Name: Wykorzystanie zamrożonej tkanki w teście komety do oceny uszkodzeń DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Poznaj przygotowanie zamrożonych próbek tkanek do testu komety w ocenie uszkodzeń DNA. Technika miniaturyzacji i kostkowania zmniejsza błędy mechaniczne i umożliwia elastyczną analizę genotoksyczności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni Lincolnowi Martinowi i Kelley Owens za fachową pomoc techniczną w przygotowaniu i ocenie slajdów komet oraz dr Carol Swartz za przeprowadzenie analiz statystycznych. Autorzy doceniają również wspierający wkład członków programów Toksykologii Genetycznej, Toksykologii Śledczej i Sekcji Zwłok w ILS.

Tkanki zostały pobrane podczas przeprowadzania badań przeprowadzonych w obiektach akredytowanych przez AAALAC w laboratoriach kontraktowych NTP zgodnie z przepisami Dobrej Praktyki Laboratoryjnej (21 CFR Part 58) i protokołami użytkowania zwierząt zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w każdym laboratorium.
1. Pobieranie i przetwarzanie tkanek
UWAGA: Warto przygotować duplikaty probówek z próbkami (np. wątroba) lub przenieść około połowy próbki do innej probówki (np. dwunastnicy, żołądka), aby umożliwić ponowną analizę, jeśli to konieczne. Aby zminimalizować potencjalną zmienność między próbkami dla tkanek przewodu pokarmowego, zaleca się ostrożność w pobieraniu próbek z tego samego obszaru tkanki względem żołądka dla każdego zwierzęcia i podzielenie próbki w celu wygenerowania zduplikowanych próbek. Kleszcze plastikowe są zalecane do przenoszenia lepkich tkanek, takich jak mózg. Opcjonalnie, rozdrobnione, zeskrobane lub homogenizowane preparaty tkankowe mogą być filtrowane w celu uzyskania jednorodnych zawiesin jednokomórkowych za pomocą sitka o wielkości 40 μm przymocowanego do stożkowej rurki.
<ol>
	<li>Usuń wszelkie przyczepione tkanki łączące, narządy i zanieczyszczenia z narządów będących przedmiotem zainteresowania. Natychmiast po usunięciu energicznie przetrzyj narząd w średniej wielkości łodzi wagowej zawierającej ~ 7 ml zimnego, świeżo przygotowanego roztworu do mielenia mięsa (Mg++, Ca ++ i fenol bez czerwieni fenolu Zbilansowany roztwór soli Hanka, 10% v/v DMSO i 20 mM EDTA pH 7,5) w celu usunięcia resztek krwi i zanieczyszczeń.</li>
	<li>Przenieś każdy narząd do innej czystej łodzi wagowej zawierającej wystarczającą ilość (~ 7 ml) zimnego roztworu do mielenia, aby utrzymać tkankę zanurzoną w lodzie do czasu dalszego przetwarzania.</li>
	<li>Usuń fragment każdego interesującego go narządu i umieść go w kasecie do osadzania. Utrwal w 10% neutralnej buforowanej formalinie, ścinku i parafinie zgodnie ze standardowymi procedurami laboratorium w celu ewentualnej przyszłej oceny histopatologicznej.</li>
	<li>W przypadku wątroby odetnij 5 mm podłużny odcinek lewego płata i delikatnie przetrzyj ~ 7 ml zimnego roztworu do mielenia. Umieść pasek tkanki w czystej, średniej wielkości łodzi wagowej zawierającej ~ 7 ml zimnego roztworu do mielenia mięsa i trzymaj na lodzie, aż będzie gotowy do dalszego przetwarzania (krok 1.8 lub 1.11).</li>
	<li>W przypadku dwunastnicy należy wyciąć 10 mm część dwunastnicy proksymalnie do żołądka. Za pomocą igły 21–25 G spłucz w celu usunięcia zanieczyszczeń i bakterii. 
	<ol>
		<li>Włóż igłę do jednego końca dwunastnicy i przepłucz 1 ml zimnego roztworu do mielenia mięsa.</li>
		<li>Przepłucz w przeciwnym kierunku, odwracając dwunastnicę i powtarzając z kolejnym 1 ml roztworu do mielenia. Wyrzucić igłę.</li>
		<li>Rozetnij dwunastnicę i opłucz ją w ~ 7 ml roztworu do mielenia mięsa przed włożeniem do średniej wielkości łodzi wagowej zawierającej ~ 7 ml czystego roztworu do mielenia mięsa; trzymaj na lodzie, aż będzie gotowa do dalszego przetwarzania (krok 1.8 lub 1.11).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku mózgu przydatne może być najpierw podzielenie mózgu na dwie półkule; jedną z nich można zachować na potrzeby ewentualnej histopatologii (patrz krok 1.2).
	<ol>
		<li>Wypreparuj obszar (y) mózgu i delikatnie przemyj ~ 7 ml zimnego roztworu do mielenia.</li>
		<li>Przenieś tkankę (tkanki) do czystej, średniej wielkości łodzi wagowej zawierającej ~ 7 ml zimnego roztworu do mielenia mięsa i trzymaj na lodzie, aż będą gotowe do dalszego przetwarzania (krok 1.8 lub 1.11; należy pamiętać, że małe obszary, takie jak móżdżek i hipokamp, mogą nie wymagać dalszego przycinania).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Na żołądek
	<ol>
		<li>Usuń i wyrzuć przedni żołądek. Rozetnij żołądek gruczołowy i umyj go z jedzenia za pomocą ~ 7 ml zimnego buforu do mielenia mięsa w średniej wielkości łodzi do ważenia.</li>
		<li>Usunąć 5-milimetrowy pasek gruczołowego żołądka proksymalnie do dwunastnicy w celu ustabilizowania w celu ewentualnej oceny histopatologicznej (patrz krok 1.2).</li>
		<li>Umieść pozostały żołądek w ~ 7 ml zimnego buforu do mielenia mięsa w średniej wielkości łodzi wagowej i inkubuj na lodzie przez 15–30 min. 
		nuta: Ten etap inkubacji może nie być konieczny; ten krok został uwzględniony w protokole walidacji JaCVAM, ale nie jest wymieniony w wytycznych OECD dotyczących testów8,9.</li>
		<li>Przenieś żołądek do czystego kawałka parafiny (lub szalki Petriego lub łodzi wagowej) i delikatnie zeskrob nabłonek powierzchniowy dwa lub więcej razy za pomocą ostrza skalpela lub skrobaka z politetrafluoroetenu (PTFE) w celu usunięcia zanieczyszczeń. Zebrać błonę śluzową żołądka za pomocą kleszczy i spłukać 1 ml zimnego buforu do mielenia za pomocą pipety. Przenieś tkankę żołądka na czystą powierzchnię lub naczynie.</li>
