Name: Ekstrakcja kortyzolu z matryc płetw jesiotra i szczęk (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji kortyzolu z płetw i szczęk jesiotra przy użyciu izopropanolu i testu ELISA. Technika ta umożliwia ocenę stresu u zwierząt rzeźnych oraz analizę historycznych próbek biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została przeprowadzona przy wsparciu Wspólnego Programu Badawczego na rzecz Rozwoju Nauki i Technologii Rolnictwa (Tytuł projektu: Analiza zmian produktywności zwierząt gospodarskich ze zmianami klimatu, Nr projektu. PJ012771), Administracja ds. Rozwoju Obszarów Wiejskich, Republika Korei. Również to badanie zostało wsparte grantem (nr PJ01344604) z Zespołu ds. Żywienia i Fizjologii Zwierząt, Narodowy Instytut Nauk o Zwierzętach, RDA, Seul, Korea Południowa. Autorzy wyrażają wdzięczność dyrektorowi generalnemu Persian Gesture Mohammadowi Hassanowi Salmanzadehowi i jego zespołowi, którzy dostarczyli ryby z trzech gatunków jesiotrów badanych w tym badaniu.

Następujące procedury i metody eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Urząd ds. Dobrostanu i Etyki Zwierząt Kangwon National University, Chuncheon, Republika Korei.
1. Kolekcja płetw
<ol>
	<li>Łatwuj jesiotra delikatnie za pomocą siatki, aby zminimalizować obrażenia i stres.</li>
	<li>Przed eutanazją dokładnie opłucz rybę świeżą wodą, a następnie wytrzyj powierzchnię ciała chłonnym ręcznikiem.</li>
	<li>Uderz w głowę ryby plastikowym młotkiem, tak aby ryba została ogłuszona lub straciła przytomność. Zdejmij głowę za pomocą noża.</li>
	<li>Zmierz masę ciała (g) i długość (cm).</li>
	<li>Po eutanazji należy pobrać próbki płetw, tnąc je jak najbliżej ciała za pomocą wysterylizowanych nożyczek chirurgicznych. 
	UWAGA: Dla każdej ryby należy używać indywidualnych, niepochodzących z recyklingu chłonnych ręczników. Dane opisowe dla gatunków wykorzystanych w tym badaniu były następujące: jesiotr bieługa (H. huso): wiek = 18 ± 2,1 miesiąca, masa ciała = 2 700 ± 300 g, długość ciała = 55 ± 5 cm; Jesiotr syberyjski (A. baerii): wiek = 9,6 ± 2,4 miesiąca, masa ciała = 1 750 ± 250 g, długość ciała = 45 ± 5 cm; jesiotr sevruga (A. stellatus): wiek = 14 ± 1,3 miesiąca, masa ciała = 1 000 ± 100 g, długość ciała = 65 ± 5 cm.</li>
</ol>
2. Przygotowanie płetwy do ekstrakcji kortyzolu
<ol>
	<li>Umieścić próbki żeber (jedna próbka na tkankę: ~3 g) na papierze do ważenia laboratoryjnego (107 mm × 210 mm) i suszyć w temperaturze pokojowej przez kilka dni do wyschnięcia.</li>
	<li>Zawiń próbki w arkusze folii aluminiowej, umieść w oznakowanych plastikowych torbach i przenieś do laboratorium.</li>
	<li>Przechowuj próbki w lodówce do dalszego wykorzystania, w tym mycia, ekstrakcji kortyzolu, suszenia i analizy ELISA (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
</ol>
3. Analiza kortyzolu w płetwach
<ol>
	<li>Skalibruj cyfrową wagę analityczną (dokładność: 0,0001) i odważ próbki od 300 ± 10 mg za pomocą papieru do ważenia na szalce wagi.</li>
	<li>Umyć próbki.
	<ol>
		<li>Przenieść każdą próbkę do stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 15 l. Dodaj 3 ml izopropanolu do każdej probówki za pomocą pipety jednokanałowej o pojemności 5 000 μl.</li>
		<li>Obracaj rurki z prędkością 80 obr./min przez 2.5 minuty, aby wypłukać kortyzol i usunąć wszelkie potencjalne zanieczyszczenia zewnętrzne. Powtórz tę procedurę dwukrotnie.</li>
