Name: Wprowadzenie nokautu genu bezpośrednio do stadium amastigoty Trypanosoma cruzi za pomocą systemu CRISPR/Cas9 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Poznaj metodę nokautu genu w amastigotach Trypanosoma cruzi za pomocą CRISPR/Cas9. Technika umożliwia badanie fenotypu wzrostowego pasożyta poza komórkami gospodarza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została częściowo wsparta przez JSPS KAKENHI Grant Number 18K15141 dla Y.T.

UWAGA: Przegląd całego przebiegu eksperymentu przedstawiono na Rysunku 1.
<img alt="Schemat procesu edycji genów Trypanosoma: elektroporacja, Cas9, replikacja akseniczna, inwazja gospodarza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59962/59962fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd eksperymentu z nokautem z wykorzystaniem EA. Trypomastigoty pochodzące z hodowli tkankowych są zbierane i różnicowane w formy amastygote (EA). gRNA jest transfekowane do amastygot wykazujących ekspresję Cas9 poprzez elektroporację, a fenotyp wzrostu amastygot z nokautem genu jest oceniany poprzez replikację akseniczną lub replikację wewnątrzkomórkową po inwazji komórek gospodarza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59962/59962fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
1. Przygotowanie hodowli pasożytów
<ol>
	<li>szczep Tulahuen Trypanosoma cruzi jest stosowany w całym niniejszym raporcie. Utrzymuj epimastygoty T. cruzi w pożywce LIT (10% FCS, patrz Tabela uzupełniająca 1). Szczelnie zakręć zakrętkę i przechowuj kolbę z hodowlą w 28 °C.</li>
	<li>Wytwarzanie szczepu transgenicznego T. cruzi który zawiera endonukleazę Cas9. Przykłady plazmidów ekspresyjnych zawierających sekwencję kodującą Cas9 oraz G418 (neormarker selekcyjny można znaleźć w pracy Lander et al.4 oraz Peng i wsp.5
	<ol>
		<li>Przeprowadź transfekcję powyższego plazmidu do epimastygot metodą elektroporacji, używając zestawu wymienionego w Tabela materiałówDla 1 kuwety odwiruj 2 x 107 komórki, odrzuć nadsącz i resuspenduj w 100 µL buforu do elektroporacji zawierającego dostarczony roztwór suplementu. 
		UWAGA: Bufor do elektroporacji można zastąpić buforem EM24 (mieszanina cytomix w stosunku 3:1)25 or bufor fosforanowo-sacharozowy).</li>
		<li>Dodaj 20-40 µg plazmidu, a następnie przenieść mieszaninę do kuwety do elektroporacji z przerwą 2 mm. Przyłożyć impuls za pomocą urządzenia do elektroporacji (patrz Tabela materiałów), z wykorzystaniem programu X-1426.</li>
		<li>Przenieś zawartość kuwety do kolby T-25 zawierającej 5 ml podłoża LIT (10% FCS). Inkubuj kolbę w temperaturze 28 °C przez 24 h.</li>
		<li>Dodać G418 do stężenia końcowego wynoszącego 250 µg/mL następnie kontynuuj inkubację w temperaturze 28 ˚C. Eliminacja nietransfekowanych epimastygot trwa około 1 tygodnia. Gdy populacja oporna na G418 zacznie się regenerować, przeprowadzaj pasażowanie hodowli raz lub dwa razy w tygodniu, aby uniknąć nasycenia i rozcieńczyć martwe komórki. Ustanowienie stabilnej linii komórkowej zajmuje zazwyczaj łącznie 4 tygodnie. 
		UWAGA: Jeśli konstytutywna ekspresja Cas9 stanowi obciążenie dla komórki5aby ograniczyć ekspresję do stadium amastigota, poprzez dołączenie 3’-UTR genu amastyny bezpośrednio za ramką odczytującą Cas927Szczegółowy opis plazmidu ekspresyjnego Cas9 specyficznego dla amastigot znajduje się w pracy Takagi i wsp.22</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utworzenie kokultury gospodarza i pasożyta z ekspresją Cas9 T. cruzi or ssacze komórki gospodarza. W niniejszym raporcie jako komórki gospodarza zastosowano fibroblasty linii 3T3-Swiss Albino.
