Name: Niezwykle szybkie i swoiste znakowanie metaboliczne RNA in vivo za pomocą 4-tiouracylu (Ers4tU) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 s
Description: Poznaj metodę szybkiego znakowania RNA za pomocą 4-tiouracylu w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Protokół umożliwia analizę nowo syntetyzowanego RNA z minimalnym tłem w eksperymentach typu pulse-chase.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez fundusze Wellcome dla JB [104648]. Prace w Wellcome Centre for Cell Biology są wspierane przez Wellcome core funding [092076]. Autorzy dziękują za pomoc członkom laboratorium: Belli Maudlin, Emanueli Sani, Susannie De Lucas-Arias i Shiney George. Autorzy chcieliby również podziękować Patrickowi Cramerowi za plazmid YEpEBI31111.

<ol><li>Duffy, E. E., Schofield, J. A., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaining+insight+into+transcriptome-wide+RNA+population+dynamics+through+the+chemistry+of+4-thiouridine%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Gaining insight into transcriptome-wide RNA population dynamics through the chemistry of 4-thiouridine.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), e1513(2018).</li>
<li>Windhager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrashort+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Research. 22, 2031-2042 (2012).</li>
<li>Baptista, T., Devys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+Metabolic+Labeling+with+4-thiouracil+and+the+Quantification+of+Newly+Synthesized+mRNA+As+a+Proxy+for+RNA+Polymerase+II+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57982(2018).</li>
<li>Barrass, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+RNA+processing+kinetics+revealed+using+extremely+short+4tU+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling.</a> Genome Biology. 16, 282(2015).</li>
<li>Burger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-thiouridine+inhibits+rRNA+synthesis+and+causes+a+nucleolar+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response.</a> RNA Biology. 10, 1623-1630 (2013).</li>
<li>Mendoza-Ochoa, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+and+tuneable+auxin-inducible+degron+for+depletion+of+target+proteins+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast+%28Chichester+England%29%22%5BJournal%5D)">A fast and tuneable auxin-inducible degron for depletion of target proteins in budding yeast.</a> Yeast (Chichester England). 36 (1), 75-81 (2018).</li>
<li>Barrass, J. D., Mendoza-Ochoa, G. I., Maudlin, I. E., Sani, E., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+degradation+to+achieve+specific+and+efficient+protein+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Tuning degradation to achieve specific and efficient protein depletion.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+fixation+methods%3A+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Vibrational+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li>
<li>Gustilo, E. M., Vendeix, F. A. P., Agris, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA%27s+Modifications+Bring+Order+to+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">tRNA's Modifications Bring Order to Gene Expression.</a> Current Opinion in Microbiology. 11, 134-140 (2008).</li>
<li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14, 1959-1972 (2008).</li>
<li>Miller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+transcriptome+analysis+measures+rates+of+mRNA+synthesis+and+decay+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast.</a> Molecular Systems Biology. 7, 458(2011).</li>
<li>Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+simple+method+for+preparation+of+RNA+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 18, 3091-3092 (1990).</li>
<li>Rädle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Labeling+of+Newly+Transcribed+RNA+for+High+Resolution+Gene+Expression+Profiling+of+RNA+Synthesis%2C+Processing+and+Decay+in+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50195(2013).</li>
<li>Herzog, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-linked+alkylation+of+RNA+to+assess+expression+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics.</a> Nature Methods. 14, 1198-1204 (2017).</li>
<li>Ohrt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dissection+of+step+2+catalysis+of+yeast+pre-mRNA+splicing+investigated+in+a+purified+system%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Molecular dissection of step 2 catalysis of yeast pre-mRNA splicing investigated in a purified system.</a> RNA. 19, 902-915 (2013).</li>
<li>Alexander, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboSys%2C+a+high-resolution%2C+quantitative+approach+to+measure+the+in+vivo+kinetics+of+pre-mRNA+splicing+and+3%E2%80%B2-end+processing+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RiboSys, a high-resolution, quantitative approach to measure the in vivo kinetics of pre-mRNA splicing and 3′-end processing in Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 16, 2570-2580 (2010).</li>
<li>Wallace, E. W. J., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+fast+and+incredibly+close%3A+cotranscriptional+splicing+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Extremely fast and incredibly close: cotranscriptional splicing in budding yeast.</a> RNA. 23, 601-610 (2017).</li>
<li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II%3A+emerging+roles+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 720-731 (2012).</li>
<li>Preker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Exosome+Depletion+Reveals+Transcription+Upstream+of+Active+Human+Promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA Exosome Depletion Reveals Transcription Upstream of Active Human Promoters.</a> Science. 322, 1851-1854 (2008).</li>
<li>Aslanzadeh, V., Huang, Y., Sanguinetti, G., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+rate+strongly+affects+splicing+fidelity+and+cotranscriptionality+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Transcription rate strongly affects splicing fidelity and cotranscriptionality in budding yeast.</a> Genome Research. 28, 203-213 (2018).</li>
<li>Schofield, J. A., Duffy, E. E., Kiefer, L., Sullivan, M. C., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TimeLapse-seq%3A+adding+a+temporal+dimension+to+RNA+sequencing+through+nucleoside+recoding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">TimeLapse-seq: adding a temporal dimension to RNA sequencing through nucleoside recoding.</a> Nature Methods. 15, 221-225 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W artykule przedstawiono protokół niezwykle szybkiego i swoistego znakowania 4tU, w celu odzyskania powstającego, nowo zsyntetyzowanego RNA z S. cerevisiae już po 15 s znakowania, przy bardzo niskim zanieczyszczeniu nieznakowanym RNA. 
Użytkownik powinien zawsze dbać o zachowanie integralności RNA poprzez stosowanie niskich temperatur i odczynników poddanych działaniu DEPC. Oczyszczanie kulek streptawidyny jest ogólnie niezawodne; Jednak bufor koralików jest trudny w obsłudze; Musi być przygotowany na świeżo, z dodanymi składnikami w odpowiedniej kolejności, a nie schłodzony lub autoklawowany. Typowe wady obejmują niecałkowicie rozpuszczone RNA po etapach wytrącania, a więc albo nie jest biotynylowane, albo w inny sposób tracone podczas etapów przetwarzania. W materiałach uzupełniających znajduje się obszerna pomoc w rozwiązywaniu problemów.
Istnieją pewne ograniczenia, o których należy pamiętać w ers4tU. Jednym z już wspomnianych jest to, że 4tU spowalnia wzrost drożdży (ryc. 1a). Oprócz endogennie tiolowanych RNA9, tylko RNA, które zostały transkrybowane w okresie znakowania, mogą być oczyszczone tą metodą. Polimerazy zatrzymane na genach przez cały czas tiolowania nie wytworzą tiolowanych transkryptów, które można oczyścić, chociaż transkrypty, które są częściowo znakowane z powodu polimeraz wchodzących lub opuszczających stan wstrzymania podczas tiolacji, można odzyskać. Szczepy, które słabo transkrybują, czy to z powodu mutacji, czy warunków wzrostu, wytwarzają mało nsRNA, chociaż zastosowane tutaj techniki poprawią jednak regenerację nsRNA w porównaniu z innymi metodami. W tych szczepach i warunkach może być konieczne wydłużenie czasu i zwiększenie objętości hodowli. Należy pamiętać, że uracyl jest dobrym źródłem azotu, dlatego ta metoda powinna zostać wypróbowana przed zastosowaniem w badaniach obejmujących głód azotu.
Protokół ers4tU jest szczególnie przydatny do analizy krótkożyciowych RNA, z których wiele ulega tak szybkiej degradacji, że nie można ich zidentyfikować bez paraliżu maszynerii degradacji. Przykłady obejmują tajemnicze niestabilne transkrypty (CUT)4 i krótkie transkrypty powstałe w wyniku przedwczesnej terminacji lub promotora prokrotnego pauzy18 oraz transkrypcji antysensownej "upstream" od promotora (PROMPTs)19. Półprodukty wytwarzane podczas przetwarzania stabilnych gatunków RNA są również przejściowe, ale mogą być wzbogacone za pomocą transkrypcji ers4tU4. Protokół ers4tU jest zatem wyjątkowy, ponieważ pozwala na analizę i wychwytywanie wysoce przejściowych gatunków RNA w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, co stanowi ogromną przewagę nad innymi metodami. Technika ta została wykorzystana do badania kinetyki transkrypcji i dalszego przetwarzania RNA w mutantach polimerazy RNA, które wydłużają się szybciej lub wolniej niż normalnie20.
Tiolacja jest również kompatybilna z RNA-seq i SLAM-seq21, co pozwala na scharakteryzowanie całego RNA wyprodukowanego w bardzo krótkim czasie.

