Name: Identyfikacja mutacji poprzez topnienie w wysokiej rozdzielczości w populacji ryżu uprawianej metodą TILLING (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Poznaj metodę HRM-TILLING do identyfikacji mutacji w genomie ryżu. Protokół umożliwia wysokoprzepustowe wykrywanie delecji, insercji i substytucji pojedynczych zasad w populacjach mutagenicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (nr 2016YFD0102103) oraz Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (nr 31701394).

1. Przygotowania
<ol>
	<li>Rozwój populacji mutagenizowanych γ-promieniami
	<ol>
		<li>Około 20 000 suszonych nasion ryżu (o wilgotności ok. 14%) z linii ryżu japonica (np. DS552) należy poddać działaniu promieni gamma o sile 137Cs przy ciśnieniu 100 Gy (1 Gy/min) w urządzeniu do napromieniania γ (np. komórce gamma). 
		UWAGA: Nasiona użyte do zaprawiania powinny charakteryzować się wysoką żywotnością (np. o zdolności kiełkowania >85%). Dawka napromieniowania ryżu indica może zostać zwiększona do 150 Gy.</li>
		<li>Napromieniowane nasiona po wykiełkowaniu wysiewać na rozsadce i przesadzać siewki pojedynczo na pole ryżowe i wyrastać na populację M1. 
		UWAGA: Bezpośredni siew roślin M1 rzadko może być również stosowany w celu obniżenia kosztów pracy. Zapobiegać krzyżowaniu roślinM1 z innymi odmianami ryżu za pomocą środków izolacji fizycznej lub biologicznej.</li>
		<li>Zbieraj luzem nasiona M2 z roślin M1, z 1-2 nasionami z każdej paniki M1, aby utworzyć populację M2. 
		UWAGA: W praktyce i dla uproszczenia należy zebrać wszystkie nasiona roślin M1, a po całkowitym wymieszaniu pobiera się próbkę z porcji, aby utworzyć populację M2.</li>
		<li>Namocz około 5,000 M2 nasiona w wodzie przez 24 (ryż indica)-36 (ryż japonica) h w temperaturze pokojowej. Następnie pozwól nasionom wykiełkować w temperaturze 37 °C przez 2 dni na wilgotnej bibule filtracyjnej na szalkach Petriego. 
		UWAGA: Można wykiełkować więcej nasionM2 do analizy, aby zwiększyć prawdopodobieństwo identyfikacji mutantów.</li>
		<li>Umieść kiełkujące nasiona na panelach wysiewających z małymi otworami i hoduj je hydroponicznie przez 3-4 tygodnie w roztworze kulturowym zmodyfikowanym przez Yoshida et al.15 w szklarni z 12-godzinnym fotoperiodem [dzień (30±2) °C i noc (24±2) °C].</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie próbek tkanek liści: Wyciąć jeden krążek (Φ ~ 2 mm) z całkowicie wysuniętego liścia każdego siewu w tej samej pozycji za pomocą dziurkacza.</li>
	<li>Przygotowanie roztworów do ekstrakcji DNA
	<ol>
		<li>Bufor A: Dodaj 2 ml 5 M NaOH i 10 ml 20% Tween 20, aby uzyskać końcową objętość 50 ml. Świeżo przygotować bufor A przed ekstrakcją DNA.</li>
		<li>Bufor B: Dodaj 20 ml 1 M Tris-HCl (pH 8,0) i 80 μl 0,5 M EDTA, aby uzyskać końcową objętość 100 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Startery PCR
	<ol>
		<li>Podstawy do analizy HRM: Zaprojektuj startery do amplifikacji sekwencji docelowej za pomocą oprogramowania (np. Primer Premier5) i zsyntetyzuj je przez firmę komercyjną. 