	<ol>
		<li>Różnicowanie T. cruzi epimastigoty w metacykliczne trypomastigoty. Wyznaczyć gęstość komórkową hodowli epimastigot za pomocą hemocytometru i zebrać 5 x 107 komórki poprzez wirowanie przez 15 min przy 2 10 x g. Odlać supernatant i resuspenderować komórki w 10 ml pożywki RPMI. Inkubować pasożyta w 28 °C przez 1 tydzień28.</li>
		<li>Zebrać metakliczne trypomastigoty w medium RPMI. Ostrożnie przechylić kolbę i odessać roztwór pipetą, niepokojąc pasożytów przytwierdzonych do dolnej powierzchni. Przenieść medium do probówki stożkowej i wirować przez 15 min przy 2100 x g. Odrzuć supernatant i resuspender pasożyty w 5 ml DMEM (10% FCS). 
		UWAGA: Populacja pasożytów stanowi mieszaninę metacyclicznych trypomastigot, epimastigot oraz niektórych form pośrednich. Chociaż nie jest to konieczne, można wyizolować trypomastigoty za pomocą chromatografii jonowymiennej DEAE.29Alternatywnie epimastygoty można wyeliminować poprzez inkubację pasożytów z aktywnym surowicą w celu poddania ich lizie zależnej od dopełniacza.30.</li>
		<li>Wysiać fibroblasty linii 3T3-Swiss Albino do uzyskania 60–70% konfluencji, czyli około 1,7–2,0 x 106 komórki w 5 ml DMEM (10% FCS) w kolbie hodowlanej T-25. Usunąć medium wzrostowe i dodać mieszaninę pasożytów z kroku 1.3.2. Inkubować przez 24 h w temperaturze 37 ˚C w atmosferze 5% CO22 w inkubatorze z nawilżaniem w celu wywołania infekcji.</li>
		<li>Usunąć pasożyty pozostające poza komórkami gospodarza 3T3 poprzez dwukrotne przemycie kokultury medium DMEM (10% FCS).</li>
		<li>Po nasyceniu kokultury należy przeprowadzić pasaż zainfekowanych amastigotami komórek gospodarza poprzez trypsynizację. Odessać pożywkę i jednokrotnie opłukać kulturę buforem PBS. Nałożyć 1 ml 0,05% roztworu trypsyny tak, aby pokrył całą powierzchnię kultury, a następnie inkubować przez kilka minut w temperaturze pokojowej, aż przytwierdzone komórki gospodarza odkleją się od powierzchni. Odizolować komórki od powierzchni kolby, przepłukując je 3 ml pożywki DMEM (10% FCS).</li>
		<li>Przenieś oddzielone komórki gospodarza do probówki stożkowej i wiruj przez 3 min w 300 x g. g. Odssać supernatant i resuspender komórki w 3 ml świeżej pożywki DMEM (10% FCS). Ten etap pomaga wyeliminować pozostałe epimastygoty. Przenieść całość do czystej kolby T-75 zawierającej 9 ml pożywki DMEM (10% FCS). Kontynuować hodowlę do momentu uwolnienia trypomastigot do supernatantu hodowli.</li>
		<li>Utrzymuj ko-kulturę poprzez pasażowanie z trypsynizacją dwa razy w tygodniu. Gdy 70-80% populacji gospodarza zostanie zainfekowanych, regularnie dodawaj niezinfekowane komórki 3T3 gospodarza w stosunku 5:1 (komórki przeniesione:świeże), aby uniknąć degradacji kultury. Ucieczka trypomastigotów następuje w sposób ciągły, jeśli zachowana jest równowaga między komórkami gospodarza a T. cruzi jest odpowiednio konserwowany.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Różnicowanie trypomastigotów w formy EA
<ol>
	<li>W dniu poprzedzającym eksperyment należy usunąć pożywkę wzrostową z kokultury gospodarz-pasożyt i dodać świeże DMEM (10% FCS), aby wypłukać EA oraz trypomastigoty, które uwolniły się z komórek gospodarza w poprzednich dniach. Standardowe eksperymenty wymagają co najmniej dwóch kolb T-75 z konfluencyjną kokulturą.</li>
	<li>Należy zebrać nadsącz z hodowli do probówki stożkowej, aby pozyskać świeżo uwolnione trypomastigoty. Próbkę należy sprawdzić pod mikroskopem (obiektyw 10x lub 20x) w celu oceny jakości. W przypadku obecności szczątków komórek gospodarza należy krótko odwirować próbkę i przenieść nadsącz do nowej probówki. Jeśli stwierdzono znaczną liczbę EA, trypomastigoty należy wyizolować za pomocą poniższej procedury wypływania (swim-out).
