Aktywowana usieciowana agaroza do szybkiego rozwoju żywic chromatograficznych o powinowactwie - wychwytywanie przeciwciał jako studium przypadku

Przeciwciała monoklonalne dominują na rynku biofarmaceutycznym i są zazwyczaj oczyszczane za pomocą chromatografii białka A. Odpowiednia żywica jest głównym czynnikiem kosztotwórczym podczas produkcji, wpływającym na cenę terapii opartych na przeciwciałach. Tutaj opisujemy nowy ligand powinowactwa oparty na białku fluorescencyjnym, które jest odczytywane jako nośnik liniowego epitopu przeciwciała neutralizującego HIV 2F5.

Ogólnie rzecz biorąc, nasza metoda pozwala na szybkie generowanie żywic chromatograficznych o powinowactwie, które mogą być używane do wychwytywania przeciwciał monoklonalnych. Wykazaliśmy tę zdolność, wychwytując przeciwciało 2F5 z surowego ekstraktu roślinnego. Zoptymalizowaliśmy warunki wychwytywania i bufor roztworu, aby poprawić zdolność dynamicznego wiązania i możliwość ponownego użycia żywicy.

Nasza żywica pozwala na ogólnie luźniejsze warunki niż białko A i może potencjalnie obniżyć koszty oczyszczania przeciwciał monoklonalnych. Co więcej, żywica może być łatwo przystosowana do innych przeciwciał, które wiążą się z liniowymi epitopami. Aby rozpocząć tę procedurę, należy dostosować stężenie przygotowanego roztworu liganda powinowactwa tak, aby mieściło się w zakresie od 5 do 15 gramów na litr, jak określono w projekcie eksperymentów.

Przechowywać roztwór na lodzie do momentu przygotowania reakcji sprzęgania. Następnie napełnij jedną dwumililitrową strzykawkę roztworem DFE. I przygotuj adapter do montażu strzykawek na aktywowanych przez NHS kolumnach agarozowych z usieciowaną przez NHS o objętości łoża jednego mililitra.

Na każde 10 kolumn używanych do sprzęgania przygotuj 30 mililitrów roztworu dezaktywującego, 30 mililitrów roztworu o niskim pH i jeden mililitr roztworu do przechowywania. Następnie przygotuj 20 mililitrów jednego milimolowego kwasu solnego w probówce. I inkubuj go na lodzie przez co najmniej 20 minut.

Przygotuj precyzyjną wagę do monitorowania przepływu frakcji dla wszystkich etapów reakcji sprzęgania. Następnie otwórz szczelną kolumnę agarozy usieciowanej aktywowaną przez NHS. Nałóż kroplę buforu na wlot adaptera, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do kolumny.

Zamontuj adapter strzykawki na wlocie kolumny. Przemyć kolumnę sześcioma mililitrami lodowatego jednomilimolowego kwasu solnego o natężeniu przepływu mniejszym niż jeden mililitr na minutę. Za pomocą strzykawki o pojemności dwóch mililitrów natychmiast wstrzyknąć 1,5 mililitra roztworu DFE z szybkością przepływu mniejszą niż jeden mililitr na minutę.

I zbieraj przepływ przez frakcję na precyzyjnej wadze do późniejszej analizy. Uszczelnij kolumnę na obu końcach i inkubuj przez 15 do 45 minut w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Następnie wstrzyknąć sześć mililitrów roztworu aktywacyjnego, a następnie sześć mililitrów roztworu o niskim pH, przy natężeniu przepływu mniejszym niż jeden mililitr na minutę, usunąć niekowalencyjnie związane ligandy z żywicy.

Wstrzyknąć sześć mililitrów roztworu aktywacyjnego i inkubować kolumnę przez 15 minut. Następnie wstrzyknąć sześć mililitrów roztworu o niskim pH do kolumny. Następnie sześć mililitrów roztworu aktywacyjnego.

