Name: Rusztowania drukarskie rdzeniowe / skorupowe do inżynierii tkankowej struktur rurowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Poznaj technikę bioprintingu rdzeniowo-skorupowego do jednoetapowej produkcji rurowych rusztowań 3D. Ta metoda umożliwia efektywne inżynierowanie tkanek z bezpośrednią inkorporacją komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować za wsparcie finansowe dla tego projektu otrzymane od Słoweńskiej Agencji Badawczej (numery grantów: P3-0036 i I0-0029) oraz Ministerstwa Nauki, Edukacji i Sportu (numer grantu: 5442-1/2018/59).

1. Przygotowanie hydrożeli i roztworów sieciujących
<ol>
	<li>Krótko, energicznie mieszając, rozpuść proszki ALG i CMC w ultraczystej wodzie, aby uzyskać łącznie 3% wag. ALG i 3% wag. roztwór CMC. 
	UWAGA: W tej pracy do drukowania używa się strzykawek o pojemności 5 ml; W ten sposób ostateczna ilość materiału jest dostosowywana do tej objętości. Jednak w przypadku innych wkładów do wytłaczania i drukowanych rozmiarów próbek ilość przygotowanego materiału powinna być odpowiednio przeskalowana.</li>
	<li>Dodaj 1,5% wag. nanowłókien celulozowych do mieszaniny ALG-CMC w celu dodatkowego wzmocnienia mechanicznego w celu osiągnięcia pożądanej lepkości, odpowiedniej do druku.</li>
	<li>Mieszać zawiesinę hydrożelową do uzyskania jednorodności za pomocą mieszadła górnego. 
	UWAGA: W hydrożelu nie powinno być żadnych włókien ani pęcherzyków.</li>
	<li>Przygotuj 10 ml 100 mM roztworu chlorku wapnia (CaCl2) w ultraczystej wodzie, która jest używana jako podstawowy roztwór sieciujący do drukowania.</li>
	<li>Przygotować 10 ml 5% wag. roztworu CaCl2 w ultraczystej wodzie, który jest używany jako wtórny roztwór sieciujący w końcowej obróbce rusztowań. 
	UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, wszystkie preparaty hydrożelowe, które nadają się do natychmiastowego sieciowania chemicznego, pozwalają na jednoetapowe wytwarzanie pustych rurek i mogą być stosowane z tego typu konfiguracją rdzenia/powłoki. Mechanizmy drukowania i sieciowania muszą być odpowiednio zoptymalizowane. Lepkość hydrożelu będzie się różnić w zależności od pożądanego składu; Można go jednak regulować za pomocą stężeń polimerów i dodatku środków zagęszczających (np. nanowłókien). Idealna lepkość do drukowania 3D stabilnych struktur jest wystarczająco wysoka, aby wytłaczany filament zachował swój kształt, a rusztowanie utrzymało swój ciężar przed usieciowaniem.</li>
</ol>
2. Drukowanie rdzeni/powłok rusztowań perfuzyjnych
<ol>
	<li>Przed drukowaniem wysterylizuj biodrukarkę, rozpylając dokładnie 70% etanolu i wystaw ją na działanie światła UV przez 1 godzinę.</li>
	<li>Włącz biodrukarkę i uruchom oprogramowanie sterujące, które jest dostarczane w zestawie z drukarką 3D.</li>
	<li>Wykonaj procedurę bazowania, naciskając ikonę Strona główna.</li>
	<li>Korzystanie z polecenia Plik | Zaimportuj G-Code, zaimportuj wygenerowany kod G rusztowania.</li>
	<li>Przenieś hydrożel do sterylnej strzykawki o pojemności 5 ml i umieść go w jednym z mocowań ekstrudera drukarki 3D. Za pomocą luer-locka i krótkiej rurki podłącz go do bocznego wejścia luer dyszy rdzenia/płaszcza.</li>
	<li>Przenieść roztwór sieciujący (100 mM CaCl2) do innej sterylnej strzykawki o pojemności 5 ml z dołączoną igłą z końcem G27 i włożyć ją do górnego uchwytu igły dyszy rdzenia/skorupy. Wewnętrzna igła powinna lekko wystawać (~1 mm) z zewnętrznej dyszy rdzenia/powłoki. Dostosuj wyrównanie ręcznie. Włożyć drugą strzykawkę do uchwytu do wytłaczania.</li>
	<li>Aby poprawnie włożyć strzykawki do mocowań (konfiguracja pokazana w Rysunek 2), ręcznie kontroluj oba mocowania do wytłaczania, klikając strzałki A i B oraz Góra i Dół.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem drukowania należy oddzielnie wytłoczyć hydrożel i roztwór sieciujący, aby usunąć nadmiar pęcherzyków powietrza w dyszy rdzenia/powłoki i zapewnić ciągły przepływ hydrożelu.</li>
	<li>Używając strzałek Z oraz Góra i Dół, ręcznie dostosuj odległość między dyszą a podłożem drukowania. Zaleca się stosowanie płaskiego podłoża do druku na szkle, które ma dobrą przyczepność. Dysza do wytłaczania nie powinna stykać się z podłożem, aby umożliwić nieprzerwany przepływ hydrożelu. Optymalna odległość dyszy od podłoża (wysokość warstwy) jest zazwyczaj taka sama jak szerokość zewnętrznej średnicy dyszy, ale jest dostosowana do użytego materiału i indywidualnych parametrów druku. Dostosuj początkową wysokość druku do indywidualnych potrzeb.</li>
	<li>Naciśnij przycisk Odtwórz, aby rozpocząć proces drukowania. 
	UWAGA: Zaleca się dołączenie nadruku fartucha (<silna klasa="xfig">Rysunek 3) otaczającego rusztowanie, aby zapewnić ułożenie jednorodnego pustego włókna przed rozpoczęciem drukowania właściwego rusztowania. Aby osiągnąć optymalny przepływ hydrożelu z zamiarem drukowania optymalnych rusztowań, zmieniaj skład receptury, skład roztworu sieciującego i parametry drukowania (tj. prędkość drukowania, ciśnienie wytłaczania, temperaturę drukowania, odległość między podłożem a dyszą wytłaczającą itp.).</li>
	<li>Po wydrukowaniu ostrożnie usuń podłoże z wydrukowanym rusztowaniem i wlej wtórny roztwór sieciujący (5% wag. CaCl2) na całe rusztowanie, aby zapewnić usieciowanie na całym rusztowaniu. Inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (RT). 
	UWAGA: Upewnij się, że całe rusztowanie jest zanurzone w roztworze sieciującym. Ten etap ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia pożądanych właściwości wytrzymałościowych rusztowania, ale będzie się różnić w zależności od zastosowanego materiału i metody sieciowania.</li>
	<li>Za pomocą skalpela ręcznie odetnij nadmiar materiału spódnicy.</li>
	<li>Sterylizuj rusztowania w świetle UV przez 30 minut. Ostrożnie odwróć rusztowanie i powtórz proces sterylizacji.</li>
	<li>Ostrożnie odłącz rusztowanie od podłoża, delikatnie pociągając je na boki. Jeśli rusztowanie mocno przylega do podłoża, należy je oddzielić, wkładając między nie ostrą krawędź.</li>
	<li>Przenieść rusztowanie do bezbarwnej pożywki do hodowli komórkowych (DMEM uzupełniony 5 % wag. FBS, 100 U/ml penicyliny i 1 mg/ml streptomycyny) i inkubować je w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5 % wag. CO2 przez co najmniej 24 godziny.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek śródbłonka i roztworu do oznaczania żywych/martwych
<ol>
	<li>Do hodowli komórek należy przygotować zaawansowaną pożywkę do hodowli komórkowych DMEM z dodatkiem czerwieni fenolowej i uzupełnić ją o 5 % wag. FBS i 2 mM L-glutaminy. Dodać 100 j/ml penicyliny i 1 mg/ml streptomycyny.</li>
	<li>Zainicjuj linię ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) i przeprowadź je zgodnie z protokołami hodowli HUVEC, jak opisano47. 
	UWAGA: Zaleca się hodowlę komórek w pożywce do hodowli komórkowych z dodatkiem czerwieni fenolowej w celu łatwej wizualizacji podczas wstrzykiwania komórek do białych, półprzezroczystych rusztowań, jak opisano poniżej.</li>
	<li>Do zliczania komórek należy pobrać pipetą 100 μl komórek zawieszonych w pożywce do hodowli komórkowych i wybarwić je 900 μl 0,1% wag. roztworu błękitu trypanowego.</li>
	<li>Użyj automatycznego licznika komórek lub ręcznego hemocytometru, aby policzyć i uzyskać szacunkową liczbę komórek w zawiesinie.</li>
	<li>Do testu żywego/martwego przygotować roztwór 4 mM Calcein-AM i 2 mM jodku propidyny w sterylnym PBS. 
	UWAGA: Żywy/martwy roztwór należy przygotować bezpośrednio przed przeprowadzeniem testu.</li>
</ol>
4. Przenoszenie komórek na rusztowania
<ol>
	<li>Usunąć rusztowania z pożywki do hodowli komórkowych i przenieść je na wystarczająco dużą szklaną szalkę Petriego.</li>
	<li>Bezpośrednio przed wstrzyknięciem komórek do rusztowań należy oddzielić HUVEC od kolb, stosując leczenie 0,25% wag. trypsyny.
	<ol>
		<li>Na krótko wyrzucić pożywkę do hodowli komórkowych i inkubować komórki z 0,25% wag. trypsyny (~ 2 ml) przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Po inkubacji dodać ~ 3 ml pożywki do hodowli komórkowych do trypsynizowanych komórek i przenieść wszystkie oderwane komórki do probówki wirówkowej.</li>
		<li>Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w świeżej pożywce do hodowli komórkowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Policz komórki zgodnie z wcześniejszym opisem. Dostosuj całkowite stężenie komórek do indywidualnych potrzeb. W tej pracy stosuje się początkowe stężenie 340 000 komórek/ml.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w sterylnej strzykawce z dołączoną igłą G27.</li>
	<li>Znajdź punkt wejścia i zacznij ostrożnie wstrzykiwać komórki do rusztowań. Przepływ zawiesiny komórek przez półprzezroczyste rusztowanie powinien być widoczny. Upewnij się, że całe rusztowanie wypełnia się zawiesiną komórek.</li>
	<li>Zanurzyć rusztowania w pożywkach do hodowli komórkowych i inkubować je w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5 % wag. CO2 przez okres do 10 dni.</li>
	<li>Uzupełnij pożywkę do hodowli komórkowych zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi.</li>
</ol>
5. Test żywy/martwy i obrazowanie komórek
<ol>
	<li>Po inkubacji spłukać rusztowania PBS.</li>
	<li>Za pomocą igły ostrożnie wstrzyknąć wcześniej przygotowany żywy/martwy roztwór (4 mM kalceiny-AM i 2 mM jodku propidyny w PBS) do rusztowań i inkubować je w PBS przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Upewnij się, że roztwór przepływa przez całą długość rusztowania.</li>
	<li>Przepłukać rusztowania PBS.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś rusztowania na szklaną zjeżdżalnię.</li>
	<li>Obserwuj barwione komórki bezpośrednio w rusztowaniach pod mikroskopem fluorescencyjnym. 