		<li>Ostrożnie zeskrob nabłonek żołądka 4-5 razy (więcej, jeśli to konieczne) w roztworze do mielenia (zwykle 250 μl / mysz lub 500-1,000 μl / szczur) grzbietem ostrza skalpela lub skrobaka PTFE, aby uwolnić komórki. Opcjonalnie spłucz tkankę mniej więcej równą objętością roztworu do mielenia, aby odzyskać więcej komórek. Zebrać roztwór do mielenia mięsa zawierający uwolnione komórki za pomocą pipety i przenieść do probówki do mikrowirówki na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku mielenia próbek tkanek należy wyciąć 3–4 mm odcinek wątroby lub tkanki mózgowej lub ~5 mm dwunastnicy i przenieść do oznakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 lub 2,0 ml zawierającej 1 ml zimnego roztworu do mielenia mięsa. Szybko zmielić (≤30 s) nożyczkami do mielenia mięsa, aż do drobnego rozproszenia, utrzymując próbkę w niskiej temperaturze. Próbka powinna wyglądać na lekko mętną; Jednak często zdarza się, że niektóre kawałki pozostają, które osiądą na dnie rurki.</li>
	<li>Aby użyć świeżej tkanki, utrzymuj probówki zawierające tkankę mieloną lub zeskrobane komórki nabłonkowe na lodzie; użyj tkanki do przygotowania szkiełka kometarnego w ciągu około 1 godziny od pobrania (opisanego w sekcji 2).</li>
	<li>Do zamrażania próbek tkanek, bezpośrednio po rozdrobnieniu lub pobraniu zeskrobanych komórek nabłonka
	<ol>
		<li>Zabezpieczyć pokrywę probówki i wrzucić probówkę do kolby Dewara zawierającej ciekły azot; probówki mogą być utrzymywane w ciekłym azocie przez czas sekcji zwłok (≤3 godziny).</li>
		<li>Wyjmij probówki za pomocą chochli i umieść na suchym lodzie w celu posortowania. Przenieś probówki do zamrażarki na suchym lodzie i przechowuj w zamrażarce o temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby przygotować zamrożone kostki tkanki, pokrój kilka małych kawałków tkanki (≤4 mm średnicy i ~6 mm długości; <silna klasa="xfig">Rysunek 1).
	<ol>
		<li>Pojedynczo wrzuć je bezpośrednio do średniej wielkości łodzi wagowej lub innego odpowiedniego naczynia zawierającego ciekły azot.</li>
		<li>Odczekaj kilka sekund, aż kawałki całkowicie zamarzną i przenieś pojedyncze zamrożone kostki tkanki do oznakowanej probówki do mikrowirówki lub krioprobówki utrzymywanej na suchym lodzie; nie pozwól, aby kawałki zlepiły się ze sobą podczas procesu zamrażania.</li>
		<li>Przenieś probówki do zamrażarki na suchym lodzie i przechowuj w zamrażarce o temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie slajdów
<ol>
	<li>Do tkanek mielonych/zeskrobanych
	<ol>
		<li>Probówki zawierające świeże chusteczki należy przechowywać na mokrym lodzie.</li>
		<li>Umieść probówki z zamrożoną tkanką w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej, aż próbki zostaną całkowicie rozmrożone, upewniając się, że są utrzymywane w niskiej temperaturze. Natychmiast przenieś probówki na lód.</li>
		<li>Bezpośrednio przed pobraniem komórek w celu przeniesienia do agarozy (krok 2.3) należy delikatnie wymieszać zawiesinę każdej komórki; w przypadku próbek niefiltrowanych pozostawić duże kawałki na dnie probówki. Utrzymuj wszystkie probówki na lodzie do momentu, gdy zostaną przygotowane szkiełka dla wszystkich próbek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do tkanek ułożonych w kostkę
	<ol>
		<li>Wyjąć probówki zawierające kostki tkanek z zamrażarki o temperaturze 80 °C i przechowywać na suchym lodzie do czasu przygotowania szkiełek.</li>
		<li>Porcję 1 ml pożywki Merchanta (0,14 M NaCl, 1,47 mM KH2PO4, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4, 10 mM NaEDTA, pH 7,4) lub roztworu do mielenia do oznakowanej 1,7 ml probówki mikrowirówkowej dla każdej próbki i przechowywać na lodzie.</li>
		<li>Pracując szybko, aby uniknąć rozmrażania tkanek, umieść kostkę tkanki w otwartym końcu urządzenia do mielenia tkanek o temperaturze pokojowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). Można użyć wielu fragmentów tkanki; W razie potrzeby zamrożoną tkankę można pociąć lub rozbić na mniejsze kawałki za pomocą zimnego moździerza i tłuczka, aby zmniejszyć rozmiar kostki, aby zmieściła się w urządzeniu.</li>
		<li>Szybko włóż dopasowany do rozmiaru tłok strzykawki do urządzenia, aby wepchnąć tkankę do końca siatki, który następnie należy umieścić w probówce mikrowirówki zawierającej zimny roztwór do mielenia; unikaj zmuszania płynu do przelania się przez rurkę. Zanurz siatkowy koniec urządzenia na około 5-10 s w zimnym roztworze do mielenia, aby umożliwić całkowite rozmrożenie tkanki.</li>
		<li>Całkowicie wciśnij tłok, aż zobaczysz, że komórki wystają przez pory siatki. Następnie pociągnąć tłok do góry o około 2,5 cm i ponownie całkowicie wcisnąć; Powtórz ten proces kilka razy, aż roztwór do mielenia stanie się mętny.</li>
		<li>W razie potrzeby próbkę można zagęścić w celu zwiększenia gęstości komórek poprzez wirowanie z chłodzeniem przez 5 minut przy 1100 obr./min i usunięcie części supernatantu.</li>
		<li>Powtórzyć ten proces dla wszystkich próbek, używając czystego urządzenia do mielenia tkanek dla każdej próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść 50 μl zawiesiny komórek do probówki zawierającej 450 μl 0,5% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w temperaturze 37 °C. 
	nuta: Objętość można regulować, ale ilość agarozy powinna wynosić ≤1%.</li>
	<li>Przygotuj i oceń slajdy zgodnie z wcześniejszym opisem10,11.</li>
</ol>