		UWAGA: Ponieważ HRM ma mniejsze zastosowanie do analizy długich fragmentów, a zatem amplikony powinny być mniejsze niż 400 pz. Fragmenty o zbyt wysokiej (>75%) lub zbyt niskiej (<25%) zawartości GC również nie nadają się do analizy HRM.</li>
		<li>Startery do kontroli jakości: Użyj 24 markerów SSR rozmieszczonych na 12 chromosomach ryżu z Peng et al.16.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekstrakcja DNA
<ol>
	<li>Umieścić 4 krążki liściowe w każdym dołku 96-dołkowej płytki PCR, dodać roztwór buforu A (50 ml / dołek). Zamrażaj talerz w zamrażarce w temperaturze -80 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Rozmrozić płytkę w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować w temperaturze 95 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Dodać 50 μl buforu B do każdej studzienki i dobrze wymieszać przez wirowanie.</li>
	<li>Odwirować płytkę przez 1 minutę przy 1 500 x g. Supernatant jest gotowy do PCR.</li>
</ol>
3. Amplifikacja PCR
<ol>
	<li>Optymalizacja PCR
	<ol>
		<li>Dodać następujące odczynniki do każdego dołka PCR: 1 μL DNA (supernatant w kroku 2.4), 5 μL 2x Master Mix (zawierający 2x bufor PCR, 4 mmol/L MgCl2, 0,4 mmol/L trifosforany 2'-deoksyrybonukleozydów (dNTP) i 50 U/ml polimerazy DNA Taq, po 0,2 μl starterów 10 μmol/L, i uzupełnić końcową objętość do 10 μl, używając wody wolnej od nukleaz.</li>
		<li>Użyj gradientowego bloku termicznego, aby określić optymalną temperaturę wyżarzania dla każdego fragmentu docelowego przy użyciu następującego programu PCR: 5 minut w temperaturze 94 °C, następnie 40 cykli po 30 s w temperaturze 94 °C, 30 s w temperaturze 52-62 °C (temperatura gradientu) i 30 s w temperaturze 72 °C, z końcowym przedłużeniem w temperaturze 72 °C przez 8 minut i zatrzymaniem w temperaturze 16 °C.</li>
		<li>Zbadaj amplikony na 1% żelach agarozowych w celu określenia optymalnej temperatury wyżarzania. 
		UWAGA: Optymalna temperatura wyżarzania powinna umożliwiać specyficzne amplifikacje docelowego fragmentu, bez niespecyficznego amplifikacji i dimeryzacji startera.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR do analizy HRM 
	UWAGA: Do PCR stosuje się płytki kompatybilne z HRM i DNA sadzonekM2 wyekstrahowanych zgodnie z opisem w kroku 2.4.
	<ol>
		<li>Wykonać PCR w końcowej objętości 10 μl, z 1 μl DNA (supernatant), 5 μl 2x Master Mix, po 0,2 μl starterów 10 μmol/l i 1 μl 10x barwnika fluorescencyjnego. Na każdej płytce należy umieścić jedną próbkę rodzicielską typu dzikiego (WT) i jedną ujemną (bez DNA) kontrolę.</li>
		<li>Dodaj kroplę oleju mineralnego do każdej studzienki, aby zapobiec parowaniu.</li>
		<li>Uszczelnić płytkę folią samoprzylepną i odwirować przy 1 000 x g przez 1 min.</li>
		<li>Uruchom PCR przy użyciu zoptymalizowanej temperatury wyżarzania. 
		UWAGA: W niektórych przypadkach barwnik fluorescencyjny może wpływać na amplifikację PCR, stąd barwnik dodaje się po zakończeniu PCR. W takich przypadkach barwnik jest wprowadzany do nici DNA przez denaturację i wyżarzanie po PCR.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Skanowanie HRM i potwierdzenie mutacji
<ol>
	<li>Usuń folię samoprzylepną z płyty i włóż płytkę do maszyny HRM.</li>