RNA ma dynamiczną naturę; wkrótce po jego wyprodukowaniu wiele RNA ulega szybkiemu przetwarzaniu i degradacji. Obecnie większość badań nad metabolizmem RNA analizuje całkowite komórkowe RNA, które jest w większości w pełni przetworzone i na poziomie stanu stacjonarnego. Poziom ten zależy od równowagi między szybkością transkrypcji, dojrzewania potranskrypcyjnego i degradacji. Analiza procesów prowadzących do równowagi w stanie ustalonym wymaga specjalistycznych technik wychwytywania bardzo krótkożyciowych gatunków RNA.
Metaboliczne znakowanie RNA analogami nukleotydów, takimi jak 4-tiouracyl (4tU) lub 4-tiourydyna (4sU) (zobacz Duffy et al.1 dla doskonałej recenzji), oferuje możliwość izolowania powstających RNA znakowanych tio i ich produktów pośrednich. Jednak opublikowane protokoły obejmują czas oznaczania wynoszący kilka minut2,3, co jest powolne w stosunku do szybkości produkcji wielu transkryptów. Transkrypcja przeciętnego genu drożdży trwa około jednej minuty, więc znakowanie RNA drożdży przez mniej niż jedną minutę można uznać za niezwykle krótkie. Niezwykle szybki i specyficzny protokół 4 tiouracylu (ers4tU) maksymalizuje stosunek sygnału do szumu, maksymalizując inkorporację 4tU i minimalizując odzyskiwanie nieznakowanego, wcześniej istniejącego RNA, umożliwiając bardzo krótkie czasy znakowania4.
Zmodyfikowana tio zasada musi zostać szybko zaimportowana do komórek w wystarczającej ilości, aby skutecznie oznaczyć nowo zsyntetyzowane RNA (nsRNA). Aby to umożliwić, komórki są hodowane w pożywce wolnej od uracylu, a ekspresja odpowiedniej przepuszczalności pomaga zwiększyć wychwyt 4tU lub 4sU (patrz Tabela 1 dla listy plazmidów, które zawierają odpowiednie geny przepuszczalności i Rysunek uzupełniający 1). Rozpuszczalność 4tU w wodorotlenku sodu pozwala uniknąć konieczności stosowania toksycznych rozpuszczalników organicznych wymaganych przez inne analogi nukleotydów. Niestety, zaobserwowano, że hodowla kultur przez długi czas z nukleozydami modyfikowanymi tio, w stężeniach większych niż 50 μM, zakłóca działanie rybosomów5. Jednak zastosowane tutaj stężenie (10 μM) i niezwykle krótki czas znakowania minimalizują szkodliwe skutki5 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1a), jednocześnie dając wystarczającą ilość RNA do analizy.
Ta technika może być połączona z szybkim i specyficznym wyczerpaniem docelowego białka za pośrednictwem auksyny6,7 (Rysunek 2), określany jako protokół "β-est AID 4U", w którym β-estradiolowa regulowana ekspresja systemu degronowego indukowanego auksyną (AID) jest połączona z znakowaniem 4tU. Dzięki β-najbardziej zaawansowanemu podejściu AID 4U, docelowe białko może zostać zubożone, a wpływ na metabolizm RNA ściśle monitorowany (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Czas ma kluczowe znaczenie; Zaleca się obejrzenie załączonego filmu i zwrócenie szczególnej uwagi na Rysunek 2 i jego animowaną formę (patrz Rysunek Uzupełniający 2).
Przetwarzanie i degradacja RNA muszą zostać zatrzymane bardzo szybko, aby uzyskać dokładne rozwiązanie czasowe. Osiąga się to za pomocą metanolu w niskiej temperaturze, który bardzo szybko wiąże zawartość komórki i degraduje błonę komórkową, zachowując jednocześnie zawartość kwasu nukleinowego8. Ekstrakcja RNA powinna być wydajna i nie uszkadzać RNA. Liza mechaniczna jest skuteczna przy braku środków chaotropowych (często zawierają one grupy tioowe, dlatego należy ich unikać). Preferowane jest wytrącanie RNA chlorkiem litu, ponieważ tRNA są mniej efektywnie wytrącane. tRNA są szybko transkrybowane i naturalnie tiolowane9, więc usunięcie tRNA zmniejsza konkurencję dla odczynnika biotynylacji. Jeśli interesujące są małe, wysoce ustrukturyzowane RNA, zalecane są metody wytrącania RNA na bazie alkoholu.
Aby odzyskać tiolowane RNA, biotyna jest kowalencyjnie przyłączana przez grupy tio włączone do RNA za pomocą 4tU. Zaleca się stosowanie modyfikowanej biotyny, która przyłącza się za pomocą rozdrobnionego wiązania dwusiarczkowego (np. HPDP-biotyna (N-[6-(Biotinamido)hexyl]-3'-(2'-pyridyldithio)propionamid, ) lub MTS-biotyna (tiosulfonian metanu)) jest zalecana, ponieważ umożliwia uwalnianie RNA przez dodanie środka redukującego. Biotynylowane RNA jest oczyszczone powinowactwem do streptawidyny sprzężonej z kulkami magnetycznymi. Ten protokół jest podobny do innych wymienionych wcześniej10, ale został intensywnie zoptymalizowany w celu zmniejszenia tła.
Istnieją dwa rodzaje eksperymentów z etykietowaniem tiolowym, które można przeprowadzić, etykietowanie ciągłe i nieciągłe. Każdy z nich ma swoje zalety. W przypadku znakowania ciągłego 4tU dodaje się do hodowli i próbek pobieranych w regularnych odstępach czasu. Ten rodzaj eksperymentu pokazuje, w jaki sposób RNA jest przetwarzane i jak jego poziomy zmieniają się w czasie. Przykładami mogą być eksperymenty z mutantami i dzikimi oraz eksperyment z pogonią za pulsem. Eksperymenty pokazane na rysunku 3b,c są tego typu. W przypadku znakowania nieciągłego indukowana jest zmiana w systemie i monitorowane jest RNA. Po wywołaniu zmiany kultura musi zostać podzielona na kilka subkultur, a w określonych momentach każda z nich jest następnie znakowana tio przez krótki okres. Jednym z przykładów jest β-est AID 4U pokazany w Rysunek 27. Ten rodzaj eksperymentu jest szczególnie przydatny do monitorowania wpływu zmiany metabolicznej na przetwarzanie RNA (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 3d).
Graficzna reprezentacja eksperymentu z etykietowaniem tio jest przedstawiona w Rysunek 4 i Rysunek 5, a arkusz kalkulacyjny, który znacznie upraszcza działanie protokołu, jest dostępny (zobacz eksperyment 4tU template.xlsx). Oprócz tego informacje uzupełniające zawierają obszerny przewodnik rozwiązywania problemów. Aby zapoznać się z najbardziej β protokołem AID 4U, który integruje znakowanie 4tU z protokołem depulacji auksyny, zobacz Rysunek 2 i Rysunek uzupełniający 2. Zobacz Barrass et al.7, aby zapoznać się ze szczegółowym protokołem wyczerpania AID.