	<ol>
		<li>Mieszaninę trypomastigot i amastigot należy wirować przez 15 min przy 2,10 x g. Należy usunąć większość nadsączu, pozostawiając w probówce 0,5-1,0 mL pożywki. 
		UWAGA: Zmniejszenie objętości jest opcjonalne, ale ułatwia kolejny krok.</li>
		<li>Osad należy inkubować w temperaturze 37 ˚C przez 1-2 h, umożliwiając aktywnym trypomastigotom wypłynięcie z osadu (Rysunek 2).</li>
		<li>Nadsącz zawierający trypomastigoty należy przenieść do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Probówkę stożkową należy wirować przez 15 min przy 2,10 x g, aby zebrać trypomastigoty. Jeśli powyżej wykonano procedurę wypływania, probówkę 1,5 mL należy wirować przez 2 min przy 4,0 x g, aby uzyskać osad trypomastigot. Nadsącz należy usunąć.</li>
	<li>Osad należy resuspendować w 5 mL DMEM buforowanego 20 mM MES (pH 5,0), uzupełnionego o 0,4% BSA19. Pasożyty należy przenieść do kolby hodowlanej T-25. Nakrętka powinna pozostać lekko poluzowana. Gęstość komórek musi wynosić około 1 x 107 komórek/mL lub mniej, ponieważ nadmierne nasycenie zwiększa ryzyko śmierci komórkowej. 
	UWAGA: Kolor DMEM musi być żółty, a nie pomarańczowy. Jeśli oryginalne DMEM miało wysoką pojemność buforową, 20 mM MES (pH 5,0) może być niewystarczające do obniżenia pH. W takim przypadku należy skorygować pH pożywki poprzez dodanie HCl. Zakwaszona pożywka może być przechowywana w temperaturze 4 ˚C, ale nie dłużej niż przez 1 miesiąc.</li>
	<li>Kolbę z hodowlą należy inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 w inkubatorze z nawilżaniem. Po 24 h około 95% pasożytów różnicuje się w amastigoty.</li>
</ol>
3. Elektroporacja EA
<ol>
	<li>Przygotować gRNA do elektroporacji. Można to przeprowadzić za pomocą transkrypcji in vitro lub poprzez zakup syntetycznych oligonukleotydów RNA od producenta. W niniejszym protokole zastosowano crRNA i tracrRNA firmy Integrated DNA Technologies, Inc.</li>
	<li>Odwirować hodowlę EA przez 15 min przy 2 10 x g. Odlać supernatant.</li>
	<li>Resuspendować osad w buforze do elektroporacji zawierającym dostarczony roztwór suplementu do końcowej gęstości komórek 1 x 108 komórek/mL. 
	UWAGA: Bufor EM powoduje większą śmiertelność komórek w porównaniu z buforem do elektroporacji wymienionym w Tabeli materiałów; dlatego nie jest on zalecany do transfekcji amastygot (Rycina dodatkowa 1).</li>
	<li>Przenieść 10 µL resuspendowanych pasożytów (1 x 107 komórek) do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Dodać 5-10 µg gRNA i delikatnie wymieszać poprzez pipetowanie.</li>
	<li>Przenieść mieszaninę do kuwety do elektroporacji z przerwą 2 mm. Aplikować impuls za pomocą urządzenia do elektroporacji, korzystając z programu X-14.</li>
	<li>Przenieść zawartość kuwety do kolby T-25 zawierającej 5 mL uprzednio ogrzanej pożywki LIT (10% FCS). Pozostawić lekko poluzowany zakręt i inkubować kolbę w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2.</li>
	<li>Monitorować wzrost komórek poprzez kontynuację hodowli aksenicznej (sekcja 4) lub jako wewnątrzkomórkowe amastygoty po zakażeniu komórek gospodarza (sekcja 5).</li>
</ol>
4. Monitorowanie wzrostu komórek typu knockout jako aksenicznych amastigot
<ol>
	<li>Amastigoty (EAs) osadzają się na dnie pożywki hodowlanej, dlatego należy delikatnie wstrząsnąć kolbą, aby ponownie zawiesić je w roztworze. Pomocne jest przemycie powierzchni kolby za pomocą pipety, ponieważ niektóre komórki przylegają do ścianek.</li>
	<li>Wymieszaj 1 µL roztworu jodku propidyny (PI) (20 µg/mL) z 20 µL hodowli amastigot. 
