Name: Wytwarzanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) do immunoterapii adoptywnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania limfocytów T CAR o zachowanej kompetencji funkcjonalnej do immunoterapii adoptywnej. Technika ta zapewnia wysoką jakość komórek i skuteczność terapeutyczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była częściowo wspierana przez fundusze dostarczone przez Novartis Pharmaceuticals poprzez sojusz badawczy z Uniwersytetem Pensylwanii (Michael C. Milone), a także St. Baldrick's Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi).

Wszystkie badania na zwierzętach są zatwierdzane przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Pensylwanii.
1. Aktywacja, transdukcja i ekspansja limfocytów T
<ol>
	<li>Aktywuj świeże lub kriokonserwowane pierwotne ludzkie limfocyty T przez zmieszanie z kulkami magnetycznymi anty CD3 / CD28 (np. Dynabeads) w stosunku 3 kulek na komórkę T w 6-dołkowych naczyniach do hodowli komórek. Hodowla limfocytów T w pożywce X-VIVO 15 uzupełniona 5% normalną ludzką surowicą AB, 2 mM L-glutaminy, 20 mM HEPES i IL2 (100 jednostek/ml). Utrzymuj limfocyty T w stężeniu 106 limfocytów T / ml podczas ekspansji. Hodowla limfocytów T w temperaturze 37 °C, 20% O2 i wilgotności 95% z 5% CO2 .</li>
	<li>Po całonocnej stymulacji dodać supernatant lentiwirusowy do aktywowanych limfocytów T. Obliczyć objętość supernatantu niezbędną do osiągnięcia wielokrotności infekcji (MOI) 3−5, 
	nuta: Plazmid lentiwirusa CD19-BBζ CAR składa się z zawiasu CD8, domeny kostymulującej 4-1BB i domeny sygnalizacyjnej CD3ζ21. Supernatant lentiwirusowy CD19-BBζ został wygenerowany zgodnie z wcześniejszym opisem21.</li>
	<li>W dniu 3 należy pobrać reprezentatywną porcję komórek do krioprezerwacji. Przed krioprezerwacją należy usunąć kulki magnetyczne za pomocą delikatnego pipetowania i separacji magnetycznej. Przygotować pożywkę zamrażającą zawierającą sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) z 0,5% dimetylosulfotlenkiem (DMSO) i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
	<ol>
		<li>Odwirować limfocyty T przy 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i dodać 5 ml PBS. Odwirować komórki o masie 300 x g przez 5 minut i wyrzucić PBS.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 1 ml zimnego podłoża do kriokonserwacji. Zamrozić limfocyty T w schłodzonym pojemniku do zamrażania i przechowywać w temperaturze -80 °C przez 48 godzin. Przenieś zamrożone komórki do ciekłego azotu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj resztę limfocytów T raz na 5 ml PBS, aby wyeliminować resztki wektora. Wirować przy 300 x g przez 5 min. Zdekantować PBS i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce do hodowli limfocytów T w stężeniu 0,5 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Podziel limfocyty T na dwie kultury, wyznaczone na dzień 5 i dzień 9. Policz limfocyty T za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu kulek zliczających (tabela materiałów) i przeciwciał monoklonalnych przeciwko ludzkim CD4 i CD8, a także barwnika żywotności (tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Aby zmierzyć stężenie limfocytów T, należy przygotować mieszankę wzorcową zawierającą 500 μl PBS, 5 μl kulek liczących, 10 μl roztworu żywotności komórek D 7-amino-aktynomycyny, 4 μl CD4-FITC i 4 μl CD8-APC. Dodać 40 μl limfocytów T do mieszanki wzorcowej i zmierzyć stężenie komórek za pomocą cytometrii przepływowej na podstawie liczby żywych limfocytów T/kulek. Ponownie podawać, aby utrzymać kultury w stężeniu 0,5 x 106 komórek/ml co drugi dzień.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W dniu 5 należy policzyć i dokonać kriokonserwacji kultur z dnia 5 zgodnie z opisem w krokach 1.3 i 1.5.</li>
	<li>W dniu 7 przemyj 0,5 x 106 limfocytów T w PBS i ponownie zawieś w 100 μl buforu do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Wykrywanie ekspresji białek powierzchniowych CAR poprzez barwienie immunologiczne fluorescencyjnie sprzężonym idiotypem anty-CAR19 za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
	<li>W dniu 9 policz kultury z dnia 9 i kriokonserwację zgodnie z opisem w kroku 1.3.</li>
</ol>
2. Fenotypowa ocena różnicowania limfocytów T
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę wzorcową zawierającą wstępnie miareczkowane przeciwciała przeciwko anty-CD3–BV605 (klon OKT3), anty-CD14–Pacific Blue (PB) (klon HCD14), anty-CD19–PB (klon HIB19), anty-CD4–BV510 (klon OKT4), anty-CD8–H7APC (klon SK1), anty-CCR7–FITC (klon 150503), anty-CD45RO–PE (klon UCHL1), anty-CD27–PE-Cy7 (klon 1A4CD27), anty-CD95–PerCP-Cy5.5 (klon DX2) i anty-CAR19-APC.</li>
