Name: Metody badań chloroplastów: badanie celowania, lokalizacji i interakcji białek chloroplastów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 2 min 45 s
Description: Poznaj metody badania importu i lokalizacji białek chloroplastów w Arabidopsis thaliana. Techniki in vitro i in vivo umożliwiają analizę kompleksów białkowych TOC/TIC oraz frakcjonowanie suborganellarne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania w laboratorium autora są finansowane przez Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC; referencje grantowe BB/N006372/1, BB/R005591/1, BB/R009333/1, BB/R016984/1).

<ol><li>Jarvis, P., López-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li>
<li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+import+into+chloroplasts+isolated+from+stressed+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).</li>
<li>Aronsson, H., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+isolating+import-competent+Arabidopsis+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts.</a> FEBS Letters. 529 (2-3), 215-220 (2002).</li>
<li>Fitzpatrick, L. M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+isolating+a+high+yield+of+Arabidopsis+chloroplasts+capable+of+efficient+import+of+precursor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A method for isolating a high yield of Arabidopsis chloroplasts capable of efficient import of precursor proteins.</a> Plant Journal. 27 (1), 59-65 (2001).</li>
<li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chloroplast+protein+import+by+the+ubiquitin+E3+ligase+SP1+is+important+for+stress+tolerance+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of chloroplast protein import by the ubiquitin E3 ligase SP1 is important for stress tolerance in plants.</a> Current Biology. 25 (19), 2527-2534 (2015).</li>
<li>Lee, J., Kang, H., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+import+into+chloroplasts+using+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Studying protein import into chloroplasts using protoplasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).</li>
<li>Asher, A., Ganesan, I., Klasek, L., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+physiologically+active+thylakoids+and+their+use+in+energy-dependent+protein+transport+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), (2018).</li>
<li>Bouchnak, I., Moyet, L., Salvi, D., Kuntz, M., Rolland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+chloroplast+sub-compartments+from+Arabidopsis+for+the+analysis+of+protein+Localization+by+immunoblotting+or+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of chloroplast sub-compartments from Arabidopsis for the analysis of protein Localization by immunoblotting or proteomics.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li>
<li>Salvi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AT_CHLORO%3A+the+first+step+when+looking+for+information+about+subplastidial+localization+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">AT_CHLORO: the first step when looking for information about subplastidial localization of proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1829, 395-406 (2018).</li>
<li>Shanmugabalaji, V., Douet, V., Agne, B., Kessler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+chloroplast+translocon+protein+complexes+using+the+TAP+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of chloroplast translocon protein complexes using the TAP tag.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), (2018).</li>
<li>Kikuchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ycf2-FtsHi+heteromeric+AAA-ATPase+complex+is+required+for+chloroplast+protein+import%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A Ycf2-FtsHi heteromeric AAA-ATPase complex is required for chloroplast protein import.</a> Plant Cell. 30 (11), 2677-2703 (2018).</li>
<li>Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thylakoid+membrane+protein+complexes+by+blue+native+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), (2018).</li>
<li>Kikuchi, S., Hirohashi, T., Nakai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+preprotein+translocon+at+the+outer+envelope+membrane+of+chloroplasts+by+blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the preprotein translocon at the outer envelope membrane of chloroplasts by blue native PAGE.</a> Plant and Cell Physiology. 47 (3), 363-371 (2006).</li>
<li>Chen, L. J., Li, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+megadalton+TOC-TIC+supercomplexes+as+major+mediators+of+protein+import+into+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Stable megadalton TOC-TIC supercomplexes as major mediators of protein import into chloroplasts.</a> Plant Journal. 92 (2), 178-188 (2017).</li>
<li>Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJarvis%2C+RP+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. JM, W. alker 775, Humana Press. New York City. 432(2011).</li>
<li>Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJarvis%2C+RP+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. JM, W. alker 774, Humana Press. New York City. 374(2011).</li>
</ol>

Komercyjne zastosowanie badań autora obejmuje zgłoszenia patentowe GB1803833.1, GB1803834.9, GB1815206.6 oraz US 16/643507.