<table><tbody><tr><td>&beta;-merkaptoetanol (&beta; ME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>UWAGA toksyczny. Roztwory podstawowe przyjmuje się około 14 M, przygotować w 1/20 do użycia</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25668</td><td>UWAGA toksyczny</td></tr><tr><td>pirowęglan dietylu (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>dodać 1/1000 do roztworu, pozostawić w temperaturze pokojowej na 24 godziny, następnie autoklaw</td></tr><tr><td>DMF (N,N-dimetyloformamid)</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td>UWAGA toksyczny</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td>Zrobić 0,5 M i pH do 8,0 z wodorotlenkiem sodu</td></tr><tr><td>Etanolem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29221</td><td></td></tr><tr><td>EZ-link HPDP Biotyna</td><td>Thermo scientific</td><td>21341</td><td>Przechowywać chronić przed światłem. Rozpuścić całą zawartość fiolki w 22,7 ml DMF (w celu uzyskania 4 mM roztworu podstawowego). Przechowywać z dala od wody, w ciemności i w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Przed użyciem należy sprawdzić roztwór, ponieważ niektóre partie HPDP wytrącają się podczas przechowywania; ciepło w 42 stopniach; C, aby ponownie zawiesić.</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>G/0500/60</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen [20 mg/mL]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10901393001</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Immobilizowany żel redukujący dwusiarczek TCEP</td><td>Thermo Scientific</td><td>77712</td><td>Opcjonalnie</td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793620</td><td>10 M roztwór. UWAGA: staje się bardzo gorący, gdy się rozpuszcza i może nawet wrzeć w temperaturze większej niż 100 oC, powoli dodawaj kryształy LiCl do wody.</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63033</td><td>1 M roztwór. UWAGA: staje się bardzo gorący, gdy się rozpuszcza i może nawet wrzeć w temperaturze większej niż 100 oC, powoli dodawaj kryształy MgCl2 do wody.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/4000/PC17</td><td>UWAGA Toksyczny i łatwopalny</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139</td><td>Przygotować 1 M roztwory każdego z nich i wymieszać w równej ilości, aby otrzymać roztwór o odpowiednim pH</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-M</td><td>5 M roztwór</td></tr><tr><td>fenol, niskie pH. &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4682</td><td>Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 stopni Celsjusza. UWAGA toksyczny</td></tr><tr><td>Chloroform fenolowy 5:1 (125:24:1) niskie pH.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1944</td><td>Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C. UWAGA</td></tr><tr><td>toksyczne kolumny Pierce Spin Thermo</td><td>Scientific</td><td>69702</td><td>Opcjonalna</td></tr><tr><td>pojedyncza kropla SCSM &ndash; ura</td><td>Formedium&nbsp;</td><td></td><td></td>DSCS101</tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32318-M</td><td>Przygotować 3 M roztwór i pH do 5,3 z kwasem octowym</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429</td><td>UWAGA</td></tr><tr><td>SDS (dodecylosiarczan sodu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>436143</td><td>UWAGA drażniący, nie wdychać</td></tr><tr><td>Streptawidyny Koraliki magnetyczne</td><td>NEB</td><td>1420S</td><td>Przechowywać w 4&deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>SUPERase-In, inhibitor RNazy</td><td>Technologie życia&nbsp;</td><td>AM2696</td><td>Sklep pod adresem -20&deg; C</td></tr><tr><td>Tiolowany Schizosaccharomyces pombe dla kolców</td><td></td><td></td><td>Patrz sekcja 1.7 protokołu</td></tr><tr><td>4-tiouracyl (4tU)&nbsp;</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>359930010</td><td>Przechowywać w ciemności. Zrób 100 mM zapasów w 1M NaOH, przechowuj roztwory w temperaturze -20&deg;C.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93362</td><td>1 M roztwory o różnym pH</td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10109541001</td><td>5mg/ml, przechowywać w temperaturze -20&deg; C</td></tr><tr><td>Urydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750</td><td>Przygotować 1 M roztwór w H2O. Podzielić na 2 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 C.</td></tr><tr><td>Drożdżowa baza azotowa bez aminokwasów&nbsp; z siarczanem amonu</td><td>Formedium</td><td>CYN0410</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Kolumny 0,5ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>89882</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Koraliki cyrkonowe</td><td>Thistle Scientific</td><td>110791052</td><td></td></tr><tr><td>Equipment and Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beadbeater</td><td>Biospec</td><td>112011EUR</td><td>Można stosować inne homogenizatory; należy ustalić odpowiednie warunki dla każdego homogenizatora i szczepu.</td></tr><tr><td>Bioanalizator (Agilent) lub podobny do oceny jakości RNA. Jeśli nie jest to ważne, przydatny jest spektrofotometr do ilościowego określenia RNA.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka: zdolna do przędzenia kultur w temperaturze 4 & stopni; C i co najmniej 3000 g. Jeśli to możliwe, wstępnie schłodzić.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka: możliwość wirowania probówek o pojemności do 2 ml ze zmiennymi prędkościami do 13 000 g i do 1000 g&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny do oddzielania kulek od próbki. Ten użyty w papierze jest wydrukowany w 3D, dostępny w Thingiverse (thing:3562952). Dostępne komercyjnie regały istnieją&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do PCR z podgrzewaną pokrywką, która umożliwi inkubację w ciemności.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obrotowe koło do obracania probówek 1,5 ml koniec nad końcem&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zaleca się wytrząsanie bloku grzewczego (takiego jak Eppendorf Thermomixer)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki, wirówki, Niska retencja, bez RNaz 0,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>H179467N</td><td></td></tr><tr><td>Probówki, wirówki, Niska retencja, bez RNaz 1,5 mL</td><td>Ambion</td><td>AM12350</td><td></td></tr><tr><td>Probówki, wirówka, 50 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td>Inne probówki wirówkowe nie są gazoszczelne, co pozwala CO2 rozpuścić się w metanolu, który energicznie wydostaje się z roztworu po dodaniu ciepłej kultury, co prowadzi do utraty próbki</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe, 15 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.001</td><td></td></tr><tr><td>Probówki, 2 mL, nakrętka</td><td>Greiner</td><td>723361</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 0,2 ml pasek po 8 sztuk ze zintegrowanymi pokrywkami</td><td>Marka</td><td>781332</td><td></td></tr></tbody></table>