		<li>Umyte próbki należy suszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej (22–28 °C) przez 7 dni.</li>
		<li>Powtórz procedurę prania, używając ultraczystej wody jako środka piorącego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyciągnij kość szczęki z tkanki ciała za pomocą kleszczy do cięcia kości. Zastosować kroki 1.5-3.2.4 do próbek kości szczęki.</li>
	<li>Odważyć (75 ± 5 mg) wysuszone próbki żeber lub szczęk i żuchwy i mielić za pomocą ubijaka do kulek o częstotliwości 50 Hz przez 32 minuty.
	<ol>
		<li>Dostarczyć 1,5 ml metanolu do każdej probówki zawierającej sproszkowaną płetwę lub szczękę za pomocą pipety o pojemności 1000 μl. Umieścić próbki na rotatorze probówkowym przy wolnych obrotach (40 obr./min) przez 18 godzin w temperaturze pokojowej w celu ekstrakcji kortyzolu z ciągłym mieszaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po ekstrakcji kortyzolu odwirować próbki o masie 9 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu zebrać górną warstwę organiczną zawierającą kortyzol (1 ml) z każdej próbki i umieścić ją w oddzielnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
	<ol>
		<li>Wysuszyć próbki przez inkubację w temperaturze 38 °C w celu odparowania metanolu. Wyekstrahowane próbki kortyzolu należy przechowywać przez noc pod wyciągiem, aby metanol mógł się rozproszyć. 
		UWAGA: Warstwa zawierająca kortyzol ma zwykle żółtawy kolor.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wykrywanie kortyzolu w płetwach
<ol>
	<li>Rozmrażanie wysuszonych próbek płetw lub szczęk w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny przed użyciem zestawu ELISA.</li>
	<li>Dodać 400 μl buforu fosforanowego, wirować i wirować przy 1 500 x g przez 15 minut.</li>
	<li>Uruchom każdą próbkę (25 μl) dwukrotnie, aby poprawić dokładność i wiarygodność testu. Usuń wszystkie dane spoza krzywej standardowej jako wartości odstające.</li>
	<li>Ustaw czytnik mikropłytek na 450 nm, a następnie ustaw na μg dL-1 i odczytaj gęstość optyczną płytki.
	<ol>
		<li>Użyj oprogramowania do mikropłytek z czteroparametrowym dopasowaniem krzywej regresji nieliniowej. Przelicz poziomy kortyzolu w próbkach uzyskanych z oprogramowania na pg mg-1, korzystając z następującego równania: 
		F = 10 000E (A/B) (C/D), 
		gdzie F = końcowa wartość poziomu kortyzolu w płetwie (pg mg-1), E = objętość (ml) buforu do oznaczania użytego do odtworzenia wysuszonego ekstraktu, A = stężenie (μg dL-1) dostarczone przez wynik testu, B = masa (mg) płetwy poddanej ekstrakcji, C = objętość (ml) metanolu dodanego do sproszkowanej płetwy, i D = objętość (ml) metanolu odzyskanego z ekstraktu, a następnie wysuszonego w dół3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5.Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Każdą próbkę należy podzielić na dwie podpróbki przed procedurą mycia, a następnie przeprowadzić ją w dwóch powtórzeniach podczas testu z użyciem zestawu ELISA (2 × 2 = 4 obserwacje na próbkę), aby zwiększyć moc testu i wiarygodność wyników.</li>
	<li>Porównaj działanie dwóch rozpuszczalników myjących i ich interakcje, stosując procedurę ogólnego modelu liniowego (GLM) w środowisku oprogramowania SAS do danych pomiarowych18.</li>
	<li>Różnice testowe między średnimi za pomocą testu Tukeya na poziomie istotności p < 0,05. Przyjmij 0,05 
</ol>