Chloroplasty to organelle definiujące rośliny1. Obok wielu innych funkcji metabolicznych, rozwojowych i sygnalizacyjnych, chloroplasty odpowiadają za fotosyntezę – proces, w którym energia słoneczna jest wykorzystywana do zasilania komórkowych aktywności życia. W związku z tym chloroplasty są niezbędne nie tylko dla roślin, ale także dla licznych ekosystemów zależnych od roślin oraz dla rolnictwa. Chloroplasty składają się z tysięcy różnych białek, z których większość jest kodowana w jądrach i importowana z cytosolu, zanim zostanie wewnętrznie skierowana do jednego z wyraźnie odrębnych przedziałów wewnątrznarządowych1. Aby uzyskać pełniejsze zrozumienie rozwoju i funkcji chloroplastów oraz umożliwić biotechnologiczne strategie związane z manipulacją chloroplastami, które odpowiadają na globalne wyzwania związane z bezpieczeństwem żywnościowym lub bioenergią, konieczne będzie określenie celowania, lokalizacji i interakcji ważnych białek chloroplastów. Ta kolekcja metod opisuje zestaw krytycznie ważnych i uzupełniających się technik, które mogą być użyte do realizacji tych celów. Kolekcja koncentruje się głównie na szeroko stosowanej roślinie modelowej Arabidopsis thaliana (rzeżucha thale), ale metody te mogą być również adaptowane i stosowane do innych organizmów.
Zbiór zawiera opisy dwóch różnych technik analizy importu białek zakodowanych przez jądro do chloroplastów przez podwójną błonę. Artykuł autorstwa Ling i Jarvis2 opisuje metodę in vitro, w której izolowane chloroplasty są inkubowane z radioaktywnie znakowanym białkiem prekursorowym. Stopień, w jakim chloroplasty pobierają białko prekursorowe, określa się poprzez monitorowanie zmiany rozmiaru białka w wyniku rozszczepienia peptydów transytowych (celujących w sekwencję lidera), przy użyciu SDS-PAGE i obrazowania fosforowego. Przedstawiona metoda jest rozwinięciem podejścia, które od kilku dekad jest stosowane do badania importu białka chloroplastowego in vitro(3,4), i zawiera dodatkowe kroki umożliwiające ocenę reakcji urządzeń importowych na warunki stresowe doświadczane przez roślinę5. Z kolei artykuł autorstwa Lee i in.6 opisuje metodę in vivo opartą na przejściowej ekspresji chimerycznego białka prekursorowego, niosącego domenę fluorescencyjną, w nienaruszonych komórkach (protoplastach). W tym badaniu zakres importu białka chloroplastowego można śledzić na dwa sposoby: monitorując lokalizację i intensywność sygnału fluorescencyjnego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej; oraz analizując zmianę rozmiaru białka zachodzącą w wyniku rozszczepienia peptydów tranzytowych za pomocą immunoblottingu. Te dwie metody są bardzo komplementarne i mogą przynieść przekonujące rezultaty, gdy są stosowane równolegle5.
Po zaimportowaniu białka przez otoczkę do chloroplastu i usunięciu jego peptydu tranzytowego, może ono przyjąć swoją ostateczną konformację w stromie (głównym wewnętrznym wodnym przedziale organelli) lub uruchomić jeden z kilku wewnętrznych szlaków sortujących1. Jako miejsce bardzo licznych kompleksów fotosyntetycznych, błony tylakoidalne są głównym celem takiego wewnętrznego sortowania; W rzeczywistości celowanie w białko thylakoid obejmuje wiele mechanistycznie odrębnych szlaków. Artykuł autorstwa Ashera i in.7 opisuje szereg metod in vitro, które umożliwiają badanie różnych szlaków translokacji białek tarczakowych. Metody te