niezwykle szybkie i swoiste znakowanie metaboliczne rna in vivo za pomocą 4-tiouracylu (ers4tu)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Analog nukleotydu, 4-tiouracyl (4tU), jest łatwo pobierany przez komórki i włączany do RNA podczas transkrypcji in vivo, co pozwala na izolację RNA wytworzonego podczas krótkiego okresu znakowania. Odbywa się to poprzez dołączenie ugrupowania biotyny do włączonej grupy tio i oczyszczanie powinowactwa za pomocą kulek pokrytych streptawidyną. Osiągnięcie dobrej wydajności czystego, nowo zsyntetyzowanego RNA, które jest wolne od istniejącego wcześniej RNA, umożliwia skrócenie czasu znakowania i pozwala na zwiększenie rozdzielczości czasowej w badaniach kinetycznych. Jest to protokół bardzo specyficznego, wysokowydajnego oczyszczania nowo zsyntetyzowanego RNA. Przedstawiony tutaj protokół opisuje, w jaki sposób RNA jest ekstrahowane z drożdży Saccharomyces cerevisiae. Jednak protokół oczyszczania tiolowanego RNA z całkowitego RNA powinien być skuteczny przy użyciu RNA z dowolnego organizmu po jego ekstrakcji z komórek. Oczyszczony RNA nadaje się do analizy za pomocą wielu powszechnie stosowanych technik, takich jak odwrotna transkryptaza-qPCR, RNA-seq i SLAM-seq. Specyficzność, czułość i elastyczność tej techniki pozwalają na niezrównany wgląd w metabolizm RNA.

