Name: Mikromacierze DNA i RNA o dużej gęstości - synteza fotolitograficzna, hybrydyzacja i przygotowanie dużych bibliotek kwasów nukleinowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Poznaj metody fotolitograficznej syntezy mikromacierzy DNA i RNA oraz przygotowania dużych bibliotek kwasów nukleinowych. Technika ta umożliwia równoległe tworzenie setek tysięcy unikalnych sekwencji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Austriacki Fundusz Naukowy (granty FWF P23797, P27275 i P30596) oraz Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (Grant #PBBEP2_146174).

<ol><li>Bumgarner, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBumgarner%2C+R+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22">Current protocols in molecular biology</a>. 101, 22(2013).</li>
<li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+protein-binding+microarrays+for+the+comprehensive+characterization+of+the+DNA-binding+specificities+of+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors.</a> Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).</li>
<li>Tietjen, J. R., Donato, L. J., Bhimisaria, D., Ansari, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-specificity+and+energy+landscapes+of+DNA-binding+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Sequence-specificity and energy landscapes of DNA-binding molecules.</a> Methods in enzymology. 497, 3-30 (2011).</li>
<li>Katilius, E., Flores, C., Woodbury, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+sequence+space+of+a+DNA+aptamer+using+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Exploring the sequence space of a DNA aptamer using microarrays.</a> Nucleic Acids Research. 35 (22), 7626-7635 (2007).</li>
<li>Franssen-van Hal, N. L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Light-Directed+Synthesis+of+Aptamer+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Optimized Light-Directed Synthesis of Aptamer Microarrays.</a> Analytical Chemistry. 85 (12), 5950-5957 (2013).</li>
<li>Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+Chemistry+.4.+Synthesis+of+Deoxyoligonucleotides+on+a+Polymer+Support%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Nucleotide Chemistry .4. Synthesis of Deoxyoligonucleotides on a Polymer Support.</a> Journal of the American Chemical Society. 103 (11), 3185-3191 (1981).</li>
<li>Eroshenko, N., Kosuri, S., Marblestone, A. H., Conway, N., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Assembly+from+Chip-Synthesized+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene Assembly from Chip-Synthesized Oligonucleotides.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 2012, (2012).</li>
<li>Kosuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+gene+synthesis+by+selective+amplification+of+DNA+pools+from+high-fidelity+microchips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Scalable gene synthesis by selective amplification of DNA pools from high-fidelity microchips.</a> Nature Biotechnology. 28 (12), 1295(2010).</li>
<li>Richmond, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+and+assembly+of+chip-eluted+DNA+%28AACED%29%3A+a+method+for+high-throughput+gene+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Amplification and assembly of chip-eluted DNA (AACED): a method for high-throughput gene synthesis.</a> Nucleic Acids Research. 32 (17), 5011-5018 (2004).</li>
<li>Schmidt, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+amplification+of+strand+subsets+from+chip-synthesized+oligonucleotide+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Scalable amplification of strand subsets from chip-synthesized oligonucleotide libraries.</a> Nature Communications. 6, (2015).</li>
<li>Grass, R. N., Heckel, R., Puddu, M., Paunescu, D., Stark, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Chemical+Preservation+of+Digital+Information+on+DNA+in+Silica+with+Error-Correcting+Codes%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Robust Chemical Preservation of Digital Information on DNA in Silica with Error-Correcting Codes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (8), 2552-2555 (2015).</li>
<li>Erlich, Y., Zielinski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Fountain+enables+a+robust+and+efficient+storage+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA Fountain enables a robust and efficient storage architecture.</a> Science. 355 (6328), 950-953 (2017).</li>
<li>Garalde, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+direct+RNA+sequencing+on+an+array+of+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores.</a> Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).</li>
<li>Cleary, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+complex+nucleic+acid+libraries+using+highly+parallel+in+situ+oligonucleotide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Production of complex nucleic acid libraries using highly parallel in situ oligonucleotide synthesis.</a> Nature Methods. 1 (3), 241-248 (2004).</li>
<li>LeProust, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+high-quality+libraries+of+long+%28150mer%29+oligonucleotides+by+a+novel+depurination+controlled+process%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Synthesis of high-quality libraries of long (150mer) oligonucleotides by a novel depurination controlled process.</a> Nucleic Acids Research. 38 (8), 2522-2540 (2010).</li>
<li>Lietard, J., Damha, M. J., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLietard%2C+J+%22Enzymatic+and+Chemical+Synthesis+of+Nucleic+Acid+Derivatives%22">Enzymatic and Chemical Synthesis of Nucleic Acid Derivatives</a>. Fernández-Lucas, J. , Wiley Online Books. (2018).</li>
<li>Fodor, S. P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+Addressable+Parallel+Chemical+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatially Addressable Parallel Chemical Synthesis.</a> Science. 251 (4995), 767-773 (1991).</li>
<li>Singh-Gasson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maskless+fabrication+of+light-directed+oligonucleotide+microarrays+using+a+digital+micromirror+array%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Maskless fabrication of light-directed oligonucleotide microarrays using a digital micromirror array.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 974-978 (1999).</li>
<li>Pease, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Generated+Oligonucleotide+Arrays+for+Rapid+DNA-Sequence+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Light-Generated Oligonucleotide Arrays for Rapid DNA-Sequence Analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (11), 5022-5026 (1994).</li>
<li>Holz, K., Lietard, J., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Power+365+nm+UV+LED+Mercury+Arc+Lamp+Replacement+for+Photochemistry+and+Chemical+Photolithography%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sustainable+Chemistry+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">High-Power 365 nm UV LED Mercury Arc Lamp Replacement for Photochemistry and Chemical Photolithography.</a> ACS Sustainable Chemistry & Engineering. 5 (1), 828-834 (2017).</li>
<li>Lackey, J. G., Mitra, D., Somoza, M. M., Cerrina, F., Damha, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetal+Levulinyl+Ester+%28ALE%29+Groups+for+2%E2%80%B2-Hydroxyl+Protection+of+Ribonucleosides+in+the+Synthesis+of+Oligoribonucleotides+on+Glass+and+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Acetal Levulinyl Ester (ALE) Groups for 2′-Hydroxyl Protection of Ribonucleosides in the Synthesis of Oligoribonucleotides on Glass and Microarrays.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (24), 8496-8502 (2009).</li>
<li>Lackey, J. G., Somoza, M. M., Mitra, D., Cerrina, F., Damha, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-situ+chemical+synthesis+of+rU-DNA+chimeras+on+chips+and+enzymatic+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Chimica+Oggi-Chemistry+Today%22%5BJournal%5D)">In-situ chemical synthesis of rU-DNA chimeras on chips and enzymatic recognition.</a> Chimica Oggi-Chemistry Today. 27 (6), 30-33 (2009).</li>
<li>Lietard, J., Ameur, D., Damha, M., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+RNA+microarrays+synthesized+in+situ+by+photolithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">High-density RNA microarrays synthesized in situ by photolithography.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (46), 15257-15261 (2018).</li>
<li>Agbavwe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency%2C+Error+and+Yield+in+Light-Directed+Maskless+Synthesis+of+DNA+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficiency, Error and Yield in Light-Directed Maskless Synthesis of DNA Microarrays.</a> Journal of Nanobiotechnology. 9, (2011).</li>
<li>Sack, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Express+photolithographic+DNA+microarray+synthesis+with+optimized+chemistry+and+high-efficiency+photolabile+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Express photolithographic DNA microarray synthesis with optimized chemistry and high-efficiency photolabile groups.</a> Journal of Nanobiotechnology. 14, (2016).</li>
<li>Kretschy, N., Holik, A. K., Somoza, V., Stengele, K. P., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-Generation+o-Nitrobenzyl+Photolabile+Groups+for+Light-Directed+Chemistry+and+Microarray+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Next-Generation o-Nitrobenzyl Photolabile Groups for Light-Directed Chemistry and Microarray Synthesis.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (29), 8555-8559 (2015).</li>
<li>Sack, M., Kretschy, N., Rohm, B., Somoza, V., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Light-Directed+Synthesis+of+Mirror-Image+Microarrays+in+a+Photochemical+Reaction+Cell+with+Flare+Suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Light-Directed Synthesis of Mirror-Image Microarrays in a Photochemical Reaction Cell with Flare Suppression.</a> Analytical Chemistry. 85 (18), 8513-8517 (2013).</li>
<li>Lietard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base-cleavable+microarrays+for+the+characterization+of+DNA+and+RNA+oligonucleotides+synthesized+in+situ+by+photolithography%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Base-cleavable microarrays for the characterization of DNA and RNA oligonucleotides synthesized in situ by photolithography.</a> Chemical Communications. 50 (85), 12903-12906 (2014).</li>
<li>Krotz, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+stability+and+degradation+pathway+of+deoxyribonucleoside+phosphoramidites+in+acetonitrile%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleosides+Nucleotides+%26+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Solution stability and degradation pathway of deoxyribonucleoside phosphoramidites in acetonitrile.</a> Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids. 23 (5), 767-775 (2004).</li>
<li>Hargreaves, J. S., Kaiser, R., Wolber, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Degradation+of+Dg+Phosphoramidites+in+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleosides+Nucleotides+%26+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">The Degradation of Dg Phosphoramidites in Solution.</a> Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids. 34 (10), 691-707 (2015).</li>
<li>McGall, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+light-directed+synthesis+of+DNA+arrays+on+glass+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">The efficiency of light-directed synthesis of DNA arrays on glass substrates.</a> Journal of the American Chemical Society. 119 (22), 5081-5090 (1997).</li>
<li>Collett, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+RNA+microarrays+for+high-throughput+screening+of+antiprotein+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Functional RNA microarrays for high-throughput screening of antiprotein aptamers.</a> Analytical Biochemistry. 338 (1), 113-123 (2005).</li>
<li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+RNA-protein+interactions+on+a+massively+parallel+array+reveals+biophysical+and+evolutionary+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of RNA-protein interactions on a massively parallel array reveals biophysical and evolutionary landscapes.</a> Nature Biotechnology. 32 (6), 562-568 (2014).</li>
<li>Wu, C. -H., Holden, M. T., Smith, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+Fabrication+of+High-Density+RNA+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Enzymatic Fabrication of High-Density RNA Arrays.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13514-13517 (2014).</li>
<li>Tian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+multiplex+gene+synthesis+from+programmable+DNA+microchips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Accurate multiplex gene synthesis from programmable DNA microchips.</a> Nature. 432 (7020), 1050-1054 (2004).</li>
<li>Lietard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+affinity+landscape+of+Thrombin-binding+aptamers+on+2%27F-ANA%2FDNA+chimeric+G-Quadruplex+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Mapping the affinity landscape of Thrombin-binding aptamers on 2'F-ANA/DNA chimeric G-Quadruplex microarrays.</a> Nucleic Acids Research. 45 (4), 1619-1632 (2017).</li>
</ol>

