Name: Aktywowana usieciowana agaroza do szybkiego rozwoju żywic chromatograficznych o powinowactwie - wychwytywanie przeciwciał jako studium przypadku (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Poznaj metodę szybkiej produkcji żywic chromatograficznych o powinowactwie do wychwytywania przeciwciał monoklonalnych z surowych ekstraktów roślinnych. Ta technika obniża koszty w porównaniu do chromatografii na białku A.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Ibrahimowi Al Amedi za uprawę transgenicznych roślin tytoniu oraz Dr. Thomasowi Rademacherowi za dostarczenie wektora ekspresji tytoniu. Autorzy pragną podziękować dr Richardowi M. Twymanowi za pomoc redakcyjną oraz Markusowi Sackowi za owocne dyskusje na temat struktury liganda powinowactwa DFE. Prace te zostały częściowo sfinansowane przez wewnętrzne programy Fraunhofer-Gesellschaft w ramach grantu nr 1. Attract 125-600164 i kraj związkowy Nadrenia Północna-Westfalia w ramach grantu Leistungszentrum nr 423 "Usieciowiona, adaptacyjna produkcja". Prace te były wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) w ramach grantu Grupy Badawczej Szkoleniowej "Dostarczanie leków ukierunkowanych na nowotwory" 331065168. Firma GE Healthcare wsparła publikację tego artykułu w otwartym dostępie.