<ol><li>van der Leede, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+and+data+interpretation+of+the+in+vivo+comet+assay+in+pharmaceutical+industry%3A+EFPIA+survey+results%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).</li>
<li>ICH. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+Conference+on+Harmonisation+of+Technical+Requirements+for+Registration+of+Pharmaceuticals+for+Human+Use+%28ICH%29+S2%28R1%29%3A+Guidance+on+Genotoxicity+Testing+and+Data+Interpretation+for+Pharmaceuticals+Intended+for+Human+Use%5BTitle%5D)+AND+%22ICH%22%5BJournal%5D)">International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) S2(R1): Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use.</a> ICH. , (2012).</li>
<li>EFSA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scientific+opinion+on+genotoxicity+testing+strategies+applicable+to+food+and+feed+safety+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22EFSA+Journal%22%5BJournal%5D)">Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment.</a> EFSA Journal. 9 (9), 2379(2011).</li>
<li>Lorenzo, Y., Costa, S., Collins, A. R., Azqueta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%2C+DNA+damage%2C+DNA+repair+and+cytotoxicity%3A+hedgehogs+are+not+always+dead%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead.</a> Mutagenesis. 28 (4), 427-432 (2013).</li>
<li>Guerard, M., Marchand, C., Plappert-Helbig, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+experimental+conditions+on+data+variability+in+the+liver+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Influence of experimental conditions on data variability in the liver comet assay.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (2), 114-121 (2014).</li>
<li>Jackson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+freezing+tissues+and+cells+for+analysis+of+DNA+strand+break+levels+by+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Validation of freezing tissues and cells for analysis of DNA strand break levels by comet assay.</a> Mutagenesis. 28 (6), 699-707 (2013).</li>
<li>Recio, L., Kissling, G. E., Hobbs, C. A., Witt, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Comet+assay+dose-response+for+ethyl+methanesulfonate+using+freshly+prepared+versus+cryopreserved+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (2), 101-113 (2012).</li>
<li>Uno, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JaCVAM-organized+international+validation+study+of+the+in+vivo+rodent+alkaline+comet+assay+for+detection+of+genotoxic+carcinogens%3A+II.+Summary+of+definitive+validation+study+results%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">JaCVAM-organized international validation study of the in vivo rodent alkaline comet assay for detection of genotoxic carcinogens: II. Summary of definitive validation study results.</a> Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 45-76 (2015).</li>
<li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OECD+Guideline+for+the+Testing+of+Chemicals%3A+In+Vivo+Mammalian+Alkaline+Comet+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22OECD%22%5BJournal%5D)">OECD Guideline for the Testing of Chemicals: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay.</a> OECD. 489, (2016).</li>
<li>Hobbs, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet+assay+evaluation+of+six+chemicals+of+known+genotoxic+potential+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Comet assay evaluation of six chemicals of known genotoxic potential in rats.</a> Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 172-181 (2015).</li>
<li>Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Alkaline+Comet+Assay+and+Enzyme-modified+Alkaline+Comet+Assay+for+Measuring+DNA+Strand+Breaks+and+Oxidative+DNA+Damage+in+Rat+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), 53833(2016).</li>
<li>Hobbs, C. A., Chhabra, R. S., Recio, L., Streicker, M., Witt, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxicity+of+styrene-acrylonitrile+trimer+in+brain%2C+liver%2C+and+blood+cells+of+weanling+F344+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Genotoxicity of styrene-acrylonitrile trimer in brain, liver, and blood cells of weanling F344 rats.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (3), 227-238 (2012).</li>
<li>Hobbs, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+evaluation+of+the+flavonol+anti-oxidants%2C+alpha-glycosyl+isoquercitrin+and+isoquercitrin%2C+for+genotoxic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive evaluation of the flavonol anti-oxidants, alpha-glycosyl isoquercitrin and isoquercitrin, for genotoxic potential.</a> Food and Chemical Toxicology. 113, 218-227 (2018).</li>
<li>Pant, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vehicle+and+positive+control+values+from+the+in+vivo+rodent+comet+assay+and+biomonitoring+studies+using+human+lymphocytes%3A+historical+database+and+influence+of+technical+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Vehicle and positive control values from the in vivo rodent comet assay and biomonitoring studies using human lymphocytes: historical database and influence of technical aspects.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 633-642 (2014).</li>
</ol>

Prace te były wspierane przez Intramural Research Program NIH, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) w ramach umowy HHSN273201300009C; jednak zawarte w nich oświadczenia, opinie lub wnioski niekoniecznie reprezentują oświadczenia, opinie lub wnioski NIEHS, NIH lub rządu Stanów Zjednoczonych.

Jak wykazano wcześniej 7,12,13, prawidłowo zamrożona tkanka mielona zapewnia dobre wyniki w teście komet. W rzeczywistości wyjściowe wartości % ogonowego DNA dla mrożonej mielonej wątroby szczura i myszy przygotowanej w naszym laboratorium wynoszą zazwyczaj ≤6%, zgodnie z zaleceniami wytycznej OECD dotyczącej badań9 dla świeżo rozdrobnionych próbek wątroby szczura. Dobre wyniki uzyskano w wielu laboratori...

