Wytwarzanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) do immunoterapii adoptywnej

Delibacja produktu z komórek CAR T o kompetencjach funkcjonalnych, które wszczepiają, namnażają się i wykazują aktywność cit-el-uric po infuzji, jest kluczowym elementem skutecznej immunoterapii adoptywnej. Na przykład w guzach litych limfocyty CAR T mogą przenikać do guzów litych i otrzymują optymalną stymulację antygenową; Jednak ich ogólne wszczepianie i proliferacja jest utrudnione u ludzi. Główną zaletą tego podejścia jest to, że może ono zachować jakość limfocytów CAR T lub stan różnicowania komórek CAR T bez generowania końcowo zróżnicowanych lub wyczerpanych limfocytów T, które miałyby zmniejszoną zdolność proliferacyjną lub słabą skuteczną funkcję po infuzji.

Ta technika może być trudna, ponieważ limfocyty T są bardzo wrażliwe na stężenie komórek lub powierzchnię naczyń, w których są hodowane. A także ich potrzeby metaboliczne. Zasadniczo limfocyty T muszą być szczęśliwe przez cały proces, w przeciwnym razie nie będą rosły.

Aby rozpocząć tę procedurę, ustaw 6-dołkowe naczynia hodowlane. Aktywuj świeże lub kriokonserwowane pierwotne ludzkie limfocyty T, mieszając je z kulkami magnetycznymi anty-CD3 CD28, w stosunku trzech kulek na komórkę T w dołkach szalek hodowlanych. Hodowla limfocytów T w pożywce X-Vivo 15 uzupełnionej normalną ludzką surowicą AB, L-glutaminą, he-pees i IL2.

Aktywuj limfocyty T w stężeniu miliona limfocytów T na mililitr podczas ekspansji. I hoduj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 20% tlenu, 5% dwutlenku węgla i 95% wilgotności. Po całonocnej stymulacji dodać supernatanty lentiwirusowe do aktywowanych limfocytów T.

Oblicz objętość supernatantów niezbędną do osiągnięcia wielokrotności infekcji od trzech do pięciu. Kontynuuj hodowlę komórek w tych samych warunkach. Trzeciego dnia zbierz reprezentatywną porcję komórek kriokonserwacji.

Przed krioprezerwacją należy usunąć kulki magnetyczne poprzez delikatne pipetowanie i separację magnetyczną. Przygotuj pożywkę do zamrażania, która zawiera PBS z 0,5% DMSO. I przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do użycia.

Następnie odwiruj limfocyty T w temperaturze 300 razy G przez pięć minut. Odrzucić supernatant i dodać pięć mililitrów PBS. Ponownie odwirować komórki w temperaturze 300 razy G przez pięć minut i wyrzucić PBS.

Zawiesiliśmy pelent w jednym mililitrze zimnego podłoża do kriokonserwacji. Zamrozić limfocyty T w schłodzonym pojemniku do zamrażania. I przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez 48 godzin.

Następnie przenieś zamrożone komórki do ciekłego azotu. Umyj resztę limfocytów T raz na pięć mililitrów PBS, aby wyeliminować wszelkie pozostałości wektora. Wirować przy 300 razy G przez pięć minut.

Następnie zdekantować PBS i ponownie zawiesić pelent komórkowy w pożywce do hodowli komórek T w stężeniu 500 000 komórek na mililitr. Podziel limfocyty T na dwie kultury zaprojektowane jako 45 i dziewięć. Policz limfocyty T za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu kulek zliczających i przeciwciał monoklonalnych przeciwko ludzkim CD4 i CD8.

A także barwnik żywotności. Podawaj kultury co drugi dzień, aby utrzymać je w stężeniu 500 000 komórek na mililitr. W piątym dniu policz i zakonserwuj w krioterapii pięć kultur tego dnia, jak opisano wcześniej.

Siódmego dnia umyj 500 000 komórek w PBS. I ponownie zawiesić je w 100 mikrolitrach bufora do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją. Następnie wykryj ekspresję białka powierzchniowego CAR przez barwienie immunologiczne fluorescencyjnie sprzężonym idiotypem anty-CAR 19 za pomocą cytometrii przepływowej.

W dziewiątym dniu policz i zakonserwuj dzień dziewięć kultur, jak opisano wcześniej. W tym badaniu mierzono funkcję i skuteczność limfocytów CAR T, które są zbierane w różnych odstępach czasu w trakcie hodowli X-Vivo. Korzystając z metod opisanych w tym filmie, limfocyty T są stymulowane i rozszerzane przez trzy lub dziewięć dni.

Profil różnicowania komórek, jak wskazano na przedstawionej tutaj strategii bramkowania, jest analizowany poprzez pomiar obfitości różnych glikoprotein ulegających ekspresji na powierzchni komórki. Postępujące przesunięcie w kierunku różnicowania efektorów jest widoczne z czasem podczas hodowli X-Vivo. Następnie oceniana jest funkcja efektorowa i zdolność proliferacyjna limfocytów CAR T w odpowiedzi na antygen.

Komórki, które są mniej rozwinięte, są funkcjonalnie lepsze od tych ekstensywnie hodowanych przez dłuższy czas. W mysim modelu ALL z ludzkim ksenoprzeszczepem porównano siłę działania limfocytów CAR T pobranych w różnych okresach czasu. Dziewięciodniowe komórki wykazują zależną od dawki odpowiedź przeciwlukemiczną z pełną odpowiedzią wartą wysokiej dawki trzech milionów; oraz utrata skuteczności w przypadku małej dawki 500 000.

Jednak komórki trzeciego dnia wykazywały trwałą kontrolę guza zarówno w wysokich, jak i niskich dawkach. Odpowiedź ta jest związana z bezwzględną liczbą CAR-T 19 we krwi obwodowej myszy. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te dostarczają dowodów na to, że limfocyty CAR T pobrane wcześniej przewyższają te pobrane później.

Po tej procedurze można wykonać dodatkowe testy funkcyjne, takie jak test konika morskiego, w celu zmierzenia ich właściwości metabolicznych, takich jak zużycie tlenu lub zdolność spir-it-ed. Można również przeprowadzić kilka rund ponownej stymulacji, aby uzyskać wgląd w ich różnicowanie i trwałość limfocytów CAR T. Wykorzystując tę pracę jako podstawę, wraz z innymi badaczami jesteśmy zaangażowani w badania mające na celu dalsze skrócenie procesu hodowli.

Można go również rozszerzyć w projektowaniu podstawowych podejść dla innych antygenów nowotworowych. Podczas pracy z lentiwirusem należy zawsze zachować ostrożność. Ale nawet wtedy, gdy lentiwirus jest zaprojektowany tak, aby był niekompetentny do replikacji.