Autorzy zaświadczają, że nie są powiązani z żadną organizacją nastawioną na zysk.

Synteza DNA i RNA w fazie stałej jest chlebem powszednim każdego laboratorium chemicznego kwasów nukleinowych i chociaż dodanie komponentu fotolitograficznego jest niewątpliwie złożoną operacją, wytwarzanie mikromacierzy za pośrednictwem światła UV jest również bardzo niezawodnym procesem. Jest to ponadto jedyna dostępna metoda syntezy RNA in situ na mikromacierzach. Mimo to, jak w każdej wieloetapowej procedurze eksperymentalnej, istnieje duże pole do błędu ludzkiego.
Być może najbardziej krytycznym krokiem jest sprzężenie fosforamidytu, ponieważ musi to być reakcja chemiczna o stałej wysokiej wydajności, aby zapewnić oligonukleotydy z niewielką liczbą błędów syntetycznych. W naszym protokole syntezy mikromacierzy sprzężenie fosforamidytu ma jeszcze większe znaczenie dla ogólnej jakości syntezy, ponieważ proces wytwarzania omija ograniczanie i zapobiega oczyszczaniu oligonukleotydów. Dla wszystkich światłoczułych fosforoamidynów DNA i RNA obliczono stopniową sprawność sprzęgania powyżej 99%, nawet dla bardzo krótkich czasów sprzęgania (15 s)24, ale czasami mogą wystąpić niższe wydajności sprzęgania, szczególnie w przypadku amidynów dG. Stabilność rozpuszczonych fosforoamidynów w temperaturze pokojowej była badana już wcześniej i wykazano, że zależy od charakteru zasady nukleotydowej, przy czym fosforoamidyty guanozyny są podatne na rozległą degradację w ciągu zaledwie kilku dni29,30. Jednak przy przechowywaniu w temperaturze -25 °C, fosforamidyty dG rozpuszczone w ACN jako roztwór 30 mM okazały się stabilne przez kilka tygodni. Względna niestabilność roztworów fosforoamidytu dG w temperaturze pokojowej oznacza jednak, że nie powinny one być podłączone do syntezatora DNA przez kilka dni.
W przypadku fosforoamidynów RNA wydajność sprzęgania jest bardzo zależna od jakości fosforoamidytu (którą można ocenić za pomocą spektroskopii 31P NMR) i czasu sprzężenia. Konieczne wydaje się stosowanie czasów sprzęgania wynoszących 5 minut dla rA, rG, rC i 2 minuty dla rU. Rzeczywiście, odkryliśmy, że skrócenie czasu kondensacji do 2 minut dla wszystkich fosforoamidynów RNA doprowadziło do znacznie niższych sygnałów hybrydyzacji.
Sam syntezator DNA, podobnie jak odczynniki i rozpuszczalniki, z pewnością musi być tak czysty, jak to tylko możliwe, aby osiągnąć najwyższą wydajność syntezy oligonukleotydów. Jednak nierozpuszczalny materiał, sole lub cząstki, mogą z czasem gromadzić się w przewodach i rurkach systemu dostarczania, prowadząc do stopniowego zmniejszania zużycia odczynników i reagentów. Tam, gdzie ogólne czyszczenie syntezatora nie rozwiązuje problemu niskiej głośności wyjściowej, alternatywnym rozwiązaniem może być zwiększenie liczby impulsów. Szczególnie przydatna w przypadku niskiego zużycia fosforoamidytu jest możliwość modyfikacji linii w protokole sprzęgania odpowiadającej pompowaniu mieszaniny fosforoamidytu i aktywatora (trzecia linia podsekcji sprzęganie w tabeli 1 i tabeli 2) z 6 do 9 impulsów bez odczuwalnego negatywnego wpływu na jakość syntezy. Ponadto liczba impulsów aktywatora potrzebnych do doprowadzenia mieszaniny amidytu/aktywatora do substratu syntezy (obecnie 6, czwarta linia w podsekcji sprzężenia, patrz Tabela 1 i Tabela 2) zależy od samego syntezatora DNA, a także od długości rurki w komórce syntezy. Liczbę tę można dostosować po zastąpieniu fosforoamidytu kolorowym roztworem i zliczeniu liczby impulsów potrzebnych do wypchnięcia kolorowej mieszanki na szklane podłoże w celu sprzężenia.
Opisana w niniejszym artykule metoda pozwala na równoczesne przeprowadzanie syntezy DNA i RNA na tej samej mikromacierzy. Hybrydy DNA i RNA mogą być również przygotowywane bez żadnych zmian w protokołach wytwarzania macierzy i pod warunkiem, że przestrzegany jest trzyetapowy protokół deprotekcji. Należy jednak zauważyć, że mikromacierze zawierające tylko RNA wymagają tylko dwuetapowej deprotekcji: najpierw decyanoetylacji za pomocą Et3N, a następnie deprotekcji hydroksylowej i zasadowej za pomocą hydrazyny. Stwierdzono, że zasady nukleotydowe DNA nie są całkowicie pozbawione ochrony w tych warunkach i wymagają dodatkowego kroku w EDA, aby doprowadzić do całkowitego usunięcia grup fenoksyacetylowych (Pac). To dodatkowe leczenie EDA jest krótsze (5 minut) niż w przypadku standardowej deprotekcji mikromacierzy DNA31, ale jest wystarczające, aby doprowadzić je do końca po zabiegach trietyloaminą i hydrazyną. Ponadto krótki czas reakcji z EDA ogranicza narażenie w pełni zdechronionego oligonukleotydu RNA na warunki podstawowe.
Przewagą syntezy macierzy RNA in situ nad alternatywnymi metodami, takimi jak plamienie lub transkrypcja DNA 32,33,34, jest możliwość przechowywania zsyntetyzowanego mikrochipa RNA w postaci chronionej do momentu użycia, co pozwala uniknąć ryzyka potencjalnej degradacji RNA. Z drugiej strony, procedury postsyntetyczne dla RNA oznaczają, że materiały eksploatacyjne i odczynniki są utrzymywane w sterylności, a obchodzenie się z nimi odbywa się w warunkach wolnych od RNaz. Warto zauważyć, że dodanie inhibitora RNazy do mieszanki hybrydyzacyjnej nie dało silniejszych sygnałów hybrydyzacji dla cech RNA.
Synteza bibliotek DNA na wrażliwym na zasady monomerze jest bardziej złożona niż synteza kilku sekwencji kontrolnych na powierzchni i jako taka jest z pewnością bardziej podatna na błędy projektowe. Zakładając jednak, że projekt sekwencji (tj. natura i liczba sekwencji) jest poprawny, przekształcenie tej listy w zbiór masek ekspozycji i uporządkowaną serię cykli sprzęgania pozostaje prostym procesem. Istnieją jednak istotne różnice w stosunku do standardowej syntezy mikromacierzy, które mają kluczowe znaczenie dla pomyślnego wytworzenia tablicy bibliotecznej o dużej gęstości.
Po pierwsze, wrażliwy na zasady monomer dT jest sprzężony jako pierwszy fosforamidyn po syntezie łącznika. Stwierdzono, że wydajność sprzęgania tego monomeru (rysunek 1) jest stosunkowo niska, około 85%28, dlatego też podejmowane są wysiłki w celu poprawy szybkości jego włączania, albo poprzez zwiększenie jego stężenia w ACN z 30 mM do 50 mM, albo poprzez powtórzenie etapu sprzęgania: dwie następujące po sobie reakcje sprzęgania przy użyciu świeżych monomerów lub dwa oddzielne, ale następujące po sobie cykle sprzęgania.
Drugą zmianą jest dodanie roztworu β-karotenu w tylnej komorze komórki syntezy, który wygodnie pochłania światło o długości fali 365 nm. Jest to ważna modyfikacja konfiguracji fotolitografii, ponieważ zapobiega odbijaniu się światła UV z powrotem na podłoże matrycy. Rzeczywiście, po przejściu przez ośrodek śródmiąższowy między podłożami, wpadające światło UV wydostaje się przez wywiercony szkiełko i dociera do kwarcowego bloku komórki. Równania Fresnela przewidują, że ~ 4% prostopadle padającego światła UV odbije się od każdego z trzech dalszych interfejsów powietrze-szkło (strona wyjściowa 2. substratu i obie strony bloku kwarcowego) i z powrotem na substrat syntezy, prowadząc do niezamierzonej ekspozycji fotochronionych oligonukleotydów. Dyfrakcja i rozpraszanie również przyczyniają się do fotodeprotekcji "poza celem", a tym samym do insercji nukleotydów, co bezpośrednio wpływa na wskaźnik błędów syntezy, ale wkłady te są znacznie mniejsze niż odbicia i można je rozwiązać głównie poprzez zmniejszenie gęstości syntezy (pozostawiając przerwy między cechami). Odkryliśmy, że poziom roztworu β-karotenu w dolnej komorze komórki ma tendencję do nieznacznego obniżania się tylko w pierwszych minutach syntezy macierzy, dlatego musi być monitorowany i ponownie dostosowywany.
Wreszcie trzecią zmianą jest roztwór deprotekcyjny, zastępujący EtOH toluenem, który utrzymuje rozszczepioną bibliotekę DNA związaną z powierzchnią, prawdopodobnie poprzez oddziaływania elektrostatyczne. Nałożenie niewielkiej ilości wody na obszar syntezy po umyciu ACN pozwala na wygodne gromadzenie biblioteki. Proces ten jest jednak skuteczny tylko wtedy, gdy zawartość wody w EDA i toluenie jest minimalna, co sprawia, że kwas nukleinowy jest całkowicie nierozpuszczalny w koktajlu deprotekcyjnym. Alternatywnie, biblioteki DNA można odciąć od chipa za pomocą amoniaku 9,10,14,35, a następnie następnie odbezpieczyć przez podgrzanie wodnego roztworu amoniaku zawierającego DNA do temperatury 55 °C przez noc. Odzyskiwanie bibliotek DNA za pomocą amoniaku nie jest jednak zgodne z RNA. Oligonukleotydy RNA na podłożu rozszczepialnym przez zasadę mogą być eluowane z powierzchni przy użyciu tej samej procedury EDA/toluenu opisanej powyżej, ale tylko na przedostatnim etapie po dwuetapowej strategii deprotekcji Et3N i hydrazyny28.
Istnieją alternatywne strategie odzyskiwania pul oligonukleotydowych z mikromacierzy bez konieczności specjalnego leczenia podstawowego, są one zasadniczo zgodne z fotolitografią i opierają się na wykorzystaniu enzymów. Na przykład pojedynczy nukleotyd deoksyuracylu może być celem glikozylazy uracylo-DNA (UDG) i wycięty z reszty sekwencji DNA lub pojedyncza jednostka RNA może być rozpoznana przez enzymy RNazy H typu 2 i wiązanie fosfodiestrowe 5' z rozszczepionym RNA, uwalniając część 5' DNA23.
Mamy teraz potężną, niezawodną i gęstą metodę syntezy DNA, RNA i hybrydowych mikromacierzy DNA/RNA. Mogą one służyć nie tylko jako platformy do hybrydyzacji lub testów wiązania36, ale także stanowią szybki i niedrogi sposób tworzenia złożonych bibliotek kwasów nukleinowych. W przypadku cyfrowego przechowywania danych opartych na DNA, fotolitografia mikromacierzowa może stać się potencjalnym rozwiązaniem wąskiego gardła "zapisu" (tj. kodowania informacji przez syntezę). Sukces w cyfrowym kodowaniu DNA i składaniu genów de novo zależy od wierności sekwencji, która na poziomie syntezy przekłada się na poziom błędów. Błędy syntetyczne i optyczne w naszych obecnych protokołach produkcji matryc zostaną omówione i omówione w innym miejscu. Równolegle prowadzone są prace mające na celu dalsze zwiększanie skali produkcji i przepustowości.