<ol><li>Meyer, J. S., Novak, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cortisol%3A+a+novel+biomarker+of+hypothalamic-pituitary-+adrenocortical+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Hair cortisol: a novel biomarker of hypothalamic-pituitary- adrenocortical activity.</a> Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).</li>
<li>Ghassemi Nejad, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cortisol+study%3A+facial+hair+and+nails%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroids+Hormonal+Sciences%22%5BJournal%5D)">A cortisol study: facial hair and nails.</a> Journal of Steroids Hormonal Sciences. 7, 1-5 (2016).</li>
<li>Meyer, J. S., Novak, M. A., Hamel, A., Rosenberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+analysis+of+cortisol+from+human+and+monkey+hair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e50882(2014).</li>
<li>Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+endogenous+cortisol+concentrations+in+the+hair+of+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques.</a> General and Comparative Endocrinology. 147, 255-261 (2006).</li>
<li>Ghassemi Nejad, J., Ataallahi, M., Park, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+validation+of+measuring+Hanwoo+hair+cortisol+concentration+using+bead+beater+and+surgical+scissors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Methodological validation of measuring Hanwoo hair cortisol concentration using bead beater and surgical scissors.</a> Journal of Animal Science and Technology. 61, 41-46 (2019).</li>
<li>Ghassemi Nejad, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wool+cortisol+is+a+better+indicator+of+stress+than+blood+cortisol+in+ewes+exposed+to+heat+stress+and+water+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Animal%22%5BJournal%5D)">Wool cortisol is a better indicator of stress than blood cortisol in ewes exposed to heat stress and water restriction.</a> Animal. 8, 128-132 (2014).</li>
<li>Brossa, A. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cortisol+in+skin+mucus+and+scales+as+a+measure+of+fish+stress+and+habitat+quality.+Ph.D.%22">Cortisol in skin mucus and scales as a measure of fish stress and habitat quality. Ph.D. dissertation</a>. , Faculty of Veterinary Medicine, Universitat Autonoma de Barcelona. Ph.D. dissertation (2018).</li>
<li>Carbajal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortisol+detection+in+fish+scales+by+enzyme+immunoassay%3A+biochemical+and+methodological+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Ichthyology%22%5BJournal%5D)">Cortisol detection in fish scales by enzyme immunoassay: biochemical and methodological validation.</a> Journal of Applied Ichthyology. 34, 1-4 (2018).</li>
<li>Bertotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+matrices+for+cortisol+measurement+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture+Research%22%5BJournal%5D)">Alternative matrices for cortisol measurement in fish.</a> Aquaculture Research. 41, 1261-1267 (2010).</li>
<li>Ghassemi Nejad, J., Jeong, C., Shahsavarani, H., Sung, I. K., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embedded+dental+cortisol+content%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+%26+Metabolic+Syndrome%22%5BJournal%5D)">Embedded dental cortisol content: a pilot study.</a> Endocrinology & Metabolic Syndrome. 5, 240(2016).</li>
<li>Pankhurst, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endocrinology+of+stress+in+fish%3A+an+environmental+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The endocrinology of stress in fish: an environmental perspective.</a> General and Comparative Endocrinology. 170, 265-275 (2011).</li>
<li>Ghassemi Nejad, J., Kim, W. B., Lee, B. H., Sung, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coat+and+hair+color%3A+hair+cortisol+and+serotonin+levels+in+lactating+Holstein+cows+under+heat+stress+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Science+Journal%22%5BJournal%5D)">Coat and hair color: hair cortisol and serotonin levels in lactating Holstein cows under heat stress conditions.</a> Animal Science Journal. 88, 190-194 (2017).</li>
<li>Baker, M. R., Gobush, K. S., Vynne, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+factors+influencing+stress+hormones+in+fish+and+wildlife%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nature+Conservation%22%5BJournal%5D)">Review of factors influencing stress hormones in fish and wildlife.</a> Journal of Nature Conservation. 21, 309-318 (2013).</li>
<li>Aerts, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scales+tell+a+story+on+the+stress+history+of+fish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Scales tell a story on the stress history of fish.</a> PLoS One. 10, e0123411(2015).</li>
<li>Heimbürge, S., Kanitz, E., Otten, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+hair+cortisol+for+the+assessment+of+stress+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The use of hair cortisol for the assessment of stress in animals.</a> General and Comparative Endocrinology. , 10-17 (2019).</li>
<li>Ghassemi Nejad, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+hair+cortisol+concentrations+from+various+body+sites+and+serum+cortisol+in+Holstein+lactating+cows+and+heifers+during+thermal+comfort+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Behavior%3A+Clinical+and+Application+Research%22%5BJournal%5D)">Comparing hair cortisol concentrations from various body sites and serum cortisol in Holstein lactating cows and heifers during thermal comfort zone.</a> Journal of Veterinary Behavior: Clinical and Application Research. 30, 92-95 (2019).</li>
<li>Bussy, U., Wassink, L., Scribner, K. T., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+cortisol+in+lake+sturgeon+%28Acipenser+fulvescens%29+eggs+by+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Determination of cortisol in lake sturgeon (Acipenser fulvescens) eggs by liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B. 1040, 162-168 (2017).</li>
<li>SAS. 1999. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22SAS.+User%27s+Guide+%28Version+8.01+Edition%29%22">SAS. User's Guide (Version 8.01 Edition)</a>. , SAS Inst. Inc. Cary, NC, USA. (1999).</li>
<li>Barton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+in+fishes%3A+a+diversity+of+responses+with+particular+reference+to+changes+in+circulating+corticosteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+and+Comparative+Biology%22%5BJournal%5D)">Stress in fishes: a diversity of responses with particular reference to changes in circulating corticosteroids.</a> Integrative and Comparative Biology. 42, 517-525 (2002).</li>
<li>Ghassemi Nejad, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+hair+and+blood+cortisol+in+sheep+and+dairy+cattle+using+RIA+and+ELISA+assay%3A+a+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Rhythm+Research.+Accepted%22%5BJournal%5D)">Measuring hair and blood cortisol in sheep and dairy cattle using RIA and ELISA assay: a comparison.</a> Biological Rhythm Research. Accepted. , (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Jesiotr jest czasami nazywany "żywą skamieliną", ponieważ w ciągu ostatnich tysiącleci wykazywał niewiele adaptacji. Rodzaj jesiotra Acipenser obejmuje 27 gatunków, które produkują kawior; Jednak trzy gatunki (Beluga, Baerii i Sevruga) produkują większość światowej podaży kawioru. Jesiotry są podatne na przełowienie i ingerencję w ich naturalne środowisko, a zatem są bardziej krytycznie zagrożone niż jakakolwiek inna grupa gatunków. Jesiotr należy do najstarszej grupy żyjących kręgowców, która istnieje od 150 mi...