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Zastosowania nowej żywicy powinowactwa
Wykazaliśmy, że niestandardowe żywice chromatograficzne o powinowactwie do wychwytywania mAb można wytwarzać poprzez unieruchomienie liganda zawierającego epitop specyficzny dla mAb do usieciowanej agarozy aktywowanej przez NHS. Aby zaprojektować taką żywicę, konieczne było poznanie sekwencji epitopów i użycie epitopu liniowego. Powstałe żywice są korzystne dla wychwytywania mAb, ponieważ mogą potencjalnie zastąpić kosztowne etapy chromatografii powinowactwa białka A. Interakcja między 2F5 a DFE w naszym studium przypadku była pośredniczona przez wiązanie epitop-paratop, więc nasz ligand powinien być bardziej selektywny niż białko A, które wiąże się z regionem Fc większości mysich i ludzkich IgG. Ponieważ do każdego mAb potrzebne są indywidualne ligandy, nasza metoda może początkowo wydawać się odpowiednia głównie dla przeciwciał, które są wytwarzane na bardzo dużą skalę. Jednak łącząc nasze podejście z szybką ekspresją białek przejściowych pochodzenia roślinnego, nowe ligandy powinowactwa można przygotować w czasie krótszym niż 2 tygodnie27 przy minimalnym wysiłku28. W związku z tym metoda nadaje się również do oczyszczania mAb na małą skalę.
Produkcja i potencjalne ulepszenia ligandu powinowactwa
Zakłady oferują szybką i bezpieczną platformę do produkcji ligandów o powinowactwie 5,29,30, takich jak białko fuzyjne DFE przedstawione w naszym studium przypadku. Blanszowanie materiału roślinnego znacznie zmniejszyło ilość białek komórek gospodarza w jednym kroku i można je było łatwo zintegrować ze standardową procedurą klarowania. Jednak odzysk liganda był niski w obecnej konfiguracji, prawdopodobnie ze względu na jego umiarkowaną stabilność termiczną i pewne niespecyficzne wiązanie z warstwami filtra, jak zgłoszono dla innych produktów 31,32,33. Inżynieria nośnika w celu zwiększenia jego stabilności termicznej może zatem pomóc w poprawie wydajności ligandów w przyszłości, jak opisano w przypadku kandydata na szczepionkę przeciwko malarii CCT, enzymu przeciwnowotworowego PpADI lub mezofilnej β-glukozydazy 34,35,36. To samo dotyczy etapu filtracji wgłębnej, w którym inżynieria białkowa może pomóc w zmniejszeniu niespecyficznego wiązania z materiałem filtracyjnym37. Koszty produkcji DFE i podobnych ligandów można również obniżyć poprzez poprawę ogólnej wydajności klarowania przy użyciu flokulantów lub dodatków filtracyjnych38,39.
Gdy DsRed jest używany jako nośnik, tworzy kompleks tetrameryczny. Jest to korzystne, ponieważ zwiększa liczbę epitopów na ligand, ale może również sprawić, że ligand będzie bardziej podatny na demontaż lub denaturację podczas chromatografii powinowactwa. Monomeryczne białko nośnikowe, takie jak mCherry, może być zatem preferowane, ponieważ jest stabilne przy niskim pH40, a włączenie tandemowych powtórzeń epitopu zwiększyłoby awidność liganda, a tym samym zwiększyłoby pojemność żywicy 5,26,41. W przypadku prostych białek epitopowych nośnikowych (tj. takich, które nie mają wiązań dwusiarczkowych ani modyfikacji potranslacyjnych) systemy produkcji mikrobiologicznej mogą obniżyć koszty produkcji i sprawić, że ligandy będą bardziej konkurencyjne w stosunku do białka A. Na przykład białko zielonej fluorescencji uległo ekspresji w komórkach bakteryjnych z wydajnością ~1 g·kg-1 biomasy, co znacznie obniżyłoby koszty produkcji ligandów42.
Niezależnie od gospodarza ekspresji, podczas sprzęgania wymagany był oczyszczony ligand powinowactwa, aby zminimalizować immobilizację białek komórek gospodarza lub składników pożywki, które w przeciwnym razie mogą zmniejszyć selektywność i pojemność żywicy. Włączenie znacznika polihistydyny do oczyszczania IMAC zwiększyło czystość do ~90% w jednym kroku, ułatwiając szybką i niedrogą produkcję ligandów 5,43,44. Jednak położenie znacznika fuzyjnego jest ważne, ponieważ może ono sterycznie utrudniać wiązanie epitopu lub indukować rozszczepienie znacznika lub epitopu od nośnika45,46.
Immobilizacja ligandu powinowactwa na kolumnach chromatograficznych aktywowanych przez NHS
Unieruchomienie przeprowadzano ręcznie lub przy użyciu systemu chromatograficznego. Małe objętości na kolumnę wydawały się sprzyjać ręcznej obsłudze (np. ze względu na minimalne objętości odpadów). Jeśli jednak potrzebnych jest wiele/większe kolumny, system chromatograficzny ułatwia kontrolowanie warunków sprzężenia (np. regulowane natężenia przepływu), a zatem ma większe szanse na osiągnięcie powtarzalnych wyników pod względem DBC. Nasze dane sugerują, że bufor sprzęgający i pH mają istotny wpływ na wydajność sprzęgania i ogólne koszty kolumny. Badanie przesiewowe czynników, które wpływają na reakcję sprzęgania i dostosowanie ich do każdego białka nośnikowego (lub nawet do każdej fuzji nośnik-ligand) może zatem poprawić wydajność sprzęgania i wydajność żywicy, a my zalecamy takie podejście.
Testowanie izolacji 2F5 przy użyciu żywicy o powinowactwie DFE
Wydajność i czystość produktu są ważnymi aspektami wydajności żywicy, a w przypadku DFE osiągnęliśmy wydajność 105 ± 11% (±SD, n=3) i czystość 97 ± 3% (±SD, n=3), co jest porównywalne z wydajnością wzorcowych żywic białkowych A25,26. Innym kluczowym wskaźnikiem wydajności dla żywic w ogóle (a w szczególności dla tych opartych na ligandach powinowactwa) jest DBC przy 10% przełomie produktu, ponieważ parametr ten wpływa na ilość żywicy wymaganej do określonego procesu, a tym samym na koszty. Dla liganda DFE początkowe DBC wynosiło ~4 g·L-1 żywicy, co stanowi ~13% odpowiedniej wartości dla białka A w podobnych warunkach (tylko 2 minuty czasu kontaktu)25,47, ale około 15-krotnie wyższe w porównaniu z innymi niestandardowymi żywicami o powinowactwie, takimi jak ligand anty-FSH-immunoaffinity, przy tym samym czasie przebywania wynoszącym 2 min48. DBC DFE spadło do 15% wartości początkowej po 25 cyklach wiązania i elucji, podczas gdy do tej samej utraty DBC w komercyjnych żywicach białkowych Apotrzeba więcej niż 50 cykli. Należy jednak zauważyć, że nasz nośnik nie został jeszcze zoptymalizowany w takim samym stopniu jak białko A, które zostało kompleksowo zbadane i ulepszone w ciągu ostatnich czterech dekad8.
Do tej pory poprawiliśmy stabilność żywicy i odzysk produktu poprzez przejście z buforu elucyjnego o niskim pH na wysokie stężenie chlorku magnezu (ryc. 3), zgodnie z zaleceniami we wcześniejszych badaniach13. Charakterystyczny czerwony kolor liganda powinowactwa nie wyblakł znacząco podczas 25 cykli wiązania i elucji, więc spekulujemy, że endogenne proteazy roślinne w oczyszczonych ekstraktach roślinnych31 mogły się skrócić, a tym samym dezaktywować epitop ligandu. Dlatego zaprojektowanie łączników odpornych na proteazy do połączenia nośnika i epitopu może pomóc w utrzymaniu początkowego DBC przez wydłużoną liczbę cykli. Biorąc pod uwagę szybką i prostą ekspresję i oczyszczanie liganda DFE, jego proste sprzężenie z dostępnymi na rynku żywicami chromatograficznymi oraz doskonałą wydajność i czystość produktu, uważamy, że nasza metoda stanowi odpowiednią alternatywę dla białka A do oczyszczania mAb i pochodnych przeciwciał, które nie wiążą się z białkiem A, zwłaszcza jeśli ulepszenia nośnika i łącznika mogą poprawić stabilność DBC i liganda. Założenie to zostało poparte niewielką różnicą w stałej dysocjacji przeciwciała 2F5 oczyszczonego z DFE i przeciwciała 2F5 oczyszczonego z białka A5, co wskazuje, że nasz nowy ligand powinowactwa umożliwia odzyskanie wysokiej jakości przeciwciał monoklonalnych.
Korzyści i obecne ograniczenia metody
Wytwarzanie ligandu powinowactwa jako fuzji genetycznej z białkiem nośnikowym zwiększa rozpuszczalność w wodnych, a tym samym zgodność z typowymi warunkami sprzęgania ligandów. Natomiast ślepe peptydy pochodzące z syntezy peptydów w fazie stałej mogą mieć ograniczoną rozpuszczalność w tych warunkach ze względu na ich sekwencję50, której nie można zmienić, ponieważ jest podyktowana sekwencją aminokwasową epitopu rozpoznawanego przez mAb do oczyszczenia. Inni zastosowali zatem syntezę ligandów peptydowych na żywicy51. Statyczna zdolność wiązania otrzymanej żywicy była wysoka (~80 g·L-1), ale proces przygotowania żywicy jest długotrwały, nie stwierdzono dynamicznej zdolności wiązania, a uzyskana czystość i odzysk były niższe niż w naszym podejściu. Dodatkową zaletą liganda białka fuzyjnego w skali laboratoryjnej jest to, że ligand i jego warianty mogą być szybko produkowane, oczyszczane i testowane przy minimalnym wysiłku w łatwym w użyciu systemie ekspresji o wysokiej zawartości52.
Dwa obecne ograniczenia przedstawionej tutaj metody to niska zdolność dynamicznego wiązania wynosząca 3 g·L-1 i jej 90% redukcja w ciągu 25 cykli wiązania i elucji5. Ograniczenia te można rozwiązać w przyszłości, stosując mniej rygorystyczne warunki obciążenia i zastępując obecny nośnik DsRed odpowiednio zaprojektowanym, bardziej stabilnym wariantem. Na przykład, podwojenie obecnego czasu kontaktu z 2 do 4 minut może potencjalnie podwoić zdolność dynamicznego wiązania, jak wykazano w przypadku niektórych żywic białkowych A26.
Rozwiązywanie problemów
Poniższa tabela przedstawia potencjalne problemy, które mogą wystąpić podczas korzystania z tego protokołu, oraz zawiera wskazówki, jak je rozwiązać (Tabela 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Tabela 1: Potencjalne problemy, które można napotkać, i możliwe rozwiązania.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krok protokołu</td>
			<td>Problem</td>
			<td>Couse</td>
			<td>Naprawiać</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>Rośliny nie rosną</td>
			<td>Zagrożone warunki wzrostu</td>
			<td>Sprawdź pH i przewodność nawozu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sprawdź temperaturę i warunki oświetleniowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 oraz 3</td>
			<td>Po ekstrakcji obecne są duże ilości białek komórek gospodarza</td>
			<td>Niepełne opady</td>
			<td>Sprawdź temperaturę podczas blanszowania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sprawdź mieszanie w kąpieli blanszującej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 oraz 3</td>
			<td>W ekstrakcie roślinnym nie znaleziono produktu</td>
			<td>Zbyt wysoka temperatura blanszowania</td>
			<td>Sprawdzaj temperaturę i pH podczas blanszowania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Zbyt niskie pH w buforze blanszującym</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>Po ekstrakcji pozostają duże części łodygi lub liści</td>
			<td>Niepełne mieszanie w blenderze</td>
			<td>Upewnij się, że materiał roślinny nie tworzy korka w blenderze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>Szybki wzrost ciśnienia podczas filtracji wgłębnej</td>
			<td>Nieprawidłowy wybór i/lub orientacja filtra</td>
			<td>Sprawdź typ i orientację filtra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>Mało białka fuzyjnego podczas elucji / dużo białka fuzyjnego w przepływie</td>
			<td>Żywica IMAC nie była naładowana jonami metali</td>
			<td>Sprawdź, czy żywica IMAC została prawidłowo naładowana jonami</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Białko fuzyjne utraciło znacznik powinowactwa</td>
			<td>Unikaj intensywnego nasłonecznienia i wysokich temperatur podczas uprawy roślin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>Białko fuzyjne utracone podczas koncentracji</td>
			<td>Białko fuzyjne związane z błoną</td>
			<td>Sprawdź typ membrany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Upewnij się, że współczynnik stężenia nie był zbyt wysoki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>Niska wydajność sprzęgła</td>
			<td>Nieprawidłowa sekwencja dodawania odczynnika sprzęgającego</td>
			<td>Sprawdź etykiety odczynników i kolejność dodawania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nieprawidłowe przygotowanie kolumn przed sprzęgnięciem</td>
			<td>Sprawdź warunki przygotowania kolumny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 oraz 6</td>
			<td>Niska wydajność mAb</td>
			<td>Niska ekspresja mAb w biomasie roślinnej</td>
			<td>Badanie ekspresji mAb w biomasie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Niska gęstość ligandów</td>
			<td>Sprawdź czystość preparatu białka fuzyjnego</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>Bardzo niskie/wysokie stężenia białka w teście Bradforda</td>
			<td>Powstawanie pęcherzyków powietrza podczas pipetowania</td>
			<td>Sprawdź, czy w 96-dołkowej pale nie ma pęcherzyków</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>Niskie stężenie mAb podczas pomiaru SPR</td>
			<td>Upośledzony chip białkowy A</td>
			<td>Porównaj z wynikami wzorca mAb o znanym stężeniu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nieprawidłowe rozcieńczenie próbki</td>
			<td>Sprawdzić stopień rozcieńczania i bufor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Rozwiązywanie problemów.