	UWAGA: Nie pozostawiaj kolby z hodowlą poza inkubatorem dłużej niż jest to konieczne. Temperatura jest jednym z czynników umożliwiających proliferację akseniczną2.</li>
	<li>Nanieś próbkę na komorę licznikową (hemocytometr) i obserwuj pod mikroskopem fluorescencyjnym. PI przenika przez uszkodzone błony komórkowe, ale nie dostaje się do żywych komórek. Policz liczbę żywotnych amastigot, które nie zostały zabarwione przez PI (ex/em 570 nm/602 nm).</li>
</ol>
5. Monitorowanie wzrostu komórek z knockoutem jako wewnątrzkomórkowych amastygot
<ol>
	<li>Wysiej komórki gospodarza 3T3 na płytkę 12-dołkową w podłożu DMEM (10% FCS). Dostosuj gęstość komórek do 70-80% konfluencji, czyli około 3 x 105 komórek na dołek. 
	UWAGA: Ponieważ amastygoty nie są ruchliwe, pokrycie większości powierzchni wzrostu przez komórki gospodarza poprawia wydajność infekcji.</li>
	<li>Zbierz amastygoty z knockoutu z kroku 3.6 poprzez wirowanie jeden dzień po elektroporacji. Odlej nadsącz i resuspenderaj pasożyty w 2 mL DMEM (10% FCS).</li>
	<li>Usuń medium z hodowli komórek gospodarza i dodaj resuspenderowane amastygoty. Wielokrotność infekcji (MOI) powinna wynosić 20 lub więcej. Inkubuj płytkę w 37 °C w 5% CO2 przez 2 dni, aby umożliwić amastygotom ustanowienie infekcji. 
	UWAGA: Okres infekcji może trwać 1 dzień, w zależności od celu.</li>
	<li>Dwukrotnie wypłucz pozostałe poza komórkami gospodarza amastygoty za pomocą DMEM (10% FCS).</li>
	<li>Dodaj świeże DMEM (10% FCS) do kokultury gospodarz-pasożyt i kontynuuj inkubację w 37 °C przez kolejne 2 dni.</li>
	<li>Aby ocenić wydajność infekcji, zwizualizuj jądra komórek gospodarza i wewnątrzkomórkowe amastygoty. 
	UWAGA: Jądra mają tendencję do nakładania się w nasyconej kokulturze. Ponowne wysianie komórek przy niższej gęstości (np. rozcieńczenie 1:5) przed fiksacją i barwieniem ułatwia liczenie jąder.
	<ol>
		<li>Usuń medium hodowlane i dodaj 1 mL 10% roztworu formaliny w PBS, aby ufiksować komórki. Inkubuj przez 10 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zastąp roztwór formaliny 1 mL PBS zawierającego 1 µg/mL Hoechst 342 oraz 0,1% Triton X-10. Inkubuj przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usuń roztwór Hoechst i przepłucz komórki raz w PBS. Dodaj 1 mL świeżego PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwuj pod mikroskopem fluorescencyjnym i zidentyfikuj jądra komórek gospodarza powiązane z mniejszymi jądrami pasożytów (Rycina 4). Komórki gospodarza zawierające więcej niż 2 amastygoty powinny być uznane za zainfekowane, aby wykluczyć nieproduktywną infekcję początkową lub niewypłukane amastygoty.</li>
</ol>

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22%28WHO%29+Fact+sheet%3A+Chagas+disease+%28American+trypanosomiasis%29%22">(WHO) Fact sheet: Chagas disease (American trypanosomiasis)</a>. , [updated 2017 Mar; cited 2017 Aug], at http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/ (2017).</li>
<li>Clayton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chagas+disease+101%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chagas disease 101.</a> Nature. 465 (n7301_supp), S4-S5 (2010).</li>
<li>Apt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+developing+therapeutic+agents+in+the+treatment+of+Chagas+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Design%2C+Development+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Current and developing therapeutic agents in the treatment of Chagas disease.</a> Drug Design, Development and Therapy. 4, 243-253 (2010).</li>
<li>Lander, N., Li, Z. H. H., Niyogi, S., Docampo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-induced+disruption+of+paraflagellar+rod+protein+1+and+2+genes+in+Trypanosoma+cruzi+reveals+their+role+in+flagellar+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-induced disruption of paraflagellar rod protein 1 and 2 genes in Trypanosoma cruzi reveals their role in flagellar attachment.</a> mBio. 6 (4), e01012(2015).</li>
<li>Peng, D., Kurup, S. P., Yao, P. Y., Minning, T. A., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-mediated+single-gene+and+gene+family+disruption+in+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-mediated single-gene and gene family disruption in Trypanosoma cruzi.</a> mBio. 6 (1), e02097-e02114 (2015).</li>