Kortyzol jest wiarygodnym wskaźnikiem stresu zwierząt. Ekstrakcja kortyzolu stanowi ważne ramy dla badaczy do monitorowania poziomu stresu i ogólnych wzorców stresorów. Na przykład w poprzednich badaniach przeprowadzono metodologiczną walidację pomiarów kortyzolu we włosach przy użyciu różnych metod u ludzi1,2, monkeys3,4, cattle5, sheep6 i goldfish7,8. Wykazano, że pomiary kortyzolu w matrycach takich jak łuski, śluz skórny, kał i krew9 dostarczają informacji o zdrowiu ryb. Gdy pobieranie krwi jest problematyczne lub brakuje łusek, potrzebne są alternatywne matryce do ekstrakcji kortyzolu. U ryb alternatywne matryce mogą obejmować kość szczęki, twardą tkankę podobną do ludzkiego zęba10.
Rozwój nowych matryc i sprawdzonych technik określania poziomów stresu ryb jest szczególnie interesujący dla przemysłu kawiorowego, gdzie jesiotry mogą doświadczać długotrwałej ekspozycji na czynniki stresu środowiskowego11. Płci jesiotra nie można określić przed ukończeniem 2 roku życia, a jesiotry nie mają łusek. Ponieważ kortyzol stopniowo gromadzi się w stałych matrycach na etapie wzrostu2,7,12, długoterminowe dane dotyczące akumulacji kortyzolu z twardych matryc, takich jak płetwy i kości szczęki, mogą dostarczyć wglądu w poziomy stresu na różnych etapach wzrostu. W przeciwieństwie do tego, poziom kortyzolu we krwi zapewnia migawkę poziomu stresu w momencie śmierci i nie może dokładnie reprezentować stresu podczas długotrwałych warunków chowu13,14. Wraz z rosnącą konkurencją na rynku kawioru, coraz ważniejszym obszarem badań stają się nowe podejścia mające na celu poprawę warunków stresowych w produkcji zdrowszych jaj wśród gatunków jesiotrów podczas długotrwałego chowu (8-12 lat lub dłużej). Ze względu na wysoki koszt jesiotra, zebrane próbki są niezwykle kosztowne (8 000-15 000 USD za dojrzałą rybę w zależności od gatunku i etapu wzrostu), co jest czynnikiem ograniczającym projekty badawcze. Jednak opracowanie odpowiedniej techniki ekstrakcji kortyzolu z płetw i szczęk jesiotra może być z pożytkiem zastosowane zarówno w systemach hodowli ryb, jak i w przypadku ryb dziko żyjących, w celu poprawy jakości i odłowu ikry jesiotra zarówno do celów konsumpcyjnych, jak i konserwatorskich.
Oprócz dostarczania wiarygodnych wyników6, wybór odpowiedniej techniki ekstrakcji kortyzolu ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że inne związki obecne w matrycy podczas przygotowywania próbki nie zaciemniają wyniku, co może prowadzić do niespójnych wyników. Równie ważne jest ustalenie, czy poziom kortyzolu w płetwach i szczękach ma wpływ na poziom hormonów w otaczającej wodzie. Heimbürge et al.15 zasugerowali, że na poziom kortyzolu może wpływać wiele czynników, w tym wiek, płeć, ciąża, pora roku, kolor12 oraz region ciała, z którego ekstrahowany jest kortyzol16. Dostępnych jest jednak niewiele informacji na temat wpływu rozpuszczalników myjących na ekstrakcję kortyzolu w matrycach ciała ryb8, a brak informacji na temat tych skutków u jesiotra, z wyjątkiem jaj jesiotra17.
Chociaż analiza wyjściowego poziomu kortyzolu z płetw i kości szczęk jesiotra wymaga eutanazji ryb, to podejście nie pociąga za sobą technik inwazyjnych wymaganych do pobierania próbek krwi u żywych jesiotrów. Próbki płetw i kości szczęki można łatwo pobrać, a ekstrakcję z tych tkanek można przeprowadzić szybko. Podobnie, ekstrakcja i analiza hormonów są proste i wymagają niewielkiego specjalistycznego sprzętu.
W tym badaniu prezentujemy nową i łatwą do zastosowania technikę ekstrakcji, płukania i oznaczania kortyzolu z płetw i kości szczękowych ryb, w celu określenia, czy poziomy kortyzolu mierzone z tych matryc mogą być wiarygodnie używane jako wskaźniki stresu. Zalety tej techniki to łatwe i nieinwazyjne podejście 8, mniejsza zmienność danych i niezawodne wyjście1,6,8,17; Technika ta ma zastosowanie do gatunków ryb bez łusek, takich jak jesiotr. Technika ta wymaga uboju ryb, doboru odpowiednich rozpuszczalników myjących2,4, odpowiedniego mielenia próbek3,5, profesjonalnego testu immunoenzymatycznego (ELISA) application5,7, oraz rozległej wiedzy na temat włączania źródeł kortyzolu do matryc stałych6.
Użyliśmy dwóch różnych rozpuszczalników myjących (ultraczysta woda i izopropanol), aby uzyskać podstawowy poziom kortyzolu w płetwach trzech gatunków jesiotrów: bieługi (Huso huso), syberyjskiego (Acipenser baerii) i sevrugi (A. stellatus), w standardowych warunkach środowiskowych dla każdego gatunku. Kości szczęki H. huso wykorzystano również do oceny stresu u jesiotra. Jest to pierwsze badanie mierzące poziom kortyzolu w kościach szczęk jesiotra. Wyniki tego badania dostarczą danych porównawczych dotyczących kortyzolu dla gatunków jesiotrów we wczesnej fazie wzrostu (~1 rok) przed określeniem płci.

