Aktywowana usieciowana agaroza do szybkiego rozwoju żywic chromatograficznych o powinowactwie - wychwytywanie przeciwciał jako studium przypadku
August 16th, 2019
W tej procedurze, ligand epitopowy oparty na DsRed jest unieruchamiany w celu wytworzenia wysoce selektywnej żywicy o powinowactwie do wychwytywania przeciwciał monoklonalnych z surowych ekstraktów roślinnych lub supernatantów do hodowli komórkowych, jako alternatywa dla białka A.
Przeciwciała monoklonalne dominują na rynku biofarmaceutycznym i są zazwyczaj oczyszczane za pomocą chromatografii białka A. Odpowiednia żywica jest głównym czynnikiem kosztotwórczym podczas produkcji, wpływającym na cenę terapii opartych na przeciwciałach. Tutaj opisujemy nowy ligand powinowactwa oparty na białku fluorescencyjnym, które jest odczytywane jako nośnik liniowego epitopu przeciwciała neutralizującego HIV 2F5.
Ogólnie rzecz biorąc, nasza metoda pozwala na szybkie generowanie żywic chromatograficznych o powinowactwie, które mogą być używane do wychwytywania przeciwciał monoklonalnych. Wykazaliśmy tę zdolność, wychwytując przeciwciało 2F5 z surowego ekstraktu roślinnego. Zoptymalizowaliśmy warunki wychwytywania i bufor roztworu, aby poprawić zdolność dynamicznego wiązania i możliwość ponownego użycia żywicy.
Nasza żywica pozwala na ogólnie luźniejsze warunki niż białko A i może potencjalnie obniżyć koszty oczyszczania przeciwciał monoklonalnych. Co więcej, żywica może być łatwo przystosowana do innych przeciwciał, które wiążą się z liniowymi epitopami. Aby rozpocząć tę procedurę, należy dostosować stężenie przygotowanego roztworu liganda powinowactwa tak, aby mieściło się w zakresie od 5 do 15 gramów na litr, jak określono w projekcie eksperymentów.
Przechowywać roztwór na lodzie do momentu przygotowania reakcji sprzęgania. Następnie napełnij jedną dwumililitrową strzykawkę roztworem DFE. I przygotuj adapter do montażu strzykawek na aktywowanych przez NHS kolumnach agarozowych z usieciowaną przez NHS o objętości łoża jednego mililitra.
Na każde 10 kolumn używanych do sprzęgania przygotuj 30 mililitrów roztworu dezaktywującego, 30 mililitrów roztworu o niskim pH i jeden mililitr roztworu do przechowywania. Następnie przygotuj 20 mililitrów jednego milimolowego kwasu solnego w probówce. I inkubuj go na lodzie przez co najmniej 20 minut.
Przygotuj precyzyjną wagę do monitorowania przepływu frakcji dla wszystkich etapów reakcji sprzęgania. Następnie otwórz szczelną kolumnę agarozy usieciowanej aktywowaną przez NHS. Nałóż kroplę buforu na wlot adaptera, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do kolumny.
Zamontuj adapter strzykawki na wlocie kolumny. Przemyć kolumnę sześcioma mililitrami lodowatego jednomilimolowego kwasu solnego o natężeniu przepływu mniejszym niż jeden mililitr na minutę. Za pomocą strzykawki o pojemności dwóch mililitrów natychmiast wstrzyknąć 1,5 mililitra roztworu DFE z szybkością przepływu mniejszą niż jeden mililitr na minutę.
I zbieraj przepływ przez frakcję na precyzyjnej wadze do późniejszej analizy. Uszczelnij kolumnę na obu końcach i inkubuj przez 15 do 45 minut w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Następnie wstrzyknąć sześć mililitrów roztworu aktywacyjnego, a następnie sześć mililitrów roztworu o niskim pH, przy natężeniu przepływu mniejszym niż jeden mililitr na minutę, usunąć niekowalencyjnie związane ligandy z żywicy.