Następnie wstrzyknij kolejne sześć mililitrów roztworu o niskim pH do kolumny. Wstrzyknąć dwa mililitry roztworu do przechowywania do kolumny i przechowywać go w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Najpierw przygotuj 100 mililitrów albo oczyszczonego ekstraktu roślinnego zawierającego 2F5, albo supernatantu dla preferowanego komórkowego systemu ekspresji, który również zawiera 2F5.

Następnie przygotuj bufor równowagi i bufor iluzji o wysokiej sile żelaza X, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przepłukać system chromatograficzny. Zamontować kolumnę powinowactwa DFE w systemie chromatograficznym.

I zrównoważyć z pięcioma CV bufora równowagi, przy natężeniu przepływu jednego mililitra na minutę. Monitoruj absorbancję UV przy 280 nanometrach. Następnie załadować 80 mililitrów oczyszczonego ekstraktu roślinnego lub supernatantu na kolumnę z natężeniem przepływu 5 mililitrów na minutę.

Aby zagwarantować czas kontaktu wynoszący dwie minuty. Zebrać przepływ przez próbki w dwumililitrowych frakcjach lub rekonstrukcji krzywej przełomu. Przechowywać przepływ przez próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, jeżeli natychmiastowa analiza próbki nie jest możliwa.

Następnie przemyć kolumnę 6CV buforu równoważącego. Pobrać próbkę na początku, w środku i na końcu prania. Rozcieńczyć MAB2F5 pięcioma objętościami buforu iluzji o wysokiej sile jonowej.

Zbierz frakcję DFE, gdy sygnał UV o długości 280 nanometrów wzrośnie do pięciu milijednostek absorbancji powyżej linii podstawowej. Zoptymalizuj bufor iluzji dla każdej pary epitop-przeciwciało, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Białko fuzyjne DFE ulega ekspresji w transgenicznych roślinach tytoniu, uprawianych w szklarni.

Całkowity odzysk DFE wynosi 23,5 miligrama na kilogram. Przy czystości ponad 90%Bezwzględna ilość DFE unieruchomionego na żywicy wzrasta wraz z masą DFE wstrzykiwanego do kolumny i utrzymuje się na poziomie około 15 gramów na litr, podczas gdy wydajność sprzężenia stale spada wraz z wtryskiwaniem większej ilości DFE. Obserwuje się, że cząsteczki DFE zachowują swój czerwony kwiatostan, nawet po sprzężeniu.

Intensywność koloru odpowiada całkowitej ilości unieruchomionego DFE. Dlatego kolor kolumny może być używany jako prosty parametr kontroli jakości w celu oszacowania wydajności sprzężenia i jakości kolumny. Rekombinowane przeciwciało 2F5 jest przejściowo wytwarzane w roślinach Nicotiana benthamiana uprawianych w fitotronie.

Wychwyt 2F5 z surowego ekstraktu roślinnego jest testowany przy użyciu kolumn powinowactwa w połączeniu z około siedmioma miligramami oczyszczonego DFE. Stężenie chlorku magnezu wynoszące 1,25 mola jest wystarczające do wymycia 2F5 z żywicy powinowactwa DFE z odzyskiem bliskim 100% i czystością około 97%, co jest porównywalne z żywicami białkowymi A. DBC żywicy o powinowactwie DFE przy przebiciu 10%2F5 spada liniowo w ciągu 25 cykli, do około 15% wartości początkowej.

Zastosowaliśmy podejście oparte na projektowaniu eksperymentów, aby zoptymalizować zdolność sprzężenia naszego ligandu powinowactwa. Warunki te mogą być w przyszłości precyzyjnie dostosowane do innych ligandów. Nasza metoda wykorzystuje białko fluorescencyjne do nawlekania białka subnośnikowego dla liganda specyficznego dla produktu.

Jednocześnie wystarczy dodać funkcje jako wizualny wskaźnik jakości procedury mobilizacji, zapewniając operatorowi natychmiastową i intuicyjną informację zwrotną.