	UWAGA: Żywe komórki wytwarzają zieloną fluorescencję, a martwe komórki emitują czerwone światło fluorescencyjne.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Konstrukcja dyszy Korzystając z opracowanej dyszy typu core/shell, zintegrowanej z systemem Vitaprint z dwoma ekstruderami, wyprodukowano puste, rurowe rusztowania w jednym etapie. Aby uzyskać równą grubość ścianki rury przez większość przygotowanych rusztowań, igła musi być umieszczona centralnie na osi zewnętrznego pierścienia wytłaczanego. Igły o standardowym rozstawie często wykazują niewielką, ale znaczną mimośrodowość poza osią. W związku z tym korpus dyszy został zaprojektowany tak, aby utrzymać igłę w dwóch miejscach, raz u góry (mocowanie piasty) i raz przed końcową komorą rdzenia/skorupy (mocowanie samej kaniuli), korygując jej osiowe ustawienie. Precyzja osiowania zwiększa się wraz z odległością między punktem mocowania. Istnieje jednak kompromis między długością igły a dostępną objętością komory dyszy. Aby jeszcze bardziej poprawić funkcjonalność konfiguracji, można wprowadzić pewne modyfikacje dyszy: A) mocowanie dyszy o zwiększonej stabilności, B) dodatkowe dysze dla szerszego zakresu kompatybilności z igłą, C) precyzyjny mechanizm regulacji położenia igły do dyszy oraz D) integracja dodatkowych wejść i urządzeń mikroprzepływowych do przygotowania materiału w locie.
Optymalizacja hydrożelu Aby określić optymalny stosunek ALG:CMC, oceniono kilka iteracji materiału. Ogólnie rzecz biorąc, drukowanie rdzenia/skorupy o stężeniach powyżej 3% wag. obu składników było niemożliwe, ponieważ nie pozwalało na ciągły przepływ hydrożelu lub powodowało zatykanie dyszy. W szczególności stężenie ALG powyżej 3% wag. nadmiernie zwiększało lepkość i powodowało zatykanie dysz, podczas gdy niższe stężenia ALG i wyższe stężenia CMC (>3% wag.) spowalniały czas sieciowania, a tym samym nie zapewniały wystarczającego podparcia strukturalnego rusztowania. Drukowanie rdzenia/skorupy było możliwe przy mniej lepkich preparatach; Jednak lepkość wytłaczanego żelu musi być wystarczająca, aby utrzymać długotrwałą wierność kształtu. Ostatecznie okazało się, że stosunek ALG:CMC 1:1 jest najbardziej odpowiednim wyborem, co potwierdza poprzednie badanie przeprowadzone przez Mavera i wsp.49. Dodanie NFC znacznie poprawiło drukowność i sztywność strukturalną rusztowań drukowanych z rdzeniem/skorupą, ale nie miało znaczącego wpływu na właściwości sieciowania materiału.
Niestandardowe zastosowania, zoptymalizowane pod kątem określonych typów komórek i konfiguracji eksperymentalnych, będą wymagały dobrze dopasowanych materiałów rusztowaniowych, które będą różnić się składem i mechanizmami sieciowania. Metoda opisana w tej pracy opiera się na mieszanym roztworze polimeru alginianowo-celulozowego, który jest sieciowany jonowo przy użyciu jonówCa2+ . Sam alginian jest liniowym polimerem bloków (1,4) połączonych reszt β-d-mannuronianu (M) i α-l-guluronianu (G), które mogą być odwracalnie usieciowane jonowo przez zastosowanie Ca2+ i innych kationów dwuwartościowych, takich jak Sr2+, Br2+, Mg2+. Niemniej jednak najczęściej stosowanym jonem do sieciowania alginianu pozostaje Ca2+ w postaci CaCl2. Ca2+ może być również stosowany w postaciCaSO4 lubCaCO3; jednak niska rozpuszczalnośćCaSO4 w stosunku do CaCl2 oznacza wolniejsze żelowanie. CaCO3 daje jeszcze wolniejszy czas żelowania, co może skutkować słabymi i niespójnymi właściwościami mechanicznymi.
Dłuższe czasy żelowania zazwyczaj dają bardziej jednorodną konstrukcję, jednak niektóre zastosowania, takie jak drukowanie rdzenia/skorupy, wymagają szybkiego tempa żelowania50. JonyMg2+ również indukują żelowanie; jednak ich skuteczność sieciowania jest około 5x-10x niższa, w porównaniu doCa2+, przy czasach sieciowania wynoszących 2-3 h. Ponadto jony magnezu są bardziej selektywne w stosunku do jednostek guluronowych, stąd sieciowanie zależy bardziej od składu chemicznego ALG51. W takim przypadku szybkie tempo żelowania jest niezbędne, aby zapewnić ciągłe tworzenie się pustego kanału, zanim pusta struktura może się zapaść. CaCl2 zapewnia najszybszą szybkość żelowania, co ma kluczowe znaczenie dla bezpośredniego osadzania pustych włókien. Zastosowano 100 mM CaCl2 , który odpowiednio ustabilizował ciągłe tworzenie się pustego w środku włókna, nie powodując krzepnięcia żelu w dyszy.
Druk i obróbka końcowa rusztowań Podczas tej części procesu należy wziąć pod uwagę następujące kroki, w tym 1) upewnienie się, że wszystkie roztwory i materiały, w tym biodrukarka 3D, są odpowiednio sterylizowane przed drukowaniem. 2) Podczas przygotowywania hydrożelu jednorodność materiału ma kluczowe znaczenie dla ciągłego druku. Należy unikać wprowadzania zanieczyszczeń lub pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one zatkać dyszę i/lub zakłócić wytłaczanie. 3) Strzykawki powinny być prawidłowo podłączone do dyszy rdzenia/skorupy za pomocą mechanizmu luer-lock i prawidłowo włożone do mocowań ekstrudera, jak pokazano na rysunku 2A, B. 4) Przed wydrukowaniem złożonej struktury zaleca się wstępne wytłoczenie niewielkiej porcji żelu i roztworu sieciującego w celu usunięcia nadmiaru pęcherzyków powietrza w dyszy rdzenia / powłoki i zapewnienia ciągłego przepływu hydrożelu. Można to włączyć bezpośrednio do kodu g w celu poprawy powtarzalności. 5) Pomocne jest dodanie fartucha otaczającego rusztowanie, aby zapewnić ułożenie jednorodnego pustego włókna przed rozpoczęciem drukowania samego rusztowania.
Dodatkowo, 6) w celu poprawy przyczepności między filamentem drukarskim a podłożem, zaleca się użycie płaskiej powierzchni o dobrej przyczepności (tj. szkiełka podstawowego lub szalki Petriego). 7) Dysza wytłaczająca nie powinna stykać się bezpośrednio z podłożem, aby umożliwić nieprzerwany przepływ hydrożelu. Początkowa odległość będzie miała duży wpływ na jakość wydruku, ale grubość wytłaczanego filamentu jest dobrym przybliżeniem początkowego ustawienia. 8) Początkowa wysokość druku w kodzie g powinna być dostosowana do indywidualnych potrzeb. Po zoptymalizowaniu parametrów drukowania, g-code rusztowania należy zaimportować do oprogramowania Planet CNC i rozpocząć proces drukowania zgodnie z opisem w protokole. 9) Aby kontrolować i optymalizować przepływ hydrożelu z zamiarem drukowania optymalnych rusztowań, należy zmieniać zarówno skład preparatu, jak i parametry druku (tj. prędkość drukowania, ciśnienie wytłaczania, temperaturę drukowania, odległość między podłożem a dyszą do wytłaczania, wysokość warstwy, rozmiar rusztowania itp.).
Ogólnie rzecz biorąc, do drukowania preparatów o wyższej lepkości wymagane są wyższe prędkości przepływu. Jak wspomniano, wszystkie preparaty hydrożelowe, które nadają się do natychmiastowego sieciowania chemicznego, pozwalają na jednoetapowe wytwarzanie pustych rurek i mogą być stosowane z opisaną konfiguracją rdzeń/powłoka. Mechanizmy drukowania i sieciowania muszą być odpowiednio zoptymalizowane. Po wydrukowaniu wszystkie rusztowania zostały poddane obróbce końcowej poprzez wtórne sieciowanie 5% wagowym roztworem CaCl2 , co zapewniło całkowite usieciowanie składnika ALG-CMC i wysterylizowane z obu stron w świetle UV przez co najmniej 30 minut. Należy upewnić się, że rusztowanie jest całkowicie zanurzone w roztworze sieciującym i inkubować wystarczająco długo, aby zakończyć proces sieciowania. Przetwarzanie końcowe będzie się różnić w zależności od zastosowanego materiału i mechanizmu sieciowania, który należy wcześniej rozważyć. Po obróbce końcowej rusztowania należy ostrożnie usunąć z podłoża, przenieść na pożywkę do hodowli komórkowych i inkubować w kontrolowanej atmosferze przez co najmniej 24 godziny przed wysiewem komórek. Użycie bezbarwnego podłoża poprawi widoczność zawiesiny komórek podczas wstrzykiwania do rusztowań.
Próba żywych/martwych Żywy/martwy roztwór należy przygotować bezpośrednio przed przeprowadzeniem testu i przechowywać w ciemności przed przeprowadzeniem testu, ponieważ zawiera barwniki fluorescencyjne, które są podatne na bielenie. Po pożądanym czasie inkubacji pożywki do hodowli komórkowych należy ostrożnie wyrzucić otaczające rusztowania i przepłukać PBS. Idealnie byłoby, gdyby ten sam punkt wejścia był używany do wysiewu komórek, a następnie do wstrzykiwania żywego/martwego testu do rusztowań.
Znaczenie wyników Zarówno ALG, jak i CMC były już stosowane do promowania angiogenezy in vitro. Opierając się na swoich cechach mimetycznych ECM, fizycznym sieciowaniu i biokompatybilności, ALG jest powszechnie stosowany jako składnik do dostarczania i kontrolowanego uwalniania angiogennych czynników wzrostu (np. odpowiednio bFGF, HGF, VEGF164 i Ang-1*)52,53,54. Ponadto, w połączeniu z żelatyną, CMC jest również stosowany do kapsułkowania komórek śródbłonka naczyń krwionośnych ze względu na jego zdolność do szybkiego sieciowania w warunkach fizjologicznych55. NFC zostały dodane, aby jeszcze bardziej zwiększyć stabilność mechaniczną i wierność kształtu rusztowań. Należy podkreślić, że celem nie było zwiększenie unaczynienia, ale zademonstrowanie możliwości wytwarzania przepuszczalnych, pustych rusztowań ALG-CMC, drukowanych w sposób rdzeń/powłoka, co również ułatwia mocowanie i namnażanie HUVEC. Wybór mieszaniny ALG-CMC opierał się na odkryciach powszechnie stosowanych, łatwo dostępnych i biokompatybilnych materiałów bazowych, które mogą umożliwić drukowanie rdzenia/skorupy pustych kanałów. Wiele innych materiałów może być bardziej realnymi opcjami dla wzmocnienia angiogenezy; Jednak niektóre z nich nie nadają się do drukowania rdzenia/skorupy, ponieważ nie ułatwiają szybkiego żelowania/sieciowania, co jest kluczowe w tym podejściu.