Produkty biotechnologiczne są istotne w leczeniu szerokiego spektrum chorób niemal we wszystkich dziedzinach medycyny1. Przeciwciała monoklonalne (mAbs) dominują na rynku produktów biotechnologicznych, a światowe przychody ze sprzedaży mają sięgnąć prawie €110 miliardów w 2020 roku2. Ulubioną platformą ekspresyjną dla mAbs są linie komórkowe chińskiego chomika (CHO), które zazwyczaj wytwarzają wysokie stężenia mAbs dochodzące do 10 g∙L-1 w osadzie po kulturze3,4. Jednak produkcja mAbs w hodowlach komórek ssaczych jest kosztowna ze względu na wysoką cenę ośrodka hodowlanego oraz konieczność przeprowadzania sterylnych procesów fermentacji5. Alternatywne platformy ekspresyjne, takie jak rośliny, mogą oferować szybsze, prostsze, tańsze i bardziej skalowalne podejście do produkcji przemysłowej6,7.
Oprócz kosztów związanych z hodowlą komórek ssaczych, powszechne wykorzystywanie chromatografii powinowactwa z białkiem A jako metody wychwytywania produktu stanowi istotny czynnik wpływający na koszty produkcji przeciwciał monoklonalnych w skali przemysłowej. Białko A występuje naturalnie na powierzchni komórek Staphylococcus aureus i wiąże się z fragmentem krystalizowalnym (Fc) niektórych przeciwciał mysich i ludzkich, pełniąc tym samym rolę mechanizmu obronnego, który pozwala uniknąć odporności humoralnej8. Dzięki wysokiej selektywności, umożliwiającej uzyskanie czystości przeciwciał monoklonalnych rzędu ~95% w jednym etapie, białko A stało się przemysłowym standardem złotym w procesie wychwytywania przeciwciał monoklonalnych z nadpołaci hodowli komórkowych i jest również powszechnie stosowane w środowisku badawczym8. Niezaskakujące jest, że sprzedaż białka A w ciągu ostatnich dwóch dekad ściśle odpowiadała dynamice sprzedaży przeciwciał monoklonalnych8. W zależności od skali produkcji, koszty związane z białkiem A mogą stanowić ponad 25% całkowitych kosztów procesu, wpływając tym samym na cenę rynkową terapeutycznych przeciwciał monoklonalnych, która może osiągać nawet €2 000 g-1 5,9. Dlatego alternatywne żywice chromatograficzne o podobnej skuteczności oczyszczania mają potencjał znacznego obniżenia kosztów produkcji, co może uczynić terapie oparte na przeciwciałach dostępniejszymi dla większej liczby pacjentów10,11,12. Takie alternatywy mogą również pozwolić na uniknięcie wad chromatografii z białkiem A, w tym surowych warunków elucji w niskim pH (zwykle &lt;3,5), które mogą powodować zmiany konformacyjne przeciwciał monoklonalnych prowadzące do ich agregacji13. Co istotne, białko A wykazuje powinowactwo wyłącznie do regionu Fc wybranych podklas IgG, wskutek czego cząsteczki nielącznikowe o skróconych domenach wiążących mogą współoczyszczać się z pełnofunkcjonalnym produktem5, podczas gdy pochodne przeciwciał monoklonalnych, takie jak fragmenty zmiennych pojedynczych łańcuchów (scFv), w ogóle nie wiążą się z białkiem A.
W niniejszej pracy opisano alternatywną żywicę do chromatografii powinowactwa służącą do izolacji neutralizującego przeciwciało monoklonalnego przeciwko HIV, mAb 2F5, z wykorzystaniem jego liniowego epitopu ELDKWA (kod jednoliterowy aminokwasów)5,14. Epitop 2F5 został genetycznie połączony z końcem C białka fluorescencyjnego DsRed, pełniącego rolę nośnika i cząsteczki raportera, a uzyskane białko DsRed-2F5-Epitop (DFE) wyprodukowano w transgenicznych roślinach tytoniu (Nicotiana tabacum). DFE oczyszczono w jednoetapowej chromatografii powinowactwa z wykorzystaniem zimmobilizowanych jonów metali (IMAC). Zimmobilizowano oczyszczony ligand powinowactwa DFE na żywicy z cross-linkowanym agarozą poprzez sprzęganie chemiczne za pomocą kolumn z cross-linkowaną agarozą aktywowaną N-hydroksysuccynimidyłem (NHS). Następnie zastosowano statystyczne projekty eksperymentalne w celu optymalizacji procedury zimmobilizowania i sprawności sprzęgania15. Strategię oczyszczania mAb 2F5 oceniono pod względem czystości przeciwciała, wydajności oraz stabilności ligandu. W przeciwieństwie do białka A, które wiąże się z regionem Fc, DFE wiązało się z regionem komplementarnie wyznaczającym (CDR) przeciwciała 2F5, co gwarantowało oczyszczanie cząsteczek z nienaruszonym paratopem. Opisywana koncepcja może być łatwo dostosowana do dowolnego przeciwciała monoklonalnego z liniowym epitopem lub do innych ligandów powinowactwa opartych na peptydach, które można łatwo zidentyfikować w badaniach mikromacierzowych16.
<img alt="Schemat procesu ekstrakcji roślin; system chromatograficzny; wynik oczyszczania białka." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat procesu przygotowania żywic o powinowactwie do epitopów, które mogą być stosowane do izolacji przeciwciał monoklonalnych z surowych ekstraktów roślinnych lub nadpozostów po kulturach komórkowych. (A) Ligand o powinowactwie DFE został wyeksprymowany w transgenicznych roślinach tytoniu. Etap sedymentacji termicznej (B) został wykonany przed homogenizacją zebranych liści (C). (D) Surowy ekstrakt roślinny został klarowany za pomocą filtracji workowej, filtracji głębokościowej oraz filtracji sterylnej 0,2 µm. (E) DFE został następnie oczyszczony metodą IMAC. (F, G) Oczyszczony ligand o powinowactwie DFE został immobilizowany na kolumnach z krzyżowanym agarozą aktywowaną EDC/NHS. (H) Kultury bakteryjne zawierające T-DNA kodujące przeciwciało 2F5 zostały wykorzystane do ekspresji chwilowej u roślin N. benthamiana (I) uprawianych w fitotronie. (J) Liście N. benthamiana zostały zebrane i przetworzone zgodnie z opisem w punkcie D. (K) Przeciwciało monoklonalne 2F5 zostało oczyszczone z klarowanego ekstraktu przy użyciu kolumn z ligandem DFE o powinowactwie (L). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Wiadro 10 l/20 l nie</td><td></td> dotyczy <td></td><td>Sprzęt do blanszowania</td></tr><tr><td>2100P Przenośny mętnościomierz</td><td>Hach</td><td>4650000</td><td>Mętnościomierz</td></tr> <tr><td>i Auml; KTApure</td><td>GE Helthcare</td><td>29018226</td><td>System chromatograficzny</td></tr><tr><td>Allegra 25R</td><td>Beckman Coulter</td><td>369434</td><td>Zestaw</td></tr><tr><td>sprzęgła aminowego</td> do wirówki GE <td>Healthcare</td><td>BR100050</td><td>SPR Zestaw sprzęgający chipy</td></tr><tr><td>Zestaw sprzęgający aminy</td> GE <td>Healthcare</td><td>BR100050</td><td>SPR Zestaw sprzęgający chipy</td></tr><tr><td>Przeciwciało 2G12</td><td>Fraunhofer IME</td><td>nie dotyczy</td><td>Norma dla SPR kwantyfikacja</td></tr><tr><td>Blender</td><td>Waring</td><td>800EG</td><td>Blender</td></tr><tr><td>BP-410</td><td>Fuhr</td><td>2632410001</td><td>Filtr workowy</td></tr><tr><td>CanoScan 5600F</td><td>Canon</td><td>2925B009</td><td>Skaner</td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa 50 ml wolnostojąca</td><td>Labomedic</td><td>1110504</td><td>Rurka reakcyjna</td></tr><tr><td>Chelatująca sefaroza FF</td><td>GE Helthcare</td><td>17-0575-01</td><td>Żywica chromatograficzna</td></tr><tr><td>Warunki 3320</td><td>WTW</td><td>EKA 3338</td><td>Konduktometr</td></tr><tr><td>Design-Expert(R) 8</td><td>Stat-Ease, Inc.