Wykorzystanie zamrożonej tkanki w teście komety do oceny uszkodzeń DNA

Protokół ten jest istotny, ponieważ zastosowanie zamrożonej tkanki upraszcza logistykę podczas oceny wielu tkanek, umożliwia transfer próbki do zdalnego laboratorium w celu analizy i umożliwia odroczenie decyzji o analizie tkanki o miesiące. Główną zaletą tej techniki jest to, że użycie zamrożonej tkanki sześciennej nie wymaga personelu przeszkolonego w teście kometarnym podczas sekcji zwłok i minimalizuje możliwość wystąpienia błędów technicznych i mechanicznych uszkodzeń DNA powstałych podczas manipulacji próbką. Technika ta ma zastosowanie w przedklinicznym opracowywaniu leków, ocenie bezpieczeństwa chemikaliów przedostających się do środowiska oraz dodatkach do żywności.

Zamrożone tkanki mogą być wykorzystane w teście komet do oceny potencjału genotoksycznego, naprawy DNA, działania ochronnego przed uszkodzeniem DNA wywołanym przez chemioterapię lub promieniowanie oraz do biomonitoringu środowiska. Idealnie byłoby, gdyby doświadczenia były tak zaprojektowane, aby umożliwić przetworzenie każdej próbki tkanki do etapu zamrażania, zanim narządy pobrane od następnego zwierzęcia staną się dostępne do przetworzenia. Zamrożone tkanki mogą być wykorzystane w teście kometarnym w celu oceny potencjału genotoksycznego, naprawy DNA, działania ochronnego przed uszkodzeniem DNA wywołanym przez chemioterapię lub promieniowanie oraz do biomonitoringu środowiska.

Trenerka techniczna Carole Bobbitt i kierowniczka laboratorium toksykologii śledczej Eileen Gilas będą dziś pełnić rolę prosektorów. Pracownik naukowy Lincoln Martin i technik histologii Amelie Ladesseur zademonstrują obchodzenie się z próbką. Aby rozpocząć tę procedurę, usuń wszelkie przyczepione tkanki łączące, narządy i zanieczyszczenia z narządu będącego przedmiotem zainteresowania.

Natychmiast energicznie przetrząśnij narząd w średniej wielkości łodzi wagowej zawierającej około siedmiu mililitrów zimnego, świeżo przygotowanego roztworu do mielenia mięsa, aby usunąć resztki krwi i gruzu. Przenieść narząd do innej czystej łodzi wagowej zawierającej wystarczającą ilość zimnego roztworu do mielenia, aby utrzymać tkankę zanurzoną i utrzymać ją na lodzie do czasu dalszego przetwarzania. W przypadku wątroby przeciąć pięciomilimetrowy podłużny odcinek lewego płata i delikatnie wsypać około siedmiu mililitrów zimnego roztworu do mielenia.

Następnie umieść pasek tkanki w czystej, średniej wielkości łodzi wagowej zawierającej około siedmiu mililitrów zimnego roztworu do mielenia mięsa i trzymaj na lodzie, aż będzie gotowy do dalszego przetwarzania. Usuń fragment wątroby i umieść go w kasecie do zatapiania. Wykonaj mocowanie, przycinanie i osadzanie parafiny zgodnie ze standardowymi procedurami laboratoryjnymi w celu ewentualnej przyszłej oceny histopatologicznej.

W przypadku dwunastnicy wytnij 10-milimetrową część dwunastnicy proksymalnie do żołądka. Włóż igłę o rozmiarze od 21 do 25 do jednego końca dwunastnicy i przepłucz ją jednym mililitrem zimnego roztworu do mielenia, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia i bakterie. Odwróć dwunastnicę, przepłucz ją ponownie kolejnym mililitrem roztworu do mielenia mięsa i wyrzuć igłę.

Rozetnij dwunastnicę i opłucz ją w około siedmiu mililitrach roztworu do mielenia. Następnie ponownie opłucz dwunastnicę i trzymaj ją w roztworze do mielenia na lodzie, aż będzie gotowa do dalszego przetwarzania. Wyciąć i utrwalić część pozostałej dwunastnicy w celu ewentualnej przyszłej oceny histopatologicznej, jak opisano wcześniej dla wątroby.