	<li>Wybierz opcję New Run (Nowy przebieg) z menu plików lub naciśnij przycisk Run (Uruchom) u góry ekranu.</li>
	<li>Określić temperaturę początkową i końcową stopu od 55 °C do 95 °C. 
	UWAGA: Po pierwszym przebiegu można określić zakres temperatur topnienia dla konkretnego fragmentu; W związku z tym temperaturę topnienia można dostosować do późniejszej analizy tego samego fragmentu, aby zaoszczędzić czas.</li>
	<li>Wybierz próbki do analizy topnienia w wysokiej rozdzielczości, wyklucz próbki podobne do kontroli ujemnej.</li>
	<li>Znormalizuj krzywe topnienia, aby miały tę samą początkową i końcową fluorescencję. Wizualnie potwierdź, że kursory Dolne Min i Dolne maksimum temperatury znajdują się w regionie krzywych.</li>
	<li>Utrzymuj poziom ∆F (różnica fluorescencji) na domyślnym ustawieniu 0,05.</li>
	<li>Z listy wyboru Standardy wybierz opcję Wspólna a Wariant i wybierz opcję Normalna czułość.</li>
	<li>Użyć WT jako kontroli; próbki o wartości ∆F ≥0,05 z WT uważa się za zawierające zmutowaną roślinę.</li>
	<li>Identyfikacja i potwierdzenie zmutowanych roślin.
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj cztery rośliny, z których zbudowano każdą pulę zmutowanych zwierząt.</li>
		<li>Wyekstrahuj DNA z każdej z tych roślin za pomocą metody CTAB zgodnie z Allen et al.17 z pewnymi modyfikacjami. 
		UWAGA: RNaza wolna od DNaz i NaAc nie są używane podczas ekstrakcji DNA metodą CTAB opisaną przez Allena i wsp.17, ponieważ jakość DNA jest wystarczająco dobra do dalszej amplifikacji PCR. Dostosuj DNA do końcowego stężenia ~25 ng / μL po ilościowym określeniu za pomocą spektrofotometru.</li>
		<li>Amplifikuj fragment docelowy za pomocą starterów PCR i zaprogramuj tak samo, jak w przypadku analizy HRM.</li>
		<li>Identyfikacja specyficznych zmian molekularnych za pomocą sekwencjonowania amplikonów metodą Sangera. 
		UWAGA: Po zakończeniu amplifikacji PCR wyślij amplikony do firmy w celu sekwencjonowania Sangera. Zmianę molekularną można zidentyfikować, porównując sekwencje między roślinąM2 a WT.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Kontrola jakości wybranych mutantów z markerami molekularnymi
<ol>
	<li>Przeprowadzić PCR dla 24 markerów SSR w końcowej objętości 10 μL z 25 ng genomowego DNA (ekstrahowanego przy użyciu protokołu CCAB), 5 μL 2x mieszanki głównej, 0,2 μL każdego z 10 μM starterów SSR.</li>
	<li>Uruchomić PCR za pomocą następującego programu: 5 minut w temperaturze 94 °C, następnie 30 cykli po 30 s w temperaturze 94 °C, 30 s w temperaturze 55 °C i 30 s w temperaturze 72 °C, z końcowym przedłużeniem w temperaturze 72 °C przez 7 minut.</li>
	<li>Oddziel amplikony na 8% żelach poliakryloamidowych i odkryj polimorfizm amplifikowanych fragmentów za pomocą barwienia srebrem18.</li>
	<li>Porównaj haplotypy SSR wybranych wariantów i WT. 
	UWAGA: Indukowane mutanty często mają haplotypy SSR identyczne z ich WT, jeśli więcej niż jeden marker SSR różni się między wariantem a WT, istnieje duże prawdopodobieństwo, że wariant jest zanieczyszczeniem genetycznym (np. mieszaniną lub rośliną skrzyżowaną), a nie indukowanym mutantem18.</li>
</ol>