<li>Romagnoli, B. A. A., Picchi, G. F. A., Hiraiwa, P. M., Borges, B. S., Alves, L. R., Goldenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+in+the+CRISPR%2FCas9+system+for+high+efficiency+gene+disruption+in+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">Improvements in the CRISPR/Cas9 system for high efficiency gene disruption in Trypanosoma cruzi.</a> Acta Tropica. 178, 190-195 (2018).</li>
<li>Burle-Caldas, G. A., Soares-Simões, M., Lemos-Pechnicki, L., DaRocha, W. D., Teixeira, S. M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+two+CRISPR-Cas9+genome+editing+protocols+for+rapid+generation+of+Trypanosoma+cruzi+gene+knockout+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Assessment of two CRISPR-Cas9 genome editing protocols for rapid generation of Trypanosoma cruzi gene knockout mutants.</a> International Journal for Parasitology. 48 (8), 591-596 (2018).</li>
<li>Costa, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+toolbox+for+Trypanosoma+cruzi%3A+A+parasite+line+incorporating+a+bioluminescence-fluorescence+dual+reporter+and+streamlined+CRISPR%2FCas9+functionality+for+rapid+in+vivo+localisation+and+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Expanding the toolbox for Trypanosoma cruzi: A parasite line incorporating a bioluminescence-fluorescence dual reporter and streamlined CRISPR/Cas9 functionality for rapid in vivo localisation and phenotyping.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (4), e0006388(2018).</li>
<li>Soares Medeiros, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Efficiency+Genome+Editing+in+Protozoan+Parasites+Using+CRISPR-Cas9+Ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">High-Efficiency Genome Editing in Protozoan Parasites Using CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins.</a> mBio. 8 (6), (2017).</li>
<li>Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+axenic+amastigote+system+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">An axenic amastigote system for drug screening.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (4), 818-822 (1997).</li>
<li>Bates, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axenic+culture+of+Leishmania+amastigotes%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+Today%22%5BJournal%5D)">Axenic culture of Leishmania amastigotes.</a> Parasitology Today. 9 (4), 143-146 (1993).</li>
<li>Ravinder, R., Bhaskar, B., Gangwar, S., Goyal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+luciferase+expressing+Leishmania+donovani+axenic+amastigotes+as+primary+model+for+in+vitro+screening+of+antileishmanial+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of luciferase expressing Leishmania donovani axenic amastigotes as primary model for in vitro screening of antileishmanial compounds.</a> Current Microbiology. 65 (6), 696-700 (2012).</li>
<li>Nühs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Validation+of+a+Novel+Leishmania+donovani+Screening+Cascade+for+High-Throughput+Screening+Using+a+Novel+Axenic+Assay+with+High+Predictivity+of+Leishmanicidal+Intracellular+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Development and Validation of a Novel Leishmania donovani Screening Cascade for High-Throughput Screening Using a Novel Axenic Assay with High Predictivity of Leishmanicidal Intracellular Activity.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), 1-17 (2015).</li>
<li>De Rycker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+high-throughput+high-content+intracellular+Leishmania+donovani+assay+with+an+axenic+amastigote+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Comparison of a high-throughput high-content intracellular Leishmania donovani assay with an axenic amastigote assay.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (7), 2913-2922 (2013).</li>
<li>Rochette, A., Raymond, F., Corbeil, J., Ouellette, M., Papadopoulou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+comparative+RNA+expression+profiling+of+axenic+and+intracellular+amastigote+forms+of+Leishmania+infantum%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Whole-genome comparative RNA expression profiling of axenic and intracellular amastigote forms of Leishmania infantum.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 165 (1), 32-47 (2009).</li>
<li>Pescher, P., Blisnick, T., Bastin, P., Späth, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteome+profiling+informs+on+phenotypic+traits+that+adapt+Leishmania+donovani+for+axenic+and+intracellular+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteome profiling informs on phenotypic traits that adapt Leishmania donovani for axenic and intracellular proliferation.</a> Cellular Microbiology. 13 (7), 978-991 (2011).</li>
