawiono protokół wykrywania trichotecenów (mykotoksyn stanowiących zagrożenie dla zdrowia ludzi) z wykorzystaniem nowo opracowanej metody przesiewowej, opartej na konkurencyjnej metodzie immunochemicznej oraz końcowej detekcji elektrochemicznej.

Metoda ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) do wykrywania mikotoksyn

Niniejszy protokół opisuje prostą metodę opartą na zastosowaniu taśmy klejącej do pobierania próbek z powierzchni pomidorów oraz innych świeżych produktów rolnych, a następnie szybką detekcję całych komórek Salmonella przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Połączenie pobierania próbek za pomocą taśmy klejącej i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu szybkiego wykrywania Salmonella na świeżych produktach rolnych

Niedawno opisaliśmy nowatorskie podejście do generowania fluorogennych sond DNAzymowych, które mogą być wykorzystane do stworzenia prostego, fluorescencyjnego testu typu „wymieszaj i odczytaj” do wykrywania bakterii. Te specjalne sondy DNA katalizują rozszczepienie zmodyfikowanego chromoforem substratu chimerycznego DNA-RNA w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) produkowanej przez konkretną bakterię, przekładając tym samym detekcję bakterii na generowanie sygnału...

Wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych DNAzymów

Źródło: Anwar, Z., et al. Wzbogacanie i wykrywanie toksyn Clostridium perfringens w detalicznych próbkach żywności. J. Vis. Exp. (2019).W tym filmie bakterie redukujące siarczyny są hodowane w pożywce agarowej zawierającej siarczyny, gdzie rosną beztlenowo i redukują siarczyn do siarkowodoru, tworząc czarne osady z jonami żelaza. Czarne kolonie są izolowane z głębokości agaru przy użyciu technik aseptycznych i przenoszone do świeżej pożywki w celu kontynuacji inkubacji beztlenowej.

Hodowla bakterii beztlenowych redukujących siarczyny z kultury agarowej

Źródło: Pava-Ripoll i in. Wykrywanie patogenów bakteryjnych przenoszonych przez żywność u pojedynczych much. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje metodę opartą na PCR, która wzmacnia docelowe DNA bakterii z wzbogaconych próbek much za pomocą tabletek specyficznych dla patogenów, umożliwiając wykrywanie fluorescencji w czasie rzeczywistym i analizę krzywej topnienia w celu potwierdzenia obecności patogenów przenoszonych przez żywność u poszczególnych owadów.

Wykrywanie patogenów przenoszonych przez żywność na podstawie wzbogaconych próbek much na PCR

Test qPCR został opracowany do wykrywania Escherichia coli O157:H7 z unikalnym markerem genetycznym, Z3276. qPCR połączono z leczeniem monoazydkiem propidyny (PMA) w celu wykrywania żywych komórek. Protokół ten został zmodyfikowany i dostosowany do formatu płytki 96-dołkowej w celu łatwej i spójnej obsługi wielu...

Wykrywanie żywych komórek Escherichia coli O157:H7 metodą PMA-qPCR

Ogólnym celem tego badania było pokazanie potencjalnego mechanizmu zanieczyszczenia krzyżowego patogenu Listeria monocytogenes przenoszonego przez żywność w sklepie delikatesowym. Metodologia ta może być stosowana w wielu różnych środowiskach do śledzenia zanieczyszczenia patogenami.

Śledzenie skażenia mikrobiologicznego w środowiskach handlu detalicznego za pomocą proszku fluorescencyjnego - przykład środowiska delikatesowego w handlu detalicznym

Protokół obejmujący zintegrowane zagęszczenie, wzbogacenie i kolorymetryczne wykrywanie patogenów przenoszonych przez żywność w dużych ilościach wody rolniczej jest tutaj przedstawiony.  Woda jest filtrowana przez zmodyfikowane waciki Moore'a (MMS), wzbogacone o selektywne lub nieselektywne media, a detekcja odbywa się za pomocą papierowych urządzeń analitycznych (μPAD) osadzonych w bakteryjno-orientacyjnych podłożach kolorymetrycznych.

Kolorymetryczne wykrywanie Escherichia coli, Salmonella spp. i Listeria monocytogenes na papierze w dużych ilościach wody rolniczej

Ogólnym celem tego protokołu jest synteza funkcjonalnych nanosensorów do przenośnego, opłacalnego i szybkiego wykrywania specyficznie ukierunkowanych bakterii chorobotwórczych poprzez połączenie relaksacji magnetycznej i emisji fluorescencji.

Badania przesiewowe patogenów przenoszonych przez żywność przy użyciu nanoczujnika magnetofluorescencyjnego: szybkie wykrywanie E. coli O157:H7

Przedstawiono protokół rozwoju elektrochemicznego biosensora DNA, składającego się z stabilizowanej kwasem polimlekowym, modyfikowanej nanocząstkami złota, sitodrukowanej elektrody węglowej do wykrywania Vibrio parahaemolyticus.

Opracowanie elektrochemicznego biosensora DNA do wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność

Campylobacter jest główną przyczyną bakteryjnego zapalenia żołądka i jelit przenoszonego przez żywność na całym świecie. Pomimo tego, że zakłady wprowadzają środki mające na celu zmniejszenie rozpowszechnienia w swoich obiektach, skażone produkty konsekwentnie docierają do konsumentów. Technika opracowana w ciągu ostatnich dwunastu lat rozwiązuje problemy związane z ograniczeniami istniejących metod izolowania i wykrywania Campylobacter spp. z surowego mięsa.

Wykrywanie i izolacja Campylobacter spp. z surowego mięsa

Poznaj metodę wzbogacania i wykrywania toksyn Clostridium perfringens w próbkach żywności detalicznej. Protokół eliminuje potrzebę użycia komór beztlenowych, umożliwiając identyfikację toksynotypów B i D.

Wzbogacanie i wykrywanie toksyn Clostridium perfringens w detalicznych próbkach żywności

Przeglądaj więcej filmów