Praktyczne zastosowanie mikromacierzy DNA tradycyjnie polegało na badaniu różnic w poziomach ekspresji genów między dwiema populacjami komórek, przy użyciu nici komplementarnych i fluorescencji jako metody wykrywania1. Od czasu do czasu mikromacierze DNA zapuszczają się w wiązania z ligandami niebędącymi kwasami nukleinowymi, takimi jak białka, ze strategią systematycznej permutacji sekwencji, która oferuje kompleksowy przegląd krajobrazu wiązań2,3,4,5. Podejście to skutecznie przekształca mikromacierze ze zwykłych powierzchni hybrydyzacyjnych w platformy o szerokim pokryciu sekwencji, co byłoby atutem w badaniu bogatszego i bardziej złożonego świata struktury i funkcji RNA. Wspierane przez niezwykle wydajną reakcję sprzęgania fosforoamidytu6, zsyntetyzowane macierze DNA in situ mogą być teraz również uważane za tanie źródło DNA7, co staje się szczególnie istotne, biorąc pod uwagę stale rosnące zapotrzebowanie na materiał kwasu nukleinowego do składania genów8,9, nanostruktury oparte na DNA10, przechowywanie lub sekwencjonowanie informacji11,12. Podobnie, technologie sekwencjonowania prawdopodobnie skorzystają na rozwoju metod, które dają bardzo złożone mieszaniny oligonukleotydów RNA13. W tym kontekście, protokoły wytwarzania macierzy, które pozwalają na syntezę oligonukleotydów in situ i przy dużej gęstości, są idealnie przygotowane do zaspokojenia potrzeb szybko rozwijającej się dziedziny biotechnologii kwasów nukleinowych. Jednak w tak różnorodnej dziedzinie, jaką jest biotechnologia, cel każdej aplikacji może wymagać, aby DNA na mikromacierzy było wytwarzane albo z wysoką przepustowością, albo z bardzo małą liczbą błędów syntetycznych14,15, lub jedno i drugie, co wymaga bliższego przyjrzenia się protokołom syntezy mikromacierzy DNA, które historycznie były przede wszystkim optymalizowane pod kątem testów hybrydyzacji. Tymczasem stwierdzono, że synteza in situ mikromacierzy RNA jest trudnym przedsięwzięciem, z większością trudności związanych z grupą ochronną dla funkcji 2'-OH, zwykle ugrupowania sililowego w standardowej syntezie w fazie stałej, które jest usuwane za pomocą odczynników na bazie fluoru, substancji chemicznych, które są niekompatybilne z powierzchniami szklanymi lub krzemowymi. Te zagadnienia i wyzwania związane z syntezą mikromacierzy DNA i RNA były ostatnio przedmiotem wielu prac, w szczególności w zakresie podejścia do fotolitografii16.
Fotolitografia wykorzystuje światło UV do odblokowywania oligonukleotydów przed sprzężeniem i wymaga masek do konstruowania wzoru ekspozycji na promieniowanie UV, tym samym przestrzennie organizując i kontrolując wzrost oligonukleotydów. Maski fizyczne zostały zastąpione sterowanymi komputerowo mikrolustrami, których przechylenie selektywnie odbija światło UV na podłoże mikromacierzy17,18,19. Jako źródło UV używamy światła 365 nm ze źródła LED o dużej mocy20. Obecne układy fotolitograficzne są wyposażone w układy mikroluster zawierające od 1024 × 768 luster, odpowiadających ponad 780 000 indywidualnie adresowalnych punktów ("cech") na małej powierzchni zaledwie 1,4cm2 lub 1080p z matrycami od 1920 × 1080, czyli >2 miliona luster. Każde z luster w urządzeniu ma zatem bezpośrednią kontrolę nad sekwencją wyhodowaną na odpowiedniej funkcji. Z wyjątkiem światła UV, fotolitografia działa jak technika syntezy w fazie stałej i przyjmuje chemię fosforamidytu opartą na cyklu. Tyle tylko, że wymaga to zupełnie innej strategii ochrony, aby synteza RNA zakończyła się sukcesem. Opracowaliśmy nową serię światłoczułych fosforamidynów RNA zawierających grupy chroniące przed labilnością hydrazyny21. Monomery te pozwalają na deprotekcję RNA w łagodnych warunkach, które nie wpływają na integralność powierzchni. Pierwszy etap deprotekcji wykorzystuje trietyloaminę do usunięcia grup ochronnych fosfodiestru cyjanoetylu, podczas gdy hydrazyna jest stosowana w drugim, oddzielnym etapie do usunięcia tych o funkcjach 2'-OH i amin egzocyklicznych. W ten sposób oligonukleotydy RNA o długości ~30-nt i dowolnej sekwencji mogą być teraz syntetyzowane in situ na mikromacierzach22,23. Równolegle niedawno zaczęliśmy zajmować się kwestiami przepustowości, jakości i szybkości w fotolitografii DNA i RNA. Zmierzyliśmy wydajność sprzężenia >99% dla wszystkich amidynów DNA i RNA (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) i zbadaliśmy każdy pojedynczy etap cyklu wydłużania oligonukleotydów, od czasu utleniania, przez wybór aktywatora i optymalną ekspozycję na promieniowanie UV24,25. Wprowadziliśmy nowe światłoczułe grupy ochronne 5', które można usunąć w ciągu zaledwie kilku sekund, przekształcając syntezę setek tysięcy 100merów w kilkugodzinny proces26. Podwoiliśmy również przepustowość produkcji tablic, udostępniając jednocześnie dwa podłoża27. Na koniec wprowadziliśmy fosforoamidyn dT zawierający wrażliwą na zasady grupę sukcynylową jako wygodny sposób rozszczepiania, zbierania i analizowania oligonukleotydów DNA i RNA, co ma kluczowe znaczenie dla przygotowania biblioteki28.
Pomimo stosunkowo przyziemnego aspektu syntezy DNA i RNA w fazie stałej, szczególnie dla chemików kwasów nukleinowych, fotolitografia mikromacierzy pozostaje nietrywialnym ulepszeniem, wymagającym skomplikowanej konfiguracji, starannej kontroli i nadzoru nad procesem oraz oddzielnych instrukcji do obsługi po syntezie, w zależności od charakteru oligonukleotydu i rodzaju zastosowania. W tym artykule pragniemy szczegółowo przedstawić całą procedurę syntezy in situ mikromacierzy DNA i RNA metodą fotolitografii, od projektu eksperymentalnego po analizę danych, z naciskiem na przygotowanie instrumentów i materiałów eksploatacyjnych. Następnie opisujemy postsyntetyczne metody deprotekcji, które odpowiadają zamierzonemu celowi wytwarzania mikromacierzy (tj. hybrydyzacja lub odzyskiwanie bibliotek kwasów nukleinowych).

<table><tbody><tr><td>Slide funkcjonalizacja</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>kwas octowy >99,8%</td><td>Sigma</td><td>33209</td><td>Do deprotekcji RNA</td></tr><tr><td>router CNC</td><td>Stepcraft</td><td>300 CK</td><td></td></tr><tr><td>Absolut etanolu</td><td>VWR</td><td>1.07017.2511</td><td>Do deprotekcji i funkcjonalizacji</td></tr><tr><td>N-(3-trietoksysililopropylo)-4-hydroksymaślanu</td><td>Gelest</td><td>SIT8189.5</td><td>Odczynnik do schylania sitowia</td></tr><tr><td>Nexterion Glass D Szkiełka mikroskopowe</td><td>Schott</td><td>1095568</td><td></td></tr><tr><td>Polymax 1040</td><td>Heidolph</td><td></td><td>Wytrząsarka orbitalna</td></tr><tr><td>Proclean 507 Ultradźwiękowa kąpiel wodna</td><td>Ulsonix</td><td></td><td>Do czyszczenia szkiełek po wierceniu</td></tr><tr><td>Tickopur RW 77 Środek do czyszczenia specjalnego celu</td><td>Sigma</td><td>Z860086</td><td>Do czyszczenia szkiełek po wierceniu</td></tr><tr><td>Synteza mikromacierzy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,25 M dicyjanoimidazol w aktywatorze ACN</td><td>Biosolve</td><td>0004712402BS</td><td></td></tr><tr><td>0,7 XGA DMD</td><td>Texas Instruments</td><td></td><td>Cyfrowe urządzenie do mikrolustra</td></tr><tr><td>20 mM I2 w pirydynie/H2O/THF</td><td>Sigma</td><td>L860020-06</td><td>Utleniacz</td></tr><tr><td>250 &mu; m gruby Chemraz 584 perfluoroelastomer</td><td>FFKM</td><td></td><td>Dolna uszczelka teflonowa</td></tr><tr><td>2'-O-ALE Fosforamidyty RNA</td><td>ChemGenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>365 nm UV-LED o dużej mocy</td><td>Nichia</td><td>NVSU333A</td><td></td></tr><tr><td>5'BzNPPOC Fosforamidyty DNA</td><td>Orgentis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5'NPPOC Fosforamidyty DNA</td><td>FlexGen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Biosolve</td><td>0001205402BS</td><td>Do syntezy DNA</td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik amidytowy do syntezy DNA</td><td>Sigma</td><td>L010010</td><td>Do rozpuszczania fosforoamidytów</td></tr><tr><td>Rozszczepialny dT</td><td>ChemGenes</td><td></td><td>Monomer wrażliwy na zasady do przygotowania biblioteki</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Biosolve</td><td>0004474701BS</td><td>Jako rozpuszczalnik ekspozycyjny</td></tr><tr><td>Ochrona mikromacierzy DNA i RNA </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etylenodiamina >99,5%</td><td>Sigma</td><td>3550</td><td>Do deprotekcji</td></tr><tr><td>Expedite 8909</td><td>Syntezator DNA</td><td>PerSeptive Biosystems</td><td></td></tr><tr><td>Hydratyk hydrazyny 50-60% hydrazyny</td><td>Sigma</td><td>225819</td><td>Do deprotekcji RNA</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma</td><td>56750</td><td></td></tr><tr><td>Taśma PTFE o niskiej gęstości o wytrzymałości przemysłowej</td><td>Gasoila</td><td></td><td>Cienka, górna uszczelka teflonowa</td></tr><tr><td>Pirydyna >99%</td><td>Sigma</td><td>P57506</td><td>Do deprotekcji RNA</td></tr><tr><td>Trietyloamina >99%</td><td>Sigma</td><td>T0886</td><td>Do deprotekcji RNA</td></tr> <tr><td>i beta;-karotenu</td><td>Sigma</td><td>C9750</td><td>Do przygotowania biblioteki</td></tr><tr><td>Hybrydyzacja i skanowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x Cytrynian soli sodowej</td><td>Roth</td><td>1054.1</td><td></td></tr><tr><td>Nici komplementarne znakowane 5'Cy3</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>Do hybrydyzacji duplex</td></tr><tr><td>Probówka mikrowirówkowa Biopur Safe-Lock</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA (10 mg / mL)</td><td>Promega</td><td>R3961</td><td></td></tr><tr><td>Klasa biologii molekularnej EDTA</td><td>Promega</td><td>H5031</td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4100A</td><td>Urządzenia molekularne Skaner</td><td></td><td>mikromacierzy</td></tr><tr><td>Piec do hybrydyzacji</td><td>Boekel Scientific</td><td>230500</td><td></td></tr><tr><td>MES monohydrat</td><td>Sigma</td><td>69889</td><td></td></tr><tr><td>MES sód</td><td>Sigma</td><td>M3058</td><td></td></tr><tr><td>NaCl >99,5%</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>Komora hybrydyzacyjna SecureSeal SA200</td><td>Grace BioLabs</td><td>623503</td><td></td></tr><tr><td>Spectrafuge mini</td><td>Labnet</td><td>C1301</td><td>Wirówka mikromacierzowa</td></tr><tr><td>Tween-20 klasa biologii molekularnej</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakcja danych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Do ekstrakcji danych</td></tr><tr><td>MatLab</td><td>MathWorks</td><td></td><td>Projektowanie</td></tr> <tr>mikromacierzy<td>NimbleScan 2.1</td><td>Roche NimbleGen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odsalanie i kwantyfikacja</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Jeden spektrofotometr</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Toluen</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZipTip C18</td><td>Millipore</td><td>ZTC18s008</td><td>Końcówki do pipet do odsalania</td></tr></tbody></table>