	<li>Przygotuj indywidualne kontrole fluorescencji minus jeden (FMO) dla anty-CD45RO-PE, anty-CCR7-FITC, anty-CD27-PE-Cy7 i anty-CD95-PerCP-Cy5.5, aby odróżnić dodatnio barwione komórki od tła.</li>
	<li>Przygotować roztwór do barwienia martwych komórek, rozcieńczając żywy/martwy odczynnik (tabela materiałów) w stosunku 1:10 000 w PBS.</li>
	<li>Rozmrozić limfocyty T dnia 3, dnia 5 i dnia 9, które były wcześniej kriokonserwowane. Odwirować 1 x 106 limfocytów T z każdej grupy w ilości 300 x g przez 3 min. Odrzucić supernatant. Umyj komórki raz za pomocą PBS. Wirować przy 300 x g przez 3 minuty i wyrzucić PBS.</li>
	<li>Mieszać limfocyty T z martwym roztworem barwiącym przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT), chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Dodaj 1 ml buforu FACS, aby ugasić barwnik barwiący martwe komórki. Wirować przy 300 x g przez 3 minuty, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl buforu FACS zawierającego koktajl przeciwciał opisany w krokach 2.1 i 2.2. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu FACS i odwirować przy 300 x g przez 3 minuty, aby zmyć niezwiązane przeciwciało. Powtórz trzy razy z buforem FACS.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 1% paraformaldehydzie (PFA) i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ponieważ ekspresja CD45RO zmniejsza się po utrwaleniu, należy przeanalizować próbki za pomocą cytometrii przepływowej po barwieniu immunologicznym. Aby ocenić różnicowanie, bramka w następującej kolejności: pojedyncze (FSC-H vs FSC-A), żywe limfocyty T CD3 + (Dump [żywy-martwy fiolet, CD14-PB i CD19-PB vs CD3-BV605], CD4-BV510 vs CD8-APC-H7). W podzbiorach CD4 + i CD8 + bramka na CD45RO-PE vs CCR7-FITC w celu zdefiniowania naiwnopodobnych limfocytów T (CD45RO-CCR7 +), Tcm (CD45RO + CCR7 +), Tem (CD45RO + CCR7-) i Tte (CD45RO-CCR7-). Aby zidentyfikować Tscm, bramka na limfocytach T CD27 + w populacji naiwnych limfocytów T. W tym przedziale Tscm to CD95+, a Tn to CD95-.</li>
</ol>
3. Analiza funkcjonalna in vitro
<ol>
	<li>Proliferacja limfocytów CAR T i wydzielanie cytokin
	<ol>
		<li>Sprawdź ekspresję CAR, a także żywotność komórek, jak opisano w krokach 1.5 i 1.7, za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
		<li>Przemyć 5 x 106 limfocytów T z każdej grupy (dzień 3, dzień 5 i dzień 9) PBS i ponownie zawiesić w roztworze 1 μM estru sukcynimidylowego dioctanu karboksyfluoresceiny (CFSE) w PBS przez 3,5 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Natychmiast dodać 10 ml PBS zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w celu wygaszenia reakcji.</li>
		<li>Odwirować roztwór o stężeniu 300 x g przez 3 minuty. Wyrzucić supernatant i powtórzyć ten etap płukania trzy razy. Policz komórki po zakończeniu barwienia CFSE za pomocą licznika Coultera (tabela materiałów).</li>
		<li>Pobrać komórki barwione CFSE (niestymulowane), ponownie zawiesić w 1% PFA i przechowywać w temperaturze 4 °C do analizy za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
		<li>Inkubować żądaną liczbę komórek CAR T barwionych CFSE z napromieniowanymi komórkami K562-CD19 (cel), jak również K562-dzikimi (kontrolnymi) w stosunku 1:1 przez 120 godzin w pożywce hodowlanej wolnej od cytokin i warunkach hodowli, jak opisano w kroku 1.1.</li>
		<li>Po 24 godzinach odwirować naczynie hodowlane o stężeniu 300 x g przez 5 minut. Zebrać 120 μl supernatantu komórkowego. Oceń zależną od aktywacji produkcję IL2, IFNγ, TNFα, GM-CSF i innych cytokin zapalnych (IL1β, IL4, IL5, IL6, IL8 i IL10) za pomocą analiz Luminex zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
		<li>Zastąpić objętość supernatantu, która została zebrana w kroku 3.1.7, równoważną objętością (120 μl) świeżej pożywki.</li>
		<li>W dniu 3 (tj. po 96 godzinach) należy policzyć i ponownie podawać w stężeniu 0,5 x 106 komórek/ml za pomocą cytometrii przepływowej opartej na kulkach, jak poprzednio w kroku 1.5.</li>
		<li>W dniu 5 policz żywe komórki CD3 + i oblicz zmianę krotności żywych komórek T w stosunku do liczby żywych komórek T w dniu 0.</li>
		<li>Wykonaj kompleksową analizę rozcieńczenia CFSE w dzielących się limfocytach CAR T za pomocą oprogramowania FlowJo, aby podkreślić kolejne rundy podziału komórek. 