Test kometarny jest coraz częściej używany jako metoda oceny uszkodzeń DNA w hodowanych komórkach i tkankach narażonych na działanie substancji chemicznych lub innych stresorów środowiskowych1. Test może wykryć pęknięcia podwójnej i pojedynczej nici DNA, zmiany alkaliczno-labilne oraz pęknięcia pojedynczej nici związane z niepełną naprawą DNA. Wytyczne Międzynarodowej Rady ds. Harmonizacji Wymagań Technicznych dla Produktów Leczniczych Stosowanych u Ludzi (ICH) dotyczące badań farmaceutycznych zalecają test pękania nici DNA, taki jak test kometowy, jako drugi test uzupełniający test mikrojądrowy erytrocytów gryzoni do oceny genotoksyczności in vivo oraz jako test uzupełniający do oceny sposobu działania indukcji nowotworu w narządach docelowych2. Europejski Urząd ds. Bezpieczeństwa Żywności (EFSA) zaleca test komet in vivo jako odpowiedni test uzupełniający w celu zbadania znaczenia pozytywnego wyniku w teście genotoksyczności in vitro3. W 2014 r. zatwierdzono wytyczne OECD dotyczące badań na gryzoniach kometowych, zwiększając tym samym dopuszczalność testu do stosowania w regulacyjnych badaniach potencjału genotoksycznego. Test opiera się na elektroforetycznym rozdzielaniu zrelaksowanych pętli i fragmentów DNA, które migrują z nukleoidów lizowanych komórek. Zasadniczo pojedyncze komórki są osadzone w agarozie, która została nałożona na szkiełka mikroskopowe. Szkiełka są następnie zanurzane w buforze do lizy, a następnie w roztworze alkalicznym (pH > 13), który pozwala ciasno zwiniętemu jądrowemu DNA na rozluźnienie i odwijanie. Szkiełka są następnie umieszczane w polu elektrycznym, które stymuluje migrację ujemnie naładowanego DNA w kierunku anody, tworząc obrazy przypominające komety; względna ilość DNA w warkoczu komety w porównaniu z głową komety jest wprost proporcjonalna do stopnia uszkodzenia DNA; Zawartość DNA w ogonie jest zwykle określana ilościowo za pomocą oprogramowania do obrazowania cyfrowego.
Ponieważ test kometarny wykrywa fragmentaryczne DNA, dokładna kwantyfikacja uszkodzeń DNA wywołanych ekspozycją może być zakłócona przez fragmentację chromatyny związaną z nekrozą lub apoptozą, wynikającą z cytotoksyczności lub stresu wywołanego leczeniem. Ponadto uszkodzenie DNA może wystąpić w wyniku mechanicznego ścinania lub niewłaściwej obróbki próbki4. Znaczenie utrzymania pobranej tkanki w stanie schłodzonym przed przygotowaniem preparatu w celu zminimalizowania wyjściowego poziomu uszkodzenia DNA zostało już wcześniej wykazane5,6. Wiele laboratoriów przygotowuje preparaty do oznaczania komet ze świeżych tkanek; Może to być jednak logistycznie trudne w przypadku przygotowywania preparatów z wielu typów tkanek na zwierzę w badaniu z dużą liczbą zwierząt. Co więcej, stanowi to problem, gdy przygotowanie i analiza preparatów ma odbywać się w odległym laboratorium, co wymaga wysyłki próbek. Na przykład amerykański Narodowy Program Toksykologiczny włącza test kometa jako składnik swojego programu badań toksykologicznych genetycznych (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html), a czasami włącza test do 28 lub 90-dniowych badań toksyczności dawki powtórzonej; Wymaga to pobrania tkanek przez laboratorium w trakcie eksploatacji i przeniesienia próbek do innego laboratorium w celu analizy. Aby to osiągnąć, kawałki tkanek są mielone i/lub komórki nabłonkowe przewodu pokarmowego są zeskrobywane, a zawiesiny komórkowe są błyskawicznie zamrażane i przechowywane w zamrażarce w celu późniejszej wysyłki i przechowywania przez laboratorium odbiorcze do czasu analizy7. Właściwe obchodzenie się z próbkami ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości danych z wykorzystaniem zamrożonych tkanek; Jednak powtarzalna manipulacja próbkami tkanek podczas sekcji zwłok przeprowadzanych przez ciągle zmieniający się personel jest trudna do kontrolowania, zwłaszcza w laboratoriach, które nie pobierają rutynowo tkanek do testu komety. Szkolenie odświeżające dla personelu przeprowadzającego sekcję zwłok lub korzystanie z mobilnej jednostki obsługiwanej przez doświadczony personel laboratoryjny do pobierania świeżych lub mrożonych próbek tkanek jest często zbyt kosztowne, niewykonalne lub po prostu niedoceniane.
Aby lepiej zapewnić spójne generowanie wysokiej jakości próbek tkanek do transferu do odległego miejsca w celu analizy testów komet, zbadano użyteczność opublikowanej metody6 konserwacji tkanek z błyskawicznie zamrożonych kostek tkanki. W tej metodzie zamrożone kostki tkanki są ładowane do urządzenia do mielenia tkanek ze stali nierdzewnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), które jest umieszczane w probówce mikrowirówki zawierającej zimny bufor. Kostka tkanki jest następnie przepychana przez siatkę o małej grubości na końcu urządzenia. Wielokrotne przetłaczanie zawiesiny tkankowej przez sito siatkowe w obu kierunkach kilkakrotnie skutkuje stosunkowo jednolitą zawiesiną jednokomórkową. Próbki przygotowane tą metodą wypadły korzystnie pod względem jakości zarówno ze świeżymi, jak i mrożonymi próbkami tkanek przygotowanymi przez mielenie. Dodatkową korzyścią jest to, że w przeciwieństwie do próbek mielonych, kostki tkankowe mogą być przechowywane w stanie zamrożonym przez dłuższy czas i nadal dają wysokiej jakości wyniki w teście komet.

