Identyfikacja mutacji poprzez topnienie w wysokiej rozdzielczości w populacji ryżu uprawianej metodą TILLING
2 września 2019
W tym artykule prezentujemy protokół, który jest opisany jako analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRM) oparta na docelowych lokalnych zmianach w genomach (TILLING). Metoda ta wykorzystuje zmiany fluorescencji podczas topnienia dupleksu DNA i nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych zarówno insercji/delecji (Indel), jak i substytucji pojedynczej zasady (SBS).
Byłoby to bardzo przydatne w przypadku cech hodowlanych, które są technicznie trudne lub kosztowne do określenia, takich jak odporność na choroby, zawartość minerałów. Jest to dość prosta, opłacalna i wysokoprzepustowa technika. Na początek umieść cztery krążki liściowe w każdym dołku 96-dołkowej płytki PCR.
Dodaj 50 mililitrów roztworu buforu A do każdej studzienki. Zamroź talerz w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na 10 minut. Następnie rozmrozić płytkę w temperaturze pokojowej.
Inkubować w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut. Dodaj 50 mikrolitrów buforu B do każdej studzienki i dobrze wymieszaj, wirując. Odwirować płytkę przez jedną minutę w temperaturze 1 500 g.
Zebrać supernatant jako DNA do PCR. Najpierw użyj supernatantu DNA z jednej studzienki jako matrycy PCR, aby zoptymalizować temperaturę wyżarzania. Dodaj odczynniki i jeden mikrolitr supernatantu DNA do każdego dołka PCR.
Umieść probówki PCR w gradientowym bloku termicznym i dostosuj program ogrzewania zgodnie z manuskryptem, aby określić optymalną temperaturę wyżarzania dla każdego docelowego fragmentu. Wykonaj elektroforezę produktu PCR na 1% żelach agarozowych w celu zbadania amplikonów. Określ optymalną temperaturę wyżarzania, która umożliwia określone wzmocnienie docelowego fragmentu.
Aby przeprowadzić analizę HRM, połącz odczynniki, w tym jeden mikrolitr 10-krotnego barwnika fluorescencyjnego i jeden mikrolitr supernatantu DNA w każdym dołku płytek kompatybilnych z HRM. Na każdej płytce należy umieścić jedną próbkę rodzicielską typu dzikiego i jedną kontrolę ujemną bez DNA. Dodaj kroplę oleju mineralnego do każdej studzienki, aby zapobiec parowaniu.
Następnie uszczelnij płytkę folią samoprzylepną i odwiruj przy 1 000 g przez jedną minutę. Uruchom PCR przy użyciu zoptymalizowanej temperatury wyżarzania. Teraz usuń folię samoprzylepną z płytki i włóż płytkę do maszyny HRM.
W oprogramowaniu wybierz opcję New Run z menu plików lub naciśnij przycisk Uruchom u góry ekranu. Określ temperaturę początkową i końcową stopu od 55 do 95 stopni Celsjusza. Wybierz próbki do analizy topnienia w wysokiej rozdzielczości i wyklucz próbki podobne do kontroli ujemnej.
Znormalizuj krzywe topnienia, aby miały tę samą początkową i końcową fluorescencję. Wizualnie upewnij się, że dolne kursory temperatury minimalnej i dolnej temperatury maksymalnej znajdują się w regionie krzywych. Utrzymuj delta F, różnicę fluorescencji, na poziomie domyślnym 05.
Z listy wyboru Standardy wybierz wariant wspólny i wariant normalny. Wybierz H12, aby użyć typu dzikiego jako kontrolki. Próbki o wartości delta F większej niż 05 uważa się za zawierające zmutowaną roślinę.
Następnie, za pomocą metody CCAB, wyekstrahuj DNA z każdej z czterech roślin z puli zmutowanych o krzywej topnienia znacznie różniącej się od typu dzikiego. Po ilościowym określeniu za pomocą spektrofotometru, dostosuj DNA za pomocą NanoDrop 2000 do końcowego stężenia około 25 nanogramów na mikrolitr. Dodaj 0,4 mikrolitra starterów PCR do próbki DNA w probówkach PCR, umieść je w termocyklerze i dostosuj program, aby wzmocnić fragment docelowy.