Wstrzyknąć sześć mililitrów roztworu aktywacyjnego i inkubować kolumnę przez 15 minut. Następnie wstrzyknąć sześć mililitrów roztworu o niskim pH do kolumny. Następnie sześć mililitrów roztworu aktywacyjnego.
Następnie wstrzyknij kolejne sześć mililitrów roztworu o niskim pH do kolumny. Wstrzyknąć dwa mililitry roztworu do przechowywania do kolumny i przechowywać go w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Najpierw przygotuj 100 mililitrów albo oczyszczonego ekstraktu roślinnego zawierającego 2F5, albo supernatantu dla preferowanego komórkowego systemu ekspresji, który również zawiera 2F5.
Następnie przygotuj bufor równowagi i bufor iluzji o wysokiej sile żelaza X, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przepłukać system chromatograficzny. Zamontować kolumnę powinowactwa DFE w systemie chromatograficznym.
I zrównoważyć z pięcioma CV bufora równowagi, przy natężeniu przepływu jednego mililitra na minutę. Monitoruj absorbancję UV przy 280 nanometrach. Następnie załadować 80 mililitrów oczyszczonego ekstraktu roślinnego lub supernatantu na kolumnę z natężeniem przepływu 5 mililitrów na minutę.
Aby zagwarantować czas kontaktu wynoszący dwie minuty. Zebrać przepływ przez próbki w dwumililitrowych frakcjach lub rekonstrukcji krzywej przełomu. Przechowywać przepływ przez próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, jeżeli natychmiastowa analiza próbki nie jest możliwa.
Następnie przemyć kolumnę 6CV buforu równoważącego. Pobrać próbkę na początku, w środku i na końcu prania. Rozcieńczyć MAB2F5 pięcioma objętościami buforu iluzji o wysokiej sile jonowej.
Zbierz frakcję DFE, gdy sygnał UV o długości 280 nanometrów wzrośnie do pięciu milijednostek absorbancji powyżej linii podstawowej. Zoptymalizuj bufor iluzji dla każdej pary epitop-przeciwciało, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Białko fuzyjne DFE ulega ekspresji w transgenicznych roślinach tytoniu, uprawianych w szklarni.
Całkowity odzysk DFE wynosi 23,5 miligrama na kilogram. Przy czystości ponad 90%Bezwzględna ilość DFE unieruchomionego na żywicy wzrasta wraz z masą DFE wstrzykiwanego do kolumny i utrzymuje się na poziomie około 15 gramów na litr, podczas gdy wydajność sprzężenia stale spada wraz z wtryskiwaniem większej ilości DFE. Obserwuje się, że cząsteczki DFE zachowują swój czerwony kwiatostan, nawet po sprzężeniu.
Intensywność koloru odpowiada całkowitej ilości unieruchomionego DFE. Dlatego kolor kolumny może być używany jako prosty parametr kontroli jakości w celu oszacowania wydajności sprzężenia i jakości kolumny. Rekombinowane przeciwciało 2F5 jest przejściowo wytwarzane w roślinach Nicotiana benthamiana uprawianych w fitotronie.
Wychwyt 2F5 z surowego ekstraktu roślinnego jest testowany przy użyciu kolumn powinowactwa w połączeniu z około siedmioma miligramami oczyszczonego DFE. Stężenie chlorku magnezu wynoszące 1,25 mola jest wystarczające do wymycia 2F5 z żywicy powinowactwa DFE z odzyskiem bliskim 100% i czystością około 97%, co jest porównywalne z żywicami białkowymi A. DBC żywicy o powinowactwie DFE przy przebiciu 10%2F5 spada liniowo w ciągu 25 cykli, do około 15% wartości początkowej.
Zastosowaliśmy podejście oparte na projektowaniu eksperymentów, aby zoptymalizować zdolność sprzężenia naszego ligandu powinowactwa. Warunki te mogą być w przyszłości precyzyjnie dostosowane do innych ligandów. Nasza metoda wykorzystuje białko fluorescencyjne do nawlekania białka subnośnikowego dla liganda specyficznego dla produktu.
Jednocześnie wystarczy dodać funkcje jako wizualny wskaźnik jakości procedury mobilizacji, zapewniając operatorowi natychmiastową i intuicyjną informację zwrotną.