<ol><li>McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+%28TILLING%29+for+plant+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).</li>
<li>Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TILLING%2C+high-resolution+melting+%28HRM%29%2C+and+next-generation+sequencing+%28NGS%29+techniques+in+plant+mutation+breeding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Breeding%22%5BJournal%5D)">TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding.</a> Molecular Breeding. 37 (3), 40(2017).</li>
<li>Till, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+discovery+of+induced+point+mutations+with+high+throughput+TILLING%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING.</a> Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).</li>
<li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TILLING%3A+practical+single+nucleotide+mutation+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">TILLING: practical single nucleotide mutation discovery.</a> The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).</li>
<li>Comai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+discovery+of+DNA+polymorphisms+in+natural+populations+by+Ecotilling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling.</a> The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).</li>
<li>Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion-based+reverse+genetics+in+Medicagotruncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Deletion-based reverse genetics in Medicagotruncatula.</a> Plant Physiology. 151 (3), 1077(2009).</li>
<li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ITILLING%3A+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis.</a> Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).</li>
<li>Colasuonno, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHPLC+technology+for+high-throughput+detection+of+mutations+in+a+durum+wheat+TILLING+population%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genetics%22%5BJournal%5D)">DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population.</a> BMC Genetics. 17 (1), 43(2016).</li>
<li>Tsai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+rare+mutations+in+populations%3A+TILLING+by+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing.</a> Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).</li>
<li>Kumar, A. P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TILLING+by+Sequencing+%28TbyS%29+for+targeted+genome+mutagenesis+in+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Breeding%22%5BJournal%5D)">TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops.</a> Molecular Breeding. 37, 14(2017).</li>
<li>Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+mutation+detection+of+three+homoeologous+genes+in+wheat+by+High+Resolution+Melting+analysis+and+Mutation+Surveyor%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor.</a> BMC Plant Biology. 9, 143(2009).</li>
<li>Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+two+high+through-put+techniques+in+a+novel+application%3A+detecting+point+mutations+in+large+EMS+mutated+plant+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations.</a> Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).</li>
<li>Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product+differentiation+by+analysis+of+DNA+melting+curves+during+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction.</a> Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).</li>
<li>Lochlainn, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melt+%28HRM%29+analysis+is+an+efficient+tool+to+genotype+EMS+mutants+in+complex+crop+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes.</a> Plant Methods. 7, 43(2011).</li>
<li>Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. Laboratory manual for physiological rice. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYoshida%2C+S+%22The+International+Rice+Research+Institute%22">The International Rice Research Institute</a>. , Manila, the Philippines. (1976).</li>
<li>Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SSR+markers+selection+and+purity+detection+of+major+hybrid+rice+combinations+and+their+parents+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Rice+Science%22%5BJournal%5D)">SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China.</a> Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).</li>
<li>Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+protocol+for+rapid+DNA+isolation+from+plant+tissues+using+cetyltrimethymmonium+bromide%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide.</a> Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).</li>
<li>Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revisit+of+mutation+induction+by+gamma+rays+in+rice+%28Oryza+sativa+L.%29%3A+implications+of+microsatellite+markers+for+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Breeding%22%5BJournal%5D)">A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control.</a> Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).</li>
<li>Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+melting-based+tilling+of+%CE%B3+ray-induced+mutations+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhejiang+University-Science+B%22%5BJournal%5D)">High-resolution melting-based tilling of γ ray-induced mutations in rice.</a> Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).</li>
<li>Acanda, Y., Óscar, M., Prado, M. J., González, M. V., Rey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMS+mutagenesis+and+qPCR-HRM+prescreening+for+point+mutations+in+an+embryogenic+cell+suspension+of+grapevine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine.</a> Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).</li>
<li>Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+an+HRM-based%2C+safe+and+high-throughput+genotyping+system+for+photoperiod+sensitive+genic+male+sterility+gene+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Agricultural+Sciences%22%5BJournal%5D)">Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice.</a> Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).</li>
<li>Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+and+type+of+inheritable+mutations+induced+by+%CE%B3+rays+in+rice+as+revealed+by+whole+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhejiang+University-Science+B%22%5BJournal%5D)">Frequency and type of inheritable mutations induced by γ rays in rice as revealed by whole genome sequencing.</a> Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905(2016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Projekt TILLING okazał się potężnym narzędziem genetyki odwrotnej do identyfikacji indukowanych mutacji na potrzeby analizy funkcjonalnej genów i hodowli roślin. W przypadku niektórych cech, które nie są łatwe do zaobserwowania lub określenia, TILLING z wysokoprzepustowym wykrywaniem mutacji opartym na PCR może być przydatną metodą uzyskiwania mutantów dla różnych genów. Metoda HRM-TILLING została zastosowana w mutagenizowanych EMS populacjach pomidora12, pszenicy11 i winor...