<table><tbody><tr><td>Lateksowe rękawice chirurgiczne do utylizacji</td> Platforma <td>Ansell</td><td>63754090</td><td></td></tr><tr><td>Waga elektroniczna o wadze 100 kg</td><td>Pipeta serologiczna Baskoolnikoo</td><td>101 EM</td><td></td></tr><tr><td>o pojemności do 24 ml</td><td>Becton Dickinson Falcon</td><td>35-7550</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek z filtrami referencyjnymi 450 nm i 490 do 492 nm</td><td>BioTek</td><td>8041000</td><td></td></tr><tr><td>Zbiorniki na odczynniki</td><td>BrandTech</td><td>703459</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa torba do przechowywania na zamek błyskawiczny&nbsp;</td><td>Cleanwrap</td><td>30cm x100m</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>Daejung chemikalia i Metale&nbsp;</td><td>5035-4400</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol metylowy</td><td>Daejung chemicals & Metale&nbsp;</td><td>5558-4100</td><td></td></tr><tr><td>Rotator rurowy- MX-RL-Pro</td><td>DLAB Scientific&nbsp;</td><td>824-2222217777</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjna pipeta do 1,5 i 10 ml</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td>M21518D</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Precyzyjna pipeta do dostarczania 15 i 25 &mu; L</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td>R25623C</td><td></td></tr><tr><td>Papier do ważenia (107 x 210 mm)</td><td>Fisherbrand</td><td>09-898-12B</td><td></td></tr><tr><td>Ubijak do koralików, 50/60 Hz 2A</td><td>GeneReach Biotechnology Corp</td><td>tp0088</td><td></td></tr><tr><td>Rotator płytowy z orbitą zdolną do 500 obr./min</td><td>Hangzhou Miu Instrument&nbsp;</td><td>MU-E30-1044</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe rurki polipropylenowe na co najmniej 24 ml</td><td>Hyundai Micro&nbsp;</td><td>H20050</td><td></td></tr><tr><td>Wyciąg</td><td>Kwang Dong Industrial</td><td>KD 901-22128175</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka o pojemności 1500 x g</td><td>Labo Gene</td><td>&nbsp; 9.900.900.729</td><td></td></tr><tr><td>Mini mieszalnik wirowy</td><td>LMS</td><td>VTX-3000L&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rolka z folii aluminiowej Lotte&nbsp;</td><td>Lotte Aluminium</td><td>B0722X5FK5</td><td></td></tr><tr><td>Waga cyfrowa</td><td>Mettler Toledo&nbsp;</td><td>&nbsp; ME204</td><td></td></tr><tr><td>Woda ultraczysta</td><td>MDM</td><td>MDM-0110</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>Neptune Scientific</td><td>REF 2100.N</td><td></td></tr><tr><td>Duża siatka na ryby</td><td>Staw H2O</td><td>Hoz135&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw kortyzolu w ślinie</td><td>Salimetrics</td><td>1-3002-4</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do cięcia kości</td><td>Sankyo</td><td>26-188A</td> Precyzyjna pipeta wielokanałowa <td></td></tr><tr><td>do dostarczania 50 &mu; L oraz 200 &mu; L</td><td>VITLAB</td><td>18A68756</td><td></td></tr><tr><td>Ręcznik</td><td>Yuhan Kimberly</td><td>1707921546</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła (107 i razy; 210)</td><td>Yuhan Kimberly</td><td>41117</td><td></td></tr></tbody></table>