<table><tbody><tr><td>Cryovials</td><td>Corning Costar</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>Arkusze wosku dentystycznego</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>72670</td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyczki do preparowania (mielenia)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-953-1B</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanka</td><td>Gibco</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Teknova</td><td>P0315-10</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr> Rurki do mikrofuge o <tr><td>niskiej temperaturze topnienia Agarose</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td></td></tr><tr><td>(1,7 mL)</td><td>Corning</td><td>3207</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Na2 HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>Neutralnie buforowana formalina</td><td>Leica</td><td>600</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza skalpela</td> Tłok strzykawki <td>Miltex</td><td>4-110</td><td></td></tr><tr><td>(1 ml)</td><td>Fisher Scientific lub Vitality Medical</td><td>14-826-88; 8881901014</td><td>Strzykawka tuberkulinowa Becton Dickinson lub Monoject</td></tr><tr><td>Urządzenie do mielenia tkanek</td><td>NorGenoTech (Oslo, Norwegia)</td><td>Brak</td><td>Zaobserwowano niewielką zmienność średnicy, która może wpływać na szczelność tłoka.</td></tr><tr><td>Pęsety z tworzyw sztucznych</td><td>Wiatry handlowe Bezpośrednie</td><td>DF8088N</td><td>Wzmocniony nylon, niesterylny, końcówka, autoklawowalny; tradewindsdirect.com</td></tr><tr><td>Łodzie wagowe</td><td>Krackler Scientific/Heathrow Scientific</td><td>6290-14251B</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie zamrożonej tkanki w teście komety do oceny uszkodzeń dna

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

Test kometarny zyskuje na popularności jako metoda oceny uszkodzeń DNA w hodowanych komórkach i tkankach, szczególnie po ekspozycji na chemikalia lub inne stresory środowiskowe. Wykorzystanie testu komety w badaniach regulacyjnych potencjału genotoksycznego u gryzoni było możliwe dzięki przyjęciu w 2014 r. wytycznych Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwoju (OECD) dotyczących badań. Szkiełka testowe komety są zwykle przygotowywane ze świeżej tkanki w czasie sekcji zwłok; Jednak zamrażanie próbek tkanek pozwala uniknąć wyzwań logistycznych związanych z jednoczesnym przygotowywaniem preparatów z wielu narządów na zwierzę i z wielu zwierząt na badanie. Zamrażanie umożliwia również wysyłkę próbek z zakładu naświetlania do innego laboratorium w celu analizy, a przechowywanie zamrożonej tkanki ułatwia odroczenie decyzji o wygenerowaniu danych o uszkodzeniach DNA dla danego narządu. Alkaliczny test komet jest przydatny do wykrywania związanych z ekspozycją pęknięć podwójnej i pojedynczej nici DNA, zmian alkaliczno-labilnych oraz pęknięć nici związanych z niepełną naprawą wycięcia DNA. Jednak uszkodzenie DNA może również wynikać z mechanicznego ścinania lub niewłaściwych procedur przetwarzania próbki, co zakłóca wyniki testu. Powtarzalność w pobieraniu i przetwarzaniu próbek tkanek podczas sekcji zwłok może być trudna do kontrolowania ze względu na zmienny personel laboratoryjny o różnym poziomie doświadczenia w pobieraniu tkanek do testu komety. Zwiększenie spójności poprzez szkolenia odświeżające lub rozmieszczenie mobilnych jednostek obsadzonych doświadczonym personelem laboratoryjnym jest kosztowne i nie zawsze jest wykonalne. Aby zoptymalizować spójne generowanie wysokiej jakości próbek do analizy komet, oceniono metodę homogenizacji szybko zamrożonych kostek tkanek przy użyciu dostosowanego urządzenia do mielenia tkanek. Próbki przygotowane do testu komety tą metodą wypadały korzystnie w porównaniu ze świeżymi i mrożonymi próbkami tkanek przygotowanymi przez mielenie podczas sekcji zwłok. Co więcej, niskie wyjściowe uszkodzenia DNA mierzono w komórkach z zamrożonych kostek tkanki po długotrwałym przechowywaniu.

Badanie 1 
Wątrobę pobrano od dwóch kohort samców szczurów Sprague Dawley, którym przez 4 dni podawano olej kukurydziany, z zachowaniem tygodniowego odstępu między grupami. Preparaty wykonano z tkanek świeżo posiekanych, mrożonych posiekanych oraz mrożonych pociętych w kostkę i przetworzonych w medium Merchant’a lub roztworze do siekania przy użyciu urządzenia do siekania tkanek. Tkanki mrożone pobrane od zwierząt z pierwszej kohorty oceniano po przechowywaniu w zamrażarce przez ok. 3,5 miesiąca. Tkan...

Ten protokół opisuje kilka procedur przygotowania wysokiej jakości zamrożonych próbek tkanek podczas sekcji zwłok do użycia w teście kometarnym do oceny uszkodzeń DNA: 1) zmielona tkanka, 2) zeskrobane komórki nabłonkowe z przewodu pokarmowego, oraz 3) sześcienne próbki tkanek, wymagające homogenizacji za pomocą urządzenia do mielenia tkanek.