Następnie wyślij produkty PCR do firmy w celu sekwencjonowania. Po sekwencjonowaniu Sangera porównaj zmianę molekularną, porównując sekwencje między rośliną M2 a typem dzikim. W tym badaniu skanowanie HRM i analiza sadzonek M2 pod kątem mutacji w genach OsLCT1 lub SPDT wykazały, że większość próbek miała krzywe topnienia nieróżniące się znacząco od typu dzikiego z deltą F mniejszą niż 05.
Mutanty wykazywały istotnie różne krzywe HRM z deltą F większą niż 05 w temperaturach odpowiednio od 90 do 92 stopni Celsjusza i od 81,5 do 83,5 stopni Celsjusza. Rodzaj mutacji i umiejscowienie na genach z 4 560 m2 siewek potwierdzono za pomocą chromatogramów sekwencjonowania. Zidentyfikowano heterozygotyczne miejsce z mutacją G do A w 4 304 parach zasad OsLCT1.
Jedna insercja pojedynczego nukleotydu A pojawiła się na 4 240 parach zasad OsLCT1, a delecję trójnukleotydu TTC zaobserwowano w pozycji 5 948 do 5 950 par zasad SPDT. Optymalizuję PCR przed analizą HRM. Barwnik w żelu jest nieco szkodliwy.
Pamiętaj, aby podczas uruchamiania żelu założyć rękawiczki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół analizy TILLING (Target Induced Local Lesions In Genomes) opartej na analizie wysokorozdzielczego topnienia (HRM). Metoda ta jest skuteczna w wysokoprzepustowym przesiewaniu mutacji insercyjno-delecyjnych (Indel) oraz mutacji substytucji pojedynczej zasady (SBS).
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genomika
- Hodowla roślin
- Biologia molekularna
Wstęp
- Analiza wysokorozdzielczego topnienia (HRM) jest techniką stosowaną do wykrywania wariancji genetycznych.
- Metoda TILLING umożliwia identyfikację mutacji w sposób kosztowo efektywny.
- Metoda ta jest szczególnie użyteczna w przypadku cech, które są trudne do oceny.
- Może ona być stosowana w różnych dziedzinach, w tym w rolnictwie i genetyce.
Cel badania
- Dostarczenie protokołu wykorzystania HRM w TILLING.
- Ułatwienie wysokoprzepustowego przesiewania wariancji genetycznych.
- Poprawa wydajności identyfikacji mutacji związanych z istotnymi cechami.
Zastosowane metody
- Przygotowanie krążków liściowych w 96-dołkowej płytce PCR.
- Aplikacja roztworu buforu A do każdego dołka.
- Zamrażanie i rozmrażanie płytki PCR w celu przygotowania próbek.
- Monitorowanie zmian fluorescencji podczas denaturacji DNA.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia skuteczne wykrywanie Indels oraz SBS.
- Zdolność do wysokoprzepustowości zwiększa wydajność przesiewową.
- Kostoeffektywna metoda odpowiednia dla różnych zastosowań badawczych.
- Ułatwia hodowlę cech takich jak odporność na choroby.
Wnioski
- TILLING oparty na metodzie HRM jest cennym narzędziem w badaniach genetycznych.
- Metoda ta upraszcza proces identyfikacji mutacji.
- Może ona znacząco wspomóc opracowywanie ulepszonych odmian roślin.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda TILLING oparta na analizie wysokorozdzielczego topnienia (HRM) umożliwia wysokoprzepustowe i kosztowo efektywne wykrywanie zarówno pojedynczych podstawień zasad, jak i mutacji typu insercja/delecja w genomach roślin. Podejście to wspiera wczesny etap walidacji celów poprzez dostarczanie ilościowych danych z przesiewu mutacji, które pomagają w podejmowaniu decyzji hodowlanych w odniesieniu do cech złożonych, takich jak odporność na choroby i zawartość składników odżywczych. Jej integracja z prostą ekstrakcją DNA zwiększa efektywność przepływu pracy w procesach odkrywania nowych wariantów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wykrywanie indukowanych mutacji w genach docelowych, takich jak OsLCT1 i SPDT.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje analizę HRM po reakcji PCR bez konieczności dodatkowej obróbki, co skraca czas pracy manualnej i zwiększa wydajność.