		UWAGA: Testy proliferacji są dobrze opisane w podręczniku FlowJo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test cytotoksyczności 
	nuta: Zdolność komórek CART19 do zabijania komórek docelowych wykazujących ekspresję CD19 ocenia się za pomocą testu uwalniania 51Cr.
	<ol>
		<li>Oznaczyć komórki docelowe, mieszając 5 x 105 komórek kontrolnych typu dzikiego K562-CD19, K562 lub komórek białaczkowych NALM6 z 50 μl Na251CrO4 i 0,5 ml RPMI uzupełnionych 10% FBS przez 90 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Odwirować komórki przy 300 x g przez 2,5 min. Wyrzucić radioaktywny supernatant do odpowiednich pojemników na odpady i umyć komórki docelowe w 5 ml PBS. Powtórz kroki prania dwukrotnie.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki docelowe w pożywce wolnej od czerwieni fenolowej zawierającej 5% FBS. Użyj tego medium do dalszej części procedury, aby zmniejszyć tło.</li>
		<li>Po ocenie ekspresji CAR i żywotności komórek za pomocą cytometrii przepływowej (jak opisano w sekcji 5.1), zmieszać limfocyty CAR T ze znakowanymi komórkami docelowymi w proporcjach efektor:cel (E:T) 10:1, 3:1 i 1:1, w trzech powtórzeniach. Przenieść na 96-dołkową płytkę dolną w kształcie litery U.</li>
		<li>Równolegle należy uwzględnić same komórki docelowe i komórki docelowe z 1% dodecylosiarczanem sodu (SDS), aby określić odpowiednio spontaniczne (S) i maksymalne (M) uwalnianie 51Cr.</li>
		<li>Odwirować komórki przy ciśnieniu 300 x g przez 5 minut i inkubować przez 4 godziny lub 20 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
		<li>Po upływie wyznaczonego czasu odwirować naczynie hodowlane o sile 300 x g przez 5 minut. Zebrać 35 μl supernatantu komórkowego i przenieść na płytkę czytnika. Unikaj bąbelków. Pozostaw talerz do wyschnięcia na noc.</li>
		<li>Uszczelnij płytkę za pomocą standardowej uszczelki płytowej i policz za pomocą licznika scyntylacji cieczy. Obfitość chromu w supernatancie stanowi wskaźnik zastępczy zabijania komórek docelowych. Oblicz procent lizy swoistej w następujący sposób: 100 x (liczba na minutę [cpm] wydanie eksperymentalne – uwolnienie cpm S)/ (uwolnienie cpm M – uwolnienie cpm S).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza funkcjonalna in vivo
<ol>
	<li>Uzyskaj 6-10-tygodniowe myszy NOD-SCID γc–/– (NSG), które nie mają adaptacyjnego układu odpornościowego, i losowo przypisz je do grupy leczonej / kontrolnej.</li>
	<li>Wstrzyknąć zwierzętom dożylnie przez żyłę ogonową 1 x 106 komórek NALM6 w 0,1 ml sterylnego PBS.</li>
	<li>Po 5-7 dniach potwierdź wszczepienie guza za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego (BLI). Wstrzyknąć 150 mg/kg D-lucyferyny myszom, które zostały znieczulone izofluranem (objętość zależy od masy ciała).</li>
	<li>Zmierz wartości bioluminescencji za pomocą systemu obrazowania. Określ ilościowo całkowity strumień za pomocą odpowiedniego oprogramowania, rysując prostokąty o identycznym obszarze wokół myszy, sięgające od głowy do 50% długości ogona. Odejmij tło dla każdego obrazu z osobna.</li>
	<li>Po ustaleniu białaczki wstrzyknąć 3 x 106-dniowych 9 komórek CART19, 0,5 x 106-dniowych 3 limfocytów T CAR lub odpowiadających im nietransdukowanych (NTD) ludzkich limfocytów T przez żyłę ogonową w objętości 100 μL sterylnego PBS / Ca2 +, 
	nuta: Ponieważ bioaktywność komórek zebranych w różnych odstępach czasu podczas procesu hodowli jest różna, wybrane stężenie komórek dnia 3 jest niższe niż dnia 9.</li>
	<li>Aby określić postęp choroby, mierz wartości bioluminescencji dwa razy w tygodniu, jak opisano powyżej w kroku 4.3.</li>
	<li>Aby określić wszczepienie limfocytów CAR T, należy pobrać 75 μl krwi przez krwawienie zaoczodołowe w probówce pokrytej EDTA. Przenieść 50 μl krwi do probówek do liczenia bezwzględnego.</li>
	<li>Zabarwić krew przeciwciałami przeciwko CD45, CD4, CD8 i CAR przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 400 μl 1x roztworu lizującego FACS do probówek i dokładnie odwirować. Po barwieniu przeanalizować ekspresję markera powierzchniowego za pomocą cytometrii przepływowej. 
	nuta: Inne markery powierzchniowe można wykorzystać do oceny stanu różnicowania i wyczerpania limfocytów T we krwi.</li>
	<li>Aby zmierzyć poziom cytokin we krwi, należy odwirować krew o stężeniu 1 200 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu oddzielenia surowicy od górnej warstwy krwi.</li>
	<li>Pobrać surowicę i zmierzyć cytokiny za pomocą przeznaczonej do tego płytki czytnika zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>