Wykorzystanie zamrożonej tkanki w teście komety do oceny uszkodzeń DNA

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ zastosowanie zamrożonej tkanki upraszcza logistykę podczas oceny wielu tkanek, umożliwia transfer próbki do zdalnego laboratorium w celu analizy i umożliwia odroczenie decyzji o analizie tkanki o miesiące. Główną zaletą tej techniki jest to, że użycie zamrożonej tkanki sześciennej nie wymaga personelu przeszkolonego w teście kometarnym podczas sekcji zwłok i minimalizuje możliwość wystąpienia błędów technicznych i mechanicznych uszkodzeń DNA powstałych podczas manipulacji próbką. Technika ta ma zastosowanie w przedklinicznym opracowywaniu leków, ocenie bezpieczeństwa chemikaliów przedostających się do środowiska oraz dodatkach do żywności.Zamrożone tkanki mogą być wykorzystane w teście komet do oceny potencjału genotoksycznego, naprawy DNA, działania ochronnego przed uszkodzeniem DNA wywołanym przez chemioterapię lub promieniowanie oraz do biomonitoringu środowiska. Idealnie byłoby, gdyby doświadczenia były tak zaprojektowane, aby umożliwić przetworzenie każdej próbki tkanki do etapu zamrażania, zanim narządy pobrane od następnego zwierzęcia staną się dostępne do przetworzenia. Zamrożone tkanki mogą być wykorzystane w teście kometarnym w celu oceny potencjału genotoksycznego, naprawy DNA, działania ochronnego przed uszkodzeniem DNA wywołanym przez chemioterapię lub promieniowanie oraz do biomonitoringu środowiska.Trenerka techniczna Carole Bobbitt i kierowniczka laboratorium toksykologii śledczej Eileen Gilas będą dziś pełnić rolę prosektorów. Pracownik naukowy Lincoln Martin i technik histologii Amelie Ladesseur zademonstrują obchodzenie się z próbką. Aby rozpocząć tę procedurę, usuń wszelkie przyczepione tkanki łączące, narządy i zanieczyszczenia z narządu będącego przedmiotem zainteresowania.Natychmiast energicznie przetrząśnij narząd w średniej wielkości łodzi wagowej zawierającej około siedmiu mililitrów zimnego, świeżo przygotowanego roztworu do mielenia mięsa, aby usunąć resztki krwi i gruzu. Przenieść narząd do innej czystej łodzi wagowej zawierającej wystarczającą ilość zimnego roztworu do mielenia, aby utrzymać tkankę zanurzoną i utrzymać ją na lodzie do czasu dalszego przetwarzania. W przypadku wątroby przeciąć pięciomilimetrowy podłużny odcinek lewego płata i delikatnie wsypać około siedmiu mililitrów zimnego roztworu do mielenia.Następnie umieść pasek tkanki w czystej, średniej wielkości łodzi wagowej zawierającej około siedmiu mililitrów zimnego roztworu do mielenia mięsa i trzymaj na lodzie, aż będzie gotowy do dalszego przetwarzania. Usuń fragment wątroby i umieść go w kasecie do zatapiania. Wykonaj mocowanie, przycinanie i osadzanie parafiny zgodnie ze standardowymi procedurami laboratoryjnymi w celu ewentualnej przyszłej oceny histopatologicznej.W przypadku dwunastnicy wytnij 10-milimetrową część dwunastnicy proksymalnie do żołądka. Włóż igłę o rozmiarze od 21 do 25 do jednego końca dwunastnicy i przepłucz ją jednym mililitrem zimnego roztworu do mielenia, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia i bakterie. Odwróć dwunastnicę, przepłucz ją ponownie kolejnym mililitrem roztworu do mielenia mięsa i wyrzuć igłę.Rozetnij dwunastnicę i opłucz ją w około siedmiu mililitrach roztworu do mielenia. Następnie ponownie opłucz dwunastnicę i trzymaj ją w roztworze do mielenia na lodzie, aż będzie gotowa do dalszego przetwarzania. Wyciąć i utrwalić część pozostałej dwunastnicy w celu ewentualnej przyszłej oceny histopatologicznej, jak opisano wcześniej dla wątroby.W przypadku mózgu przydatne może być najpierw podzielenie mózgu na dwie półkule, z których jedna jest zachowana na wypadek ewentualnej histopatologii. Wypreparuj interesujące Cię obszary mózgu, a następnie delikatnie je opłucz i trzymaj na lodzie w roztworze do mielenia, aż będą gotowe do dalszego przetwarzania, jak opisano wcześniej dla wątroby i dwunastnicy. W przypadku żołądka usuń i wyrzuć przedni żołądek.Rozetnij żołądek gruczołowy i umyj go z jedzenia, wrzucając go do średniej wielkości łodzi ważącej zawierającej około siedmiu mililitrów zimnego buforu do mielenia. Usunąć pięciomilimetrowy pasek gruczołowego żołądka proksymalnie do dwunastnicy w celu unieruchomienia w celu ewentualnej oceny histopatologicznej, jak opisano wcześniej. Umieść pozostały żołądek w średniej wielkości łodzi wagowej zawierającej około siedmiu mililitrów zimnego buforu do mielenia mięsa i inkubuj na lodzie przez 15 do 30 minut.Następnie przenieś żołądek na czysty kawałek parafiny i użyj ostrza skalpela lub plastikowego skrobaka do komórek, aby delikatnie zeskrobać nabłonek powierzchni co najmniej dwa razy, aby usunąć zanieczyszczenia. Podnieś błonę śluzową żołądka kleszczami i za pomocą pipety przepłucz ją jednym mililitrem zimnego buforu do mielenia. Przenieś opłukaną tkankę żołądka na czystą powierzchnię lub naczynie i dodaj zimny roztwór do mielenia.Użyj tylnej części ostrza skalpela lub plastikowego skrobaka do komórek, aby ostrożnie zeskrobać nabłonek żołądka cztery do pięciu razy, aby uwolnić komórki. Następnie za pomocą pipety zebrać roztwór do mielenia mięsa zawierający uwolnione komórki i przenieść go do probówki mikrowirówkowej na lodzie. W przypadku mielenia próbek tkanek należy wyciąć fragment wątroby, mózgu lub dwunastnicy i przenieść go do oznakowanej probówki mikrowirówkowej zawierającej jeden mililitr zimnego roztworu do mielenia.Użyj nożyczek do mielenia mięsa, aby szybko zmielić próbkę, aż zostanie ostatecznie zdyspergowana, upewniając się, że próbka pozostaje zimna. Próbka powinna wyglądać na lekko mętną. Jednak często zdarza