Rusztowania drukarskie rdzeniowe / skorupowe do inżynierii tkankowej struktur rurowych

Wytwarzanie struktur rurkowych jest obiecującym podejściem do inżynierii tkankowej sieci naczyniowych, która pozostaje jednym z głównych wyzwań w hodowli grubych tkanek in vitro. Główną zaletą techniki rdzeń/powłoka jest prosta produkcja rusztowań z pustych włókien w jednym kroku, co skraca czas produkcji i potencjalnie umożliwia bezpośrednie drukowanie z komórkami. Przygotowanie preparatu hydrożelowego o odpowiednich właściwościach lepkosprężystych i utrzymanie ciągłego, zrównoważonego przepływu materiałów rdzenia/powłoki ma kluczowe znaczenie dla druku 3D stabilnych rusztowań.

Na początek napełnij sterylną strzykawkę o pojemności 5 ml świeżo przygotowanym hydrożelem. Napełnij drugą strzykawkę o pojemności 5 ml, wyposażoną w igłę o końcu w rozmiarze 27, świeżo przygotowanym roztworem sieciującym. Zamontuj dyszę rdzenia/skorupy.

Włóż igłę z końcem G27 jako element rdzeniowy i przymocuj igłę za pomocą. Wewnętrzna igła powinna wystawać około 1 mm z zewnętrznej dyszy skorupy rdzenia. Podłącz strzykawkę z roztworem sieciującym do igły G27 w dyszy i załaduj strzykawkę do jednego z mocowań ekstrudera drukarki 3D sterylizowanej etanolem.

Zamontuj strzykawkę z hydrożelem w drugiej wytłaczarce i podłącz ją do dyszy. Użyj blokady Luer, aby podłączyć krótką rurkę do bocznego wejścia Luer dyszy rdzenia/powłoki. Ostrożnie ręcznie wyreguluj wyrównanie, aż dysza dotknie powierzchni, zanim cofniesz dyszę na odległość równą zewnętrznej średnicy dyszy.

Zaimportuj wygenerowany kod g rusztowania i naciśnij przycisk Odtwórz, aby rozpocząć proces drukowania. Po wydrukowaniu należy ostrożnie usunąć podłoże z wydrukowanym rusztowaniem i wylać wtórny roztwór sieciujący na całe rusztowanie. Inkubować rusztowanie przez jedną minutę w temperaturze pokojowej.

Aby odłączyć rusztowanie od podłoża, delikatnie pociągnij rusztowanie na boki. Jeśli rusztowanie mocno przylega do podłoża, włóż ostrą krawędź między oba materiały, aby je rozdzielić. Przenieś rusztowanie do nowego pojemnika.

Sterylizuj UV obie strony rusztowania przez 30 minut z każdej strony. Następnie umieść rusztowanie w bezbarwnym podłożu do hodowli komórkowych i inkubuj rusztowanie w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez co najmniej 24 godziny. Następnego dnia zbierz huvex z kultury in vitro z 0,25% trypsyny przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po odłączeniu komórek należy zatrzymać reakcję enzymatyczną za pomocą 3 ml świeżej pożywki do hodowli komórkowych i zebrać komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad w świeżej pożywce hodowlanej zawierającej czerwień fenolową i rozcieńczyć komórki do stężenia 3,4 razy 10 do piątej komórki śródbłonka na mililitr. Załaduj komórki do sterylnej strzykawki o pojemności 5 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 27 i zlokalizuj punkt wejścia w rusztowaniu.

Wyrównując igłę z prostą częścią włókna rusztowania, ostrożnie nakłuj rusztowanie pod małym kątem. Upewnij się, że igła znajduje się w pustym włóknie kanału i delikatnie naciśnij tłok, aby wstrzyknąć około 1-2 ml zawiesiny komórek do rusztowania. Przepływ zawiesiny powinien być widoczny przez półprzezroczyste rusztowanie.

Gdy całe rusztowanie zostanie wypełnione zawiesiną komórkową, zanurz rusztowanie w świeżej pożywce do hodowli komórkowych i włóż rusztowanie z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych na okres do 10 dni. W przypadku obrazowania żywego/martwego pod koniec inkubacji, należy przepłukać rusztowanie PBS i użyć igły, aby ostrożnie wstrzyknąć żywy/martwy roztwór do rusztowania. Upewnij się, że roztwór wypełnił całe rusztowanie i umieść rusztowanie w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut.

Pod koniec inkubacji przepłukać rusztowanie PBS i ostrożnie przenieść rusztowanie na szkiełko podstawowe. Barwione komórki można następnie obserwować na rusztowaniach pod mikroskopem fluorescencyjnym. W tym przekroju świeżo wydrukowanego i poddanego obróbce wtórnej rusztowania można zaobserwować wyraźnie widoczny pusty kanał w żarniku.

Nawet po 72 godzinach inkubacji w pożywce do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza, jak wykazano, włókno zachowuje pustą strukturę na całej długości rusztowania. Tutaj pokazano reprezentatywny test żywych/martwych komórek śródbłonka po 48 godzinach hodowli w rusztowaniu. Żywe komórki można zidentyfikować po ich jasnozielonym sygnale fluorescencyjnym.

Technika ta jest podstawą jednoetapowego wytwarzania rusztowań rurowych z wydrążonymi rurami i może być ulepszona poprzez bezpośrednie drukowanie przy użyciu komórek wbudowanych w biotusz.