Prawdopodobnie ostatecznym celem inżynierii tkankowej (TE) jest wytwarzanie funkcjonalnych tkanek lub organów in vitro, które mogą być używane do regeneracji lub wymiany uszkodzonych lub chorych części ludzkiego ciała1,2,3. Obecne badania w dziedzinie inżynierii tkankowej (TE) koncentrują się na poszczególnych aspektach tej dziedziny (materiały rusztowaniowe, procedury produkcyjne, źródła komórek itp.)4,5, a także opracowuje proste modele in vitro tkanek i narządów, które naśladują podstawowe aspekty ich odpowiedników in vivo. Takie modele są już przydatne w wielu zastosowaniach, takich jak badania przesiewowe leków i toksyczności, zwłaszcza w przypadkach, gdy konwencjonalne hodowle komórkowe 2D nie naśladują dynamicznych reakcji natywnych tkanek6,7,8,9. Trójwymiarowe modele in vitro są zwykle konstruowane poprzez połączenie komórek10, fizyko-chemiczne wskazówki11 i biologicznie aktywne cząsteczki12,13 na rusztowaniach, które są uzyskiwane z tkanek bezkomórkowych lub konstruowane de novo z materiałów biologicznych lub biokompatybilnych14,15,16,17,18.
Kluczowe jest, aby rusztowania odzwierciedlały złożoną mikroarchitekturę 3D i hierarchiczną strukturę natywnych tkanek, aby umożliwić funkcjonalność tkanek inżynieryjnych, reprezentatywnych dla tkanek in vivo19. Pomimo znacznego postępu technologicznego w TE, opracowanie fizjologicznie istotnych konstruktów tkanek sztucznych pozostaje wyzwaniem. Grube tkanki (o grubości >200 μm) są szczególnie problematyczne ze względu na ograniczenia, takie jak dyfuzja tlenu i składników odżywczych20. Poczyniono postępy w kierunku większych konstruktów tkankowych; Należy jednak ponownie podsumować wymaganą dużą bliskość komórek do naczyń krwionośnych w celu transportu tlenu i składników odżywczych oraz wspomagania usuwania odpadów. Unaczynienie tkanek (lub alternatywnie, wytwarzanie połączonych ze sobą sieci naczyniowych 3D w konstruktach tkankowych) odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu żywotności komórek i promowaniu funkcji tkanek zmodyfikowanych in vitro, co jest trudniejsze dla modeli w długotrwałych eksperymentach21,22. Co więcej, wymagana rozdzielczość, integralność strukturalna i jednoczesna biokompatybilność nie zostały jeszcze osiągnięte23.
Zaproponowano kilka podejść TE w celu skonstruowania struktur podobnych do naczyń krwionośnych i ułatwienia unaczynienia in vitro. Niektóre przykłady obejmują wysiewanie komórek śródbłonka (również hodowanych wspólnie z innymi typami komórek, takimi jak fibroblasty), które samoorganizują się w celu wytworzenia sieci mikronaczyniowych24, wykorzystanie naczyniowych komórek progenitorowych i perycytów, które promują wzrost komórek śródbłonka21,25, dostarczanie angiogennych czynników wzrostu, które indukują unaczynienie20,26, wykorzystując technologię arkuszy komórkowych, która pozwala na kontrolę nad warstwowaniem naczyń krwionośnych20, oraz wytwarzanie wysoce porowatych struktur rusztowań, które sprzyjają angiogenezie27. Wspomniane podejścia koncentrują się na indukcji angiogenezy, która na ogół wymaga znacznych ilości dodatkowych czynników wzrostu (np. VEGF) i czasu do powstania. Jednak największymi wadami są ich ograniczona odtwarzalność i ograniczona kontrola przestrzenna nad wzorcami naczyniowymi, co zwykle skutkuje losowym rozkładem naczyń w konstrukcie tkankowym, co niekoniecznie ułatwia perfuzję.
Produkcja addytywna (AM, taka jak biodruk 3D) jest coraz częściej zaangażowana w wytwarzanie konstrukcji 3D przy użyciu materiałów biologicznych lub biokompatybilnych do tworzenia rusztowań odpowiednich dla TE. Kilka podejść AM jest stosowanych i rozwijanych równolegle (np. metody oparte na druku atramentowym i mikrowytłaczaniu, różne rodzaje technik litograficznych) w celu wytworzenia rusztowań, które naśladują rodzime tkanki pod względem architektury, biochemii i funkcjonalności. Poszczególne techniki mają pewne zalety i wady28, dlatego badane są różne modyfikacje (np. mikrowzorce, indukowana angiogeneza itp.), aby zwiększyć zakres, w jakim można wytwarzać duże, złożone i stabilne sieci naczyniowe22,29,30.
Wśród nich, najczęściej stosowaną metodą jest biodrukowanie ekstruzyjne, szczególnie ze względu na szeroki zakres kompatybilnych materiałów (ogólnie przyjazny dla komórek proces28,31,32), a także wyjątkową wszechstronność pod względem zastosowań (np. druk osadzony i ofiarny23,33, wytwarzanie pustych struktur34,35, itd.). Główne wyzwania stojące przed obecnymi badaniami obejmują transfer ze struktur 2D do 3D, tworzenie gęstej sieci pustych rurek o wysokiej rozdzielczości przestrzennej oraz ogólną integralność mechaniczną i wierność kształtu podczas przepływu płynu w warunkach hodowli komórkowej30.
Najprostszym podejściem do perfukowalnej tkanki jest stworzenie połączonej sieci kanałów wewnątrz konstrukcji. Oczekuje się, że stworzenie takich przepuszczalnych kanałów w rusztowaniu tkankowym rozwiąże wiele z wyżej wymienionych problemów, ponieważ natychmiast pozwala na dyfuzję składników odżywczych i tlenu podczas usuwania produktów przemiany materii. W związku z tym unika się potencjalnego tworzenia się obszarów nekrotycznych w konstrukcie36. Takie kanały mogą być dodatkowo wypełnione komórkami śródbłonka (EC) i służyć jako sztuczne naczynia krwionośne w modelach tkanek 3D37. W najbardziej podstawowym sensie naczynie może składać się z pustego kanału, miękkiej warstwy EC i sztywnej skorupy. Ostatnio duże zainteresowanie zyskało wytłaczanie 3D dwóch różnych materiałów w trybie rdzenia/skorupy z wykorzystaniem współosiowych igieł do wytłaczania38,39,40,41, ponieważ pozwala na wytwarzanie pustych rur.
Podobnie jak w przypadku konwencjonalnego druku 3D metodą mikroekstruzji, drukowanie rdzenia/skorupy odbywa się za pomocą dyszy współosiowej (np. dwie igły o różnych średnicach ustawione na tej samej osi w taki sposób, że szersza igła otacza węższą). W ten sposób dwa materiały mogą być wytłaczane jednocześnie, z których jeden jest centralnym włóknem lub "wewnętrznym" rdzeniem, a drugi "zewnętrznym" shell41. Do tej pory biodruk współosiowy był wykorzystywany do wytwarzania struktur z solid42, core/shell43 i hollow strands40,44; Jednak użyte materiały nie zostały zoptymalizowane zarówno pod kątem optymalnej żywotności ogniw, jak i wytrzymałości mechanicznej wydrukowanych konstrukcji. Jak wspomniano, technika ta daje możliwość łączenia biomateriałów o różnych właściwościach mechanicznych, w których sztywniejszy wspiera bardziej miękki. Co ważniejsze, jeśli materiał rusztowania (np. alginian, karboksymetyloceluloza) jest wytłaczany jako powłoka, podczas gdy rdzeń złożony ze środka sieciującego (np. chlorku wapnia) jest dozowany z wewnętrznej kapilary, a następnie wypłukiwany po wydrukowaniu, możliwe jest wytworzenie ciągłej pustej rury w jednym kroku45.
Mając to na uwadze, opracowano prostą i powtarzalną jednoetapową metodę budowy dobrze zdefiniowanych i przepuszczalnych rusztowań do inżynierii struktur naczyniowych i innych tkanek rurkowych. Aby opracować opłacalną technologię, produkcja powinna być w idealnym przypadku procesem jednoetapowym. W związku z tym dostosowano konfigurację rdzeń/powłoka i zintegrowano ją z biodrukarką 3D. Podstawowa konstrukcja składa się z centralnej dyszy wykonanej z metalu, aby uniknąć deformacji podczas wtrysku, wokół której umieszczona jest druga dysza o większej średnicy. Taka współosiowa konfiguracja dyszy pozwala na koekstruzję dwóch przepływów i natychmiastowe usieciowanie wytłaczanego kanału hydrożelowego. Umożliwia to bezpośrednie wytwarzanie wielowarstwowych pustych włókien, a późniejsze sieciowanie wyższymi stężeniami chlorku wapnia (CaCl2) zapewnia bardziej trwałą stabilizację od zewnątrz.
Jako taka, ta metoda pozwala na jednoczesne drukowanie rusztowań i mikrokanałów, w których puste włókna hydrożelowe służą jako rusztowanie wspierające mechaniczną integralność konstrukcji 3D i jednocześnie działają jako wbudowane mikrokanały dostarczające składniki odżywcze do wzrostu komórek. Protokół ten zapewnia szczegółową procedurę strategii biodruku 3D rdzenia / powłoki w oparciu o użycie niestandardowej dyszy współosiowej, w której hydrożelowe struktury 3D z wbudowanymi kanałami są wytwarzane poprzez kontrolowanie sieciowania w celu wytworzenia pustych włókien, które pozostają przepuszczalne podczas hodowli komórkowej.
Konfiguracja druku 3D używana w tej pracy jest skonfigurowana tak, jak wcześniej opisali Banović i Vihar46 i może być podzielona na trzy główne komponenty: A) trzyosiowy układ mechaniczny CNC z dokładnością pozycjonowania 50 μm w kierunkach X, Y i Z; B) dwa ekstrudery, przystosowane do jednorazowych strzykawek typu luer-lock o pojemności 5 ml, o rozdzielczości 1,2 μl wokseli; oraz C) sterowanie elektroniką i oprogramowaniem.
Aby ułatwić drukowanie rdzenia/skorupy, opracowano odpowiednią dyszę, którą można zamontować na jednym z ekstruderów (ekstruder podstawowy, drukujący rdzeń) i jest kompatybilna z igłami o końcach G27. Ma również kompatybilność ze złączem luer-lock do połączenia z drugim ekstruderem (drukowanie powłoki). Pierwsze prototypy zostały wytworzone poprzez włożenie igły G27 (średnica wewnętrzna = 210 μm, średnica zewnętrzna = 410 μm) do igły G21 (średnica wewnętrzna = 510 μm, średnica zewnętrzna = 820 μm) lub stożkowej końcówki G20 (średnica wewnętrzna = 600 μm), a następnie włożenie bocznej igły wtórnej w celu dostarczenia materiału powłoki. Jednak ze względu na niewielkie wygięcie trzonka igły nie jest możliwe wytworzenie końcówki dyszy z koncentrycznym wyrównaniem igieł wewnętrznych i zewnętrznych.
Aby rozwiązać ten problem, opracowano nowy projekt dyszy, który spełniał następujące kryteria: 1) może być wyprodukowany przy użyciu 3-osiowej frezarki CNC, 2) może być wykonany z różnych materiałów (tworzywa sztuczne o wysokiej wydajności, takie jak PEEK lub metale), 3) jest kompatybilny z luer-lock do nakładania materiału skorupy, oraz 4) jest kompatybilny z igłą z końcem G27 i utrzymuje ją w miejscu w dwóch pozycjach, aby wyrównać końcówkę z centralną oś. Schemat prototypu dyszy jest pokazany w Rysunek 1.