Typowe wydajności nsRNA odzyskanego przy użyciu tego protokołu ers4tU przedstawiono na Rysunku 1b; dane te zostały uzyskane za pomocą bioanalizatora, a wykres przedstawia wydajność RNA w zależności od wielkości (nukleotydy [nt]). Należy zauważyć, zarówno na zapisie z bioanalizatora, jak i na wykresie wstawkowym, że odzysk RNA z punktu czasowego 0 stanowi bardzo niewielką część ilości odzyskanej z późniejszych punktów czasowych – około 0,3 µg RNA odzyskanego z około 109 komórek w porównaniu z ponad dwukrotnie większą ilością po zaledwie 30 s znakowania (0,8 µg nsRNA) z tej samej liczby komórek. Odzysk RNA w 15 s jest bardziej zmienny, ponieważ niewielkie różnice w przeprowadzaniu pobierania próbek mają proporcjonalnie większy wpływ na odzysk RNA. Na zapisie z bioanalizatora prekursory rRNA są widoczne jako piki w pobliżu 1000 nt oraz dublet pików w zakresie 1700−1800 nt. Obfitość tych produktów pośrednich wzrasta w miarę trwania tiolacji.
Do ilościowego oznaczenia splicingu transkryptu ACT1 wykorzystano znakowanie tiolowe (Rysunek 3). Przeprowadzono tiolowanie i pobierano próbki w odstępach 15 s od rozpoczęcia znakowania tiolowego, monitorując przetwarzanie RNA ACT1 (Rysunek 3a,b). Jak widać, pre-mRNA (poprzez transkrypcję) oraz struktury lasso (poprzez pierwszy etap splicingu pre-mRNA) powstają już po zaledwie 15 s znakowania. Po około 45 s do 1 min ilości struktur lasso i pre-mRNA osiągają stan równowagi, w którym ilość tych form RNA wytwarzanych w procesie transkrypcji jest równa ilości przetwarzanej w wyniku splicingu.
Aby uzyskać dane przedstawione na Ryc. 3c, szczep poddano impulsowi 4tU przez 25 s, a następnie zastosowano wymywanie urydyną. Generowanie pre-mRNA i lariatu osiąga maksimum w 1 minucie. Wynik ten jest zgodny z Ryc. 3b; maksimum zostało osiągnięte po 45 s potrzebnych do osiągnięcia stanu równowagi oraz po 25 s znakowania. Po osiągnięciu szczytu poziomy spadają, gdy znakowane tio-RNA są usuwane w procesie splicingu.
Rycina 3d przedstawia deplecję czynnika splicingu białkowego i jej wpływ na metabolizm RNA z wykorzystaniem systemu β-est AID 4U6,7. W tym przypadku poziom białka Prp16p zostaje zredukowany z poziomu bliskiego fizjologicznemu do 5% tej wartości po 25 min deplekcji. Prp16p jest niezbędnym czynnikiem splicingu dla drugiego etapu splicingu15. Lariaty są usuwane podczas drugiego etapu splicingu (Rycina 3a), jednak w tym przypadku ich poziom wzrasta powyżej poziomu pre-mRNA w miarę, jak Prp16 staje się czynnikiem limitującym. W późniejszych odstępach czasu deplekcji, w wyniku efektów wtórnych, czynnikiem limitującym stają się inne białka, co prowadzi do spadku poziomu lariatów i wzrostu poziomu pre-mRNA. Poziom splicingowanego mRNA ulega obniżeniu.
<img alt="Wpływ 4tU na wzrost drożdży; wykres słupkowy, wykres odzysku nsRNA w funkcji czasu tiolacji; analiza spektroskopowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Wzrost w obecności 4tU i odzysk RNA. (a) 4-tiouracyl wpływa na wzrost. Zwiększenie stężenia 4tU w pożywce wzrostowej YMM drop-out bez uracylu zwiększa czas podwojenia liczby komórek S. cerevisiae (BY4741) niosących plazmid p4FuiΔPEST. Wzrost czterech kultur powtórzonych monitorowano w temperaturze 30 °C w urządzeniu Tecan Infinite Pro 200. Wszystkie kultury znajdowały się przez cały czas w fazie logarytmicznej, z OD600 w zakresie od 0,1 do 0,6. Mock to kultura kontrolna z dodatkiem równoważnej ilości NaOH, co samo w sobie nie zmienia tempa wzrostu. Wykres ten pokazuje, że znakowanie tiolowe stanowi kompromis pomiędzy szybkim znakowaniem a uszkodzeniem komórki. Słupki błędów przedstawiają błąd standardowy dla 4 powtórzeń. (b) Wydajność nsRNA rośnie liniowo od około 15 s znakowania. Główna rycina przedstawia ślady z bioanalizatora dla oczyszczonego nsRNA od 0 (nieznakowanego) do 2 min po dodaniu 4tU w odstępach 15 s. Należy zauważyć, że próbka z 15 s nie jest pokazana, ponieważ była nieodróżnialna od próbki nieznakowanej. Dwa duże piki odpowiadają rybosomalnym RNA (rRNAs). Prekursory i produkty pośrednie rRNA są widoczne jako kilka pików o większej masie cząsteczkowej niż dojrzałe rRNAs. Odzysk tych prekursorów i produktów pośrednich zwiększa się z czasem. Przedstawiono wyniki z jednego reprezentatywnego eksperymentu. Wykres wstawkowy pokazuje odzysk nsRNA wraz z wydłużeniem inkubacji z 4tU. Wydajność nsRNA rośnie wraz ze wzrostem czasu hodowli z 4tU. Odzysk jest niezwykle liniowy (R2 = 0,934) w całym przedziale czasowym tego eksperymentu i wykazuje niewielki wzrost ponad poziom tła nawet przy 15 s znakowania 4tU, mimo że na śladzie z bioanalizatora nie jest on odróżnialny od próbki nieznakowanej. Słupki błędów przedstawiają błąd standardowy dla trzech powtórzeń biologicznych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu eksperymentalnego równowagi statycznej; przedstawia metodę hodowli z użyciem β-estradiolu, auksyny i 4tU." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Protokół graficzny β-est AID 4U β-est AID 4U. Graficzne podsumowanie protokołu β-est AID 4U. β-estradiol (β-est) promuje ekspresję systemu degronu indukowanego auksyną (AID), który z kolei powoduje usunięcie białka docelowego znakowanego AID*, szczegółowy protokół znajduje się u Barrass et al.7. W tym przypadku ekspresja systemu degronu jest inicjowana 25 min przed rozpoczęciem degradacji białka, a tiolacja w każdym punkcie czasowym trwa 1 min. Próbki są pobierane przed indukcją oraz co 2 minuty podczas procesu usuwania białek. Wersja animowana znajduje się w Rysunku dodatkowym 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat procesu splicingu RNA z wykresami przedstawiającymi poziomy prekursora RNA ACT1, produktów pośrednich i końcowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Prekursory i produkty pośrednie splicingu RNA ACT1. Splicing transkryptów pre-mRNA ACT1 monitorowano za pomocą ilościowej RT-PCR16. Poziomy prekursora ACT1 (pre-mRNA), produktu pośredniego w formie lariat-ekson 2 (Lariat) oraz produktu splicingu (mRNA) przedstawiono po normalizacji względem poziomu eksonu 2 ACT1 oraz poziomów stanu stacjonarnego tych RNA. (a) Położenie produktów qPCR na transkrypcie ACT1. Schemat rozmieszczenia produktów qPCR wykorzystanych do analizy poziomów prekursorów, produktów pośrednich i końcowych reakcji splicingu transkryptów ACT116. Eksony przedstawiono jako prostokąty, intron jako linię, a produkty qPCR jako linie z rombami na końcach; kolory odpowiadają tym zastosowanym na wykresach. PCR dla pre-mRNA jest specyficzny dla pre-mRNA, a nie dla produktów pośrednich splicingu, ponieważ produkt ten obejmuje punkt rozgałęzienia (branch point), który zostaje przerwany po pierwszym etapie splicingu. PCR dla lariatu wykryje produkt pierwszego etapu splicingu oraz wyciętego lariatu powstałego po drugim etapie. PCR dla mRNA jest specyficzny dla produktu splicingu, czyli mRNA. Wyników z PCR