mikromacierze dna i rna o dużej gęstości - synteza fotolitograficzna, hybrydyzacja i przygotowanie dużych bibliotek kwasów nukleinowych

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Fotolitografia jest potężną techniką syntezy oligonukleotydów DNA na szkiełkach podstawowych, ponieważ łączy w sobie efektywność reakcji sprzęgania fosforoamidytu z precyzją i gęstością światła UV odbijanego od mikrometrowych luster. Fotolitografia pozwala uzyskać mikromacierze, które mogą pomieścić od setek tysięcy do kilku milionów różnych sekwencji DNA, 100-nt lub dłuższych, w ciągu zaledwie kilku godzin. Dzięki tak dużej przestrzeni sekwencji, mikromacierze są idealnymi platformami do badania mechanizmów oddziaływań kwas-ligand nukleinowy, które są szczególnie istotne w przypadku RNA. Niedawno informowaliśmy o przygotowaniu nowego zestawu fosforoamidynów RNA kompatybilnych z fotolitografią in situ, które następnie wykorzystano do hodowli oligonukleotydów RNA, homopolimerów, a także sekwencji mieszanych zasad. Tutaj szczegółowo ilustrujemy proces wytwarzania mikromacierzy RNA, od projektu eksperymentalnego, po konfigurację instrumentalną, syntezę macierzy, deprotekcję i końcowy test hybrydyzacji na przykładzie sekwencji matrycy 25mer zawierającej wszystkie cztery zasady. Równolegle wychodzimy poza eksperymenty oparte na hybrydyzacji i wykorzystujemy fotolitografię mikromacierzy jako niedrogą bramę do złożonych bibliotek kwasów nukleinowych. Aby to zrobić, mikromacierze DNA o dużej gęstości są wytwarzane na wrażliwym na zasady monomerze, który umożliwia wygodne rozszczepianie i pobieranie DNA po syntezie i deprotekcji. Protokół produkcyjny jest zoptymalizowany tak, aby ograniczyć liczbę błędów syntetycznych i w tym celu wprowadza się warstwę roztworu β-karotenu w celu pochłaniania fotonów UV, które w przeciwnym razie mogłyby odbijać się z powrotem na substratach syntezy. Opisujemy krok po kroku cały proces przygotowania biblioteki, od projektu po podział i kwantyfikację.