W przypadku mózgu przydatne może być najpierw podzielenie mózgu na dwie półkule, z których jedna jest zachowana na wypadek ewentualnej histopatologii. Wypreparuj interesujące Cię obszary mózgu, a następnie delikatnie je opłucz i trzymaj na lodzie w roztworze do mielenia, aż będą gotowe do dalszego przetwarzania, jak opisano wcześniej dla wątroby i dwunastnicy. W przypadku żołądka usuń i wyrzuć przedni żołądek.

Rozetnij żołądek gruczołowy i umyj go z jedzenia, wrzucając go do średniej wielkości łodzi ważącej zawierającej około siedmiu mililitrów zimnego buforu do mielenia. Usunąć pięciomilimetrowy pasek gruczołowego żołądka proksymalnie do dwunastnicy w celu unieruchomienia w celu ewentualnej oceny histopatologicznej, jak opisano wcześniej. Umieść pozostały żołądek w średniej wielkości łodzi wagowej zawierającej około siedmiu mililitrów zimnego buforu do mielenia mięsa i inkubuj na lodzie przez 15 do 30 minut.

Następnie przenieś żołądek na czysty kawałek parafiny i użyj ostrza skalpela lub plastikowego skrobaka do komórek, aby delikatnie zeskrobać nabłonek powierzchni co najmniej dwa razy, aby usunąć zanieczyszczenia. Podnieś błonę śluzową żołądka kleszczami i za pomocą pipety przepłucz ją jednym mililitrem zimnego buforu do mielenia. Przenieś opłukaną tkankę żołądka na czystą powierzchnię lub naczynie i dodaj zimny roztwór do mielenia.

Użyj tylnej części ostrza skalpela lub plastikowego skrobaka do komórek, aby ostrożnie zeskrobać nabłonek żołądka cztery do pięciu razy, aby uwolnić komórki. Następnie za pomocą pipety zebrać roztwór do mielenia mięsa zawierający uwolnione komórki i przenieść go do probówki mikrowirówkowej na lodzie. W przypadku mielenia próbek tkanek należy wyciąć fragment wątroby, mózgu lub dwunastnicy i przenieść go do oznakowanej probówki mikrowirówkowej zawierającej jeden mililitr zimnego roztworu do mielenia.

Użyj nożyczek do mielenia mięsa, aby szybko zmielić próbkę, aż zostanie ostatecznie zdyspergowana, upewniając się, że próbka pozostaje zimna. Próbka powinna wyglądać na lekko mętną. Jednak często zdarza się, że niektóre kawałki pozostają, które osiądą na dnie rurki.

Aby użyć chusteczki w stanie świeżym, probówki zawierające próbki należy przechowywać na lodzie. Aby zamrozić próbki tkanek, należy zabezpieczyć pokrywę probówki natychmiast po mieleniu lub pobraniu i wrzucić probówkę do kolby Dewara zawierającej ciekły azot. Po zakończeniu pobierania tkanek użyj chochli, aby pobrać probówki z próbkami i umieść je na suchym lodzie w celu posortowania.

Przenieś probówki do zamrażarki na suchym lodzie i przechowuj pudełko w zamrażarce w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby przygotować zamrożone kostki tkanki, pokrój kilka małych kawałków tkanki i pojedynczo wrzuć je bezpośrednio do średniej wielkości łodzi wagowej lub innego odpowiedniego naczynia zawierającego ciekły azot na kilka sekund. Po całkowitym zamrożeniu kawałków przenieś zamrożone kostki tkanek pojedynczo do oznakowanych probówek do mikrowirówek lub krioprobówek na suchym lodzie.

Po zakończeniu pobierania tkanek przenieś probówki do zamrażarki na suchym lodzie i przechowuj pudełko w zamrażarce w temperaturze minus 800 stopni Celsjusza. Używając świeżo zmielonej lub zeskrobanej tkanki utrzymywanej na mokrym lodzie, przygotuj zjeżdżalnie komety w ciągu godziny od zbioru. W przypadku stosowania zamrożonej tkanki mielonej lub zeskrobanej, probówki z zamrożoną tkanką należy umieścić w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej, aż próbki zostaną całkowicie rozmrożone, upewniając się, że są utrzymywane w niskiej temperaturze.

Po rozmrożeniu próbek natychmiast przenieś probówki na lód. W przypadku tkanek pokrojonych w kostkę wyjmij probówki zawierające kostki z zamrażarki i trzymaj na suchym lodzie do czasu przygotowania szkiełek. Porcję jednego mililitra pożywki handlowej lub roztworu do mielenia mięsa do oznaczonej 1,7 mililitrowej probówki mikrowirówkowej dla każdej próbki i utrzymywać na lodzie.