<li>Andrews, N. W., Hong, K. S. U., Robbins, E. S., Nussenzweig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+surface+antigens+expressed+during+the+morphogenesis+of+vertebrate+forms+of+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Stage-specific surface antigens expressed during the morphogenesis of vertebrate forms of Trypanosoma cruzi.</a> Experimental Parasitology. 64 (3), 474-484 (1987).</li>
<li>Pan, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+cruzi%3A+intracellular+stages+grown+in+a+cell-free+medium+at+37+C%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma cruzi: intracellular stages grown in a cell-free medium at 37 C.</a> Experimental Parasitology. 45 (2), 215-224 (1978).</li>
<li>Tomlinson, S., Vandekerckhove, F., Frevert, U., Nussenzweig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+Trypanosoma+cruzi+trypomastigote+to+amastigote+transformation+by+low+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">The induction of Trypanosoma cruzi trypomastigote to amastigote transformation by low pH.</a> Parasitology. 110 (05), 547(1995).</li>
<li>Ley, V., Andrews, N. W., Robbins, E. S., Nussenzweig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amastigotes+of+Trypanosoma+cruzi+sustain+an+infective+cycle+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Amastigotes of Trypanosoma cruzi sustain an infective cycle in mammalian cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 168 (0022-1007 (Print)), 649-659 (1988).</li>
<li>Bonfim-Melo, A., Ferreira, E. R., Florentino, P. T. V., Mortara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amastigote+Synapse%3A+The+Tricks+of+Trypanosoma+cruzi+Extracellular+Amastigotes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Amastigote Synapse: The Tricks of Trypanosoma cruzi Extracellular Amastigotes.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1341(2018).</li>
<li>Takagi, Y., Akutsu, Y., Doi, M., Furukawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+proliferable+extracellular+amastigotes+for+transient+gene+expression%2C+drug+sensitivity+assay%2C+and+CRISPR%2FCas9-mediated+gene+knockout+in+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Utilization of proliferable extracellular amastigotes for transient gene expression, drug sensitivity assay, and CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in Trypanosoma cruzi.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 13 (1), e0007088(2019).</li>
<li>Fernandes, J. F., Castellani, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+characteristics+and+chemical+composition+of+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Growth characteristics and chemical composition of Trypanosoma cruzi.</a> Experimental Parasitology. 18 (2), 195-202 (1966).</li>
<li>Oberholzer, M., Lopez, M. A., Ralston, K. S., Hill, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+for+Functional+Analysis+of+Flagellar+Proteins+in+African+Trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Approaches for Functional Analysis of Flagellar Proteins in African Trypanosomes.</a> Methods in Cell Biology. 93, 21-57 (2009).</li>
<li>van den Hoff, M. J. B., Moorman, A. F. M., Lamers, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+in+%E2%80%98intracellular%E2%80%99+buffer+increases+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Electroporation in ‘intracellular’ buffer increases cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 20 (11), 2902-2902 (1992).</li>
<li>Pacheco-Lugo, L., Díaz-Olmos, Y., Sáenz-García, J., Probst, C. M., DaRocha, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+gene+delivery+to+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes+through+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+International%22%5BJournal%5D)">Effective gene delivery to Trypanosoma cruzi epimastigotes through nucleofection.</a> Parasitology International. 66 (3), 236-239 (2017).</li>