dla eksonu (obecnego we wszystkich prekursorach, produktach pośrednich i końcowych, z wyjątkiem wyciętego lariatu) nie przedstawiono na wykresach, ponieważ posłużyły one do normalizacji danych i w związku z tym są zawsze równe 1. (b) Ciągłe znakowanie tiolowe. Ilość pre-mRNA zwiększa się z czasem w miarę włączania 4tU podczas transkrypcji, a po krótkim czasie splicing przekształca go w produkt pośredni lariat-ekson 2 oraz produkty splicingu. Poziomy tych form pre-mRNA i lariatu są wykrywalne powyżej tła już po 15 s wzrostu z 4tU i osiągają maksimum po około 45 s ciągłego znakowania 4tU, kiedy to ich produkcja zostaje zrównoważona przez konwersję do mRNA i/lub degradację. Wartości znormalizowano do stanu stacjonarnego (punkt najbardziej po lewej na wykresie), a poziomy eksonu 2 przedstawiono, aby ukazać ich pojawianie się i przetwarzanie w porównaniu do transkrypcji eksonu 2. Ponieważ splicing RNA ACT1 zachodzi w dużej mierze ko-transkrypcyjnie4,17, splicowany mRNA szybko staje się najliczniejszą formą, a jego poziom jest zbliżony do poziomu eksonu 2. Błąd standardowy trzech powtórzeń biologicznych, z których każde analizowano w trzech powtórzeniach technicznych. (c) Pulse/chase. Puls tiolowania trwający 25 sekund, po którym nastąpił etap chase z urydyną. W porównaniu do poziomów stanu stacjonarnego tych RNA (punkt najbardziej po lewej), początkowo są one bardzo liczne w nowo syntetyzowanej puli. Poziomy stopniowo spadają w miarę przetwarzania do mRNA (lub degradacji), zbliżając się do poziomów stanu stacjonarnego po 5 min. Błąd standardowy trzech powtórzeń biologicznych, z których każde analizowano w trzech powtórzeniach technicznych. (d) Deplecja nsRNA i białka. Splicing transkryptów pre-mRNA ACT1 monitorowano za pomocą ilościowej RT-PCR, jak w panelu (a), po deplekcji białka Prp16 przy użyciu systemu degronu auksynowego, opisanego na Rysunku 2. Poziomy białka Prp16 przedstawiono również na wykresie na drugiej osi Y jako procent poziomu przed deplekcją auksyną. Prp16 jest kluczowym składnikiem splisomu, szczególnie ważnym dla drugiego etapu splicingu pokazanego w panelu (a), po którym lariaty ulegają degradacji. Gdy ten etap staje się ograniczający, początkowo dochodzi do akumulacji lariatów. W późniejszych punktach czasowych splicing całkowicie ustaje, lariaty nie są już produkowane, a poziomy pre-mRNA rosną. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy trzech powtórzeń biologicznych, z których każde analizowano w trzech powtórzeniach technicznych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat przygotowania i biotynylacji RNA, przedstawiający etapy znakowania tio- i wirowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Graficzne podsumowanie sekcji protokołu od 1 do 3. Komórki są tiolowane za pomocą 4tU i poddawane wzrostowi w celu włączenia zmodyfikowanego nukleotydu do RNA. Można dodać tiolowany standard wewnętrzny S. pombe, aby umożliwić normalizację pomiędzy punktami czasowymi i eksperymentami. Impuls 4tU można zastąpić nie-tiolowaną urydyną. Znakowanie może być przeprowadzane albo w sposób ciągły od momentu dodania 4tU lub zmiany warunków wzrostu, albo poprzez podzielenie hodowli i dodawanie 4tU do hodowli w zwiększających się odstępach czasu od zmiany warunków wzrostu, przy czym każde znakowanie trwa krótko. Komórki są zbierane, a z nich przygotowywane RNA, najlepiej przy użyciu homogenizatora i metod opartych na fenolu. RNA jest biotynylowane, a następnie biotynylowane RNA jest oczyszczane z niewłączonej biotynyy za pomocą kolumny do wykluczania wielkości. nsRNA jest teraz gotowe do oczyszczania za pomocą kulek ze streptawidyną (sekcja 4, Rycina 5). Numery na czerwono odpowiadają numerom kroków w protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces oczyszczania RNA za pomocą kulek streptawidynowych; schemat szczegółowo przedstawiający przebieg eksperymentu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Graficzne podsumowanie części 4 protokołu. Po wykonaniu etapów opisanych w sekcjach 1–3 (Rysunek 4), kulki streptawidynowe zostają zablokowane, a do przygotowanych kulek dodaje się próbkę biotynilowanego RNA. Biotynilowany RNA wiąże się z kulkami streptawidynowymi, a niebiotynilowany RNA zostaje usunięty i wypłukany. Biotynilowany RNA jest eluowany z kulek przy użyciu βME i wytrącony w celu dalszych badań. Numery zaznaczone na czerwono odpowiadają numerom kroków w protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rysunek uzupełniający 1: Poprawa odzysku nsRNA z komórek drożdży z i bez dodatkowych kopii importera po 1 i 3 minutach znakowania tio. Należy zauważyć, że Fui1 jest własnym promotorem drożdży ekspresowanym z plazmidu 2 µm. Genomowa kopia tego genu jest obecna w obu tych szczepach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S1.ai">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 2: Animowana wersja graficznego protokołu β-est AID 4U β-est AID 4U. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S2_Best-AID_4U.mp4">Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.</a>
Plik uzupełniający 1: 4tU_experiment_template.xltx. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/4tU_experiment_template.xltx">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nazwa plazmidu</td>
			<td>Importer/permeaza</td>
			<td>Marker</td>
			<td>Komentarz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p4Fui</td>
			<td>S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>URA3</td>
			<td rowspan="2">Fui1 importuje uracyl i urydynę, co czyni go idealnym do eksperymentów typu pulse/chase.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAT2</td>
			<td>S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>LEU2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p4Fui-ΔPEST</td>
			<td>*S. cerevisiae* Fui1</td>
			<td>URA3</td>
			<td>Motyw PEST białka Fui1 został zdeaktywowany, dzięki czemu permeaza nie ulega degradacji w sytuacji, gdy wewnątrzkomórkowe stężenie uracylu jest wystarczające dla potrzeb komórki. Rozwiązanie to sprawdza się w eksperymentach z znakowaniem i poprawia efektywność badań metodą impuls-pogoń (pulse-chase).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p4Fur</td>
			<td>S. cerevisiae Fur4</td>
			<td>URA3</td>
			<td>Permeaza uracylu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">YEpEBI311</td>
			<td>H. sapiens ENT1</td>
			<td rowspan="2">LEU2</td>
			<td rowspan="2">Miller i wsp.11Zawiera również gen tymidynokinazy HSV.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(równowagowy transporter nukleozydów)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Wszystkie plazmidy są 2 µm oparte. Wszystkie plazmidy p4 i pAT są oparte na pRS16 seria plazmidów. FUI1 i FUR4 są ekspresjonowane z ich własnych, endogennych promotorów.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Plazmidy użyte w tym protokole.