</td><td>n/a</td><td>DoE software</td></tr><tr><td>Discovery Compfort</td><td>Gilson</td><td>F81029</td><td>Pipeta wielokanałowa</td></tr><tr><td>Fosforan disodowy</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4984.3</td><td>Komponent medialny</td></tr><tr><td>Różnorodne butelki</td><td>Schott Duran</td><td>n/a</td><td>Butelki</td></tr><tr><td>szklane Dri Block DB8</td><td>Techne</td><td>Z381373</td><td>Blok grzewczy</td></tr><tr><td>DsRed</td><td>Fraunhofe IME</td><td>n/a</td><td>Standart</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>8043.2</td><td>Składnik buforowy</td></tr><tr><td>EnSpire</td><td>Perkin Elmer</td><td>2390-0000</td><td>Czytnik płytek</td></tr><tr><td>ETHG-912</td><td>Oregon Scientific</td><td>086L001499-230</td><td>Termometr</td></tr><tr><td>F9-C</td><td>GE Helthcare</td><td>29027743</td><td>Kolektor frakcji</td></tr><tr><td>Ferty 2 Mega</td><td>Kammlott</td><td>5.220072</td><td>Nawóz</td></tr><tr><td>Forma - Zamrażarka ULT 86C</td><td>ThermoFisher</td><td>88400</td><td>Zamrażarka</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9105.3</td><td>Składnik buforowy</td></tr><tr><td>Wirówka Hettich Mikro 200</td><td>Wirówka</td><td>Hettich</td><td>2400</td></tr><tr><td>HiPrep 26/10</td><td>GE Helthcare</td><td>GE17-5087-01</td><td>Kolumna chromtograficzna</td></tr><tr><td>HiTrap Sepharose aktywowana przez NHS HP, 1 ml</td><td>GE Helthcare</td><td>17-0716-01</td><td>Chromatografia kolumny</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4625.1</td><td>Składnik buforowy</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3899.2</td><td>Składnik buforowy</td></tr><tr><td>K700</td><td>Pall</td><td>5302305</td><td>Warstwa filtra wgłębnego</td></tr><tr><td>KM02 basic</td><td>IKA</td><td>n/a</td><td>Mieszadło magnetyczne</td></tr><tr><td>KS50P 60D</td><td>Pall</td><td>B12486</td><td>Warstwa filtra wgłębnego</td></tr><tr><td>L/S 24</td><td>Masterflex</td><td>SN-06508-24</td><td></td></tr><tr><td>Rurka Lauda E300</td><td>Lauda Dr Wobser GmbH</td><td>Z90010</td><td>Cyrkulator zanurzeniowy</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>KK36.2</td><td>Element buforowy</td></tr><tr><td>Masterflex L/S</td><td>Masterflex</td><td>HV-77921-75</td><td>Pompa perystaltyczna</td></tr><tr><td>Minisart 0,2 i mikro; m</td><td>Sartorius</td><td>16534K</td><td>Jednostka filtrująca</td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow PES Filtr butelkowy</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>595-4520</td><td>Filtracja próżniowa SPR</td></tr><tr><td>Siarczan niklu</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>T111.1</td><td>Składnik buforowy</td></tr><tr><td>Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS żele</td><td>Invitrogen</td><td>NP0336BOX</td><td>LDS-PAA żele</td></tr><tr><td>Novex X-cell Mini Cell</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td>Komora PAGE</td></tr><tr><td>NuPAGE 20x bufor do biegania</td><td>Invitrogen</td><td>NP0002</td><td>Koncentrat buforowy</td></tr><tr><td>NuPAGE przeciwutleniacz</td><td>Invitrogen</td><td>NP0005</td><td>Przeciwutleniacz</td></tr><tr><td>PageRuler drabinka białkowa (10-180 kDa)</td><td>Invitrogen</td><td>26616</td><td>Standard białkowy</td></tr><tr><td>Perforowany bez</td><td></td><td></td><td>blanszowania</td></tr><tr><td>PH 3110</td><td>WTW</td><td>Miernik pH 2AA110</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac HC</td><td>Biorad</td><td>1645052</td><td>Moduł do elektroforezy</td></tr><tr><td>Białko A z Staphylococcus aureus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7837-5MG</td><td>Powlekanie chipów SPR</td></tr><tr><td>Sephadex G-25 drobny, usieciowany dekstran</td><td>GE Helthcare</td><td>17003301</td><td>Żywica chromatograficzna</td></tr><tr><td>Łyżka silikonowa</td><td>n/a</td> n<td>/d</td><td>Łyżka</td></tr><tr><td>Simply Blue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>Żelowy roztwór barwiący</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6773.1</td><td>Składnik buforowy</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>X891.1</td><td>Składnik medialny</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002-100G</td><td>Składnik medialny</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P029.2</td><td>Składnik buforowy</td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>HN13.2</td><td>Składnik buforowy</td></tr><tr><td>Wodorosiarczyn sodu</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>243973-100G</td><td>Składnik medialny</td></tr><tr><td>Fosforan sodu</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>T877.2</td><td>Składnik medialny</td></tr><tr><td>Czujnik powinowactwa SPR - High Capacity Amine</td><td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td><td>Układ SPR-AS-HCA</td><td>SPR</td></tr><tr><td>SPR-2/4 Plazmon powierzchniowy Analizator rezonansu</td><td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td><td>brak</td><td>urządzenia SPR</td></tr><tr><td>SSM3</td><td>Stuart</td><td>10034264</td><td>Mini Gyro-rocker</td></tr><tr><td>Podgrzewane naczynie, 20 L</td><td>Clatronic</td><td>n/a</td><td>Komora blanszowania</td></tr><tr><td>Sterylne strzykawki, 2 ml</td><td>B. Braun</td><td>4606027V</td><td>Strzykawka</td></tr><tr><td>Adpter strzykawki (Union Luer F)</td><td>GE Helthcare</td><td>181112-51</td><td>Adapter strzykawki</td></tr><tr><td>TE6101</td><td>Sartorius</td><td>TE6101</td><td>Waga precyzyjna</td></tr><tr><td>Tween-20 (Polysorbate)</td><td>Merck</td><td>8170721000</td><td>Składnik buforowy</td></tr><tr><td>Jednorożec 6.4</td><td>GE Helthcare</td><td>29056102</td><td>Oprogramowanie chromatograficzne</td></tr><tr><td>Worki</td><td>próżniowe Ikea</td><td>203.392.84</td><td>Przechowywanie roślin</td></tr><tr><td>VelaPad 60</td><td>Pall</td><td>VP60G03KNH4</td><td>Obudowa</td></tr> <tr>filtra<td>Vortex-Genie 2</td><td>Przemysł naukowy</td><td>SI-0236</td><td>Obudowa kolumny Vortex</td></tr><tr><td>XK-26/20</td><td>GE Helthcare</td><td>28-9889-48</td><td>Kolumna chromtograficzna</td></tr></tbody></table>