polegają na inkubacji izolowanych tylakoidów z radioaktywnie znakowanym białkiem prekursorowym oraz, w niektórych przypadkach, z koncentrowanym ekstraktem stromalnym. Stopień, w jakim białko jest pobierane przez tylakoidy, jest monitorowany poprzez ocenę rozszczepienia sygnału docelowego oraz ochronę białka przed egzogennie aplikowaną termolizyną, przy użyciu SDS-PAGE i obrazowania fosforowego. Oczywiście tylakoidy nie są jedynym podprzedziałem chloroplastu i często pożądane jest posiadanie możliwości oceny innych przedziałów. W tym kontekście szczególnie ważny jest artykuł Bouchnaka i in.8 , ponieważ opisuje metody subfrakcjonacji chloroplastów w celu uzyskania wysokoczystych próbek odpowiadających błonom otoczkowym, stromom i tylakoidom. Po przygotowaniu frakcje te mogą być analizowane za pomocą immunoblottingu i/lub spektrometrii masowej, aby dostarczyć bogatych informacji na temat suborganellarnej lokalizacji białek chloroplastów9.
W odniesieniu do analizy interakcji białko-białko oraz zespołów kompleksów wielobiałkowych, w zbiorze opisane są dwie różne metodologie. Artykuł autorstwa Shanmugabalaji i in.10 przedstawia metodę oczyszczania powinowactwa wielobiałkowych kompleksów chloroplastów. Technika ta polega na analizie roślin transgenicznych wyrażających komponent interesującego kompleksu, który został zaprojektowany tak, aby nosił tag powinowactwa (tzw. tag oczyszczania powinowactwa tandemowego, czyli TAP). Zdolność tego tagu do silnego wiązania się z macierzą intymną jest wykorzystywana jako część strategii oczyszczania. Przedstawiona metoda koncentruje się szczególnie na oczyszczaniu mechanizmu importu białek chloroplastowych (obejmuje to kompleksy wielobiałkowe zwane TOC i TIC osadzone w błonach otoczkowych1), ale w zasadzie może być dostosowana do badania dowolnego z innych zespołów wielobiałkowych występujących w chloroplastach11. Artykuł autorstwa Rantala i in.12 opisuje uzupełniające podejście do charakteryzacji złożonej oparte na elektroforezie w warunkach natywnych. Technika ta, przedstawiona tutaj, polega na uwalnianiu kompleksów fotosyntetycznych z oczyszczonych tylakoidów przy użyciu łagodnego, niejonowego detergentu, a następnie ich rozdzielaniu za pomocą niebieskiego (BN)-PAGE. Pierwotna rozdzielczość kompleksów może być następowana przez drugi wymiar elektroforezy w warunkach denaturacji, co umożliwia wizualizację poszczególnych składników każdego kompleksu zidentyfikowanych w pierwszym wymiarze. Podobnie jak w metodzie TAP, to natywne podejście PAGE można z powodzeniem zaadaptować do badania innych kompleksów białkowych w organellu13,14. W obu przypadkach oczyszczone kompleksy można analizować na różne sposoby, w tym za pomocą immunoblotingu i spektrometrii mas.
Razem artykuły zawarte w tej kolekcji metod stanowią potężny zestaw technik uzupełniających, które w połączeniu z istniejącymi zasobami15,16 mogą znacznie pogłębić nasze zrozumienie różnych aspektów biogenezy i funkcji chloroplastów, szczególnie tych ściśle związanych z proteomem organellarnym. Ponieważ chloroplasty odpowiadają za większość naziemnej produkcji fotosyntetycznej, a ponadto odgrywają kluczową rolę w reakcjach roślin na środowisko (w tym zarówno na stresy biotyczne, jak i abiotyczne), te niezwykłe organelle nieuchronnie pozostaną głównym obszarem badań podstawowych i stosowanych na całym świecie przez wiele lat.