ekstrakcja kortyzolu z matryc płetw jesiotra i szczęk

Cortisol Extraction from Sturgeon Fin and Jawbone Matrices

Celem tego badania było opracowanie techniki ekstrakcji kortyzolu z płetw jesiotra za pomocą dwóch rozpuszczalników myjących (wody i izopropanolu) oraz ilościowe określenie wszelkich różnic w poziomach kortyzolu między trzema głównymi gatunkami jesiotrów. Płetwy zebrano z 19 ofiarowanych jesiotrów, w tym siedmiu bieługi (Huso huso), siedmiu syberyjskich (Acipenser baerii) i pięciu sevruga (A. stellatus). Jesiotry były hodowane w irańskich gospodarstwach przez 2 lata (2017-2018), a analizę ekstrakcji kortyzolu przeprowadzono w Korei Południowej (styczeń-luty 2019 r.). Kości szczęki pięciu H. huso wykorzystano również do ekstrakcji kortyzolu. Dane analizowano przy użyciu procedury ogólnego modelu liniowego (GLM) w środowisku SAS. Współczynniki zmienności wewnątrz i między testami wynosiły odpowiednio 14,15 i 7,70. Krótko mówiąc, technika ekstrakcji kortyzolu obejmowała dwukrotne przemycie próbek (300 ± 10 mg) 3 ml rozpuszczalnika (woda ultraczysta i izopropanol), obracanie z prędkością 80 obr./min przez 2,5 min, suszenie umytych próbek na powietrzu w temperaturze pokojowej (22-28 °C) przez 7 dni, dalsze suszenie próbek za pomocą ubijaka do kulek przy 50 Hz przez 32 minuty i mielenie ich na proszek, nałożenie 1,5 ml metanolu na wysuszony proszek (75 ± 5 mg) i powolne obroty (40 obr./min) przez 18 godzin w temperaturze pokojowej z ciągłym mieszaniem. Po ekstrakcji próbki odwirowano (9 500 x g przez 10 minut), a 1 ml supernatantu przeniesiono do nowej probówki do mikrowirówki (1,5 ml), inkubowano w temperaturze 38 °C w celu odparowania metanolu i analizowano za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA). Nie zaobserwowano różnic w poziomie kortyzolu w płetwach między gatunkami ani w poziomach kortyzolu w płetwach i szczękach między rozpuszczalnikami do prania. Wyniki tego badania pokazują, że macierz kości szczęki jesiotra jest obiecującym alternatywnym wskaźnikiem stresu dla matryc stałych.

Przedstawiona technika ekstrakcji kortyzolu z płetw została opracowana i potwierdzona w niniejszym badaniu z wykorzystaniem trzech gatunków jesiotrów. Porównano poziomy kortyzolu uzyskane przy zastosowaniu wody ultraczystej i izopropanolu jako rozpuszczalników płuczących (Rysunek 2). Zbadano zawartość kortyzolu w kościach szczękowych H. huso, aby ustalić, czy kości szczękowe jesiotrów mogą być stosowane jako alternatywna macierz w miejsce płetw. Wpły...

W tym badaniu prezentujemy protokół ekstrakcji kortyzolu z płetwy i szczęki jesiotra. Poziom kortyzolu w płetwach i szczękach badano dalej, porównując dwa rozpuszczalniki do mycia, a następnie testy ELISA. W ramach tego badania pilotażowo sprawdzono wykonalność kortyzolu w kości szczęki jako nowego wskaźnika stresu.

Ekstrakcja kortyzolu z matryc płetw jesiotra i szczęk

The aims of this study were to develop a technique for the extraction of cortisol from sturgeon fins using two washing solvents (water and isopropanol) ...