Użycie tiolowanego uracylu do wrażliwego i specyficznego oczyszczania nowo przepisanego RNA z drożdży Saccharomyces cerevisiae.

Niezwykle szybkie i swoiste znakowanie metaboliczne RNA in vivo za pomocą 4-tiouracylu (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Metoda ta jest znacząca, ponieważ żaden inny protokół nie pozwala na analizę nowo zsyntetyzowanego RNA w tak krótkiej skali czasowej i nie pozwala na eksperymenty z pogonią za impulsem z tak krótkim impulsem. Protokół ten działa dobrze w przypadku wyczerpania białka, takiego jak protokół Best AID 4U. Główną zaletą jest to, że tło jest niskie.Pozwala to na krótki czas znakowania, poprzez usunięcie prawie całego nietiolowanego RNA. Pisemny protokół wyszczególnia również wiele różnych rodzajów eksperymentów, które można przeprowadzić i jak zintegrować je z tą techniką. Aby rozpocząć tę procedurę, hoduj drożdże w pożywce YMM do OD 600 między 0,6 a 0,8.W dygestorium dodać metanol odpowiadający 30 do 50% zamierzonej objętości próbki do 50-mililitrowej probówki. Zamknij szczelnie tubki, oznacz je i umieść na suchym lodzie do schłodzenia. Następnie oznacz dwie mililitrowe probówki do długotrwałego przechowywania próbek i umieść na lodzie do ostygnięcia.Dodaj kulki cyrkonu do dwóch mililitrowych tubek. Schłodzić na lodzie co najmniej jeden mililitr wody na próbkę. Jeśli do kultury ma zostać dodany kolec S.pombe, należy umieścić porcję tiolicznych komórek S.pombe na lodzie w celu rozmrożenia.Zmieszaj rozmrożoną porcję i dodaj ją do kultury. Następnie dodać 4tU do kultury o stężeniu 10 mikromolowym i energicznie wymieszać. Znakowanie tioznakowe przez okres od 15 sekund do pięciu minut.Pobieraj próbki kultury w regularnych odstępach czasu do końca biegu czasowego. Dodać każdą próbkę do jednej z przygotowanych probówek wirówkowych zawierających metanol. Zamknij każdą tubkę, wstrząśnij, aby dokładnie wymieszać i umieść na suchym lodzie.Po pobraniu wszystkich próbek umieść je wszystkie na lodzie. Upewnij się, że żadna z próbek nie zamarzła. Jeśli któryś z nich zamarzł, delikatnie rozgrzej go w dłoni, ciągle odwracając.Odwirować komórki w temperaturze 3 000 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie minuty, aby granulować komórki. Odlej płyn i ponownie zawieś granulkę w co najmniej jednym mililitrze lodowatej wody, energicznie pipetując w górę iw dół. Przenieść zawiesinę do przygotowanej rurki z nakrętką i umieścić probówkę na lodzie.Odwirować próbki na krótko z prędkością większą niż 13 000 razy g w celu ponownego osadzenia komórek. Następnie umieść je z powrotem na lodzie i usuń płyn. Najpierw dodaj 400 mikrolitrów buforu AE, 40 mikrolitrów SDS i 800 mikrolitrów fenolu o niskim pH.Ponowne zawieszenie przez wirowanie na 10 sekund. Następnie poddaj komórki lizie w homogenizatorze przez trzy dwuminutowe serie przy najniższym ustawieniu mocy. Pozostawić próbki na lodzie na dwie minuty między impulsami homogenizacji.Umieść lizowane komórki na suchym lodzie na pięć minut, aż zestalą się. Następnie za pomocą mikrowirówki wiruj komórki z prędkością ponad 13 000 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie należy przeprowadzić ekstrakcję chloroformem fenolowym i ekstrakcję chloroformem zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Dodaj od 1/3 do 1/2 objętości 10 molowego chlorku litu i wymieszaj, aby wytrącić RNA. Wirować z prędkością ponad 13 000 razy g przez pięć minut. Usunąć płyn i na krótko ponownie obrócić próbkę, aby usunąć osady.Następnie umyj granulat 300 do 500 mikrolitrami 70% etanolu. Krótko odwirować przemyty osad i usunąć pozostały etanol. Ponownie rozpuść osad RNA w 90 mikrolitrach TE przy pH 7,0, ogrzewając w temperaturze 65 stopni Celsjusza podczas wstrząsania.Po sprawdzeniu, czy RNA jest w pełni rozpuszczalny, przenieś zawiesinę do probówki o pojemności 0,2 mililitra. Na początek należy wykonać biotynylację, dodając 10 mikrolitrów roztworu HPDP-biotyny do RNA i dokładnie wymieszać. Inkubować w ciemności w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 15 do 30 minut.Następnie przygotuj małą objętość żywicy, kolumnę wykluczającą rozmiar, aby wykluczyć niewłączoną biotynę. Usuń dolną etykietę kolumny, poluzuj nasadkę i umieść kolumnę w dwumililitrowej probówce wirówkowej. Odwirować przy 1 500 g przez jedną minutę, aby wypłukać bufor i wyrzucić przepływ.Następnie delikatnie dodaj 0,3 mililitra TE na górę kolumny i ponownie odwiruj w tych samych warunkach. Przenieś umytą kolumnę do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Po zakończeniu inkubacji próbki dodaj próbkę na górze kolumny.Wirować przy 1 500 g przez dwie minuty, pozostawiając biotynylowaną próbkę RNA na dnie probówki. Odrzuć kolumnę. I dodać 1/3 do 1/2 objętości 10 molowego chlorku litu do probówki zawierającej próbkę.Wymieszaj, aby ponownie wytrącić RNA. Najpierw ponownie rozpuść RNA w 200 mikrolitrach wody uzdatnionej DEPC. Zmierz stężenie RNA i oblicz objętości dla każdej próbki, które dadzą równe ilości RNA dla wszystkich próbek.Dodaj tę ilość RNA do świeżej probówki i dodaj z powrotem wodę uzdatnioną DEPC do całkowitej objętości 200 mikrolitrów. Gdy próbka ma temperaturę pokojową, dodaj 25 mikrolitrów 10 x bufor NaTM, 25 mikrolitrów jednego molowego fosforanu sodu i 2,5 mikrolitra 10% SDS. Dokładnie wymieszaj i delikatnie odwiruj około 100 razy g przez mniej niż 30 sekund.Przygotuj dwa mililitry buforu perełkowego dla każdej próbki z jednym buforem NaTM, 0,1 molowym fosforanem sodu i 0,1% SDS. Dodaj 50 mikrolitrów kulek streptawidyny do 1,5-mililitrowej probówki o niskiej retencji. Umieść rurkę na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż koraliki opadną.Następnie usuń płyn przez aspirację. Aby umyć kulki, dodaj 200 mililitrów bufora do kulek i wiruj, aż granulka kulki zostanie całkowicie zawieszona. Odwirować probówkę z prędkością około 100 razy g przez maksymalnie pięć sekund.Umieść rurkę w stojaku magnetycznym, aby koraliki mogły zostać uchwycone przez magnes. Usunąć płyn przez aspirację, jeśli jest niewielka liczba próbek. Odlej płyn, a następnie odessać, jeśli jest wiele próbek.Blok z 200 mikrolitrami buforu perełkowego, 10 mikrolitrami glikogenu i 2,5 mikrolitrami tRNA. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut, obracając się od końca do końca z umiarkowaną prędkością. Następnie usuń płyn i ponownie umyj, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Ponownie zawiesić kulki w próbce i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, obracając się. Podczas tej inkubacji przygotuj świeżą probówkę o pojemności 1,5 mililitra dla każdej próbki. Dodać 1/10 objętości trzech molowych octanu sodu o pH 5,3 i 20 mikrogramów glikogenu.Wirować z prędkością około 100 razy g przez trzy sekundy. Usuń niezwiązane RNA z kulek i umyj je zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby wymyć RNA, dodaj 50 mikrolitrów świeżo przygotowanego 0,7 molowego beta merkaptoetanolu do kulek.Po wirowaniu i odwirowaniu umieść gnojowicę w stojaku magnetycznym. Odpipetować roztwór zawierający RNA do przygotowanych 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych. Elute jeszcze raz, jak opisano wcześniej.Następnie umieść próbkę z powrotem w stojaku magnetycznym, aby usunąć resztki kulek z eluowanego RNA i przenieś płyn do świeżej, nisko wiążącej probówki wirówkowej o pojemności 0,5 mililitra. Wymieszać próbkę. A następnie dodaj 2,5 objętości etanolu, aby wytrącić nsRNA.Po wymieszaniu i inkubacji odwirować z prędkością co najmniej 13 000 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Typowe plony dla snRNA odzyskanego przy użyciu tego protokołu przedstawiono tutaj. Należy zauważyć, że odzyskiwanie RNA w punkcie zerowym jest bardzo małą częścią tego, co jest odzyskiwane w dłuższych punktach czasowych, przy czym tylko 0,3 mikrograma RNA jest odzyskiwane z około 30 miliardów komórek.Jednak już po 30 sekundach znakowania z tej samej liczby komórek pobiera się ponad dwa razy więcej RNA. W śladzie bioanalizatora nasze prekursory RNA mogą być widziane jako pik w pobliżu 1000 nukleotydów i dublet pików przy 1700 do 1800 nukleotydów. Obfitość tych produktów pośrednich wzrasta wraz z postępującą tiolacją.Następnie przeprowadza się tiolizację, pobierając próbki w odstępach 15-sekundowych od rozpoczęcia znakowania tiologicznego i monitoruje się przetwarzanie transkryptu RNA ACT1. Jak widać, pre-mRNA i lariaty są generowane nawet po 15 sekundach znakowania. Po około 45 sekundach do jednej minuty ilość lariatów i pre-mRNA osiąga równowagę, przy czym tyle tych gatunków RNA jest tworzonych przez transkrypcję, ile jest przetwarzanych przez splicing.Najtrudniejsze kroki to te związane z koralikami, myciem i blokowaniem. Uważaj, aby nie zgubić koralików lub pozwolić im wyschnąć. Po oczyszczeniu nowo zsyntetyzowanego RNA można użyć dowolnej tradycyjnej procedury analizy RNA.Zaleca się uruchomienie RNA na bioanalizatorze lub podobnym urządzeniu. Następnie zwykle używamy QPCR i RNA-Seq do analizy RNA. Metoda ta okazała się idealna do analizy kinetyki przetwarzania RNA.Najbardziej niebezpiecznymi etapami są te z wykorzystaniem fenolu i chloroformu w ekstrakcji RNA. Za każdym razem, gdy używasz tych chemikaliów w niezamkniętym pojemniku, rób to w dygestoriach i noś odpowiednią odzież ochronną, fartuch laboratoryjny i rękawice. Zwróć szczególną uwagę, aby w gwincie rurki z tlenkiem cyrkonu nie było kropelek cyrkonu, ponieważ doprowadzi to do wycieku.