aktywowana usieciowana agaroza do szybkiego rozwoju żywic chromatograficznych o powinowactwie - wychwytywanie przeciwciał jako studium przypadku

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Oczyszczanie przeciwciał monoklonalnych (mAb) jest zwykle osiągane za pomocą chromatografii powinowactwa do białka A, która może stanowić do 25% całkowitych kosztów procesu. Alternatywne, ekonomiczne etapy wychwytywania są zatem cenne dla produkcji na skalę przemysłową, w której produkowane są duże ilości pojedynczego mAb. W tym miejscu przedstawiamy metodę immobilizacji liganda epitopowego na bazie DsRed do usieciowanej żywicy agarozowej, co pozwala na selektywne wychwytywanie przeciwciała neutralizującego wirusa HIV 2F5 z surowych ekstraktów roślinnych bez użycia białka A. Liniowy epitop ELDKWA został najpierw genetycznie połączony z białkiem fluorescencyjnym DsRed, a białko fuzyjne uległo ekspresji w transgenicznych roślinach tytoniu (Nicotiana tabacum) przed oczyszczeniem za pomocą immobilizowanej chromatografii powinowactwa jonów metali. Ponadto metoda oparta na aktywowanej usieciowanej agarozie została zoptymalizowana pod kątem wysokiej gęstości ligandów, wydajnego sprzężenia i niskich kosztów. pH i skład buforu oraz stężenie rozpuszczalnego liganda były najważniejszymi parametrami podczas procedury sprzęgania, która została ulepszona dzięki podejściu opartemu na projektowaniu eksperymentów. Uzyskaną żywicę powinowactwa przetestowano pod kątem jej zdolności do selektywnego wiązania docelowego mAb w surowym ekstrakcie roślinnym, a bufor elucyjny zoptymalizowano pod kątem wysokiego odzysku mAb, aktywności produktu i stabilności żywicy powinowactwa. Metodę można łatwo dostosować do innych przeciwciał z liniowymi epitopami. Nowe żywice umożliwiają łagodniejsze warunki elucji niż białko A i mogą również obniżyć koszty początkowego etapu wychwytywania do produkcji mAb.