<li>Coughlin, B. C., Teixeira, S. M., Kirchhoff, L. V., Donelson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amastin+mRNA+abundance+in+Trypanosoma+cruzi+is+controlled+by+a+3%E2%80%99-untranslated+region+position-dependent+cis-element+and+an+untranslated+region-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Amastin mRNA abundance in Trypanosoma cruzi is controlled by a 3’-untranslated region position-dependent cis-element and an untranslated region-binding protein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (16), 12051-1260 (2000).</li>
<li>Shaw, A. K., Kalem, M. C., Zimmer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Gene+Expression+Is+Responsive+to+Starvation+Stress+and+Developmental+Transition+in+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Gene Expression Is Responsive to Starvation Stress and Developmental Transition in Trypanosoma cruzi.</a> mSphere. 1 (2), (2016).</li>
<li>Chao, D., Dusanic, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+studies+of+the+isolation+of+metacyclic+trypomastigotes+of+Trypanosoma+cruzi+by+DEAE+ion+exchange+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Zhonghua+Minguo+wei+sheng+wu+ji+mian+yi+xue+za+zhi+%28Chinese+Journal+of+Microbiology+and+Immunology%29%22%5BJournal%5D)">Comparative studies of the isolation of metacyclic trypomastigotes of Trypanosoma cruzi by DEAE ion exchange chromatography.</a> Zhonghua Minguo wei sheng wu ji mian yi xue za zhi (Chinese Journal of Microbiology and Immunology). 17 (3), 146-152 (1984).</li>
<li>Nogueira, N., Bianco, C., Cohn, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+selective+lysis+and+purification+of+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Studies on the selective lysis and purification of Trypanosoma cruzi.</a> The Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 224-229 (1975).</li>
<li>Minning, T. A., Weatherly, D. B., Atwood, J., Orlando, R., Tarleton, R. L., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+steady-state+transcriptome+of+the+four+major+life-cycle+stages+of+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The steady-state transcriptome of the four major life-cycle stages of Trypanosoma cruzi.</a> BMC Genomics. 10, 370(2009).</li>
<li>Rico, E., Jeacock, L., Kovářová, J., Horn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+high-efficiency+CRISPR-Cas9-targeted+gene+editing+and+precision+base+editing+in+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Inducible high-efficiency CRISPR-Cas9-targeted gene editing and precision base editing in African trypanosomes.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7960(2018).</li>
<li>Fu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+off-target+mutagenesis+induced+by+CRISPR-Cas+nucleases+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Chiurillo, M. A., Lander, N., Bertolini, M. S., Storey, M., Vercesi, A. E., Docampo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+roles+of+mitochondrial+calcium+uniporter+complex+subunits+in+growth+and+infectivity+of+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Different roles of mitochondrial calcium uniporter complex subunits in growth and infectivity of Trypanosoma cruzi.</a> mBio. 8 (3), e00574-e00617 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Wykazaliśmy, że kultura aksoniczna amastigotów T. cruzi może być wykorzystana w nokaucie genów za pośrednictwem CRISPR / Cas9, poprzez elektroportowanie gRNA bezpośrednio do EA wykazującego ekspresję Cas9. W ten sposób można ocenić istotność genu docelowego, szczególnie w stadium amastigoty, bez przechodzenia przez inne etapy rozwoju.
Innym korzystnym aspektem transfekcji amastigotów jest wygoda w testowaniu dużej liczby docelowych genów. Po ustaleniu wspólnej hodowli T. cruzi</em...

Trypanosoma cruzi jest czynnikiem wywołującym chorobę Chagasa, która jest rozpowszechniona głównie w Ameryce Łacińskiej1. T. cruzi ma charakterystyczne etapy cyklu życiowego, ponieważ przemieszcza się między wektorem owada a ssaczym żywicielem2. T. cruzi replikuje się jako epimastigota w jelicie środkowym krwiopijnego pluskwiaka triatominowego i różnicuje się w zakaźną metacykliczną trypomastigotę w jelicie tylnym, zanim zostanie osadzona na ludzkim lub zwierzęcym żywicielu. Gdy trypomastigota dostanie się do organizmu żywiciela przez miejsce ukąszenia lub przez błonę śluzową, pasożyt atakuje komórkę gospodarza i przekształca się w pozbawioną wici okrągłą formę zwaną amastigotą. Amastigota replikuje się w komórce gospodarza i ostatecznie różnicuje się w trypomastigote, który wydostaje się z komórki gospodarza i dostaje się do krwiobiegu, aby zainfekować inną komórkę gospodarza.