Nasza metoda wprowadza nowatorski alternatywny wskaźnik stresu, który może być platformą dla wielu przyszłych badań nad pomiarem kortyzolu w nowych matrycach niefabularnych i włosowych. Zaletą tej techniki jest jej prostota i możliwość wykorzystania do oceny poziomu stresu nawet u zwierząt poddanych ubojowi. Ustalenie związku między wysokim poziomem kortyzolu a zdrowymi zwierzętami lub ludźmi za pomocą tej techniki może pomóc w diagnozowaniu niektórych chorób.Metoda ta może być również stosowana do badania wielowiekowych próbek biologicznych, takich jak te stare skamieniałości, w celu oceny poziomu stresu w okresie życia próbki. W celu ekstrakcji kortyzolu odważ 300 plus minus 10 miligramów każdej próbki na cyfrowej wadze analitycznej z dokładnością do 0,0001 przed umieszczeniem próbek w pojedynczych 15-mililitrowych probówkach stożkowych. Dodaj trzy mililitry izopropanolu do każdej probówki z próbką i obracaj probówki z prędkością 80 obrotów na minutę przez 2,5 minuty, aby wypłukać kortyzol i usunąć wszelkie potencjalne zanieczyszczenia zewnętrzne.Po ostatnim myciu próbki należy suszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej przez siedem dni, a następnie umyć je jeszcze trzy razy, jak wykazano, przy użyciu świeżej ultraczystej wody do każdego mycia. Odważyć 75 plus minus pięć miligramów wysuszonej próbki żeber lub szczęki i żuchwy użyć ubijaka, aby ostatecznie zmielić próbkę z częstotliwością 50 Hz przez 32 minuty. Następnie dostarczyć 1,5 mililitra metanolu do każdej probówki ze sproszkowaną żeberką lub szczęką i umieścić próbki na rotatorze probówki z prędkością 40 obrotów na minutę przez 18 godzin w temperaturze pokojowej.Po ekstrakcji kortyzolu osadzaj tkanki próbki przez odwirowanie. I przenieś górny mililitr żółtawej, organicznej warstwy zawierającej kortyzol z każdej próbki do pojedynczych 1,5 mililitrowych mikrowirówek. Wysuszyć próbki kortyzolu w temperaturze 38 stopni Celsjusza w dygestorium przez noc, aby odparować metanol.Następnego ranka dodaj 400 mikrolitrów PBS do każdej probówki, odwiruj i odwiruj próbki, aby zebrać kortyzol. W przypadku analizy ELISA załaduj 25 mikrolitrów każdej wyekstrahowanej próbki kortyzolu i kontroluj ją dwa razy do odpowiednich dołków 96-dołkowej płytki ELISA. Załaduj 25 mikrolitrów rozcieńczalnika do oznaczania do dwóch studzienek, aby służyły jako zero i do każdej niespecyficznej studzienki wiążącej.Wymieszaj 15 mikrolitrów koniugatu enzymatycznego z 24 mililitrami rozcieńczalnika do oznaczania i dodaj 200 mikrolitrów koniugatu do każdej studzienki. Mieszaj płytkę na rotatorze przez pięć minut z prędkością 500 obrotów na minutę. Następnie następuje godzinna inkubacja w temperaturze pokojowej.Pod koniec inkubacji przemyć płytkę czterokrotnie 300 mikrolitrami 1x buforu do płukania na studzienkę. Szybkie odwrócenie talerza nad zlewem po każdym myciu, aby wyrzucić bufor i osuszenie talerza na stosie ręczników papierowych. Po ostatnim myciu dodaj 200 mikrolitrów roztworu podłoża TMB do każdej studzienki i umieść płytkę na rotatorze na pięć minut z prędkością 500 obrotów na minutę.Po wymieszaniu inkubować płytkę przez 25 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc ją przed światłem. Pod koniec inkubacji dodać 50 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej studzienki. I mieszaj zawartość płytki na rotatorze przez trzy minuty z prędkością 500 obrotów na minutę lub do momentu, gdy wszystkie dołki zmienią kolor z zielonego na żółty.Następnie odczytaj gęstość optyczną próbek i użyj oprogramowania mikropłytki, aby przeliczyć poziom kortyzolu w każdej próbce na pikogramy na miligram. W tej reprezentatywnej analizie poziomy kortyzolu były zwykle wyższe w próbkach płetw przemytych izopropanolem niż w próbkach przemytych wodą, ale nie zaobserwowano istotnych różnic w poziomach kortyzolu w płetwach między gatunkami jesiotrów. Nie stwierdzono istotnej interakcji między rozpuszczalnikami do prania a gatunkami jesiotra.Badanie kortyzolu z kości szczęki H.Huso w celu ustalenia, czy kości szczęki jesiotra mogą być używane jako alternatywna matryca dla płetw, ujawniło, że rozpuszczalnik myjący nie miał znaczącego wpływu na poziom kortyzolu mierzony w jesiotrze H. Huso. Co więcej, dane ujawniły duże podobieństwo między płetwami trzech badanych gatunków jesiotrów oraz w kościach szczękowych H.Huso. Ważne jest, aby używać ubijaka do kulek do mielenia próbek na drobny proszek i używać odpowiedniego komercyjnego zestawu testowego ELISA w celu pomyślnego pomiaru kortyzolu.Metoda ta może być również stosowana do wykrywania kortyzolu w zębach i innych twardych matrycach, ponieważ pomiary poziomu kortyzolu dostarczają ważnych informacji o tym, jak środowisko wpływa na biologię zwierząt. Metoda ta może być stosowana jako nowe podejście do oceny poziomu kortyzolu w zębach mlecznych u dzieci oraz w endokrynologii dziecięcej, psychobiologii, badaniach behawioralnych, archeologicznych i sądowych.

cortisol-extraction-from-sturgeon-fin-and-jawbone-matrices

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Opisujemy szczurzy model zespołu stresu pourazowego (PTSD), który wykazuje trwałe zmiany w funkcji neuroendokrynnej oraz opóźnioną, długotrwałą i nasiloną reakcję lękową, charakterystyczną dla pacjentów z PTSD. Opisany tutaj model zwierzęcy oraz metody są przydatne do korelacji biomarkerów w jądrach mózgu, które mają charakter mechanistyczny, ale nie mogą być mierzone u pacjentów, z biomarkerami w obwodowych leukocytach, które podlegają pomiarowi.

Biomarkery w modelu zwierzęcym służące do ujawnienia korelatów neuronalnych, hematologicznych i behawioralnych PTSD

Kortyzol (CORT) gromadzi się w rosnących łodygach włosów ludzi i naczelnych. Opisujemy metody ekstrakcji i analizy włosów CORT z dużą precyzją i czułością. Pomiar CORT włosów jest szczególnie dobrze przystosowany do oceny przewlekłego stresu w okresach od tygodni do miesięcy.