się, że niektóre kawałki pozostają, które osiądą na dnie rurki.Aby użyć chusteczki w stanie świeżym, probówki zawierające próbki należy przechowywać na lodzie. Aby zamrozić próbki tkanek, należy zabezpieczyć pokrywę probówki natychmiast po mieleniu lub pobraniu i wrzucić probówkę do kolby Dewara zawierającej ciekły azot. Po zakończeniu pobierania tkanek użyj chochli, aby pobrać probówki z próbkami i umieść je na suchym lodzie w celu posortowania.Przenieś probówki do zamrażarki na suchym lodzie i przechowuj pudełko w zamrażarce w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby przygotować zamrożone kostki tkanki, pokrój kilka małych kawałków tkanki i pojedynczo wrzuć je bezpośrednio do średniej wielkości łodzi wagowej lub innego odpowiedniego naczynia zawierającego ciekły azot na kilka sekund. Po całkowitym zamrożeniu kawałków przenieś zamrożone kostki tkanek pojedynczo do oznakowanych probówek do mikrowirówek lub krioprobówek na suchym lodzie.Po zakończeniu pobierania tkanek przenieś probówki do zamrażarki na suchym lodzie i przechowuj pudełko w zamrażarce w temperaturze minus 800 stopni Celsjusza. Używając świeżo zmielonej lub zeskrobanej tkanki utrzymywanej na mokrym lodzie, przygotuj zjeżdżalnie komety w ciągu godziny od zbioru. W przypadku stosowania zamrożonej tkanki mielonej lub zeskrobanej, probówki z zamrożoną tkanką należy umieścić w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej, aż próbki zostaną całkowicie rozmrożone, upewniając się, że są utrzymywane w niskiej temperaturze.Po rozmrożeniu próbek natychmiast przenieś probówki na lód. W przypadku tkanek pokrojonych w kostkę wyjmij probówki zawierające kostki z zamrażarki i trzymaj na suchym lodzie do czasu przygotowania szkiełek. Porcję jednego mililitra pożywki handlowej lub roztworu do mielenia mięsa do oznaczonej 1,7 mililitrowej probówki mikrowirówkowej dla każdej próbki i utrzymywać na lodzie.Pracując szybko, aby uniknąć rozmrażania, umieść kostkę tkanki w otwartym końcu urządzenia do mielenia tkanek w temperaturze pokojowej. Szybko włóż tłok strzykawki o dopasowanym rozmiarze do urządzenia, aby wepchnąć tkankę do końca siatki, który następnie należy umieścić w probówce mikrowirówki zawierającej zimny roztwór do mielenia mięsa. Zanurz siatkowy koniec urządzenia na około pięć do 10 sekund w zimnym roztworze do mielenia mięsa, aby tkanka mogła się całkowicie rozmrozić.Całkowicie wciśnij tłok, aż zobaczysz, że komórki wystają przez pory siatki. Następnie pociągnij tłok do góry o około 2,5 centymetra i ponownie całkowicie dociśnij. Powtórz kilka razy, aż roztwór do mielenia stanie się mętny.Aby przygotować szkiełka, delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową i przenieś 50 mikrolitrów do probówki zawierającej 450 mikrolitrów 0,5% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przygotuj i oceń slajdy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W pierwszym badaniu wątrobę pobrano z dwóch kohort samców szczurów kontrolnych Sprague Dawley w odstępie jednego tygodnia.Preparaty przygotowywano ze świeżo zmielonej tkanki, zamrożonej tkanki mielonej i zamrożonej tkanki pokrojonej w kostkę. Ponieważ zalecana przez OECD górna granica procentowego DNA z ogona w świeżej wątrobie szczura wynosi 6%, wyniki te pokazują, że każda z metod zamrażania może być skuteczna w ocenie tkanki. Ogólnie rzecz biorąc, odsetek jeży był równoległy do procentowego DNA ogona, chociaż zamrożone tkanki wykazywały większą zmienność.W drugim badaniu samicom myszy B6C3F1 podawano nośnik lub mutagenny metanosulfonian etylu. Wyniki procentowego DNA ogona wskazują, że tkanka wątroby zamrożona w postaci sześcianów, a następnie przetworzona za pomocą urządzenia do mielenia tkanek, dała wyniki bardzo podobne do tych uzyskanych dla świeżo zmielonej tkanki. Statystycznie istotny wzrost uszkodzeń DNA wywołanych przez EMS zmierzono w próbkach tkanek przetworzonych wszystkimi trzema metodami.W trzecim badaniu analizowano próbki wątroby pobrane od samic myszy B6C3F1 w 90-dniowym badaniu toksyczności chemicznej. Uszkodzenia DNA w zamrożonej tkance mielonej były wysokie we wszystkich grupach dawkowania, przy znacznej zmienności między zwierzętami. Procentowe wyniki DNA ogona korelowały z procentem jeży, co wskazuje, że jeże znacząco przyczyniły się do wysokiego poziomu uszkodzeń DNA, które zaobserwowano w tych próbkach.W przeciwieństwie do tego, zarówno uszkodzone DNA, jak i procentowe jeże były bardzo niskie w błyskawicznie zamrożonej tkance sześciennej, która została przygotowana równolegle z próbkami tkanek mielonych. Tak więc wysoce uszkodzone komórki objawiające się jako jeże w próbkach tkanek mielonych wyraźnie nie były wynikiem procesu biologicznego, ale prawdopodobnie zostały wprowadzone przez mechaniczne zakłócenie i/lub rozgrzanie tkanki podczas procedury mielenia przed błyskawicznym zamrożeniem. W związku z tym dane dotyczące tkanki mielonej uznano za niewiarygodne.Dla porównania, wysokiej jakości dane uzyskano z zamrożonej tkanki w kształcie kostki, nawet po długotrwałym przechowywaniu. Bardzo ważne jest, aby pobrane tkanki były zimne i wilgotne, a także aby szybko pracować nad zamrożeniem próbek. Ponadto zamrożoną tkankę kostki należy rozmrozić bezpośrednio przed etapem homogenizacji.Zamrożone próbki tkanek nadają się do innych zastosowań, w tym na przykład do modyfikacji testu komety w celu wykrycia uszkodzeń oksydacyjnych lub sieciowania oraz oceny zmian w ekspresji genów. Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z ostrzami skalpela w celu cięcia lub zeskrobywania tkanek oraz podczas obchodzenia się z ciekłym azotem podczas procesu zamrażania.