Mutanty są ważnymi zasobami genetycznymi dla badań nad genomiką funkcjonalną roślin i hodowli nowych odmian. Podejście oparte na genetyce przyszłościowej (tj. od selekcji mutantów do klonowania genów lub rozwoju odmian) było główną i jedyną metodą stosowania mutacji indukowanych około 20 lat temu. Opracowanie nowatorskiej metody genetyki odwrotnej, TILLING (Targeting Induced Local Lesions In Genomes) przez McCallum et al.1 otworzyło nowy paradygmat i od tego czasu jest ono stosowane u wielu gatunków zwierząt i roślin2. Uprawa roli jest szczególnie przydatna w przypadku cech hodowlanych, które są technicznie trudne lub kosztowne do określenia (np. odporność na choroby, zawartość minerałów).
TILLING został początkowo opracowany do badania przesiewowego mutacji punktowych wywołanych przez chemiczne mutageny (np. EMS1,3). Obejmuje on następujące etapy: ustanowienie populacji (populacji) uprawy; Przygotowanie DNA i łączenie poszczególnych roślin; Amplifikacja PCR docelowego fragmentu DNA; tworzenie heterodupleksów przez denaturację i wyżarzanie amplikonów PCR oraz rozszczepianie przez nukleazę CEL I; oraz identyfikacja zmutowanych osobników i ich specyficznych zmian molekularnych3,4. Jednak ta metoda jest nadal stosunkowo złożona, czasochłonna i ma niską przepustowość. Aby uczynić go bardziej wydajnym i o większej przepustowości, opracowano wiele zmodyfikowanych metod TILLING, takich jak usuwanie TILLING (De-TILLING) (Tabela 1)1,3,5,6,7,8,9,10,11,12.
Analiza krzywej HRM, która opiera się na zmianach fluorescencji podczas topnienia dupleksu DNA, jest prostą, opłacalną i wysokoprzepustową metodą badania przesiewowego mutacji i genotypowania13. HRM jest już szeroko stosowany w badaniach roślin, w tym w HRM BASED TILLING (HRM-TILLING) do badań przesiewowych mutacji SBS indukowanych przez mutagenezę EMS14. W tym miejscu przedstawiliśmy szczegółowe protokoły HRM-TILLING do badań przesiewowych mutacji (zarówno Indel, jak i SBS) indukowanych przez promienie gamma (γ) w ryżu.