Ekspresja i oczyszczanie ligandu powinowactwa
Białko fuzyjne DFE wyprodukowano w transgenicznych roślinach tytoniu uprawianych w szklarni. Wydajność wynosiła ~120 mg·kg-1 masy liści, przy średniej biomasie ~130 g na roślinę. Czystość DFE w surowych ekstraktach roślinnych przed blanszowaniem stanowiła &lt;5% TSP, natomiast wzrosła do ~40% po obróbce termicznej w temperaturze 70 °C przez 1,5 min, co spowodowało wytrącenie &gt;97% białek komórek gospodarza. Etap blanszowania został łatwo włączony do rutyny zbioru i ekstrakcji (Rysunek 1>) i zajął mniej niż 2 h dodatkowego czasu, wliczając w to przygotowanie kąpieli wodnej. Całkowity odzysk DFE wyniósł 23,5 mg kg1 przy czystości &gt;90%. Etapami odpowiedzialnymi za utratę produktu były blanszowanie, filtracja wgłębna oraz IMAC, z odpowiednio 40%, 27% i 45% strat specyficznych. Pojemność filtra wgłębnego wynosiła średnio 135 ± 36 L m-2 (±SD, n=3), co mieści się w górnym zakresie wartości raportowanych w literaturze21. Wydajność DFE wzrastała wraz z wiekiem rośliny (Rysunek 2).
Immobilizacja ligandu powinowactwa na kolumnach chromatograficznych aktywowanych NHS
Podczas wstępnych testów sprzęgania stwierdzono, że bufor HEPES (pH 8,3) zwiększył wydajność sprzęgania do 89 ± 6% (±SD, n=3) w porównaniu do 78 ± 9% (±SD, n=3) w przypadku buforu wodorowęglanowego zalecanego przez producenta. W związku z tym we wszystkich późniejszych eksperymentach sprzęgania zastosowano HEPES. W celu optymalizacji wydajności sprzęgania DFE z sieciowaną żywicą agarozową aktywowaną NHS wybrano podejście DoE (projektowanie eksperymentów). Bezwzględna ilość DFE unieruchomionego na żywicy wzrastała wraz z masą DFE wstrzykniętą do kolumny i osiągnęła poziom plateau przy wartości ~15 g·L-1 podczas gdy wydajność sprzęgania stale spadała wraz z wstrzykiwaniem coraz większej ilości DFE (Rysunek 2). Uzyskano również wydajność sprzęgania na poziomie &gt;o 50% niższe w buforze kwasowym, co wskazuje na konieczność analizy odpowiednich warunków sprzęgania dla każdego ligandu w oddzielnych przypadkach. Optymalne warunki pod względem wydajności sprzęgania, bezwzględnej ilości unieruchomionego DFE oraz kosztów kolumn zidentyfikowano przy użyciu narzędzia optymalizacji numerycznej oprogramowania DoE. Najbardziej pożądane warunki (pH 9,0 i 7,0 mg DFE na 1 ml sieciowanej żywicy agarozowej) znajdowały się na szerokim płaskowyżu, a zatem były stabilne. Cząsteczki DFE zachowały czerwoną fluorescencję nawet po sprzęganiu, a intensywność barwy odpowiadała całkowitej ilości unieruchomionego DFE (Rysunek 2). W związku z tym kolor kolumny może służyć jako prosty parametr kontroli jakości do oceny wydajności sprzęgania oraz jakości kolumny. Fluorescencja potwierdziła ponadto, że białko fuzyjne DFE uległo zgromadzeniu w stanie tetramerycznym natywnego białka DsRed.
<img alt="schemat elektroforezy SDS-PAGE, trójwymiarowy wykres powierzchniowy pH w funkcji masy, układ sprzężonej analizy DFE." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Optymalizacja immobilizacji DFE do sieciowanej żywicy agarozowej aktywowanej NHS. (A) żel LDS-PAA z nałożonym obrazem western blot próbek homogenatu i eluatów z ekstraktów z nieblanszowanych i blanszowanych transgenicznych roślin DFE. Zbiór roślin przeprowadzono 38, 45 lub 52 dni po wysiewie. Analizy western blot wykonano z użyciem przeciwciała anty-His6-przeciwciała5. (B) Całkowita ilość sprzężonego ligandu powinowactwa DFE w zależności od pH sprzęgania i całkowitej masy oczyszczonego DFE naniesionego na kolumny z agarozy sieciowanej aktywowanej NHS. Czerwone kropki wskazują faktyczne eksperymenty przeprowadzone w celu zbudowania modelu powierzchni odpowiedzi. (C) kolumny powinowactwa DFE po procedurze sprzęgania. Numery odpowiadają warunkom sprzęgania wyróżnionym w panelu B. dps = dni po wysianiu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Testowanie izolacji 2F5 przy użyciu żywicy powinowactwa DFE
Rekombinowane przeciwciało 2F5 wyprodukowano w sposób przejściowy w roślinach Nicotiana benthamiana hodowanych w fitotronie5. Przechwytywanie 2F5 z surowego ekstraktu roślinnego przetestowano przy użyciu kolumn powinowactwa sprzężonych z ~7,0 mg oczyszczonego DFE (krok 6). Elucja z żywic Protein A zazwyczaj wymaga zastosowania buforu kwasowego (pH ~3,3)13. W związku z tym w pierwszej kolejności oceniono różne bufory elucyjne o niskim pH (pH 6,0–3,25) dla kolumn DFE. Elucja 2F5 przebiegała pomyślnie przy wartościach pH poniżej 4,5, a najwyższy odzysk wyniósł ~35% przy pH 3,25. Jednak elucja przy niskim pH doprowadziła do inaktywacji zarówno przeciwciała (co potwierdzono spektrometrią SPR), jak i liganda DFE (na co wskazywała utrata koloru i niższa wartość DBC, Rycina 3). To ostatnie było przewidywalne, biorąc pod uwagę, że natywne DsRed denaturuje przy pH &lt;4,02,23. Aby uniknąć denaturacji produktu i liganda, przetestowano chlorek magnezu jako alternatywny czynnik elucyjny, ponieważ był on wcześniej stosowany do elucji mAb z innych żywic powinowactwa24. Stężenie chlorku magnezu wynoszące 1,25 M było wystarczające do elucji 2F5 z żywicy powinowactwa DFE, przy odzysku na poziomie 105 ± 1% (±SD, n=3) i czystości 97 ± 3% (±SD, n=3). Efektywność ta była porównywalna z żywicami Protein A25,26. Równoważna stała dysocjacji (KD) przeciwciała 2F5 oczyszczonego za pomocą DFE oraz syntetycznego liganda Fuzeon wyniosła 791 pM, podczas gdy dla odpowiednika oczyszczonego za pomocą Protein A wyniosła ona 763 pM5. Co więcej, w żywicy nie zaobserwowano znaczącej utraty koloru w ciągu łącznie 25 cykli wiązania i elucji. DBC żywicy powinowactwa DFE przy 10% prześwicie 2F5 spadało liniowo w ciągu 25 cykli do ~15% wartości początkowej (Rycina 3).
<img alt="Zmiana pH w chromatografii, cykle chlorku magnezu; wykresy stężeń elucji; wyniki analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Testowanie izolacji 2F5 z klarownych ekstraktów roślinnych przy użyciu żywic powinowactwa DFE. (A) żywice powinowactwa DFE po jednym cyklu elucji z użyciem buforów o różnych wartościach pH w zakresie 4,0–3,0 oraz te same żywice po etapie neutralizacji przy pH 6,0. (B) żywice powinowactwa DFE po jednym i sześciu cyklach oczyszczania 2F5 z użyciem 1,25 M lub 4,0 M chlorku magnezu jako eluentu. (C) Chromatogramy z eksperymentów z obciążeniem czołowym (krzywe przełomu) służące do wyznaczenia zależnej od cyklu dynamicznej pojemności wiązania żywicy DFE z użyciem chlorku magnezu jako eluentu. Krzywe przełomu zmierzono dla buforów eluujących zawierających 4,0 M i 1,25 M chlorku magnezu oraz dla różnych liczb cykli. (D) Zależna od cyklu dynamiczna pojemność wiązania DFE przy użyciu 1,25 M chlorku magnezu jako eluentu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

W tej procedurze, ligand epitopowy oparty na DsRed jest unieruchamiany w celu wytworzenia wysoce selektywnej żywicy o powinowactwie do wychwytywania przeciwciał monoklonalnych z surowych ekstraktów roślinnych lub supernatantów do hodowli komórkowych, jako alternatywa dla białka A.