use-frozen-tissue-comet-assay-for-evaluation-dna

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Film demonstruje test komety do wykrywania uszkodzeń DNA po ekspozycji na szkodliwe czynniki. W warunkach zasadowych DNA rozwija się i denaturuje, a po elektroforezie nieuszkodzone i uszkodzone DNA migruje inaczej w żelu agarozowym, tworząc strukturę w kształcie komety. Wolno migrujące, nieuszkodzone DNA tworzy okrągłą głowę komety, podczas gdy szybko migrujące uszkodzone fragmenty DNA tworzą wydłużony warkocz komety.

Test komety do wykrywania uszkodzeń DNA w komórkach

Test komet jest skutecznym sposobem wykrywania pęknięć jedno- i dwuniciowych, w tym miejsc alkaliczno-labilnych i powiązań krzyżowych DNA-DNA/DNA-protein na DNA we wszystkich komórkach, w tym w neuronach hipokampa. Metoda wykorzystuje zróżnicowaną migrację DNA w polu elektrycznym ze względu na różnice w ilości uszkodzeń DNA.

Oznaczanie uszkodzeń DNA w neuronach hipokampa za pomocą testu komety

Opisujemy tutaj platformę, która pozwala na wykrywanie uszkodzeń DNA metodą testów komet z niespotykaną dotąd wydajnością. Urządzenie tworzy modele komórek ssaków w mikromacierz i umożliwia równoległe przetwarzanie 96 próbek. Podejście to ułatwia analizę uszkodzeń DNA na poziomie podstawowym, uszkodzeń DNA wywołanych ekspozycją oraz kinetyki naprawy DNA.

CometChip: wysokowydajna, 96-dołkowa platforma do pomiaru uszkodzeń DNA w mikromacierzowanych komórkach ludzkich

Test Comet mierzy pęknięcia DNA, wywołane przez różne czynniki. Jeśli wszystkie czynniki (z wyjątkiem stresu oksydacyjnego) powodujące uszkodzenie DNA są utrzymywane na stałym poziomie, ilość uszkodzeń DNA jest dobrym pośrednim parametrem stresu oksydacyjnego. Celem tego protokołu jest wykorzystanie testu kometarnego do pośredniego pomiaru stresu oksydacyjnego.

Test komety jako pośrednia miara ogólnoustrojowego stresu oksydacyjnego

Test komet jest skuteczną metodą wykrywania uszkodzeń DNA, w tym jedno- i dwuniciowych pęknięć DNA. Opisujemy alkaliczne i neutralne testy komet w celu zmierzenia uszkodzeń DNA w komórkach nowotworowych w celu oceny efektu terapeutycznego chemioterapii.

Ocena uszkodzeń DNA in vitro za pomocą testu komety

Test kometarny jest popularnym sposobem wykrywania uszkodzeń DNA. W tym badaniu opisano podejście do przeprowadzania slajdów w reprezentatywnych wariantach testu komety. Takie podejście znacznie zwiększyło liczbę próbek przy jednoczesnym skróceniu czasu trwania testu, liczby manipulacji szkiełkami i ryzyka uszkodzenia żeli.

Wysokoprzepustowy test kometowy do oceny uszkodzeń DNA komórkowego

Protokół ten opisuje skuteczną metodę ilościowego określania różnic w uszkodzeniach DNA wywołanych przez inhibitory typu I i typu II w zmutowanych komórkach FLT3 poprzez zastosowanie testu komety.

Test kometarny w celu ilościowego określenia uszkodzeń DNA w komórkach 32D z ekspresją mutanta FLT3 po ekspozycji na inhibitory FLT3 typu I i II

Ukierunkowane uszkodzenie DNA można osiągnąć poprzez przywiązanie czynnika uszkadzającego DNA do oligonukleotydu tworzącego triplex (TFO). Za pomocą zmodyfikowanych TFO, asocjacji białek specyficznych dla uszkodzenia DNA i modyfikacji topologii DNA można badać w komórkach ludzkich poprzez wykorzystanie zmodyfikowanych testów immunoprecypitacji chromatyny i testów superzwijania DNA opisanych w niniejszym dokumencie.

Narzędzia do badania roli architektonicznego białka HMGB1 w przetwarzaniu zniekształcających helisę, specyficznych dla miejsca wiązań międzyniciowych DNA

Celem tego protokołu jest opisanie, jak używać mikronapromieniowania laserowego do wywoływania różnych rodzajów uszkodzeń DNA, w tym stosunkowo prostych pęknięć nici i złożonych uszkodzeń, do badania sygnalizacji uszkodzeń DNA i montażu czynników naprawczych w miejscach uszkodzenia in vivo.

Mikronapromienianie laserowe do badania in vivo odpowiedzi komórkowych na proste i złożone uszkodzenia DNA

Ten artykuł demonstruje szczegółowy protokół izolacji DNA i budowy biblioteki sekwencjonowania o wysokiej przepustowości z materiału zielnikowego, w tym ratowania wyjątkowo niskiej jakości DNA.

Solidna izolacja DNA i wysokoprzepustowa budowa biblioteki sekwencjonowania dla okazów zielnikowych

Poznaj przygotowanie zamrożonych próbek tkanek do testu komety w ocenie uszkodzeń DNA. Technika miniaturyzacji i kostkowania zmniejsza błędy mechaniczne i umożliwia elastyczną analizę genotoksyczności.

Wykorzystanie zamrożonej tkanki w teście komety do oceny uszkodzeń DNA

Przeglądaj więcej filmów