<table><tbody><tr><td>2 razy; Taq plus PCR Master Mix</td><td>Tiangen, Chiny</td><td>KT201</td><td>Bufor PCR, dNTP i polimeraza do amplifikacji PCR</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Bio-rad, Ameryka</td><td>MSP-9651</td><td>Specyficzna płytka do PCR w analizie HRM</td></tr><tr><td>Mastercycler nexus</td><td>Eppendorf, niemiecki</td><td>6333000073</td><td>amplifikacji PCR</td></tr><tr><td>LightScanner</td><td>Idaho Technology, USA</td><td>LCSN-ASY-0011</td><td>Do pobierania próbek fluorescencji i przetwarzanie</td></tr><tr><td>CALL-IT 2.0</td><td>Idaho Technology, USA</td><td></td><td>Do analizy zmiany fluorescencji</td></tr><tr><td>EvaGreen</td><td>Biotium, USA</td><td>31000-T</td><td>Barwnik fluorescencyjny HRM</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>ND2000</td><td>Do kwantyfikacji DNA</td></tr></tbody></table>

identyfikacja mutacji poprzez topnienie w wysokiej rozdzielczości w populacji ryżu uprawianej metodą tilling

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) to strategia genetyki odwrotnej do wysokoprzepustowego badania przesiewowego indukowanych mutacji. Jednak system TILLING ma mniejsze zastosowanie w wykrywaniu indukcji/delecji (Indel), a tradycyjne TILLING wymaga bardziej złożonych etapów, takich jak trawienie nukleazy CEL I i elektroforeza żelowa. Aby poprawić przepustowość i efektywność selekcji oraz umożliwić przesiewanie zarówno indeli, jak i substytucji pojedynczej zasady (SBS), opracowano nowy system TILLING oparty na topnieniu w wysokiej rozdzielczości (HRM). W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół HRM-TILLING i pokazujemy jego zastosowanie w badaniach przesiewowych w kierunku mutacji. Metoda ta może analizować mutacje amplikonów PCR, mierząc denaturację dwuniciowego DNA w wysokich temperaturach. Analiza HRM jest wykonywana bezpośrednio po PCR bez dodatkowego przetwarzania. Co więcej, prosta, bezpieczna i szybka metoda ekstrakcji DNA (SSF) jest zintegrowana z HRM-TILLING w celu identyfikacji zarówno Indeli, jak i SBS. Jego prostota, solidność i wysoka przepustowość sprawiają, że jest potencjalnie przydatny do skanowania mutacji w ryżu i innych uprawach.

Skanowanie i analiza HRM
Łącznie przygotowano 1 140 połączonych próbek DNA z 4 560 siewek M2, które następnie poddano amplifikacji PCR. W przypadku genów OsLCT1 oraz SPDT amplifikowano odpowiednio fragmenty o rozmiarach 195 bp i 259 bp (Tabela 2). Większość próbek wykazała krzywe topnienia nieznacząco różniące się od WT (ΔF &lt; 0,05). Krzywe HRM znacząco różniące się od WT (ΔF &gt; 0,05) zostały pogrupowane przez oprogramowanie pr...

W tym artykule prezentujemy protokół, który jest opisany jako analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRM) oparta na docelowych lokalnych zmianach w genomach (TILLING). Metoda ta wykorzystuje zmiany fluorescencji podczas topnienia dupleksu DNA i nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych zarówno insercji/delecji (Indel), jak i substytucji pojedynczej zasady (SBS).

Identyfikacja mutacji poprzez topnienie w wysokiej rozdzielczości w populacji ryżu uprawianej metodą TILLING