Przegląd
To badanie prezentuje nową żywicę powinowactwa opartą na DsRed do selektywnego uchwytywania przeciwciał monoklonalnych z surowych ekstraktów roślinnych lub nadstanów kultur komórkowych. Metoda ma na celu zmniejszenie kosztów oczyszczania w porównaniu z tradycyjną chromatografią na białku A.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Biotechnologia
- Oczyszczanie białek
- Przeciwciała monoklonalne
Tło
- Przeciwciała monoklonalne są kluczowe w biofarmaceutykach.
- Chromatografia na białku A jest powszechną, ale kosztowną metodą oczyszczania.
- Potrzebne są nowe metody, aby obniżyć koszty produkcji.
- Fluorescencyjne białka mogą być wykorzystane do chromatografii powinowactwa.
Cel badania
- Rozwój alternatywnej żywicy powinowactwa do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych.
- Optymalizacja warunków uchwytywania dla poprawionej pojemności wiązania.
- Wykazanie przystosowania żywicy do różnych przeciwciał.
Zastosowane metody
- Przygotowanie roztworu ligandu powinowactwa opartego na DsRed.
- Łączenie ligandu z kolumnami agarozy aktywowanymi NHS.
- Testowanie żywicy z klaryfikowanymi ekstraktami roślinnymi zawierającymi przeciwciała.
- Monitorowanie absorbancji UV podczas etapów oczyszczania.
Główne wyniki
- Nowa żywica umożliwia efektywne uchwytywanie przeciwciał o wysokiej czystości.
- Osiągnięto stopień odzysku prawie 100% dla testowanych przeciwciał.
- Żywica wykazała lepszą ponowną używalność w porównaniu z białkiem A.
- Efektywność łączenia może być wizualnie monitorowana poprzez fluorescencje.
Wnioski
- Żywica oparta na DsRed jest obiecującą alternatywą do oczyszczania przeciwciał.
- Może potencjalnie obniżyć koszty w produkcji biofarmaceutyków.
- Przyszłe adaptacje dla innych przeciwciał są możliwe.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Protein A chromatography remains a major cost driver in monoclonal antibody purification, impacting the affordability of biologics. This method presents a cost-effective alternative using a DsRed-based affinity ligand immobilized on activated cross-linked agarose, enabling selective capture of antibodies with linear epitopes from crude extracts. The approach supports early-stage target validation and assay development by providing a reusable, visually quantifiable resin system that reduces reliance on expensive ligands.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through selective capture of epitope-specific antibodies from complex mixtures.
- Operational Value: Supports biological de-risking by validating target engagement using a linear epitope ligand expressed in plant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized affinity matrix for quantitative measurement of antibody binding in crude extracts.
- Operational Value: Enables assay standardization and reproducibility through fluorescence-based coupling efficiency monitoring.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates translational biomarker alignment by allowing purification of functional antibodies from disease-relevant expression systems.
- Operational Value: Supports predictive confidence in lead identification through consistent recovery and purity across multiple cycles.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation to lead identification, offering a platform for rapid resin generation applicable to multiple antibody targets with linear epitopes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling isolation of specific antibodies from complex biological samples.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via UV absorbance monitoring and fluorescence-coupled ligand quantification.
- Analytics: Provides measurable readouts such as dynamic binding capacity and recovery rates to compare purification conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by producing purified antibodies suitable for functional validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for rapid adaptation to new antibody targets through ligand exchange.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in antibody-ligand interactions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of resin production using design-of-experiments optimization.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early purification feasibility.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on achievable purity and recovery metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein expression, purification, and conjugation chemistry.
- Needs instrumentation for flow-controlled coupling, UV monitoring, and fraction collection.
- Demands cross-team standardization of ligand concentration, buffer conditions, and coupling timelines.
- Involves adaptation considerations for different epitope-antibody pairs, particularly in optimizing elution buffers.
- Includes practical limitations such as ligand leaching over cycles and declining dynamic binding capacity with reuse.