<table><tbody><tr><td>Kwas alginowy sól sodowa</td><td>Sigma-Aldrich (Niemcy) 180947</td><td></td> <td>proszku; Mw ~ 80 000</td></tr><tr><td>ATTC HUV-EC-C [HUVEC] Standardy</td> <td>LGC (Wielka Brytania)</td> <td>ATCC-CRL-1730</td><td>Suplement na wzrost komórek śródbłonka (ECGS) i niezidentyfikowane czynniki z ekstraktów z przysadki bydlęcej, podwzgórza lub całego mózgu są mitogenne dla tej linii; Średnia długość życia komórek wynosi od 50 do 60 podwojeń populacji.</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop optyczny Axiovert 40</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH (Niemcy)</td><td></td><td>trzy techniki kontrastu w jednym obiektywie &ndash; np. jasne pole, kontrast fazowy i PlasDIC</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich (Niemcy)</td><td>C1016</td><td>anhydrou; granulowany; &le; 7,0 mm; &ge; 93.0%</td></tr><tr><td>Zawiesina nanowłókien celulozowych (NFC, 3% (w/v))Centrum</td> <td>Rozwoju Procesu, University of Maine (Maine, USA)</td><td></td><td>nominalna szerokość włókna 50 nm; długości do kilkuset mikronów</td></tr><tr><td>System oczyszczania wody ELGA Purelab</td><td>Veolia Water Technologies (Wielka Brytania)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Cell Imaging System</td><td>ThermoFisher Scientific Inc. (Niemcy)</td><td>AMF4300</td><td>w pełni zintegrowany, cyfrowy, odwrócony system obrazowania do zastosowań w czterokolorowej fluorescencji i świetle przechodzącym</td></tr><tr><td>Gibco Advanced Dulbecco" s zmodyfikowany Orzeł" s medium (Advance DMEM)</td><td>ThermoFisher Scientific Inc. (Niemcy)</td><td>12491015</td><td>wysoka zawartość glukozy; bez glutaminy; czerwień fenolowa</td></tr><tr><td>Gibco Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)</td><td>ThermoFisher Scientific Inc. (Niemcy)</td><td>21063029</td><td>wysoka zawartość glukozy; L-glutamina; HEPES; bez czerwieni fenolowej</td></tr><tr><td>Gibco Płodowa surowica bydlęca (FBS), kwalifikowana</td><td>ThermoFisher Scientific Inc. (Niemcy)</td><td>10270106</td><td>FBS pochodzenie: Brazylia; 5 % (w/v)</td></tr><tr><td>FBS Hypodermic Sterican Needle</td><td>B. Braun Melsungen AG (Niemcy)</td><td>9180117</td><td>0,40 x 25mm, 27G x 1'</td></tr><tr><td>'L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich (Niemcy)</td><td>G3126</td><td>ReagentPlus&reg; , &ge; 99% (HPLC)</td></tr><tr><td>Zestaw do podwójnego barwienia żywych/martwych komórek</td><td>Sigma-Aldrich (Niemcy)</td><td>4511</td><td>zawiera roztwory kalceiny-AM i jodku propidyny (PI); nadaje się do fluorescencji</td></tr><tr><td>Kolby do hodowli komórkowych Nunc EasYFlask</td><td>ThermoFisher Scientific Inc. (Niemcy)</td><td>156367</td><td>Nunclon Delta z certyfikatem tworzenia monowarstw, skuteczności klonowania, niecytotoksyczności, niepirogenności i sterylności; nasadki filtrów; obszar hodowli 25 cm2</td></tr><tr><td>Strzykawka Omnifix</td><td>B. Braun Melsungen AG (Niemcy)</td><td>4617053V</td><td>5 ml Luer Lock</td></tr><tr><td>Sól sodowa penicyliny G</td><td>Sigma-Aldrich (Niemcy)</td> Proszek <td>P3032</td><td>; Bioodczynnik; nadaje się do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma-Aldrich (Niemcy)</td><td>P4417</td><td>tabletka; jedna tabletka rozpuszczona w 200 ml wody dejonizowanej daje 0,01 M bufor fosforanowy, 0,0027 M chlorek potasu i 0,137 M chlorek sodu, pH 7,4, w 25 &deg; C</td></tr><tr><td>Sól sodowa karboksymetylocelulozy</td><td>Sigma-Aldrich (Niemcy) 419338</td><td></td> <td>proszku; średnia Mw ~ 700 000</td></tr><tr><td>Sól siarczanu streptomycyny</td><td>Proszek Sigma-Aldrich (Niemcy)</td> <td>S9137</td><td>; Bioodczynnik; nadaje się do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Woda ultraczysta</td><td>Veolia Water Technologies (Wielka Brytania)</td><td></td><td>18,2 m² przy 25?; Biodrukarka 3D C</td></tr><tr><td>VitaPrint</td><td>IRNAS (Słowenia)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rusztowania drukarskie rdzeniowe / skorupowe do inżynierii tkankowej struktur rurowych