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Byłoby to bardzo przydatne w przypadku cech hodowlanych, które są technicznie trudne lub kosztowne do określenia, takich jak odporność na choroby, zawartość minerałów. Jest to dość prosta, opłacalna i wysokoprzepustowa technika. Na początek umieść cztery krążki liściowe w każdym dołku 96-dołkowej płytki PCR.Dodaj 50 mililitrów roztworu buforu A do każdej studzienki. Zamroź talerz w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na 10 minut. Następnie rozmrozić płytkę w temperaturze pokojowej.Inkubować w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut. Dodaj 50 mikrolitrów buforu B do każdej studzienki i dobrze wymieszaj, wirując. Odwirować płytkę przez jedną minutę w temperaturze 1 500 g.Zebrać supernatant jako DNA do PCR. Najpierw użyj supernatantu DNA z jednej studzienki jako matrycy PCR, aby zoptymalizować temperaturę wyżarzania. Dodaj odczynniki i jeden mikrolitr supernatantu DNA do każdego dołka PCR.Umieść probówki PCR w gradientowym bloku termicznym i dostosuj program ogrzewania zgodnie z manuskryptem, aby określić optymalną temperaturę wyżarzania dla każdego docelowego fragmentu. Wykonaj elektroforezę produktu PCR na 1% żelach agarozowych w celu zbadania amplikonów. Określ optymalną temperaturę wyżarzania, która umożliwia określone wzmocnienie docelowego fragmentu.Aby przeprowadzić analizę HRM, połącz odczynniki, w tym jeden mikrolitr 10-krotnego barwnika fluorescencyjnego i jeden mikrolitr supernatantu DNA w każdym dołku płytek kompatybilnych z HRM. Na każdej płytce należy umieścić jedną próbkę rodzicielską typu dzikiego i jedną kontrolę ujemną bez DNA. Dodaj kroplę oleju mineralnego do każdej studzienki, aby zapobiec parowaniu.Następnie uszczelnij płytkę folią samoprzylepną i odwiruj przy 1 000 g przez jedną minutę. Uruchom PCR przy użyciu zoptymalizowanej temperatury wyżarzania. Teraz usuń folię samoprzylepną z płytki i włóż płytkę do maszyny HRM.W oprogramowaniu wybierz opcję New Run z menu plików lub naciśnij przycisk Uruchom u góry ekranu. Określ temperaturę początkową i końcową stopu od 55 do 95 stopni Celsjusza. Wybierz próbki do analizy topnienia w wysokiej rozdzielczości i wyklucz próbki podobne do kontroli ujemnej.Znormalizuj krzywe topnienia, aby miały tę samą początkową i końcową fluorescencję. Wizualnie upewnij się, że dolne kursory temperatury minimalnej i dolnej temperatury maksymalnej znajdują się w regionie krzywych. Utrzymuj delta F, różnicę fluorescencji, na poziomie domyślnym 05.Z listy wyboru Standardy wybierz wariant wspólny i wariant normalny. Wybierz H12, aby użyć typu dzikiego jako kontrolki. Próbki o wartości delta F większej niż 05 uważa się za zawierające zmutowaną roślinę.Następnie, za pomocą metody CCAB, wyekstrahuj DNA z każdej z czterech roślin z puli zmutowanych o krzywej topnienia znacznie różniącej się od typu dzikiego. Po ilościowym określeniu za pomocą spektrofotometru, dostosuj DNA za pomocą NanoDrop 2000 do końcowego stężenia około 25 nanogramów na mikrolitr. Dodaj 0,4 mikrolitra starterów PCR do próbki DNA w probówkach PCR, umieść je w termocyklerze i dostosuj program, aby wzmocnić fragment docelowy.Następnie wyślij produkty PCR do firmy w celu sekwencjonowania. Po sekwencjonowaniu Sangera porównaj zmianę molekularną, porównując sekwencje między rośliną M2 a typem dzikim. W tym badaniu skanowanie HRM i analiza sadzonek M2 pod kątem mutacji w genach OsLCT1 lub SPDT wykazały, że większość próbek miała krzywe topnienia nieróżniące się znacząco od typu dzikiego z deltą F mniejszą niż 05.Mutanty wykazywały istotnie różne krzywe HRM z deltą F większą niż 05 w temperaturach odpowiednio od 90 do 92 stopni Celsjusza i od 81,5 do 83,5 stopni Celsjusza. Rodzaj mutacji i umiejscowienie na genach z 4 560 m2 siewek potwierdzono za pomocą chromatogramów sekwencjonowania. Zidentyfikowano heterozygotyczne miejsce z mutacją G do A w 4 304 parach zasad OsLCT1.Jedna insercja pojedynczego nukleotydu A pojawiła się na 4 240 parach zasad OsLCT1, a delecję trójnukleotydu TTC zaobserwowano w pozycji 5 948 do 5 950 par zasad SPDT. Optymalizuję PCR przed analizą HRM. Barwnik w żelu jest nieco szkodliwy.Pamiętaj, aby podczas uruchamiania żelu założyć rękawiczki.

identifying-mutations-high-resolution-melting-tilling-population

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Fundamentalnym celem biologii komórki jest zdefiniowanie mechanizmów leżących u podstaw tożsamości organelli tworzących komórki eukariotyczne. W niniejszej pracy proponujemy metodę identyfikacji genów odpowiedzialnych za integralność morfologiczną i funkcjonalną organelli roślinnych, wykorzystując mikroskopię fluorescencyjną oraz narzędzia sekwencjonowania następnej generacji.

Przesiew mikroskopii fluorescencyjnej i sekwencjonowanie następnej generacji: użyteczne narzędzia do identyfikacji genów zaangażowanych w integralność organelli

W tym filmie opisujemy technikę topnienia PCR o wysokiej rozdzielczości, aby określić polimorfizm długości fragmentów DNA o różnych długościach sekwencji, na podstawie analizy temperatury topnienia.

