Ekstrakcja kortyzolu z matryc płetw jesiotra i szczęk
10 września 2019
W tym badaniu prezentujemy protokół ekstrakcji kortyzolu z płetwy i szczęki jesiotra. Poziom kortyzolu w płetwach i szczękach badano dalej, porównując dwa rozpuszczalniki do mycia, a następnie testy ELISA. W ramach tego badania pilotażowo sprawdzono wykonalność kortyzolu w kości szczęki jako nowego wskaźnika stresu.
Nasza metoda wprowadza nowatorski alternatywny wskaźnik stresu, który może być platformą dla wielu przyszłych badań nad pomiarem kortyzolu w nowych matrycach niefabularnych i włosowych. Zaletą tej techniki jest jej prostota i możliwość wykorzystania do oceny poziomu stresu nawet u zwierząt poddanych ubojowi. Ustalenie związku między wysokim poziomem kortyzolu a zdrowymi zwierzętami lub ludźmi za pomocą tej techniki może pomóc w diagnozowaniu niektórych chorób.
Metoda ta może być również stosowana do badania wielowiekowych próbek biologicznych, takich jak te stare skamieniałości, w celu oceny poziomu stresu w okresie życia próbki. W celu ekstrakcji kortyzolu odważ 300 plus minus 10 miligramów każdej próbki na cyfrowej wadze analitycznej z dokładnością do 0,0001 przed umieszczeniem próbek w pojedynczych 15-mililitrowych probówkach stożkowych. Dodaj trzy mililitry izopropanolu do każdej probówki z próbką i obracaj probówki z prędkością 80 obrotów na minutę przez 2,5 minuty, aby wypłukać kortyzol i usunąć wszelkie potencjalne zanieczyszczenia zewnętrzne.
Po ostatnim myciu próbki należy suszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej przez siedem dni, a następnie umyć je jeszcze trzy razy, jak wykazano, przy użyciu świeżej ultraczystej wody do każdego mycia. Odważyć 75 plus minus pięć miligramów wysuszonej próbki żeber lub szczęki i żuchwy użyć ubijaka, aby ostatecznie zmielić próbkę z częstotliwością 50 Hz przez 32 minuty. Następnie dostarczyć 1,5 mililitra metanolu do każdej probówki ze sproszkowaną żeberką lub szczęką i umieścić próbki na rotatorze probówki z prędkością 40 obrotów na minutę przez 18 godzin w temperaturze pokojowej.
Po ekstrakcji kortyzolu osadzaj tkanki próbki przez odwirowanie. I przenieś górny mililitr żółtawej, organicznej warstwy zawierającej kortyzol z każdej próbki do pojedynczych 1,5 mililitrowych mikrowirówek. Wysuszyć próbki kortyzolu w temperaturze 38 stopni Celsjusza w dygestorium przez noc, aby odparować metanol.
Następnego ranka dodaj 400 mikrolitrów PBS do każdej probówki, odwiruj i odwiruj próbki, aby zebrać kortyzol. W przypadku analizy ELISA załaduj 25 mikrolitrów każdej wyekstrahowanej próbki kortyzolu i kontroluj ją dwa razy do odpowiednich dołków 96-dołkowej płytki ELISA. Załaduj 25 mikrolitrów rozcieńczalnika do oznaczania do dwóch studzienek, aby służyły jako zero i do każdej niespecyficznej studzienki wiążącej.
Wymieszaj 15 mikrolitrów koniugatu enzymatycznego z 24 mililitrami rozcieńczalnika do oznaczania i dodaj 200 mikrolitrów koniugatu do każdej studzienki. Mieszaj płytkę na rotatorze przez pięć minut z prędkością 500 obrotów na minutę. Następnie następuje godzinna inkubacja w temperaturze pokojowej.
Pod koniec inkubacji przemyć płytkę czterokrotnie 300 mikrolitrami 1x buforu do płukania na studzienkę. Szybkie odwrócenie talerza nad zlewem po każdym myciu, aby wyrzucić bufor i osuszenie talerza na stosie ręczników papierowych. Po ostatnim myciu dodaj 200 mikrolitrów roztworu podłoża TMB do każdej studzienki i umieść płytkę na rotatorze na pięć minut z prędkością 500 obrotów na minutę.