Hybrydyzacja mikromacierzy DNA i RNA 
Rysunek 5 przedstawia wyniki testu hybrydyzacji przeprowadzonego na mikromacierzy zawierającej wersje DNA i RNA sekwencji 25-meru (5'-GTCATCATCATGAACCCTGGTC-3' w formie DNA). Skan na Rysunku 5A jest przedstawiony w skali odcieni zieleni odpowiadającej widmu wzbudzenia/emisji fluorescencji Cy3, przy czym intensywność fluorescencji została zarejestrowana w jednostkach arbitralnych w zakresie od 0 do 6536. Projekt macierzy był zgodny z układem cech 25:36 opisanym w sekcji protokołu. Skan pokazano po prawidłowym zorientowaniu macierzy, z lewym górnym rogiem wypełnionym najdłuższym łańcuchem cech fiducjalnych. W tym przypadku cechy fiducjalne zawierają wersję DNA 25-meru i powinny, w zasadzie, zawsze dawać dodatni sygnał fluorescencyjny w celu przeprowadzenia wyrównania skanu i ekstrakcji danych. Zhybrydyzowana mikromacierz powinna być jednolicie jasna, przy czym krawędzie obszaru syntezy są zazwyczaj jaśniejsze niż centrum (nawet o 50%). Duża liczba replik sekwencji, rozmieszczonych losowo na całym obszarze, zmniejsza wpływ artefaktów przestrzennych. Tutaj każda sekwencja (DNA i RNA) została zsyntetyzowana w 20 losowych lokalizacji. Zazwyczaj występuje niski szum fluorescencyjny (tło), &lt;50 a.u., co prowadzi do stosunku sygnału do szumu rzędu od 200:1 do 80:1 w testach hybrydyzacyjnych. Po ekstrakcji danych intensywności fluorescencji są uśredniane i przedstawiane jako ±SD.
Występuje znaczna zmienność bezwzględnych wartości fluorescencji pomiędzy poszczególnymi eksperymentami. Przedstawiamy tutaj wyniki trzech niezależnych syntez z zastosowaniem tych samych parametrów wytwarzania i tej samej procedury postępowania po syntezie. 25mer DNA, po hybrydyzacji z komplementarną nicią DNA znakowaną Cy3, generuje sygnały fluorescencyjne w zakresie od 20 0 do 30 0, bardzo rzadko powyżej lub poniżej tych wartości. 25mer RNA, po hybrydyzacji z tym samym komplementarnym DNA znakowanym Cy3, wykazuje intensywność fluorescencji na odpowiadających mu obszarach w zakresie od 15 0 do 20 0. Jednakże intensywność fluorescencji dupleksów RNA/DNA sporadycznie spada poniżej 8 0, podczas gdy odpowiadające im dupleksy DNA/DNA nadal fluorescują w zakresie 20 0-30 0. W takich przypadkach wyniki dla RNA można uznać za suboptymalne. Niepowodzenie syntezy lub hybrydyzacji, zarówno w przypadku DNA, jak i RNA, będzie natychmiast zauważalne podczas skanowania ze względu na oczywisty brak fluorescencji. Istnieje wiele możliwości niepowodzenia lub jedynie częściowego sukcesu syntezy RNA, które zostaną omówione w części dyskusyjnej.
Deprotekcja, odszczepienie i odzysk biblioteki 
W zależności od złożoności i gęstości biblioteki, kształt i zarys zsyntetyzowanej macierzy mogą być widoczne bez powiększenia, lecz przy odpowiednim oświetleniu (Rycina 4), gdy DNA nadal znajduje się w formie chronionej. Po deprotekcji za pomocą EDA/toluenu, a przed dodaniem wody w celu zebrania odszczepionej biblioteki, obszar syntezy zawierający obecnie zdeprotektowane oligonukleotydy może wyróżniać się jako strefa hydrofilowa, podczas gdy reszta szkiełka przedmiotowego będzie wydawać się pokryta mętną warstwą hydrofobową. Bezpośrednia obserwacja obszaru syntezy zależy od całkowitej powierzchni wykorzystanej do syntezy oligonukleotydów: większe wykorzystanie obszaru syntezy będzie wiązać się z większą szansą na wyraźne rozróżnienie między regionami hydrofilowymi a hydrofobowymi na powierzchni. I odwrotnie, biblioteki syntetyzowane przy użyciu mniejszej liczby luster i z mniejszymi elementami mogą nie być natychmiast widoczne.
Podobnie, ilość odzyskanego DNA po odsoleniu jest bezpośrednio proporcjonalna do całkowitej powierzchni wykorzystanej do syntezy. Jeśli wszystkie obszary zostaną wykorzystane do syntezy oligonukleotydów, procedura odcinania i odzyskiwania powinna przynieść od 25 do 30 pmol DNA. Wykorzystanie 10% powierzchni syntezy pozwoli zatem na uzyskanie jedynie około 3 pmol DNA.
<img alt="Schemat fosforamidytów DNA i RNA; struktury chemiczne do syntezy, analizy i znakowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1Struktury chemiczne fosforamidytów DNA i RNA wykorzystywanych w syntezie oligonukleotydów metodą fotolitografii mikromacierzy. Standardowe światłoczułe grupy ochronne nitrofenylopropylokarbonylowe (NPPOC) w pozycji 5'-OH są stosowane w rutynowej syntezie mikroarrayów DNA i RNA do celów hybrydyzacji. W przypadku syntezy złożonych bibliotek DNA w pozycji 5'-OH preferowany jest bardziej fotolabilny benzyl-NPPOC (BzNPPOC), ponieważ BzNPPOC jest usuwany dwukrotnie szybciej niż NPPOC, co znacząco skraca całkowity czas syntezy mikroarrayu. Oligonukleotydy DNA przeznaczone do bibliotek wymagają również sprzęgnięcia monomeru dT z grupą odspajalną na końcu 3'. Monomer ten, zawierający funkcję estru succynylowego, ulegnie hydrolizie podczas deprotekcji, co umożliwi odzyskanie DNA z mikrochipu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.</a>
<img alt="Równowaga statyczna; wzór ΣFx=0; tło z wzorcem szumu; koncepcja równowagi statycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2Przykład maski w formie pliku obrazu przesyłanego do urządzenia z mikrolustrami podczas naświetlania promieniowaniem UV. Białe piksele odpowiadają lustrom, które zostaną nachylone w „WŁ.pozycja, odbijająca światło UV do celi syntezy. Piksele czarne odpowiadająWYŁ.lustra, w których światło UV zostanie odbite od komórki. Białe piksele umożliwią zatem przyłączenie kolejnego nadchodzącego fosforamidytu do oligonukleotydów znajdujących się na odpowiadających im obszarach na podłożach szklanych. Oligonukleotydy syntetyzowane na obszarach, których odpowiadające im lustra w tym pliku maski są czarnymi pikselami, pozostaną jednak nieaktywne podczas kolejnego etapu przyłączania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ do syntezy nanocząsteczek z UV-LED, DMD i komorą syntezy; schemat odczynników, warstw slajdu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3Zdjęcia optycznej aparatury do fotolitografii mikroarrayów oraz układu do syntezy. (A) Układ optyczny do ekspozycji UV. Światło UV z diody UV-LED jest najpierw homogenizowane za pomocą światłowodu o prostokątnym przekroju, a następnie odbija się od mikrolusterek. Mikrolusterka ustawione w pozycji „OFF” (wyłączone) odbijają światło UV w kierunku przeciwnym do komórki syntezy, natomiast mikrolusterka w pozycji „ON” (włączone) kierują światło na komórkę syntezy, znajdującą się w płaszczyźnie ogniskowej, po uprzednim przejściu przez system obrazujący Offner Relay o powiększeniu 1:1. (BZmontowana komórka syntezy składa się z nawierconego szkiełka przedmiotowego, które jako pierwsze zostaje umieszczone na bloku kwarcowym komórki, oddzielone grubą uszczelką z PTFE (nie pokazano). Następnie nad nawierconym szkiełkiem umieszcza się drugie, nienawiercone szkiełko, oddzielone cienką uszczelką z PTFE. Całość konstrukcji jest utrzymywana przez metalową ramkę (nie pokazano).C). W celu przygotowania biblioteki, po zamocowaniu komory syntezy w płaszczyźnie ogniskowej padającego światła UV, przestrzeń znajdująca się pomiędzy blokiem kwarcowym a nawierconym szkiełkiem wypełnia się 1% roztworem β-karotenu w CH2Cl2W tym celu do bloku kwarcowego podłączono dodatkowe przewody wlotowe i wylotowe, a pomarańczowy roztwór przepływa z pozycji skrajnie prawej do skrajnie lewej. Przepływ odczynników i rozpuszczalników stosowanych w syntezie zaznaczono białymi strzałkami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.</a>
<img alt="Układ spektroskopowy z chipem mikroprzepływowym, wykorzystywany do separacji DNA i analizy optycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4Obszar syntezy jest zazwyczaj widoczny gołym okiemTutaj można zobaczyć bibliotekę DNA na szklanej powierzchni bezpośrednio po syntezie, gdy DNA znajduje się wciąż w formie chronionej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig4large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki mikroarray DNA, wykres intensywności fluorescencji, analiza syntezy RNA, dane eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rycina 5Analizy hybrydyzacyjne z 25-merowymi sekwencjami DNA i RNA syntetyzowanymi in situ na mikromacierzach. (A) Skan fluorescencyjny całego zhybrydyzowanego mikroarrays DNA i RNA. 25-merowe oligonukleotydy DNA i RNA zhybrydyzowano z ich komplementarnymi nićmi znakowanymi Cy3. Array został przeskanowany laserem o długości fali wzbudzenia 532 nm, przy 5 µm rozdzielczość. (B) Intensywności fluorescencji (jednostki umowne) dupleksów DNA:DNA i RNA:DNA w trzech oddzielnych eksperymentach. Jasnozielone dane dla oligonukleotydów RNA syntetyzowanych in situ można uznać za suboptymalne w porównaniu z intensywnością fluorescencji odpowiadających im sekwencji DNA. Słupki błędów oznaczają SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat równowagi statycznej z etapami reakcji chemicznej; EDA/toluen, proces pipetowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig6v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 6"> 
Rysunek 6Schematyczna prezentacja procedury deprotekcji, odszczepiania i odzyskiwania bibliotek DNA syntetyzowanych na mikromacierzach. Sekwencje DNA są syntezowane na nukleozydzie dT z grupą odcinającą wrażliwą na zasady (pokazaną w powiększonym obszarze). Po syntezie deprotekcja oligonukleotydów DNA (grupy chroniące zasady przedstawiono jako czerwone sfery) w mieszaninie EDA/toluen pozostawia zdeprotekcjonowany materiał związany elektrostatycznie z powierzchnią, który można następnie odessać pipetą, aplikując niewielką ilość wody na obszar syntezy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig6large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres absorbancji w funkcji długości fali; wynik spektroskopii UV-Vis; analiza piku w zakresie 260–280 nm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig7v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rycina 7Reprezentatywne widmo absorbancji (20 – 350 nm) pociętej i odsolonej biblioteki DNA zawierającej 40 różnych sekwencji o długości 10 nt. Z pojedynczej syntezy macierzy wyizolowano łącznie 940 ng DNA, co odpowiada 30 pmol DNA łącznie lub 15 pmol na jeden podłoże szklane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig7large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Cykl BzNPPOC-dA; tabela; synteza DNA; etapy: sprzęganie, capping, utlenianie; impulsy, czas, opis." src="/files/ftp_upload/59936/59936table1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1. Reprezentatywny protokół cyklu dla sprzęgania/utleniania/fotodeprotekcji 5'-BzNPPOC-dA, przy założeniu, że odpowiadający mu fosforamidyt został umieszczony w porcie „A”. Czas sprzęgania (w sekundach) jest wskazany w linii „couple monomer” (sprzęgaj monomer). Czas fotodeprotekcji UV, odpowiadający w tym przypadku energii promieniowania 3 J/cm22 (fotochemia BzNPPOC) oblicza się jako czas, który upłynął pomiędzy dwoma sygnałami komunikacyjnymi „Event 2 Out”.
<img alt="Tabela procesu cyklicznego dla NPPOC-rA przedstawiająca etapy sprzęgania, blokowania i utleniania oraz szczegóły impulsów." src="/files/ftp_upload/59936/59936table2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Tabela 2"> 
Tabela 2. Reprezentatywny protokół cyklu dla sprzęgania/utleniania/fotodeprotekcji 5'-NPPOC-rA, przy założeniu, że odpowiadający mu fosforamidyt RNA został załadowany do portu „A”. Czas sprzęgania (w sekundach) jest podany w linii „couple monomer”. Czas fotodeprotekcji UV odpowiada w tym przypadku energii promieniowania wynoszącej 6 J/cm²2 (fotochemia NPPOC) oblicza się jako czas, który upłynął pomiędzy dwoma sygnałami komunikacyjnymi „Event 2 Out”.