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Trójwymiarowy (3D) druk filamentów typu core/shell umożliwia bezpośrednie wytwarzanie struktur kanałowych ze stabilną powłoką, która jest usieciowana na granicy faz z płynnym rdzeniem. Ten ostatni jest usuwany po wydrukowaniu, pozostawiając pustą rurkę. Zintegrowanie techniki wytwarzania przyrostowego (takiej jak opisana tutaj z dostosowanymi do potrzeb tuszami [bio]inkowymi, które strukturalnie i biochemicznie naśladują natywną macierz zewnątrzkomórkową [ECM]) jest ważnym krokiem w kierunku zaawansowanej inżynierii tkankowej. Jednak precyzyjne wytwarzanie dobrze zdefiniowanych struktur wymaga dostosowanych strategii produkcyjnych zoptymalizowanych pod kątem używanego materiału. Dlatego rozsądnie jest zacząć od konfiguracji, która jest konfigurowalna, prosta w użyciu i kompatybilna z szerokim spektrum materiałów i zastosowań. W niniejszej pracy przedstawiono łatwą do wyprodukowania dyszę typu rdzeń/skorupa z kompatybilnością ze standardem Luer w celu zbadania drukowania rdzenia/skorupy struktur drewnianych, przetestowana przy użyciu dobrze zdefiniowanej formuły materiału rusztowania na bazie alginianu.