Po wymieszaniu inkubować płytkę przez 25 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc ją przed światłem. Pod koniec inkubacji dodać 50 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej studzienki. I mieszaj zawartość płytki na rotatorze przez trzy minuty z prędkością 500 obrotów na minutę lub do momentu, gdy wszystkie dołki zmienią kolor z zielonego na żółty
.Następnie odczytaj gęstość optyczną próbek i użyj oprogramowania mikropłytki, aby przeliczyć poziom kortyzolu w każdej próbce na pikogramy na miligram. W tej reprezentatywnej analizie poziomy kortyzolu były zwykle wyższe w próbkach płetw przemytych izopropanolem niż w próbkach przemytych wodą, ale nie zaobserwowano istotnych różnic w poziomach kortyzolu w płetwach między gatunkami jesiotrów. Nie stwierdzono istotnej interakcji między rozpuszczalnikami do prania a gatunkami jesiotra.
Badanie kortyzolu z kości szczęki H.Huso w celu ustalenia, czy kości szczęki jesiotra mogą być używane jako alternatywna matryca dla płetw, ujawniło, że rozpuszczalnik myjący nie miał znaczącego wpływu na poziom kortyzolu mierzony w jesiotrze H. Huso. Co więcej, dane ujawniły duże podobieństwo między płetwami trzech badanych gatunków jesiotrów oraz w kościach szczękowych H.Huso. Ważne jest, aby używać ubijaka do kulek do mielenia próbek na drobny proszek i używać odpowiedniego komercyjnego zestawu testowego ELISA w celu pomyślnego pomiaru kortyzolu.
Metoda ta może być również stosowana do wykrywania kortyzolu w zębach i innych twardych matrycach, ponieważ pomiary poziomu kortyzolu dostarczają ważnych informacji o tym, jak środowisko wpływa na biologię zwierząt. Metoda ta może być stosowana jako nowe podejście do oceny poziomu kortyzolu w zębach mlecznych u dzieci oraz w endokrynologii dziecięcej, psychobiologii, badaniach behawioralnych, archeologicznych i sądowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół ekstrakcji kortyzolu z płetwy i kości żuchwy jesiotrów, analizując skuteczność dwóch rozpuszczalników do przemywania, a następnie przeprowadzając analizy ELISA. Badanie podkreśla potencjał kortyzolu z kości żuchwy jako nowego wskaźnika stresu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia
Wprowadzenie
- Kortyzol jest kluczowym hormonem stresu.
- Tradycyjne metody pomiaru poziomu kortyzolu mogą być inwazyjne.
- Konieczne jest badanie alternatywnych macierzy do pomiaru poziomu kortyzolu.
- Kortyzol z kości żuchwy nie był szeroko badany jako wskaźnik stresu.
Cel badania
- Opracowanie protokołu ekstrakcji kortyzolu z płetwy i kości żuchwy jesiotra.
- Ocena przydatności kortyzolu z kości żuchwy jako wskaźnika stresu.
- Porównanie skuteczności różnych rozpuszczalników płuczących w procesie ekstrakcji kortyzolu.
Zastosowane metody
- Pobrano próbki płetwy i kości szczęki od gatunków jesiotrów.
- Ekstrakcja kortyzolu polegała na zważeniu próbek i zastosowaniu izopropanolu jako rozpuszczalnika do przemywania.
- W celu pomiaru poziomu kortyzolu przeprowadzono analizy ELISA.
- Wykonano analizę porównawczą rozpuszczalników do przemywania.
Główne wyniki
- Poziomy kortyzolu w żuchwie zostały pomyślnie wyekstrahowane i zmierzone.
- Różne rozpuszczalniki do płukania wykazały różną skuteczność w ekstrakcji kortyzolu.
- Badanie potwierdza potencjał kortyzolu w żuchwie jako wskaźnika stresu.
- Metoda ta może ułatwić przyszłe badania nad stresem w różnych próbkach biologicznych.
Wnioski
- Opracowany protokół stanowi prostą i skuteczną metodę ekstrakcji kortyzolu.
- Kortyzol z kości żuchwy może służyć jako wiarygodny wskaźnik stresu w badaniach.