metody badań chloroplastów: badanie celowania, lokalizacji i interakcji białek chloroplastów

Chloroplast Research Methods: Probing The Targeting, Localization And Interactions Of Chloroplast Proteins

Metody badań chloroplastów: badanie celowania, lokalizacji i interakcji białek chloroplastów

Chloroplasts are the organelles that define plants1. Along with many other metabolic, developmental and signaling functions, chloroplasts are responsible ...

Witamy w kolekcjach JoVE Methods Collections on Chloroplast Research Methods, kuratorowanych przez naszego gościnnego redaktora, Paula Jarvisa. Zbiór ten obejmuje szeroki zakres technik in vitro i in vivo, które charakteryzują interakcje białek wewnątrz chloroplastów. Naukowcy z Uniwersytetu Oksfordzkiego opisują metodę in vitro z wykorzystaniem izolowanych chloroplastów, które są inkubowane z białkami znakowanymi radioaktywnie w celu monitorowania ich pobierania.Ta metoda jest rozwinięciem wcześniejszych metod stosowanych do badania importu białka chloroplastowego in vitro. Następnie, w metodzie uzupełniającej, bada się import białka chloroplastowego in vivo. Metoda ta wykorzystuje przejściową ekspresję białek chimerycznych i protoplastów do badania zmian rozmiaru białek i lokalizacji za pomocą mikroskopii immunoblottingowej i fluorescencyjnej.W tym filmie metodycznym autorzy przeanalizowali system błony tarczycy obecny w chloroplastach. Dzięki izolacji błon szlaki translokacji białek są wyjaśniane w chloroplastach za pomocą SDS-PAGE oraz obrazowania fosforowego. Naukowcy we Francji stosują różne metody wirowania do izolacji podprzedziałów występujących w chloroplastach.Te izolowane frakcje komórkowe są następnie analizowane za pomocą immunoblottingu i proteomiki, aby dostarczyć informacji o suborganellarnej lokalizacji białek chloroplastów. Następnie szwajcarscy naukowcy wykorzystali oczyszczanie powinowactwa wielobiałkowych kompleksów chloroplastów do zbadania mechanizmów molekularnych zaangażowanych w import białek. Konkretnie kompleksy wielobiałkowe talk i tick osadzone w błonach otoczkowych.W podejściu uzupełniającym naukowcy charakteryzują kompleks białka białka tylakoidalnego roślin u Arabidopsis za pomocą Blue Native PAGE, czyli BN-PAGE, który umożliwia rozdzielanie kompleksów białkowych w ich rodzimej i funkcjonalnej formie. Kompleksy są dalej analizowane za pomocą 2D SDS-PAGE. Właśnie mieliście wgląd w różne metody badania białek chloroplastów w naszej kolekcji metod JoVE.Artykuły można obejrzeć szczegółowo na stronie Chloroplast Research Methods Collection, widocznej pod linkiem na ekranie.

chloroplast-research-methods-probing-targeting-localization

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisane porównawcze, ilościowe podejście proteomiczne ma na celu uzyskanie wglądu w skład kompleksów wielobiałkowych w różnych warunkach i jest demonstrowane przez porównanie genetycznie różnych szczepów. Do analizy ilościowej równe objętości różnych frakcji z gradientu gęstości sacharozy miesza się i analizuje za pomocą spektrometrii mas.

Nowe podejście do analizy porównawczej kompleksów wielobiałkowych oparte na znakowaniu metabolicznym 15N i ilościowej spektrometrii mas

Tworzenie kompleksów białkowych in vivo można wizualizować za pomocą dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Partnerzy interakcji są łączeni z komplementarnymi częściami znaczników fluorescencyjnych i przejściowo ulegają ekspresji w liściach tytoniu, co skutkuje odtworzonym sygnałem fluorescencyjnym po bliskim zbliżeniu dwóch białek.

Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

Tutaj opisujemy nową metodę badania importu białek do izolowanych chloroplastów pod wpływem stresu. Metoda jest szybka i prosta i może być stosowana do badania konsekwencji różnych warunków stresowych dla importu białka chloroplastowego i odpowiednich mechanizmów regulacyjnych.

Analiza importu białek do chloroplastów wyizolowanych z roślin zestresowanych

Tutaj prezentujemy protokół przechwytywania interaktomii zastosowany do protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana. Metoda ta opiera się w dużej mierze na sieciowaniu UV in vivo i pozwala na izolację i identyfikację białek wiążących mRNA roślin ze środowiska fizjologicznego.

Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

Prezentujemy tutaj protokoły do wysokowydajnej izolacji fizjologicznie aktywnych tylakoidów i testów transportu białek dla szlaków translokacji bliźniaczej argininy chloroplastów (cpTat), wydzielniczej (cpSec1) i rozpoznawania sygnałów cząstek (cpSRP).

Izolacja fizjologicznie aktywnych tylakoidów i ich zastosowanie w testach transportu białek zależnych od energii

Tutaj opisujemy protokół ekspresji białek do protoplastów za pomocą metody transformacji za pośrednictwem PEG. Metoda ta zapewnia łatwą ekspresję białek będących przedmiotem zainteresowania oraz efektywne badanie lokalizacji białek i procesu importu dla różnych warunków eksperymentalnych in vivo.

Badanie importu białek do chloroplastów przy użyciu protoplastów

Prezentujemy tutaj sprawdzony i przetestowany protokół oczyszczania kompleksów importujących białka chloroplastowe (kompleks TOC-TIC) za pomocą znacznika TAP. Jednoetapowy protokół izolacji powinowactwa może być potencjalnie zastosowany do dowolnego białka i może być wykorzystany do identyfikacji nowych partnerów interakcji za pomocą spektrometrii mas.

Oczyszczanie powinowactwa kompleksów białkowych chloroplastów translokonu za pomocą znacznika TAP

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania nienaruszonych chloroplastów z liści Arabidopsis i ich trzech głównych podkomór (otoczka, zrąb i tylakoidy), używając kombinacji wirowania różnicowego, ciągłych gradientów Percoll i nieciągłych gradientów sacharozy. Metoda ta jest cenna dla subplastydialnej i subkomórkowej lokalizacji białek za pomocą immunoblottingu i proteomiki.

Przygotowanie podkompartmentów chloroplastowych z Arabidopsis do analizy lokalizacji białek za pomocą immunoblottingu lub proteomiki

Wiele gatunków roślin zmienia położenie chloroplastów, aby zoptymalizować absorpcję światła. Protokół ten opisuje, jak używać prostego, zbudowanego w domu instrumentu do badania ruchu chloroplastów w liściach Arabidopsis thaliana przy użyciu zmian w transmisji światła przez liść jako proxy.

Wykorzystanie zmian w transmisji liści do zbadania ruchu chloroplastów u Arabidopsis thaliana

Potrzeba nowych podejść do badania miejsc kontaktu z błoną (MCS) wzrosła ze względu na rosnące zainteresowanie badaniem tych struktur komórkowych i ich składników. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który integruje wcześniej dostępne technologie mikroskopowe w celu identyfikacji i ilościowego określenia kompleksów białkowych wewnątrz organelli i między organellami, które znajdują się w MCS.

Wizualizacja i kwantyfikacja endogennych interakcji białek wewnątrz organelli w miejscach kontaktu ER-mitochondria za pomocą testów ligacji zbliżeniowej

Poznaj metody badania importu i lokalizacji białek chloroplastów w Arabidopsis thaliana. Techniki in vitro i in vivo umożliwiają analizę kompleksów białkowych TOC/TIC oraz frakcjonowanie suborganellarne.

Metody badań chloroplastów: badanie celowania, lokalizacji i interakcji białek chloroplastów

Przeglądaj więcej filmów