Celem niniejszej pracy było opracowanie łatwej w produkcji dyszy typu rdzeń/otoczka (core/shell) z kompatybilnością Luer do drukowania struktur typu woodpile w architekturze rdzeń/otoczka. Ponadto opisano prosty i powtarzalny jednostopniowy protokół drukowania, który jest łatwy do modyfikacji i pozwala na zastosowanie szerokiego zakresu materiałów oraz różnych mechanizmów sieciowania chemicznego w celu budowy precyzyjnie zdefiniowanych i perfuzowalnych rusztowań do inżynierii naczyniowych i innych rurkowatych struktur tkankowych.
Dysza rdzeń/powłoka 
Dysza składa się z igły stumionej G27 (do drukowania wewnętrznego filamentu osiowego) oraz korpusu dyszy, który utrzymuje igłę na miejscu i tworzy zewnętrzną dyszę dla filamentu powłoki z portem przyłączeniowym do doprowadzania materiału. Schemat przedstawiono na Rysunku 1. Dwie strzykawki o pojemności 5 mL są umieszczone w oddzielnych ekstruderach i dostarczają materiały na rdzeń oraz powłokę. Przewody łączą korpus dyszy ze strzykawką, doprowadzając materiał na powłokę.
Kompletny zestaw dyszy rdzeń/otoczka oraz strzykawki przedstawiono na Ryc. 2. Pierwszy funkcjonalny prototyp korpusu dyszy został wykonany poprzez frezowanie CNC z bloku polioksymetylenu (POM). Kompatybilność i szczelność pomiędzy elementem, igłą G27 a rurkami sprawdzono poprzez montaż w urządzeniu Vitaprint. W dyszy, złączce luer-lock oraz pomiędzy korpusem a igłą nie zaobserwowano wycieków materiału otoczki. Korpus dyszy ściśle przylega do piasty igły (złącze luer), co zapewnia zsynchronizowany ruch całej dyszy wraz z ekstruderem.
Budowa rusztowania 
Najprostszym podejściem do wytwarzania rusztowań jest osadzanie materiałów warstwa po warstwie, przy czym kierunek drukowania zmienia się w każdej kolejnej warstwie, zazwyczaj pod kątem 90°. Ze względu na wiskoelastyczne i higroskopijne właściwości hydrożeli, zachowanie wierności kształtu wydrukowanych struktur pozostaje wyzwaniem. Głównym celem tej sekcji protokołu jest druk 3D perfuzowalnych rusztowań typu rdzeń/otoczka (core/shell) przy użyciu dwóch polimerów, które wcześniej wykazały obiecujące wyniki w budowie rusztowań (ALG i CMC), z dodatkiem nanowłókien celulozowych (NFC) w celu zwiększenia stabilności mechanicznej. Zarówno ALG, jak i CMC są ujemnie naładowanymi, rozpuszczalnymi w wodzie liniowymi kopolimerami48 i oba zawierają grupy karboksylowe, które mogą być sieciowane poprzez dodanie kationów dwuwartościowych. Cząsteczki Ca2+ tworzą wiązania jonowe z dwiema grupami funkcyjnymi jednocześnie, tworząc połączenia między łańcuchami polimerowymi, co zwiększa sztywność żelu.
Drukowanie perfuzowalnych rusztowań 
Celem tego procesu jest wydruk 3D prostych struktur rusztowań typu woodpile, które obejmują kilka warstw i zachowują wierność kształtu oraz perfuzowalność aż do pełnego usieciowania. Wymaga to równomiernej koekstruzji rdzenia i otoczki bez ruchów przecinających lub retrakcji, które mogłyby przerwać przepływ. W związku z tym typowe metody modelowania CAD i slicingu są mniej odpowiednie. W niniejszej pracy zastosowano ręcznie zaprojektowany g-kod oraz opracowano generator g-kodu oparty na języku Python w celu szybkiego przygotowania kodu.
Rusztowania miały strukturę siatki w kształcie stosu drewna i zostały zbudowane na płaskiej powierzchni szklanej. Fabrykacja była prowadzona warstwa po warstwie, przy czym przecinające się linie każdej kolejnej warstwy nakładano pod kątem 90° względem poprzedniej. Dodatkowo każda kolejna warstwa była o 2% węższa w kierunkach X i Y, co zapewniało ciągłe podparcie włókien przez warstwy poprzednie. Odległość między włóknami (rozmiar makroporów) można precyzyjnie zaprojektować w g-code, uwzględniając średnicę zewnętrzną ekstrudowanego włókna (0.8 mm) oraz odległość między liniami siatki (3 mm).
Rusztowania musiały spełnić kluczowe kryteria włączenia, aby zostać zakwalifikowane do dalszej analizy. Po pierwsze, aby rusztowania mogły zostać poddane dalszemu rozwojowi, musiały posiadać co najmniej 4 warstwy wysokości i zachować integralność strukturalną oraz geometrię (np. rozmiar makroporów) podczas drukowania. Po drugie, rusztowania musiały pozostać przepuszczalne (stabilne mikrokanały) nawet po 7 dniach inkubacji w pożywce hodowlanej w temperaturze 37 °C. W odpowiednich odstępach czasu (1, 2, 5 i 7 dni) rusztowania wyjmowano z pożywki i sprawdzano, czy nadal są przepuszczalne. Na Rysunku 4A przekrój świeżo wydrukowanego i poddanego obróbce rusztowania wykazuje wyraźnie widoczny pusty kanał wewnątrz włókna. Na Rysunku 4B widać, że nawet po 72 h inkubacji w pożywce hodowlanej w temperaturze 37 °C włókno zachowuje pustą strukturę na całej długości rusztowania.
Kilka formulacji nadawało się do druku, zachowywało stabilność strukturalną, utrzymywało wydrukowaną geometrię i pozostało przepuszczalnych; jednak do dalszych testów wybrano jedną z nich (tj. 3 wt.% ALG + 3 wt.% CMC + 1.5 wt.% NFC), która umożliwiła wydruk przepuszczalnych rusztowań o grubości do 10 warstw. Proces drukowania z użyciem niestandardowej dyszy przedstawiono na Rysunku 5A. Druk rdzeń/powłoka (core/shell) był możliwy przy zastosowaniu mniej lepkich formulacji; jednak żele o wyższych stężeniach nie pozwalały na ciągły przepływ przez dyszę. Do wstępnego sieciowania (materiał rdzenia, dostarczany podczas druku) wykorzystano 100 mM CaCl2, co w odpowiedni sposób ustabilizowało ciągłe formowanie się pustego w środku włókna, nie powodując krzepnięcia żelu wewnątrz dyszy. Po druku rusztowania namaczano w 5 wt.% roztworze CaCl2, aby całkowicie zsieciować hydrożel w celu zapewnienia długoterminowej wierności kształtu. Gotowy przykład rusztowania przedstawiono na Rysunku 5B. Podczas optymalizacji procesu formulacji w roztworze rdzenia zastosowano sztuczny barwnik, aby umożliwić wizualną ocenę i badanie jakości ekstrudowanego włókna. Barwnika nie używano do wytwarzania końcowych rusztowań, które zostały przygotowane do zasiewu komórek i hodowli.
Test żywotności komórek (Live/dead assay) 
Po inkubacji przeprowadzono test żywotności komórek w celu wizualizacji EC oraz rozróżnienia między komórkami żywymi (zielonymi) a martwymi (czerwonymi) w obrębie inkubowanego rusztowania. Służyło to dwóm głównym celom: A) określeniu, czy rusztowania zapewniają biokompatybilne środowisko sprzyjające wzrostowi i adhezji, nie wywierając szkodliwego wpływu na komórki, oraz B) bardziej szczegółowej wizualizacji integralności strukturalnej struktur cewkowatych i ich wewnętrznego systemu kanałów.
Wyniki testu żywotności (live/dead) przedstawiono na Rysunku 6. W obecności wewnątrzkomórkowych esteraz przenikający przez błonę plazmatyczną Calcein-AM jest przekształcany w kalceinę, która emituje zielone światło fluorescencyjne w żywych komórkach. Z kolei komórki apoptotyczne są wizualizowane za pomocą nieprzenikającego przez błonę jodku propidyny, który fluorescuje na czerwono po interkalacji w podwójną helisę DNA. Obrazy z testu żywotności oraz zdjęcia w polu jasnym rusztowań zostały połączone, aby ułatwić wizualizację komórek wewnątrz pustych kanałów. Roztwór barwiący został wstrzyknięty, a test przeprowadzony bezpośrednio w wydrukowanych w technologii 3D rusztowaniach po 48 h inkubacji rusztowań z komórkami.