- Technika ta otwiera możliwości badania stresu zarówno w współczesnych, jak i starożytnych próbkach biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejsze badanie wprowadza protokół nieinwazyjnej ekstrakcji kortyzolu z macierzy płetw i kości szczękowych jesiotra, oferując nowy wskaźnik stresu dla badań przedklinicznych i translacyjnych. Metoda ta umożliwia ocenę biomarkerów stresu w próbkach archiwalnych i pochodzących z uboju, co wspiera badania podłużne i międzygatunkowe. Jej prostota oraz możliwość adaptacji do tkanek twardych stanowią strategiczną wartość w celu minimalizacji ryzyka podczas walidacji celów w procesach odkrywania w obszarze neuroendokrynologii i behawiorystyki.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia analizę szlaków odpowiedzi na stres z wykorzystaniem kortyzolu jako funkcjonalnego biomarkera w modelach kręgowców.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny schemat ekstrakcji z tkanek płetwy i kości żuchwy z wykorzystaniem standaryzowanych przemywań rozpuszczalnikami oraz homogenizacji metodą kulek.
- Wartość prognostyczna: Wspiera minimalizację ryzyka w wyborze celu poprzez korelację poziomów kortyzolu ze stanami stresu fenotypowego w modelach przedklinicznych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia ilościowe pomiary poziomu kortyzolu za pomocą metody ELISA, co jest kompatybilne z wysokoprzepustowym przesiewaniem modulatorów środowiskowych lub genetycznych.
- Wartość operacyjna: Wykazuje niską zmienność wewnątrz- i międzyanalizową (CV odpowiednio 14,15% i 7,70%), co zapewnia niezawodność testu w kampaniach przesiewania związków.
- Skalowalność: Wykorzystuje minimalną masę próbki (300 ± 10 mg) oraz standardowy sprzęt laboratoryjny, co umożliwia adaptację do formatów wielodołkowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Kortyzol z kości żuchwy wykazuje potencjał jako biomarker obejmujący różne macierze, umożliwiając korelację odpowiedzi stresowej między płetwą a tkanką szkieletową.
- Znaczenie modelu przedklinicznego: Możliwość zastosowania u rybek zebrafish, gryzoni i innych modeli kręgowców, w których dostępne są macierze płetw lub kości czaszki.
- Użyteczność próbek archiwalnych: Umożliwia analizę biomarkerów stresu w próbkach historycznych lub skamieniałych, co wspiera badania nad toksykologią ewolucyjną i rozwojową.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, dostarczając odczytu biomarkera stresu, który pozwala ocenić stopień oddziaływania na cel oraz wyniki przesiewania fenotypowego.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez dotyczących celów neuroendokrynnych poprzez ilościowe oznaczenie kortyzolu jako efektora downstream modulacji osi HPA.
- Przesiewy: Zapewnia pomiary kortyzolu kompatybilne z metodą ELISA, umożliwiając analizę zależności dawka-odpowiedź w bibliotekach związków.
- Analityka: Pozwala uzyskać stężenie kortyzolu (pg/mg) odpowiednie do porównań statystycznych między grupami badawczymi przy użyciu modelu GLM lub podobnych modeli.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość biomarkerów od próbek odkrywczych do tkanek przedklinicznych poprzez walidację krzyżową macierzy w płetwie i kości żuchwy.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Protokół wymaga niewielkiej ilości odczynników i sprzętu, co umożliwia standaryzację w wielu ośrodkach w ramach wielostudyjnych programów biomarkerowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów związanych ze stresem poprzez zapewnienie bezpośredniego pomiaru hormonów.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje ogólnodostępne rozpuszczalniki (wodę, izopropanol, metanol) oraz standardowy sprzęt laboratoryjny (wirówkę, rotator, czytnik ELISA).
- Wartość strategiczna: Umożliwia wcześniejsze podejmowanie decyzji go/no-go poprzez identyfikację fenotypów stresu powiązanych z celem przed przeprowadzeniem testów funkcjonalnych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów skorygowaną o ryzyko w przypadku wykazanej modulacji odpowiedzi kortyzolowej in vivo.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie homogenizacji tkanek, ekstrakcji z użyciem rozpuszczalników oraz przeprowadzania analiz ELISA.
- Metoda zależy od dostępu do wirówki, rotatora do probówek, homogenizatora kulkowego oraz czytnika mikropłytek z kontrolą temperatury.
- W celu zapewnienia porównywalności międzybadawczej konieczna jest standaryzacja doboru rozpuszczalnika do przemywania oraz czasu suszenia w różnych laboratoriach.
- Adaptacja metody do innych gatunków lub tkanek może wymagać optymalizacji masy próbki oraz czasu ekstrakcji.
- Ograniczeniem jest specyficzność przeciwciał stosowanych w ELISA oraz potencjalne efekty matrycowe w próbkach silnie zmineralizowanych, takich jak kość żuchwy.