Ekstrakcja i analiza kortyzolu z włosów ludzkich i małpich

Próbki krwi są przydatne do oceny biomarkerów stanów fizjologicznych lub chorób in vivo. Tutaj opisujemy metodologię pobierania krwi z bocznej żyły ogonowej u szczura. Ta metoda zapewnia szybkie pobieranie próbek przy minimalnym bólu i inwazyjności.

Pobieranie próbek krwi z bocznej żyły ogonowej szczura

Aktywność nadnerczy może być oceniona u koniowatych poprzez analizę kału pod kątem metabolitów kortykosteronu. Metoda ta oferuje nieinwazyjną opcję oceny długoterminowych wzorców zarówno u koni domowych, jak i wolno żyjących. Protokół ten opisuje zaangażowany test immunologiczny sprzężony z enzymem i związaną z nim walidację biochemiczną.

Analiza glikokortykosteroidów w kale: nieinwazyjne monitorowanie nadnerczy u koniowatych

Analiza stężenia kortyzolu we włosach stanowi alternatywę dla tradycyjnych pomiarów kortyzolu; jednakże, aby pobrać próbki włosów od Afroamerykanów, naukowcy muszą być kulturowo poinformowani i kompetentni. Celem tego protokołu jest zademonstrowanie kulturowo poinformowanej techniki pobierania próbek włosów do analizy kortyzolu od Afroamerykanów.

Pobieranie próbek włosów do analizy kortyzolu we włosach u Afroamerykanów

Hormon wydzielany przez korę nadnerczy jest niezbędny dla zwierząt w walce ze stresem i chorobami. Tutaj przedstawiamy protokół hodowli pierwotnych komórek nadnerczy szczura. Może to być dobra platforma in vitro do badania mechanizmów działania odczynnika będącego przedmiotem zainteresowania w steroidogenezie nadnerczy i biosyntezie lipidów.

Pierwotna hodowla komórek kory nadnerczy szczura i oznaczanie funkcji steroidogennych

Przedstawiamy protokół do określenia optymalnego rozpuszczalnika ekstrakcyjnego do pomiaru kortyzolu z futra koali. Rozpuszczalnikami stosowanymi w tym protokole są metanol, etanol i izopropanol. Określenie optymalnego rozpuszczalnika ekstrakcyjnego pomoże w wiarygodnym pomiarze sierści w celu określenia wpływu przewlekłego stresu na koale.

Pomiar kortyzolu w futrze koali (Phascolarctos cinereus)

Celem tego artykułu jest zidentyfikowanie zmian w poziomie stresu po wizycie w trzech różnych miejscach i opisanie metod stosowanych do identyfikacji poziomów stresu na podstawie pomiarów kortyzolu w ślinie, α-amylazy i psychologicznego narzędzia do samoopisu.

Pomiar poziomu stresu biofizycznego i psychicznego po wizycie w trzech miejscach o różnym poziomie natury

Ten protokół pokazuje, jak zapewnić praktyczne, znaczące wzbogacenie środowiska dla świń, które są trzymane na podłodze z rusztów w różnych etapach ich życia, oraz jak pobierać próbki śliny w sposób nieinwazyjny do pomiaru stężenia kortyzolu, jako biomarkera ostrego stresu.

Zapewnienie znaczącego wzbogacenia środowiska i pomiar kortyzolu w ślinie u świń trzymanych na podłodze rusztowej

Ten protokół opisuje technikę obrazowania konfokalnego do wykrywania trzech trybów fuzji w komórkach chromochłonnych nadnerczy bydlęcych. Te tryby fuzji obejmują: 1) fuzję bliską (zwaną również pocałunkiem i ucieczką), polegającą na otwieraniu i zamykaniu porów fuzyjnych, 2) fuzję pozostawaną, polegającą na otwieraniu porów fuzyjnych i utrzymywaniu otwartych porów, oraz 3) fuzję termokurczliwą, polegającą na kurczeniu się stopionych pęcherzyków.

Mikroskopia konfokalna do pomiaru trzech trybów dynamiki porów fuzyjnych w komórkach chromochłonnych nadnerczy

Ten protokół opisuje szybki metodę przetwarzania przedpłynku do poprawy wykrywania kortyzolu. Używany jest przenośny urządzenie do filtrowania w celu usunięcia mucyn i innych substancji interferencyjnych przy zachowaniu docelowego analitu. Przetworzony przedpłyn wykazuje ulepszony przepływ kapilarny, co umożliwia bardziej spójne i bardziej powtarzalne wykonanie testu.

Urządzenie przenośne do przetwarzania śliny w celu poprawy wykrywania kortyzolu

Poznaj metodę ekstrakcji kortyzolu z płetw i szczęk jesiotra przy użyciu izopropanolu i testu ELISA. Technika ta umożliwia ocenę stresu u zwierząt rzeźnych oraz analizę historycznych próbek biologicznych.

Ekstrakcja kortyzolu z matryc płetw jesiotra i szczęk

Przeglądaj więcej filmów