PCR z topnieniem w wysokiej rozdzielczości w celu określenia zmian sekwencji w zmutowanych sekwencjach DNA

PCR w połączeniu z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRMA) jest pokazane jako szybka i skuteczna metoda genotypowania danio pręgowanego.

Szybkie i wydajne genotypowanie danio pręgowanego za pomocą PCR z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości

Podczas gdy analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości oferuje możliwość różnicowania polimorfizmów pojedynczego nukleotydu w heterogenicznej populacji, stronniczość amplifikacji zmutowanego allelu może zwiększyć jego zdolność do wykrywania alleli obecnych w stosunkowo niskich procentach w próbce. W tym protokole opisano ulepszenia, które poprawiają czułość analizy topnienia w wysokiej rozdzielczości.

Metody zwiększania czułości genotypowania polimorfizmu pojedynczego nukleotydu topniejącego w wysokiej rozdzielczości w malarii

Ten protokół dostarcza kroków eksperymentalnych i informacji o odczynnikach, sprzęcie i narzędziach analitycznych dla badaczy, którzy są zainteresowani przeprowadzeniem analizy porównawczej hybrydyzacji genomowej (CGH) na bazie całego genomu zmian liczby kopii u roślin.

Oparta na macierzy platforma porównawczej hybrydyzacji genomu do skutecznego wykrywania zmian liczby kopii u prędko indukowanych neutronami mutantów Medicago truncatula

Opisany jest protokół rozwoju populacji Indukowanych Miejscowych Zmian Chorobowych (TILLING) w małych uprawach zbóż z użyciem metanosulfonianu etylu (EMS) jako mutagenu. Podano również protokół wykrywania mutacji za pomocą testu Cel-1.

Opracowanie ukierunkowanych populacji indukowanych miejscowymi zmianami chorobowymi w genomach (TILLING) w małych uprawach zbóż metodą mutagenezy metanosulfonianu etylu

Ta metoda demonstruje użycie techniki północnej hybrydyzacji do wykrywania miRNA z całkowitego ekstraktu RNA.

Analiza plam RNA w celu wykrywania i kwantyfikacji mikroRNA roślin

Ten protokół pozwala na przygotowanie przekrojów nasion zbóż (np. ryżu) do analizy morfologii bielma i granulek skrobi za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.

Przekroje poprzeczne dojrzałego ryżu (Oryza sativa L.) Ziarna do obrazowania w skaningowej mikroskopii elektronowej z wykorzystaniem końcówek do pipet jako wspomagania immobilizacji

Analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRM) jest czułym i szybkim rozwiązaniem do wykrywania wariantów genetycznych. Zależy to od różnic w sekwencji, które powodują, że heterodupleksy zmieniają kształt krzywej topnienia. Łącząc HRM i elektroforezę w żelu agarozowym, można zidentyfikować różne rodzaje wariantów genetycznych, takich jak indele.

Wykrywanie wariantów genetycznych w genie CALR za pomocą analizy topnienia o wysokiej rozdzielczości

Ten artykuł opisuje protokół szybkiej identyfikacji indeli indukowanych przez CRISPR/Cas9 i selekcji linii mutantów u komara Aedes aegypti za pomocą analizy topnienia w wysokiej rozdzielczości.

Wykrywanie indel po mutagenezie CRISPR/Cas9 przy użyciu analizy stopienia w wysokiej rozdzielczości u komara Aedes aegypti

Protokół opisuje hodowlę odpornych odmian ryżu skrobiowego za pomocą technologii edycji genomu w precyzyjny, wydajny i technicznie prosty sposób.

Hodowla według projektu funkcjonalnego ryżu z technologiami edycji genomu

Poznaj metodę HRM-TILLING do identyfikacji mutacji w genomie ryżu. Protokół umożliwia wysokoprzepustowe wykrywanie delecji, insercji i substytucji pojedynczych zasad w populacjach mutagenicznych.

Identyfikacja mutacji poprzez topnienie w wysokiej rozdzielczości w populacji ryżu uprawianej metodą TILLING

Przeglądaj więcej filmów