Pracując szybko, aby uniknąć rozmrażania, umieść kostkę tkanki w otwartym końcu urządzenia do mielenia tkanek w temperaturze pokojowej. Szybko włóż tłok strzykawki o dopasowanym rozmiarze do urządzenia, aby wepchnąć tkankę do końca siatki, który następnie należy umieścić w probówce mikrowirówki zawierającej zimny roztwór do mielenia mięsa. Zanurz siatkowy koniec urządzenia na około pięć do 10 sekund w zimnym roztworze do mielenia mięsa, aby tkanka mogła się całkowicie rozmrozić.

Całkowicie wciśnij tłok, aż zobaczysz, że komórki wystają przez pory siatki. Następnie pociągnij tłok do góry o około 2,5 centymetra i ponownie całkowicie dociśnij. Powtórz kilka razy, aż roztwór do mielenia stanie się mętny.

Aby przygotować szkiełka, delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową i przenieś 50 mikrolitrów do probówki zawierającej 450 mikrolitrów 0,5% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przygotuj i oceń slajdy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W pierwszym badaniu wątrobę pobrano z dwóch kohort samców szczurów kontrolnych Sprague Dawley w odstępie jednego tygodnia.

Preparaty przygotowywano ze świeżo zmielonej tkanki, zamrożonej tkanki mielonej i zamrożonej tkanki pokrojonej w kostkę. Ponieważ zalecana przez OECD górna granica procentowego DNA z ogona w świeżej wątrobie szczura wynosi 6%, wyniki te pokazują, że każda z metod zamrażania może być skuteczna w ocenie tkanki. Ogólnie rzecz biorąc, odsetek jeży był równoległy do procentowego DNA ogona, chociaż zamrożone tkanki wykazywały większą zmienność.

W drugim badaniu samicom myszy B6C3F1 podawano nośnik lub mutagenny metanosulfonian etylu. Wyniki procentowego DNA ogona wskazują, że tkanka wątroby zamrożona w postaci sześcianów, a następnie przetworzona za pomocą urządzenia do mielenia tkanek, dała wyniki bardzo podobne do tych uzyskanych dla świeżo zmielonej tkanki. Statystycznie istotny wzrost uszkodzeń DNA wywołanych przez EMS zmierzono w próbkach tkanek przetworzonych wszystkimi trzema metodami.

W trzecim badaniu analizowano próbki wątroby pobrane od samic myszy B6C3F1 w 90-dniowym badaniu toksyczności chemicznej. Uszkodzenia DNA w zamrożonej tkance mielonej były wysokie we wszystkich grupach dawkowania, przy znacznej zmienności między zwierzętami. Procentowe wyniki DNA ogona korelowały z procentem jeży, co wskazuje, że jeże znacząco przyczyniły się do wysokiego poziomu uszkodzeń DNA, które zaobserwowano w tych próbkach.

W przeciwieństwie do tego, zarówno uszkodzone DNA, jak i procentowe jeże były bardzo niskie w błyskawicznie zamrożonej tkance sześciennej, która została przygotowana równolegle z próbkami tkanek mielonych. Tak więc wysoce uszkodzone komórki objawiające się jako jeże w próbkach tkanek mielonych wyraźnie nie były wynikiem procesu biologicznego, ale prawdopodobnie zostały wprowadzone przez mechaniczne zakłócenie i/lub rozgrzanie tkanki podczas procedury mielenia przed błyskawicznym zamrożeniem. W związku z tym dane dotyczące tkanki mielonej uznano za niewiarygodne.

Dla porównania, wysokiej jakości dane uzyskano z zamrożonej tkanki w kształcie kostki, nawet po długotrwałym przechowywaniu. Bardzo ważne jest, aby pobrane tkanki były zimne i wilgotne, a także aby szybko pracować nad zamrożeniem próbek. Ponadto zamrożoną tkankę kostki należy rozmrozić bezpośrednio przed etapem homogenizacji.

Zamrożone próbki tkanek nadają się do innych zastosowań, w tym na przykład do modyfikacji testu komety w celu wykrycia uszkodzeń oksydacyjnych lub sieciowania oraz oceny zmian w ekspresji genów. Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z ostrzami skalpela w celu cięcia lub zeskrobywania tkanek oraz podczas obchodzenia się z ciekłym azotem podczas procesu zamrażania.