<ol><li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138(2013).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cells+with+Chimeric+Antigen+Receptors+Have+Potent+Antitumor+Effects+and+Can+Establish+Memory+in+Patients+with+Advanced+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia.</a> Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73(2011).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li>
<li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li>
<li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139(2015).</li>
<li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoma+Remissions+Caused+by+Anti-CD19+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+Are+Associated+With+High+Serum+Interleukin-15+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).</li>
<li>Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+therapy+in+the+treatment+of+post-transplant+lymphoproliferative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).</li>
<li>Brestrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+T-cell+therapy+of+a+lung+transplanted+patient+with+severe+CMV+disease+and+resistance+to+antiviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy.</a> American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).</li>
<li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+solid+organ+transplant+recipients+with+autologous+Epstein+Barr+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+%28CTLs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs).</a> Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).</li>
<li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+effector+CD8%2B+T+cells+derived+from+central+memory+cells+establishes+persistent+T+cell+memory+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates.</a> The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+memory+T+cell+subset+with+stem+cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A human memory T cell subset with stem cell-like properties.</a> Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).</li>
<li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptively+transferred+effector+cells+derived+from+naive+rather+than+central+memory+CD8%2B+T+cells+mediate+superior+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).</li>
<li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+memory+self%2Ftumor-reactive+CD8%2B+T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+human+central+memory-derived+effector+CD8%2B+T+cells+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice.</a> Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+naive+and+central+memory+derived+CD8%2B+effector+cell+engraftment+fitness+and+function+following+adoptive+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer.</a> Oncoimmunology. 5 (1), e1072671(2016).</li>
<li>Fraietta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li>
<li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Ex+Vivo+Culture+Improves+the+Antileukemic+Activity+of+Chimeric+Antigen+Receptor+%28CAR%29+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells.</a> Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).</li>
<li>Milone, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+receptors+containing+CD137+signal+transduction+domains+mediate+enhanced+survival+of+T+cells+and+increased+antileukemic+efficacy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).</li>
<li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li>
<li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7-Induced+Glycerol+Transport+and+TAG+Synthesis+Promotes+Memory+CD8+T+Cell+Longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity.</a> Cell. 161 (4), 750-761 (2015).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li>
<li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+memory+phenotypes+drive+T+cell+proliferation+in+patients+with+pediatric+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies.</a> Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy podejścia do pomiaru funkcji i skuteczności limfocytów CAR T zbieranych w różnych odstępach czasu podczas hodowli ex vivo. Nasze metody zapewniają kompleksowy wgląd w testy przeznaczone do oceny zdolności proliferacyjnej, a także funkcji efektorowej in vitro. Opisujemy, jak mierzyć aktywność limfocytów CAR T po stymulacji za pomocą CAR i szczegółowo opisujemy modele ksenoprzeszczepów białaczki przy użyciu komórek CAR T pobranych w 3 dniu w porównaniu z 9 dniem ich logarytmicznej fazy ekspansji.</p...