Aktywowana usieciowana agaroza do szybkiego rozwoju żywic chromatograficznych o powinowactwie - wychwytywanie przeciwciał jako studium przypadku

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Przeciwciała monoklonalne dominują na rynku biofarmaceutycznym i są zazwyczaj oczyszczane za pomocą chromatografii białka A. Odpowiednia żywica jest głównym czynnikiem kosztotwórczym podczas produkcji, wpływającym na cenę terapii opartych na przeciwciałach. Tutaj opisujemy nowy ligand powinowactwa oparty na białku fluorescencyjnym, które jest odczytywane jako nośnik liniowego epitopu przeciwciała neutralizującego HIV 2F5.Ogólnie rzecz biorąc, nasza metoda pozwala na szybkie generowanie żywic chromatograficznych o powinowactwie, które mogą być używane do wychwytywania przeciwciał monoklonalnych. Wykazaliśmy tę zdolność, wychwytując przeciwciało 2F5 z surowego ekstraktu roślinnego. Zoptymalizowaliśmy warunki wychwytywania i bufor roztworu, aby poprawić zdolność dynamicznego wiązania i możliwość ponownego użycia żywicy.Nasza żywica pozwala na ogólnie luźniejsze warunki niż białko A i może potencjalnie obniżyć koszty oczyszczania przeciwciał monoklonalnych. Co więcej, żywica może być łatwo przystosowana do innych przeciwciał, które wiążą się z liniowymi epitopami. Aby rozpocząć tę procedurę, należy dostosować stężenie przygotowanego roztworu liganda powinowactwa tak, aby mieściło się w zakresie od 5 do 15 gramów na litr, jak określono w projekcie eksperymentów.Przechowywać roztwór na lodzie do momentu przygotowania reakcji sprzęgania. Następnie napełnij jedną dwumililitrową strzykawkę roztworem DFE. I przygotuj adapter do montażu strzykawek na aktywowanych przez NHS kolumnach agarozowych z usieciowaną przez NHS o objętości łoża jednego mililitra.Na każde 10 kolumn używanych do sprzęgania przygotuj 30 mililitrów roztworu dezaktywującego, 30 mililitrów roztworu o niskim pH i jeden mililitr roztworu do przechowywania. Następnie przygotuj 20 mililitrów jednego milimolowego kwasu solnego w probówce. I inkubuj go na lodzie przez co najmniej 20 minut.Przygotuj precyzyjną wagę do monitorowania przepływu frakcji dla wszystkich etapów reakcji sprzęgania. Następnie otwórz szczelną kolumnę agarozy usieciowanej aktywowaną przez NHS. Nałóż kroplę buforu na wlot adaptera, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do kolumny.Zamontuj adapter strzykawki na wlocie kolumny. Przemyć kolumnę sześcioma mililitrami lodowatego jednomilimolowego kwasu solnego o natężeniu przepływu mniejszym niż jeden mililitr na minutę. Za pomocą strzykawki o pojemności dwóch mililitrów natychmiast wstrzyknąć 1,5 mililitra roztworu DFE z szybkością przepływu mniejszą niż jeden mililitr na minutę.I zbieraj przepływ przez frakcję na precyzyjnej wadze do późniejszej analizy. Uszczelnij kolumnę na obu końcach i inkubuj przez 15 do 45 minut w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Następnie wstrzyknąć sześć mililitrów roztworu aktywacyjnego, a następnie sześć mililitrów roztworu o niskim pH, przy natężeniu przepływu mniejszym niż jeden mililitr na minutę, usunąć niekowalencyjnie związane ligandy z żywicy.Wstrzyknąć sześć mililitrów roztworu aktywacyjnego i inkubować kolumnę przez 15 minut. Następnie wstrzyknąć sześć mililitrów roztworu o niskim pH do kolumny. Następnie sześć mililitrów roztworu aktywacyjnego.Następnie wstrzyknij kolejne sześć mililitrów roztworu o niskim pH do kolumny. Wstrzyknąć dwa mililitry roztworu do przechowywania do kolumny i przechowywać go w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Najpierw przygotuj 100 mililitrów albo oczyszczonego ekstraktu roślinnego zawierającego 2F5, albo supernatantu dla preferowanego komórkowego systemu ekspresji, który również zawiera 2F5.Następnie przygotuj bufor równowagi i bufor iluzji o wysokiej sile żelaza X, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przepłukać system chromatograficzny. Zamontować kolumnę powinowactwa DFE w systemie chromatograficznym.I zrównoważyć z pięcioma CV bufora równowagi, przy natężeniu przepływu jednego mililitra na minutę. Monitoruj absorbancję UV przy 280 nanometrach. Następnie załadować 80 mililitrów oczyszczonego ekstraktu roślinnego lub supernatantu na kolumnę z natężeniem przepływu 5 mililitrów na minutę.Aby zagwarantować czas kontaktu wynoszący dwie minuty. Zebrać przepływ przez próbki w dwumililitrowych frakcjach lub rekonstrukcji krzywej przełomu. Przechowywać przepływ przez próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, jeżeli natychmiastowa analiza próbki nie jest możliwa.Następnie przemyć kolumnę 6CV buforu równoważącego. Pobrać próbkę na początku, w środku i na końcu prania. Rozcieńczyć MAB2F5 pięcioma objętościami buforu iluzji o wysokiej sile jonowej.Zbierz frakcję DFE, gdy sygnał UV o długości 280 nanometrów wzrośnie do pięciu milijednostek absorbancji powyżej linii podstawowej. Zoptymalizuj bufor iluzji dla każdej pary epitop-przeciwciało, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Białko fuzyjne DFE ulega ekspresji w transgenicznych roślinach tytoniu, uprawianych w szklarni.Całkowity odzysk DFE wynosi 23,5 miligrama na kilogram. Przy czystości ponad 90%Bezwzględna ilość DFE unieruchomionego na żywicy wzrasta wraz z masą DFE wstrzykiwanego do kolumny i utrzymuje się na poziomie około 15 gramów na litr, podczas gdy wydajność sprzężenia stale spada wraz z wtryskiwaniem większej ilości DFE. Obserwuje się, że cząsteczki DFE zachowują swój czerwony kwiatostan, nawet po sprzężeniu.Intensywność koloru odpowiada całkowitej ilości unieruchomionego DFE. Dlatego kolor kolumny może być używany jako prosty parametr kontroli jakości w celu oszacowania wydajności sprzężenia i jakości kolumny. Rekombinowane przeciwciało 2F5 jest przejściowo wytwarzane w roślinach Nicotiana benthamiana uprawianych w fitotronie.Wychwyt 2F5 z surowego ekstraktu roślinnego jest testowany przy użyciu kolumn powinowactwa w połączeniu z około siedmioma miligramami oczyszczonego DFE. Stężenie chlorku magnezu wynoszące 1,25 mola jest wystarczające do wymycia 2F5 z żywicy powinowactwa DFE z odzyskiem bliskim 100% i czystością około 97%, co jest porównywalne z żywicami białkowymi A. DBC żywicy o powinowactwie DFE przy przebiciu 10%2F5 spada liniowo w ciągu 25 cykli, do około 15% wartości początkowej.Zastosowaliśmy podejście oparte na projektowaniu eksperymentów, aby zoptymalizować zdolność sprzężenia naszego ligandu powinowactwa. Warunki te mogą być w przyszłości precyzyjnie dostosowane do innych ligandów. Nasza metoda wykorzystuje białko fluorescencyjne do nawlekania białka subnośnikowego dla liganda specyficznego dla produktu.Jednocześnie wystarczy dodać funkcje jako wizualny wskaźnik jakości procedury mobilizacji, zapewniając operatorowi natychmiastową i intuicyjną informację zwrotną.