W tym artykule prezentujemy i omawiamy nowe osiągnięcia w syntezie i zastosowaniach mikromacierzy kwasów nukleinowych wytwarzanych in situ. W szczególności pokazujemy, w jaki sposób protokoły syntezy DNA można rozszerzyć na RNA i jak można wykorzystać mikromacierze do tworzenia pobieralnych bibliotek kwasów nukleinowych.

Mikromacierze DNA i RNA o dużej gęstości - synteza fotolitograficzna, hybrydyzacja i przygotowanie dużych bibliotek kwasów nukleinowych

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...

Mikromacierze DNA i RNA są bardzo przydatne do badania interakcji między kwasami nukleinowymi a białkami, ale są również wygodną metodą przygotowania bibliotek sekwencji. Fotolitografia pozwala na równoległą syntezę setek tysięcy unikalnych sekwencji i jest obecnie jedyną bezpośrednią metodą syntezy RNA na mikromacierzach. Fotolitograficzną syntezę mikromacierzy in situ można również rozszerzyć na chemicznie modyfikowane oligonukleotydy, na przykład za pomocą dwóch pierwszych fluoro peptydowych kwasów nukleinowych.Obserwowanie procesu wytwarzania i obsługi mikromacierzy może pomóc w zrozumieniu, w jaki sposób ta złożona maszyneria została opracowana na podstawie dobrze znanej standardowej syntezy DNA w fazie stałej. Rozpocznij tę procedurę od zaprojektowania mikromacierzy i funkcjonalności slajdów zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Włącz syntezator DNA UV LED i jego wentylator chłodzący.Zamocuj miernik natężenia promieniowania UV w ognisku przychodzącego światła UV i włącz go. Na komputerze uruchom oprogramowanie WiCell Controller. Włącz i zainicjuj urządzenie mikromerowe.Załaduj plik całej białej maski, klikając prawym przyciskiem myszy DMD, a następnie wybierając załaduj obraz. Kliknij prawym przyciskiem myszy ikonę UVS i wybierz Otwórz migawkę UV. Odczytaj wartość mocy na mierniku intensywności i odlicz 60 sekund.Po 60 sekundach ponownie odczytaj wartość mocy i zanotuj wartości początkową i końcową. Zamknij migawkę, wybierając opcję Zamknij migawkę UV i wyłącz miernik intensywności. Oblicz średnią wartość natężenia promieniowania UV w miliwatach na centymetr kwadratowy.W oprogramowaniu WiCell załaduj pliki zadania, sekwencji i protokołu w odpowiednich oknach podrzędnych, a następnie kliknij przycisk Wyślij, aby wysłać pliki sekwencji i protokołu do syntezatora DNA. Aby zmontować komórkę syntezy, umieść grubą uszczelkę perfluoroelastomerową na kwarcowym bloku komórki. Następnie umieść wywiercone, funkcjonalizowane szkiełko mikroskopowe na pierwszej uszczelce i sprawdź, czy otwory na szkiełkach łączą się z rurką wlotową i wylotową komory syntezy.Umieść drugą, cienką uszczelkę z politetrafluoroetylenu na wywierconej prowadnicy, otaczając dwa otwory. Na koniec umieść drugą, funkcjonalizowaną, ale niewierconą prowadnicę na drugiej uszczelce. Teraz umieść metalową ramę na 4 na zmontowanej komórce z podwójnym podłożem Dokręć z tą samą siłą zacisku za pomocą śrubokręta dynamometrycznego.Podłącz rurkę wlotową i wylotową do syntezatora DNA. Zagruntować linię myjącą acetonitryl i sprawdzić prawidłowy przepływ acetonitrylu przez podłoża. Zmierzyć objętość acetonitrylu na linii odpływu po przejściu przez siedem cykli zalewania acetonitrylem.Ta objętość powinna wynosić dwa mililitry. Przymocuj komórkę syntezy w płaszczyźnie ogniskowej przychodzącego światła UV. W przypadku przygotowania biblioteki należy podłączyć dodatkowy przewód wlotowy i wylotowy z tyłu komórki i napełnić tylną komorę dwoma mililitrami roztworu betakarotenu.Rozpocznij syntezę, klikając najpierw Uruchom w oprogramowaniu WiCell. Przy pierwszym poleceniu wait w pliku zadania naciśnij start na syntezatorze DNA. Po syntezie zwykłych mikromacierzy odłącz komórkę od syntezatora i zdemontuj komórkę.Użyj diamentowego długopisu, aby wytrawić liczbę syntezy na szklanych szkiełkach. Wytraw liczbę na niezsyntetyzowanej powierzchni każdego slajdu. Przenieś szkiełka do 50-mililitrowych probówek wirówkowych i przechowuj w wysuszonym miejscu do dalszego użycia.Po syntezie mikromacierzy bibliotecznych najpierw spuść roztwór betakarotenu z komory, a następnie umyj komorę dwukrotnie, przepuszczając przez nią pięć mililitrów chlorku metylenu przed opróżnieniem. W celu deprotekcji mikroaryzmu DNA napełnij słoik witrażowym 20 mililitrami etanolu i 20 mililitrami EDA. Umieść mikromacierze zawierające tylko DNA pionowo w słoiku, zamknij pokrywkę i pozostaw szkiełka do deochrony na dwie godziny w temperaturze pokojowej.Po dwóch godzinach wyjmij szkiełka za pomocą pęsety i dokładnie spłucz je wodą podwójnie destylowaną. Wysuszyć szkiełka w wirówce do mikromatryc przez kilka sekund przed umieszczeniem ich w eksykatorze. W celu deprotekcji mikromacierzy RNA przygotuj suchy roztwór 20 mililitrów trietyloaminy i 30 mililitrów acetonitrylu w 50-mililitrowej probówce wirówkowej.Przenieś jedno szkiełko mikromacierzy RNA do probówki wirówkowej, zamknij pokrywę i owiń plastikową folią uszczelniającą. Delikatnie potrząsaj probówką wirówkową na wytrząsarce orbitalnej przez godzinę i 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie wyjmij szkiełko i umyj dwukrotnie 20 mililitrami suchego acetonitrylu przed suszeniem w wirówce do mikromatryc przez kilka sekund.Po pierwszym etapie deprotekcji przenieś szkiełko RNA do roztworu hydratu hydrazyny, zamknij pokrywkę i owiń plastikową folią uszczelniającą. Po dwóch godzinach delikatnego potrząsania na wytrząsarce orbitalnej zdejmij szkiełko i umyj je dwukrotnie 20 mililitrami suchego acetonitrylu. Następnie suszyć w wirówce z mikromatrycą przez kilka sekund.Jeśli mikromacierz RNA zawiera również nukleotydy DNA, przejdź do trzeciego etapu deprotekcji. Dodaj mikromacierz DNA/RNA do 50-mililitrowej probówki zawierającej roztwór etanolu EDA jeden do jednego Po 5 minutach w temperaturze pokojowej wyjmij szkiełko i umyj mikromacierz dwukrotnie 20 mililitrami sterylnej wody. Wysuszyć szkiełko w wirówce do mikromatryc i przechowywać w eksykatorze.W sterylnej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 mililitra przygotuj bufor hybrydyzacyjny zawierający DNA znakowane Cy3, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wymieszaj i zwiruj roztwór. Ostrożnie umieścić samoprzylepną komorę hybrydyzacyjną o pojemności 300 mikrolitrów w obszarze syntezy na każdym szkiełku i odpipetować roztwór do hybrydyzacji.Zakryj otwory komory samoprzylepnymi kropkami i zawiń cały szkiełko w folię aluminiową. Umieść szkiełko do mikromacierzy w piecu do hybrydyzacji, przykryj i pozwól mu delikatnie obracać się w wybranej temperaturze hybrydyzacji przez dwie godziny. Po dwóch godzinach odłącz szkiełko, usuń folię aluminiową, odpipetuj roztwór hybrydyzacyjny i ostrożnie oderwij komorę hybrydyzacyjną.Przenieść szkiełka do probówki wirówkowej zawierającej 30 mililitrów nierygorystycznego buforu do płukania. Wstrząsaj energicznie przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Przenieść szkiełko do probówki wirówkowej zawierającej 30 mililitrów buforu do rygorystycznego przemywania i energicznie wstrząsać przez jedną minutę.Na koniec przenieś szkiełko do probówki wirówkowej zawierającej 30 mililitrów buforu do płukania końcowego. Wstrząsaj przez kilka sekund. Wysuszyć szkiełko w wirówce z mikromatrycą.Teraz umieść suchą mikromacierz, obszarem syntezy skierowanym w dół, w uchwycie szkiełek skanera mikromatrycowego. Aby zdeprotect i rozszczepić biblioteki DNA, zanurz szkiełko w roztworze do rozszczepienia w 50-mililitrowej probówce wirówkowej. Zamknij probówkę i owiń plastikową folią uszczelniającą, a następnie delikatnie obracaj w wytrząsarce orbitalnej przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.Po dwóch godzinach wyjmij szkiełko i umyj dwukrotnie 20 mililitrami starannie wysuszonego acetonitrylu przed pozostawieniem go do wyschnięcia na powietrzu. Za pomocą pipety nanieś 100 mikrolitrów sterylnej wody na teraz dostrzegalny obszar syntezy. Odpipetuj roztwór kilka razy w górę iw dół przed przeniesieniem go do 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki.Powtórz proces i połącz eluat mikromacierzy w tej samej probówce. Odparować chip, wypłukać do sucha, a następnie ponownie rozpuścić w 10 mikrolitrach H2O wolnego od nukleaz. Poniżej przedstawiono wyniki testu hybrydyzacji przeprowadzonego na mikromacierzy zawierającej wersje DNA i RNA sekwencji 25mer.Skan pojawia się w formacie zielonej skali odpowiadającym widmu wzbudzenia, emisji fluorescencji Cy3, przy czym intensywność fluorescencji jest rejestrowana w dowolnych jednostkach. Istnieje znaczna zmienność bezwzględnych wartości fluorescencji między eksperymentami. Przedstawiono wyniki dla trzech niezależnych syntez przy użyciu tych samych parametrów produkcyjnych i tej samej obsługi postsyntetycznej.25-merowe DNA, po hybrydyzacji z komplementarną nicią DNA znakowaną Cy3, będzie wytwarzać sygnały fluorescencyjne w zakresie od 20 000 do 30 000, bardzo rzadko powyżej lub poniżej. 25-merowe RNA, po hybrydyzacji z tym samym dopełniaczem DNA znakowanym Cy3, da intensywność fluorescencji na odpowiednich cechach w zakresie od 15 000 do 20 000. Jednak intensywność fluorescencji dupleksów RNA/DNA czasami spada poniżej 8 000, podczas gdy odpowiadające im dupleksy DNA/DNA nadal będą fluoryzować w zakresie od 20 000 do 30 000.W takich przypadkach wyniki dla RNA mogą być uznane za nieoptymalne. Podobnie jak w przypadku każdego innego eksperymentu opartego na RNA, ważne jest, aby pamiętać, że mikromacierze RNA są wrażliwe na degradację i powinny być obsługiwane w sterylnych warunkach. Biblioteki kwasów nukleinowych zebrane z mikromacierzy mogą być wykorzystywane w sekwencjonowaniu DNA lub RNA, a także w kodowaniu cyfrowych informacji o DNA.NED wytwarza intensywne światło UV, na które nie należy patrzeć bezpośrednio. Z tego powodu zaleca się noszenie okularów ochronnych podczas użytkowania instrumentu.