- Wartość prognostyczna: Wartości Delta F powyżej 0.5 pozwalają zidentyfikować próbki zmutowane, co umożliwia pewny wybór hitów do dalszej walidacji.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Płytki kompatybilne z metodą HRM z warstwą oleju mineralnego zapobiegają odparowywaniu i zapewniają odtwarzalność pomiaru krzywych topnienia.
- Wynik ilościowy: Znormalizowane krzywe topnienia oraz pomiary delta F umożliwiają obiektywne porównanie próbek typu dzikiego i wariantów.
- Skalowalność: Format płytki 96-dołkowej pozwala na przesiew tysięcy siewek M2, co wykazano na przykładzie 4 560 próbek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Potwierdzone mutacje za pomocą sekwencjonowania metodą Sangera dostarczają danych o uszkodzeniach molekularnych, które łączą genotyp z fenotypem w programach hodowlanych.
- Dopasowanie biomarkerów: Zidentyfikowane SNP i indele służą jako wykrywalne markery powiązań z cechami w ulepszaniu upraw.
- Minimalizacja ryzyka: Wczesne wykrywanie mutacji zmniejsza niepewność dotyczącą dziedziczenia cech przed próbami polowymi.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda HRM-TILLING wpisuje się w kontinuum od odkrycia do fazy przedklinicznej, umożliwiając przesiewanie mutacji po przeprowadzeniu mutagenezy, a przed walidacją fenotypową, co wspiera identyfikację wiodących linii w biotechnologii rolniczej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez identyfikację wariantów allelicznych w genach docelowych za pomocą czułej analizy krzywych topnienia.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki HRM, które standaryzują wykrywanie mutacji w dużych populacjach.
- Analityka: Próg Delta F (>0.5) stanowi podstawę statystyczną do rozróżnienia próbek mutantowych od próbek typu dzikiego.
- Badania translacyjne: Potwierdzone sekwencjonowaniem mutacje umożliwiają mapowanie genotyp-fenotyp w celu podejmowania decyzji hodowlanych związanych z konkretnymi cechami.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Protokół jest adaptowalny do różnych genów docelowych i gatunków roślin poza ryżem, co sprzyja ponownemu wykorzystaniu platformy.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Wykrywa zarówno SNP, jak i indels z wysoką czułością, ograniczając liczbę wyników fałszywie ujemnych w przesiewaniu mutacji.
- Wartość operacyjna: Prosta, bezpieczna i szybka (SSF) ekstrakcja DNA w połączeniu z HRM minimalizuje zużycie odczynników i zapotrzebowanie na sprzęt.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybsze podejmowanie decyzji go/no-go w programach hodowlanych poprzez szybką identyfikację użytecznych wariantów allelicznych.
- Wpływ na portfolio: Zwiększa pewność w prowadzeniu linii z potwierdzonymi mutacjami, redukując ryzyko niepowodzenia na późnych etapach.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest znajomość konfiguracji urządzenia HRM oraz normalizacji krzywych topnienia.
- Wymagany jest dostęp do termocyklerów z funkcją gradientu w celu optymalizacji temperatury przyłączania.
- Metoda jest zależna od zastosowania płytek kompatybilnych z HRM oraz barwników fluorescencyjnych dla dokładnej analizy topnienia.
- Wymagana jest możliwość sekwencjonowania w celu potwierdzenia mutacji zidentyfikowanych za pomocą HRM.
- Efektywność może różnić się w zależności od długości amplikonu i zawartości GC, co wymaga optymalizacji specyficznej dla danego celu.