activated-cross-linked-agarose-for-rapid-development-affinity

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przepuszczalny przez błony komórkowe czynnik sieciujący DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizuje przejściowe i nietrwałe oddziaływania in vivo, co umożliwia ich izolację przy użyciu rygorystycznych technik oczyszczania kompleksów białkowych. W niniejszym materiale przedstawiamy technikę sieciowania komórek hodowlanych, a następnie izolacji kompleksów białkowych metodą immunoprecypitacji.

Izolacja nietrwałych kompleksów wielobiałkowych za pomocą kontrolowanego sieciowania komórkowego in vivo oraz immunomagnetycznej chromatografii powinowactwa

Ten film opisuje technikę chromatografii powinowactwa do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych 2F5 za pomocą ligandów DsRed-2F5-Epitope lub DFE. Oczyszczone przeciwciała monoklonalne 2F5 są niezbędnymi lekami w immunoterapii.

Chromatografia powinowactwa oparta na DFE: technika oczyszczania przeciwciał monoklonalnych 2F5 z surowej próbki przy użyciu warunków elucji opartych na wysokiej sile jonowej

Ten film demonstruje wykrywanie chemicznie sprzężonych kompleksów przeciwciało-antygen za pomocą testu immunoenzymatycznego typu sandwich, czyli ELISA. Przechwycone przeciwciało wiąże się ze specyficznym epitopem antygenu koniugatu przeciwciało-antygen, który można później uwidocznić za pomocą przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z enzymem.

Test immunoenzymatyczny w celu weryfikacji chemicznie sprzężonych koniugatów przeciwciało-antygen

Ten film demonstruje technikę oczyszczania przeciwciał monoklonalnych z supernatantu hodowli uzyskanego z hodowli komórkowej wytwarzającej przeciwciała. Proces ten polega na wykorzystaniu matrycy usieciowanych kulek agarozy ze sprzężonym białkiem A, które unieruchamia przeciwciała w supernatancie na kulkach, co pozwala na skuteczne oddzielenie od zanieczyszczeń. Poprzez zastosowanie buforu elucyjnego o niskim pH oddziaływanie białka A z przeciwciałem zostaje rozluźnione, co ułatwia zbieranie...

Technika chromatografii powinowactwa do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych

W porównaniu z tradycyjną chromatografią powinowactwa z użyciem kolumn wypełnionych kulkami białka A, adsorbery błonowe białka A mogą znacznie przyspieszyć laboratoryjną izolację przeciwciał i innych białek wyrażających fragmenty Fc. Odpowiednie metody analizy i kwantyfikacji mogą jeszcze bardziej przyspieszyć przetwarzanie białek, pozwalając na zakończenie izolacji/charakterystyki w ciągu jednego dnia roboczego, zamiast 20+ godzin pracy.

Izolacja i charakterystyka chimerycznych ludzkich białek eksprymujących Fc przy użyciu adsorberów błonowych białka A i usprawnionego przepływu pracy

Przedstawiamy protokół do identyfikacji grup białkowych zawierających antygeny dla ludzkich i mysich przeciwciał IgM ze specyficznymi łańcuchami lekkimi kappa (Vκ). Protokół ten nie ogranicza się do przeciwciał klasy IgM, ale ma zastosowanie do wszystkich izotypów immunoglobulin, które celują w swój antygen z wystarczająco wysokim powinowactwem podczas immunoprecypitacji.

Swoistość wiązania przeciwciał dla ludzkich przeciwciał Kappa (Vκ) zawierających łańcuch lekki (IgM): kwas polisjalowy (PSA) dołączony do NCAM jako studium przypadku

Tutaj opisujemy protokoły rozbijania komórek ssaków poprzez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej, wytwarzanie ekstraktu komórkowego z powstałego proszku komórkowego i izolowanie interesujących kompleksów białkowych poprzez wychwytywanie powinowactwa na paramagnetycznych kulkach w skali mikronowej sprzężonych z przeciwciałami.

Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Demonstrujemy technologię chipową do wykonywania testów immunologicznych typu sandwich bez reaktywności krzyżowej, po prostu pstrykając dwa slajdy. Aparat zatrzaskowy służy do niezawodnego przenoszenia odczynników z mikromacierzy do mikromacierzy. Chip zatrzaskowy może być stosowany do wszelkich reakcji biochemicznych wymagających kolokalizacji różnych odczynników bez zanieczyszczenia krzyżowego.

Snap Chip do multipleksowanych testów immunologicznych typu sandwich wolnych od reaktywności krzyżowej i Spotterów

Aby dostarczyć leki przeciwnowotworowe do miejsc nowotworowych o wysokiej swoistości i zmniejszonych skutkach ubocznych, potrzebne są nowe metody oparte na nanocząsteczkach. Tutaj opisujemy usieciowane micele dwusiarczkowe, które można łatwo przygotować przez utlenianie za pośrednictwem nadtlenku wodoru i są w stanie skutecznie dysocjować w środowisku redukującym guza, aby uwolnić ładunki.

Łatwe i wydajne podejście do produkcji odwracalnych miceli usieciowanych dwusiarczkowym

Poznaj metodę szybkiej produkcji żywic chromatograficznych o powinowactwie do wychwytywania przeciwciał monoklonalnych z surowych ekstraktów roślinnych. Ta technika obniża koszty w porównaniu do chromatografii na białku A.

Aktywowana usieciowana agaroza do szybkiego rozwoju żywic chromatograficznych o powinowactwie - wychwytywanie przeciwciał jako studium przypadku (Wideo) | JoVE Journal

Aktywowana usieciowana agaroza do szybkiego rozwoju żywic chromatograficznych o powinowactwie - wychwytywanie przeciwciał jako studium przypadku

Przeglądaj więcej filmów