Chimeryczne receptory antygenowe (CARs) stanowią obiecujące podejście do przekierowywania limfocytów T przeciwko różnym antygenom nowotworowym. CAR to syntetyczne receptory, które wiążą cel antygenowy. Chociaż ich dokładny skład jest zmienny, Republiki Środkowoafrykańskie zazwyczaj zawierają 3 odrębne domeny. Domena zewnątrzkomórkowa kieruje wiązanie z antygenem docelowym i zwykle składa się z fragmentu przeciwciała o pojedynczym łańcuchu połączonym z CAR za pomocą zawiasu zewnątrzkomórkowego. Druga domena, powszechnie wywodząca się z łańcucha CD3ζ kompleksu receptora komórek T (TCR), promuje aktywację limfocytów T po zaangażowaniu CAR. Trzecia domena kostymulacyjna jest uwzględniona w celu poprawy funkcji limfocytów T, wszczepienia, metabolizmu i trwałości. Sukces terapii komórkami CAR T w różnych nowotworach układu krwiotwórczego, w tym w ostrej białaczce limfoblastycznej z komórek B (ALL), przewlekłej białaczce limfocytowej (CLL) i szpiczaku mnogim, podkreśla terapeutyczną obietnicę tego podejścia1,2,3,4,5,6. Niedawne zatwierdzenia przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) dla dwóch terapii limfocytami CAR T specyficznych dla CD19, tisagenlecleucel dla dzieci i młodych dorosłych ALL oraz axicabtagene ciloleucel dla chłoniaka rozlanego z dużych komórek B, wzmacniają wartość translacyjną terapii komórkami CAR T.
Podejścia oparte na CAR T polegają na izolacji limfocytów T z krwi obwodowej, aktywacji, modyfikacji genetycznej i ekspansji ex vivo. Różnicowanie jest ważnym parametrem regulującym skuteczność limfocytów CAR T. W związku z tym ograniczenie różnicowania limfocytów T podczas hodowli ex vivo zwiększa zdolność podawanego produktu do wszczepiania, rozszerzania się i utrzymywania, zapewniając długotrwały nadzór immunologiczny po transferze adoptywnym2,7,8,9. Limfocyty T składają się z kilku odrębnych podzbiorów, w tym: naiwnych limfocytów T (Tn), pamięci centralnej (Tcm), pamięci efektorowej (Tem), zróżnicowanej efektorowej (Tte) i pamięci komórek macierzystych (Tscm). Limfocyty T zróżnicowane efektorowo mają silną zdolność cytolityczną; Są one jednak krótkotrwałe i słabo się wszczepiają10,11,12. W przeciwieństwie do tego, limfocyty T o mniej zróżnicowanym fenotypie, w tym naiwne limfocyty T i Tcm, wykazują lepsze zdolności do wszczepiania i proliferacji po adoptywnym transferze komórek13,14,15,16,17,18. Skład pobranych limfocytów T w prefabrykowanym produkcie może się różnić u różnych pacjentów i koreluje z potencjałem terapeutycznym limfocytów CAR T. Odsetek limfocytów T o pierwotnym immunofenotypie w wyjściowym produkcie aferezy jest silnie skorelowany zarówno z wszczepieniem, jak i odpowiedzią kliniczną19.
Czas trwania hodowli jest ważnym parametrem wpływającym na różnicowanie w limfocytach CAR T przygotowanych do adopcyjnego transferu. Niedawno opracowaliśmy podejście do generowania najwyższej jakości komórek CAR T przy użyciu skróconego paradygmatu hodowli20. Korzystając z naszego podejścia, wykazaliśmy, że ograniczona hodowla powoduje powstawanie limfocytów CAR T o lepszej funkcji efektorowej i trwałości po transferze adoptywnym w ksenoprzeszczepowych modelach białaczki. W tym miejscu przedstawiamy podejścia do niezawodnego generowania komórek CART19 (autologiczne limfocyty T zaprojektowane do ekspresji anty-CD19 scFv przyłączone do CD3ζ i domen sygnalizacyjnych 4-1BB) i zawieramy szczegółowy opis testów, które zapewniają wgląd w bioaktywność i skuteczność CAR T przed transferem adoptywnym.