high-density-dna-rna-microarrays-photolithographic-synthesis

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Biblioteki metagenomiczne archiwizują duże fragmenty ciągłych sekwencji genomowych mikroorganizmów bez konieczności ich wcześniejszej hodowli. Tworzenie...

Wielkoskalowe przesiewanie bibliotek metagenomicznych

Niniejsze wideo jest demonstracją techniczną protokołu hybrydyzacji dla zestawu CGH z płytkami o gęstym pokryciu całego genomu (whole genome tiling path array CGH), który pozwala na przeskanowanie całego ludzkiego genomu przy użyciu zaledwie 25-100 ng DNA, które można wyizolować z różnych źródeł, w tym z archiwalnego materiału utrwalonego w formalinie.

Demonstracja techniczna porównawczej hybrydyzacji genomowej całego genomu z wykorzystaniem macierzy (array CGH)

Ze względu na przejściowy charakter pre-mRNA, jego izolacja i badanie in vivo mogą być trudne. Przedstawiamy tutaj nowatorskie podejście in vitro do badania oddziaływań RNA-białko z wykorzystaniem syntetycznej puli oligonukleotydów, która pokrywa wybrane regiony pre-mRNA.

Szybka metoda wysokoprzepustowa mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkim pre-mRNA

Metoda Hi-C umożliwia bezstronną, genomową identyfikację oddziaływań chromatyny (1). Hi-C łączy ligację bliskościową z sekwencjonowaniem masowo równoległym. Wynikowe dane mogą być wykorzystane do badania architektury genomowej w wielu skalach: wstępne wyniki pozwoliły zidentyfikować takie cechy jak terytoria chromosomowe, segregacja chromatyny otwartej i zamkniętej oraz struktura chromatyny w skali megabazy.

Hi-C: Metoda badania trójwymiarowej architektury genomów.

Prezentujemy zastosowanie mikromacierzy DNA w profilowaniu ekspresji układu nerwowego. Opisujemy kontrolę jakości RNA, znakowanie próbek oraz hybrydyzację i skanowanie macierzy.

Mikromacierze DNA: kontrola jakości próbek, hybrydyzacja i skanowanie macierzy

Ten artykuł wideo opisuje metodę opartą na mikromacierzy in vitro, która pozwala określić cele genów i miejsca wiązania dla regulatorów odpowiedzi systemu dwuskładnikowego.

Metoda DAP-chip oczyszczona z powinowactwa DNA do określania celów genowych dla dwuskładnikowych systemów regulacyjnych bakteryjnych

Gel-seq umożliwia badaczom jednoczesne przygotowanie bibliotek dla sekwencji DNA i RNA przy znikomych dodatkowych kosztach, zaczynając od 100 - 1000 komórek za pomocą prostego urządzenia hydrożelowego. W artykule przedstawiono szczegółowe podejście do wytwarzania urządzenia, a także protokół biologiczny do generowania sparowanych bibliotek.

Gel-seq: metoda jednoczesnego przygotowania biblioteki sekwencjonowania DNA i RNA przy użyciu matryc hydrożelowych

Przedstawiono szczegółowy protokół generowania samodzielnie składających się mikromacierzy białek ludzkich do badań przesiewowych inhibitorów kinaz.

Badania przesiewowe inhibitorów kinaz w samoorganizujących się mikromacierzach białek ludzkich

Przedstawiamy tutaj protokół umożliwiający wychwycenie interakcji chromatyny DNA z RNA w celu mapowania trójwymiarowej organizacji genomu powiązanej z RNA.

Metoda interakcji chromatyny DNA z DNA związanej z RNA

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę sekwencjonowania Susieciowanych, Ligowanych i Swybranych Hybridów (SPLASH), która umożliwia mapowanie całego genomu wewnątrzcząsteczkowych i międzycząsteczkowych interakcji RNA-RNA in vivo. SPLASH może być stosowany do badania interakcji RNA w organizmach, w tym drożdżach, bakteriach i ludziach.

Mapowanie interakcji RNA-RNA na całym świecie przy użyciu biotynylowanego psoralenu

Poznaj metody fotolitograficznej syntezy mikromacierzy DNA i RNA oraz przygotowania dużych bibliotek kwasów nukleinowych. Technika ta umożliwia równoległe tworzenie setek tysięcy unikalnych sekwencji.

Mikromacierze DNA i RNA o dużej gęstości - synteza fotolitograficzna, hybrydyzacja i przygotowanie dużych bibliotek kwasów nukleinowych (Wideo) | JoVE Journal

Mikromacierze DNA i RNA o dużej gęstości - synteza fotolitograficzna, hybrydyzacja i przygotowanie dużych bibliotek kwasów nukleinowych

Przeglądaj więcej filmów