Należy zauważyć, że zastosowano stosunkowo niską gęstość wysiewu EC (340 000 cells/mL), ponieważ badanie to służyło jedynie jako dowód koncepcji drukowania rusztowań perfuzowalnych w strukturze rdzeń/otoczka. Najważniejszym wnioskiem z testu żywotności (live/dead assay) jest fakt, że nawet po 48 h nie zaobserwowano martwych komórek (kolor czerwony), co dowodzi, że ani sam materiał rusztowania, ani produkty jego degradacji nie wykazują działania toksycznego. Ponadto komórki EC faktycznie przylgnęły i pozostały przytwierdzone wewnątrz rusztowań, a podczas wzrostu w kanałach zdawały się tworzyć równomiernie rozmieszczone aglomeraty. Sugeruje to, że opisana metoda wytwarzania oraz skład rusztowania stanowią odpowiednią bazę do budowy rurkowatych morfologii tkanek istotnych w warunkach in vivo. Inżynieria złożonych tkanek, poza naśladowaniem oddziaływań komórka-ECM i ścisłej komunikacji międzykomórkowej we wszystkich trzech wymiarach przestrzennych, wymaga również stałej ekspozycji komórek na świeżą pożywkę w celu utrzymania ich żywotności. Można to osiągnąć poprzez gęstą sieć kanałów poddawanych ciągłej perfuzji, co uzasadnia dalsze badania w przyszłych pracach i będzie wymagało optymalizacji parametrów materiałowych oraz wzrostowych w celu umożliwienia długoterminowej inżynierii tkankowej naczyń krwionośnych.
<img alt="Schemat zestawu igieł do mikroenkapsulacji z konfiguracją dyszy rdzeń-otoczka z opisami przepływu materiału." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59951/59951fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Prototyp dyszy rdzeń/otoczka. (A) Przedstawiono ogólny projekt i główne elementy prototypu korpusu dyszy. Dyszę kończy się poprzez włożenie igły G27 z tępym końcem od góry. Górny i dolny uchwyty igły unieruchamiają ją i wyrównują z osią dyszy, zapewniając, że końcówka wystaje z dyszy przez jej środek. Aby połączyć dyszę z materiałem „otoczki” wytłaczanym z wtórnej strzykawki, do bocznego wlotu przyłącza się rurkę z łącznikiem luer-lock. Stąd materiał jest przekazywany do dyszy przez wąski kanał. Wykonanie wspomnianego kanału wymaga wiercenia w dwóch miejscach, co tworzy otwory, które muszą zostać zamknięte po zakończeniu produkcji. (B) Przedstawiono zbliżenie dyszy z włożoną igłą G27, wystającą z dyszy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59951/59951fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat układu wtryskiwania cieczy porównujący systemy strzykawkowe do analiz biochemicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59951/59951fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Końcowy układ rdzeń/powłoka. (A) Przedstawiono ukończoną dyszę rdzeń/powłoka z prawidłowo przymocowanymi strzykawkami zawierającymi hydrożel (prawo), tworzący „powłokę”, oraz roztwór sieciujący (lewo), wytłaczany jako „rdzeń”. (B) Przedstawiono układ rdzeń/powłoka zainstalowany w systemie Vitaprint z dwoma wytłaczarkami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59951/59951fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Renderowanie trójwymiarowego układu współrzędnych z etykietami osi w oprogramowaniu CAD; wyświetlona lista programowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59951/59951fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: G-kod rusztowania rurkowego. Przedstawiono zrzut ekranu z oprogramowania drukarki, a konkretnie podgląd ścieżki (A) oraz surowy g-kod pierwszej warstwy (B). G-kod to zestaw instrukcji z współrzędnymi docelowymi w bezwzględnych kierunkach przestrzennych (X, Y, Z), a także ekstruzją (A,B) w kierunkach względnych. Komenda G określa rodzaj instrukcji, gdzie G1 oznacza ruch liniowy w kierunku współrzędnych docelowych, a G92 określa początkową pozycję startową. Dodatkowo, prędkość posuwu następujących komend jest określana instrukcją F w mm/min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59951/59951fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopowe grudek roślinnych, podkreślające różnice strukturalne w skali 1mm do analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59951/59951fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Przekrój poprzeczny nici rusztowania z pustym wnętrzem. (A) Przedstawiono przekrój poprzeczny świeżo wydrukowanego i poddanego obróbce rusztowania. (B) Przedstawiono przekrój poprzeczny rusztowania po inkubacji w pożywce hodowlanej przez 72 h. Choć kształt dyszy definiuje ekstruzję rurki o okrągłym przekroju poprzecznym, filament wydaje się być nieco spłaszczony podczas osadzania. Kanał wewnętrzny pozostaje jednak nienaruszony i zachowuje swoją formę podczas inkubacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59951/59951fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces biodruku 3D; tworzenie struktury hydrożelowej. Schemat wytwarzania warstwa po warstwie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59951/59951fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Druk rdzeń/otoczka rusztowań. Tutaj przedstawiono wytwarzanie (A) trójwarstwowego rusztowania w formie pustej rurki oraz jego końcową formę (B). W celu lepszej wizualizacji roztwór sieciujący w rdzeniu zabarwiono czerwonym barwnikiem. Sformułowanie wykazuje wystarczającą stabilność mechaniczną, aby zachować stabilność rusztowania, nawet w przypadku wytwarzania grubszych struktur (do 10 warstw, dane nie pokazane). Wymiary zewnętrzne końcowej struktury wynosiły około 27 mm x 27 mm x 3.5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59951/59951fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej, mapowanie neuronów, porównanie próbek A i B, pasek skali 2mm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59951/59951fig6.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Test żywotności (live/dead assay) przeprowadzony bezpośrednio w rusztowaniach. Zawiesinę HUVECs wstrzyknięto do wewnętrznego kanału rusztowania, inkubowano przez 48 h, a następnie potraktowano barwnikiem do testu żywotności. Żywe komórki HUVECs emitują zielone światło fluorescencyjne, co jest reprezentowane przez jasne punkty na obrazie. Martwe komórki emitują czerwone światło fluorescencyjne; jednak w obserwowanym rusztowaniu żadne nie są widoczne. Rozmieszczenie komórek wskazuje również na kształt i zachowane możliwości perfuzji kanałów. W niewielkim stopniu roztwór do testu żywotności zabarwił również materiał rusztowania, wywołując słabą fluorescencję pod mikroskopem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59951/59951fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Prezentowany tutaj jest prosty w użyciu, trójwymiarowy zestaw do biodruku z rdzeniem/powłoką, do jednoetapowego wytwarzania pustych rusztowań, odpowiedni do inżynierii tkankowej naczyń krwionośnych i innych struktur rurowych.