extremely-rapid-specific-metabolic-labelling-rna-vivo-with-4

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Transkrypty RNA podlegają rozległej regulacji potranskrypcyjnej, w której pośredniczy wiele trans-działających białek wiążących RNA (RBP). W tym miejscu przedstawiamy uogólnioną metodę precyzyjnej identyfikacji w skali całego transkryptomu miejsc wiązania RNA RBP.

PAR-CliP - metoda identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących RNA w całym transkryptomie

Całkowite komórkowe RNA stanowi kiepski szablon do badania krótkoterminowych zmian w syntezie i rozpadzie RNA, jak również kinetyki przetwarzania RNA. W tym miejscu opisujemy znakowanie metaboliczne nowo transkrybowanego RNA za pomocą 4-tiourydyny, a następnie biotynylację specyficzną dla tiolu i oczyszczanie nowo transkrybowanego RNA, co pozwala przezwyciężyć te ograniczenia.

Znakowanie metaboliczne nowo transkrybowanego RNA w celu profilowania ekspresji genów w wysokiej rozdzielczości syntezy, przetwarzania i rozpadu RNA w hodowli komórkowej

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Opisujemy oryginalną platformę do analizy transferowego RNA o nazwie SPOt (Streamlined Platform for Observing tRNA). SPOt jednocześnie mierzy poziomy komórkowe wszystkich tRNA w próbkach biologicznych, w zaledwie trzech krokach i w czasie krótszym niż 24 godziny.

Znakowanie metaboliczne i profilowanie transferowych RNA za pomocą płaszczek Macroarray

Ta metoda może być użyta do pomiaru syntezy RNA. 5-bromourydyna jest dodawana do komórek i włączana do syntetyzowanego RNA. Syntezę RNA mierzy się przez ekstrakcję RNA bezpośrednio po znakowaniu, a następnie immunoprecypitację znakowanego RNA ukierunkowaną na 5-bromourydynę i analizę za pomocą odwrotnej transkrypcji i ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy.

Badanie syntezy RNA z wykorzystaniem znakowania 5-bromourydyną i immunoprecypitacji

Opisany tutaj protokół opiera się na kwantyfikacji całego genomu nowo zsyntetyzowanych mRNA oczyszczonych z komórek drożdży znakowanych 4-tiouracylem. Metoda ta pozwala na pomiar syntezy mRNA niesprzężonej z rozpadem mRNA, a tym samym zapewnia dokładny pomiar transkrypcji polimerazy II RNA.

Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) Znakowanie metaboliczne za pomocą 4-tiouracylu i kwantyfikacja nowo zsyntetyzowanego mRNA jako wskaźnika aktywności polimerazy II RNA

Ten artykuł opisuje dwukolorowe znakowanie długich RNA na końcach i ich unieruchomienie powierzchni poprzez enkapsulację w pęcherzykach fosfolipidowych dla zastosowań mikroskopii pojedynczej cząsteczki FRET TIRF. Połączenie tych technik umożliwia precyzyjną wizualizację i analizę dynamiki RNA na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Fluorescencyjne znakowanie końcowe i enkapsulacja długich RNA w mikroskopii jednocząsteczkowej FRET-TIRF

Ten protokół opisuje szybką i bardzo czułą kwantyfikację danych z sensora rezonansu rezonansu (FRET) za pomocą przenośnego analizatora FRET wykonanego na zamówienie. Urządzenie zostało wykorzystane do wykrywania maltozy w krytycznym zakresie temperatur, który maksymalizuje czułość wykrywania, umożliwiając praktyczną i efektywną ocenę zawartości cukru.

Bardzo czuła i szybka detekcja fluorescencji za pomocą przenośnego analizatora FRET

Adsorpcja peptydów na plastikowych naczyniach podczas tradycyjnych seryjnych rozcieńczeń na bazie końcówek może znacząco wpłynąć na określenie siły działania i zakłócić zrozumienie zależności struktura-aktywność używanych do identyfikacji ołowiu i optymalizacji ołowiu w fazach odkrywania leków. W tym miejscu opisano metody automatycznego akustycznego bezkontaktowego seryjnego rozcieńczania próbek peptydów.

Zautomatyzowane dozowanie akustyczne do seryjnego rozcieńczania agonistów peptydów w testach oznaczania siły działania

Opisujemy protokół do identyfikacji białek wiążących RNA i mapowania ich regionów wiążących RNA w żywych komórkach za pomocą fotosieciowania za pośrednictwem UV i spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do identyfikacji regionów wiążących RNA w oparciu o spektrometrię mas

Poznaj metodę szybkiego znakowania RNA za pomocą 4-tiouracylu w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Protokół umożliwia analizę nowo syntetyzowanego RNA z minimalnym tłem w eksperymentach typu pulse-chase.

Niezwykle szybkie i swoiste znakowanie metaboliczne RNA in vivo za pomocą 4-tiouracylu (Ers4tU)

Przeglądaj więcej filmów