<table><tbody><tr><td>Anty CD3/CD28 Termo</td><td>Fisher</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>Mysz APC Anti-Human CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>555369</td><td>RRID:AB_398595</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-ludzkie CD8 APC-H7</td> BD <td>Biosciences</td><td>560179</td><td>RRID:AB_1645481</td></tr><tr><td>BD FACS Roztwór do lizy 10X Koncentrat</td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>BD Trucount Absolutne probówki liczące</td><td>BD Biosciences</td><td>340334</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 anty-ludzkie przeciwciało CD4</td><td>BioLegend</td><td>317444</td><td>RRID:AB_2561866</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anty-ludzkie przeciwciało CD3</td><td>BioLegend</td><td>317322</td><td>RRID:AB_2561911</td></tr><tr><td>Zestaw do proliferacji komórek CellTrace CFSE Life</td><td>Technolohgies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Absolutne koraliki do liczenia,</td> <td>Invitrogen</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>FITC anty-ludzkie przeciwciało CD197 (CCR7)</td><td>BD Pharmingen</td><td>561271</td><td>RRID:AB_10561679</td></tr><tr><td>FITC Mysz anty-ludzka CD4</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>555346 RRID:AB_395751</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka surowica AB</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka IL-2 IS, premium klasa</td><td>Miltenyi</td><td>130-097-744</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>28030-081</td><td></td></tr><tr><td>Licznik scyntylacyjny cieczy, MicroBeta trilux</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Fioletowe</td><td>sondy molekularne</td><td>L34964</td><td></td></tr><tr><td>Multisizer Coulter Licznik redlic</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na251CrO4</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEZ030S001MC</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Niebieskie przeciwciało anty-ludzkie CD14</td><td>BioLegend</td><td>325616</td><td>RRID:AB_830689</td></tr><tr><td>Pacific Blue anty-ludzkie przeciwciało CD19</td><td>BioLegend</td><td>302223</td><td></td></tr><tr><td>PE anty-ludzkie przeciwciało CD45RO</td><td>BD Biosciences</td><td>555493</td><td>RRID:AB_395884</td></tr><tr><td>PE/Cy5 anty-ludzkie przeciwciało CD95 (Fas)</td><td>BioLegend</td><td>305610</td><td>RRID:AB_493652</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie CD27 PE/Cy7</td><td>Beckman Coulter</td><td>A54823</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco</td><td>10373-017</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure SDS Solution, 10%</td> <td>Invitrogen</td><td>15553027</td><td></td></tr><tr><td>Via-Probe</td><td>BD Biosciences</td><td>555815</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Gibco</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>XenoLight D-Luciferin - K+ Salt</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie limfocytów t z chimerycznym receptorem antygenowym (car) do immunoterapii adoptywnej