Rusztowania drukarskie rdzeniowe / skorupowe do inżynierii tkankowej struktur rurowych

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Wytwarzanie struktur rurkowych jest obiecującym podejściem do inżynierii tkankowej sieci naczyniowych, która pozostaje jednym z głównych wyzwań w hodowli grubych tkanek in vitro. Główną zaletą techniki rdzeń/powłoka jest prosta produkcja rusztowań z pustych włókien w jednym kroku, co skraca czas produkcji i potencjalnie umożliwia bezpośrednie drukowanie z komórkami. Przygotowanie preparatu hydrożelowego o odpowiednich właściwościach lepkosprężystych i utrzymanie ciągłego, zrównoważonego przepływu materiałów rdzenia/powłoki ma kluczowe znaczenie dla druku 3D stabilnych rusztowań.Na początek napełnij sterylną strzykawkę o pojemności 5 ml świeżo przygotowanym hydrożelem. Napełnij drugą strzykawkę o pojemności 5 ml, wyposażoną w igłę o końcu w rozmiarze 27, świeżo przygotowanym roztworem sieciującym. Zamontuj dyszę rdzenia/skorupy.Włóż igłę z końcem G27 jako element rdzeniowy i przymocuj igłę za pomocą. Wewnętrzna igła powinna wystawać około 1 mm z zewnętrznej dyszy skorupy rdzenia. Podłącz strzykawkę z roztworem sieciującym do igły G27 w dyszy i załaduj strzykawkę do jednego z mocowań ekstrudera drukarki 3D sterylizowanej etanolem.Zamontuj strzykawkę z hydrożelem w drugiej wytłaczarce i podłącz ją do dyszy. Użyj blokady Luer, aby podłączyć krótką rurkę do bocznego wejścia Luer dyszy rdzenia/powłoki. Ostrożnie ręcznie wyreguluj wyrównanie, aż dysza dotknie powierzchni, zanim cofniesz dyszę na odległość równą zewnętrznej średnicy dyszy.Zaimportuj wygenerowany kod g rusztowania i naciśnij przycisk Odtwórz, aby rozpocząć proces drukowania. Po wydrukowaniu należy ostrożnie usunąć podłoże z wydrukowanym rusztowaniem i wylać wtórny roztwór sieciujący na całe rusztowanie. Inkubować rusztowanie przez jedną minutę w temperaturze pokojowej.Aby odłączyć rusztowanie od podłoża, delikatnie pociągnij rusztowanie na boki. Jeśli rusztowanie mocno przylega do podłoża, włóż ostrą krawędź między oba materiały, aby je rozdzielić. Przenieś rusztowanie do nowego pojemnika.Sterylizuj UV obie strony rusztowania przez 30 minut z każdej strony. Następnie umieść rusztowanie w bezbarwnym podłożu do hodowli komórkowych i inkubuj rusztowanie w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez co najmniej 24 godziny. Następnego dnia zbierz huvex z kultury in vitro z 0,25% trypsyny przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po odłączeniu komórek należy zatrzymać reakcję enzymatyczną za pomocą 3 ml świeżej pożywki do hodowli komórkowych i zebrać komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad w świeżej pożywce hodowlanej zawierającej czerwień fenolową i rozcieńczyć komórki do stężenia 3,4 razy 10 do piątej komórki śródbłonka na mililitr. Załaduj komórki do sterylnej strzykawki o pojemności 5 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 27 i zlokalizuj punkt wejścia w rusztowaniu.Wyrównując igłę z prostą częścią włókna rusztowania, ostrożnie nakłuj rusztowanie pod małym kątem. Upewnij się, że igła znajduje się w pustym włóknie kanału i delikatnie naciśnij tłok, aby wstrzyknąć około 1-2 ml zawiesiny komórek do rusztowania. Przepływ zawiesiny powinien być widoczny przez półprzezroczyste rusztowanie.Gdy całe rusztowanie zostanie wypełnione zawiesiną komórkową, zanurz rusztowanie w świeżej pożywce do hodowli komórkowych i włóż rusztowanie z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych na okres do 10 dni. W przypadku obrazowania żywego/martwego pod koniec inkubacji, należy przepłukać rusztowanie PBS i użyć igły, aby ostrożnie wstrzyknąć żywy/martwy roztwór do rusztowania. Upewnij się, że roztwór wypełnił całe rusztowanie i umieść rusztowanie w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut.Pod koniec inkubacji przepłukać rusztowanie PBS i ostrożnie przenieść rusztowanie na szkiełko podstawowe. Barwione komórki można następnie obserwować na rusztowaniach pod mikroskopem fluorescencyjnym. W tym przekroju świeżo wydrukowanego i poddanego obróbce wtórnej rusztowania można zaobserwować wyraźnie widoczny pusty kanał w żarniku.Nawet po 72 godzinach inkubacji w pożywce do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza, jak wykazano, włókno zachowuje pustą strukturę na całej długości rusztowania. Tutaj pokazano reprezentatywny test żywych/martwych komórek śródbłonka po 48 godzinach hodowli w rusztowaniu. Żywe komórki można zidentyfikować po ich jasnozielonym sygnale fluorescencyjnym.Technika ta jest podstawą jednoetapowego wytwarzania rusztowań rurowych z wydrążonymi rurami i może być ulepszona poprzez bezpośrednie drukowanie przy użyciu komórek wbudowanych w biotusz.

coreshell-printing-scaffolds-for-tissue-engineering-tubular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Elastomeryczne rusztowania PGS z hodowanymi komórkami mięśni gładkich naczyń w bioreaktorze z przepływem pulsacyjnym mogą prowadzić do uzyskania obiecujących konstruktów tętniczych o małej średnicy z produkcją natywnej ECM w stosunkowo krótkim okresie hodowli.

Elastomeryczne rusztowania PGS w inżynierii tkanki tętniczej

Aby stworzyć wysoce zorganizowane struktury złożonej tkanki, należy złożyć wiele typów materiałów i komórek w zintegrowany kompozyt.  Ten kombinatoryczny projekt obejmuje warstwowe arkusze komórek specyficzne dla narządów z dwoma odrębnymi materiałami pochodzenia biologicznego, zawierającymi silną włóknistą podstawę macierzy oraz komórki śródbłonka w celu usprawnienia tworzenia nowych naczyń.

Inżynieria tkankowa: budowa wielokomórkowego rusztowania 3D do dostarczania warstwowych arkuszy komórkowych

W tej pracy prezentujemy technikę szybkiego wytwarzania żywych tkanek naczyniowych poprzez bezpośrednią hodowlę kolagenu, komórek mięśni gładkich i komórek śródbłonka. Ponadto opisano nowy protokół charakterystyki mechanicznej zmodyfikowanych tkanek naczyniowych.

Inżynieria 3D cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej

A kartezjańska biodrukarka została zaprojektowana i wyprodukowana, aby umożliwić osadzanie wielu materiałów w precyzyjnych, powtarzalnych geometriach, jednocześnie umożliwiając kontrolę czynników środowiskowych. Korzystając z trójwymiarowej biodrukarki, można drukować i łatwo odtwarzać złożone i żywotne konstrukcje.

Żywotność biodrukowanych konstruktów komórkowych przy użyciu drukarki kartezjańskiej z trzema dozownikami

Dostarczamy uogólniony protokół oparty na strategii mikroprzepływowego biodruku do inżynierii mikrowłóknistego łożyska naczyniowego, gdzie wtórny typ komórek może być dalej umieszczany w przestrzeni śródmiąższowej tej mikrofibrowej struktury w celu wytworzenia unaczynionych tkanek i organoidów.

Bioprinting mikroprzepływowy do inżynierii unaczynionych tkanek i organoidów

Ten protokół opisuje platformę do produkcji samodzielnie składających się pierścieni tkankowych w różnych rozmiarach przy użyciu dostosowanej formy z tworzywa sztucznego wydrukowanej w 3D. Negatywy PDMS są utwardzane w formie wydrukowanej w 3D; następnie agaroza jest odlewana w utwardzonych negatywach PDMS. Komórki są wysiewane do powstałych studzienek agarozowych, gdzie agregują się w pierścienie tkankowe.

Wytwarzanie niestandardowych studzienek agarozowych do wysiewu komórek i samomontażu pierścieni tkankowych przy użyciu form drukowanych w 3D

Bezkomórkowa matryca zewnątrzkomórkowa (dECM) może dostarczyć odpowiednich wskazówek mikrośrodowiskowych do podsumowania inherentnych funkcji tkanek docelowych w skonstruowanym konstrukcie. W tym artykule wyjaśniono protokoły decelularyzacji tkanki trzustkowej, ocenę biotuszu dECM pochodzącego z tkanki trzustki oraz generowanie konstruktów 3D tkanki trzustki przy użyciu techniki biodruku.

Biotusz do macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzącej z tkanki trzustki do drukowania 3D obciążonych komórkami konstruktów tkanki trzustkowej

Zmodyfikowane tkanki w dużym stopniu polegają na odpowiednich sieciach naczyniowych, które dostarczają niezbędnych składników odżywczych i gazów oraz usuwają odpady metaboliczne. W tej pracy protokół stopniowego wysiewu komórek śródbłonka i komórek podporowych tworzy wysoce zorganizowane sieci naczyniowe na wysokoprzepustowej platformie do badania rozwijającego się zachowania naczyń w kontrolowanym środowisku 3D.

Stopniowe wysiewanie komórek na mozaikowych rusztowaniach w celu zbadania kiełkujących naczyń krwionośnych

Zaprojektowane klapy wymagają wbudowanej funkcjonalnej sieci naczyniowej. W tym protokole przedstawiamy metodę wytwarzania wydrukowanego w 3D płata tkankowego zawierającego hierarchiczną sieć naczyniową i jej bezpośrednie zespolenia mikrochirurgiczne z tętnicą udową szczura.

Wytwarzanie zaprojektowanych płatów naczyniowych przy użyciu technologii druku 3D

To badanie wprowadza nowatorską sub-mikrożelową kąpiel zawiesinową κ-karagenową, wykazującą niezwykłe właściwości odwracalnego przejścia między zakleszczeniem a odblokowaniem. Atrybuty te przyczyniają się do budowy biomimetycznych tkanek i narządów w osadzonym biodruku 3D. Udane drukowanie tkanek przypominających serce/przełyk o wysokiej rozdzielczości i wzroście komórek świadczy o wysokiej jakości biodruku i zastosowaniach inżynierii tkankowej.

Osadzony biodruk struktur tkankopodobnych przy użyciu submikrożelowej pożywki κ-karagenowej

Poznaj technikę bioprintingu rdzeniowo-skorupowego do jednoetapowej produkcji rurowych rusztowań 3D. Ta metoda umożliwia efektywne inżynierowanie tkanek z bezpośrednią inkorporacją komórek.

Rusztowania drukarskie rdzeniowe / skorupowe do inżynierii tkankowej struktur rurowych

Przeglądaj więcej filmów