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Immunoterapia adopcyjna jest obiecująca w leczeniu raka i chorób zakaźnych. Opisujemy proste podejście do transdukcji pierwotnych ludzkich limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) i ekspansji ich potomstwa ex vivo. Uwzględniamy testy do pomiaru ekspresji CAR, a także różnicowania, zdolności proliferacyjnej i aktywności cytolitycznej. Opisujemy testy do pomiaru produkcji cytokin efektorowych i wydzielania cytokin zapalnych w komórkach CAR T. Nasze podejście zapewnia wiarygodną i kompleksową metodę hodowli limfocytów CAR T do przedklinicznych modeli immunoterapii adoptywnej.

Stosując opisane powyżej metody, stymulowaliśmy i namnażaliśmy limfocyty T przez 3 lub 9 dni (Rycina 1A,B). Przeanalizowaliśmy również ich profil różnicowania, zgodnie ze strategią bramkowania przedstawioną na Rycynie 1C, mierząc poziom poszczególnych glikoprotein eksprymowanych na powierzchni komórek. Wykazujemy progresywne przesunięcie w stronę różnicowania efektorowego w czasie trwania hodowli ex vivo (Ry...

Opisujemy podejście do niezawodnego generowania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) i testowania ich różnicowania i funkcji in vitro i in vivo.

Wytwarzanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) do immunoterapii adoptywnej

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Delibacja produktu z komórek CAR T o kompetencjach funkcjonalnych, które wszczepiają, namnażają się i wykazują aktywność cit-el-uric po infuzji, jest kluczowym elementem skutecznej immunoterapii adoptywnej. Na przykład w guzach litych limfocyty CAR T mogą przenikać do guzów litych i otrzymują optymalną stymulację antygenową; Jednak ich ogólne wszczepianie i proliferacja jest utrudnione u ludzi. Główną zaletą tego podejścia jest to, że może ono zachować jakość limfocytów CAR T lub stan różnicowania komórek CAR T bez generowania końcowo zróżnicowanych lub wyczerpanych limfocytów T, które miałyby zmniejszoną zdolność proliferacyjną lub słabą skuteczną funkcję po infuzji.Ta technika może być trudna, ponieważ limfocyty T są bardzo wrażliwe na stężenie komórek lub powierzchnię naczyń, w których są hodowane. A także ich potrzeby metaboliczne. Zasadniczo limfocyty T muszą być szczęśliwe przez cały proces, w przeciwnym razie nie będą rosły.Aby rozpocząć tę procedurę, ustaw 6-dołkowe naczynia hodowlane. Aktywuj świeże lub kriokonserwowane pierwotne ludzkie limfocyty T, mieszając je z kulkami magnetycznymi anty-CD3 CD28, w stosunku trzech kulek na komórkę T w dołkach szalek hodowlanych. Hodow

manufacturing-chimeric-antigen-receptor-car-t-cells-for-adoptive

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film demonstruje technikę wytwarzania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) ex vivo. Ludzkie limfocyty T są inkubowane za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28, wraz z pożywką uzupełnioną interleukiną-2 (IL-2), co prowadzi do aktywacji i proliferacji limfocytów T. Wprowadzane są transgeniczne wektory lentiwirusowe, które umożliwiają transgenicznemu RNA integrację z genomem gospodarza i ekspresję transgenu. Powoduje to, że transdukowane...

Technika ex vivo do wytwarzania chimerycznych limfocytów T receptora antygenowego

Ten film demonstruje technikę generowania ex vivo limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) specyficznym dla antygenu nowotworowego. Wektory retrowirusowe przenoszące transgeniczne RNA są mieszane z komórkami śledziony w pożywce uzupełnionej interleukiną-2 w celu promowania przeżycia i proliferacji komórek T. Mieszanina jest następnie przenoszona na płytkę pokrytą rekombinowanymi fragmentami ludzkiej fibronektyny i odwirowywana, aby ułatwić fuzję wirusa z komórką, umożliwiając...

Technika ex vivo do generowania specyficznych dla nowotworu chimerycznych komórek T receptora antygenowego

Opisujemy ilościowy system testów cytolizy in vitro w czasie rzeczywistym, aby ocenić siłę działania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenu ukierunkowanych na płynne i lite komórki nowotworowe. Protokół ten można rozszerzyć w celu oceny innych komórek efektorowych układu odpornościowego, a także leczenia skojarzonego.

Test siły działania w czasie rzeczywistym dla chimerycznych limfocytów T receptora antygenowego ukierunkowanych na stałe i hematologiczne komórki nowotworowe

Tutaj prezentujemy protokół edycji genów w pierwotnych ludzkich limfocytach T za pomocą technologii CRISPR Cas do modyfikacji komórek CAR-T.

Produkcja ludzkich komórek CAR-T zmodyfikowanych przez CRISPR

Ten artykuł szczegółowo opisuje proces produkcji limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym do użytku klinicznego, w szczególności przy użyciu automatycznego procesora komórkowego zdolnego do przeprowadzania transdukcji wirusa i hodowli limfocytów T. Przedstawiamy rekomendacje i opisujemy pułapki, które należy wziąć pod uwagę podczas opracowywania procesu i wdrażania badania klinicznego wczesnej fazy.

Wytwarzanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym na zautomatyzowanym procesorze komórkowym

Ten protokół usprawnia produkcję wektorów retrowirusowych i transdukcję mysich limfocytów T, ułatwiając efektywne wytwarzanie mysich komórek CAR-T.

Wydajne wytwarzanie mysich chimerycznych receptorów antygenowych (CAR)-T

Ten protokół zapewnia usprawniony przepływ pracy do generowania i testowania ludzkich limfocytów regulatorowych receptora antygenu chimerycznego (Treg CAR).

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego

Ten protokół opisuje szczegółową procedurę generowania przejściowych limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) przy użyciu nieintegrującego mRNA do immunoterapii nowotworów i dostarcza wiarygodnych metod oceny komórek CAR-T i ich funkcji cytotoksycznej.

Niewirusowe podejście do generowania przejściowych limfocytów T receptora chimerycznego antygenu przy użyciu mRNA do immunoterapii nowotworów

Tutaj opisujemy metodę tworzenia kropelek podwójnej emulsji otaczających jedną limfocyt T i komórkę docelową raka, aby zbadać zabijanie komórek na poziomie pojedynczej komórki. Metoda ta pozwala na podwójną kwantyfikację zarówno cząsteczek cytotoksycznych, jak i apoptozy komórek docelowych w dużej populacji limfocytów T.

Test cytotoksyczności oparty na kropelkach w celu oceny limfocytów T receptora antygenu chimerycznego na poziomie pojedynczej komórki

Ten protokół opisuje kluczowe kroki uprawy pierwotnych komórek T, w tym ich izolację, aktywację, ekspansję oraz przejściową transfekcję przez elektroporację mRNA. Dodatkowo proponowany jest przepływ pracy i panel przeciwciał do analizy cytometrycznej fenotypu, markerów aktywacji, żywotności oraz ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych (CAR).

Izolacja, hodowla i przejściowa transfekcja pierwotnych ludzkich komórek T w celu wygenerowania komórek T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR)

Poznaj metodę wytwarzania limfocytów T CAR o zachowanej kompetencji funkcjonalnej do immunoterapii adoptywnej. Technika ta zapewnia wysoką jakość komórek i skuteczność terapeutyczną.

Wytwarzanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) do immunoterapii adoptywnej

Przeglądaj więcej filmów