Ponieważ obecnie dostępne środki chemioterapeutyczne, benznidazol i nifurtimox, powodują niepożądane skutki uboczne i są nieskuteczne w przewlekłej fazie choroby3, bardzo interesujące jest zidentyfikowanie nowych celów leków przeciwko T. cruzi. W ostatnich latach system CRISPR/Cas9 stał się potężnym narzędziem do skutecznego nokautowania genów u T. cruzi, poprzez transfekcję oddzielnych lub pojedynczych plazmidów zawierających gRNA i Cas94, poprzez stabilną ekspresję Cas9, a następnie wprowadzenie gRNA5,6,7 lub szablon transkrypcji gRNA8lub przez elektroporację wstępnie uformowanego kompleksu gRNA/Cas9 RNP 7,9. Oczekuje się, że ten postęp technologiczny przyspieszy badania nad docelowymi lekami w chorobie Chagasa.
Aby kontynuować rozwój leku, kluczowe jest sprawdzenie istotności docelowego genu lub skuteczności związków kandydujących na lek w amastigocie T. cruzi, ponieważ jest to etap replikacji pasożyta u ssaczego gospodarza. Jest to jednak trudne zadanie, ponieważ amastigotami nie można bezpośrednio manipulować ze względu na obecność przeszkadzającej komórki gospodarza. W Leishmania, pasożytze blisko spokrewnionym z T. cruzi, opracowano metodę hodowli aksenu amastigotów, która została wykorzystana w testach przesiewowych leków10,11,12,13. Chociaż istnieją pewne rozbieżności w podatności na związki między amastigotami aksenicznymi a amastigotami wewnątrzkomórkowymi14, zdolność do utrzymania kultury aksenicznej dostarcza jednak cennych narzędzi eksperymentalnych do badania podstawowej biologii klinicznie istotnego stadium Leishmania15,16. W przypadku T. cruzi literatura dotycząca obecności naturalnie występujących zewnątrzkomórkowych amastigotów (EA)17 oraz produkcji in vitro EA17,18,19 sięga dziesięcioleci wstecz. Ponadto wiadomo, że EA ma zdolność infekcyjną20, choć mniejszą niż trypomastigote, a mechanizm inwazji gospodarza amastigote został wyjaśniony w ostatnich latach (sprawdzone przez Bonfim-Melo et al.21). Jednak w przeciwieństwie do Leishmania, EA nie został wykorzystany jako narzędzie eksperymentalne u T. cruzi, głównie dlatego, że EA został uznany za obligatoryjnego pasożyta wewnątrzkomórkowego, a zatem nie był uważany za "formę replikacyjną" w sensie praktycznym.
Ostatnio nasza grupa zaproponowała wykorzystanie EA T. cruzi jako czasowej kultury aksenicznej22. Amastigoty szczepu T. cruzi Tulahuen mogą namnażać się bez komórek gospodarza w pożywce LIT w temperaturze 37 °C przez okres do 10 dni bez znacznego pogorszenia lub utraty właściwości podobnych do amastigotów. W okresie wzrostu bez gospodarza, EA został z powodzeniem wykorzystany do egzogennej ekspresji genów za pomocą konwencjonalnej elektroporacji, testu miareczkowania leków ze związkami trypanobójczymi oraz nokautu za pośrednictwem CRISPR/Cas9, a następnie monitorowania fenotypu wzrostu. W tym raporcie opisujemy szczegółowy protokół wytwarzania EA pochodzącego z in vitro i wykorzystania aksenu amastigoty w eksperymentach z nokautem.

<table><tbody><tr><td>20% roztwór formaliny</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td><td>068-03863</td><td>komórki mocujące</td></tr><tr><td>25 cm2 kolba hodowlana z podwójnym uszczelnieniem</td><td>AGC Techno Glass</td><td>3100-025</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 kolba hodowlana z podwójnym uszczelnieniem</td><td>AGC Techno Glass</td><td>3110-075</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny All-in One</td><td>Keyence</td><td>BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (dla kontroli)</td><td></td><td>Niestandardowa</td><td>sekwencja docelowa IDT = GGACGGCACCTTCATCTACAAGG</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (dla TcCGM1)</td><td>Niestandardowa</td><td></td><td>sekwencja docelowa IDT = TAGCCGCGATGGAGAGTTTATGG</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (dla TcPAR1)</td><td></td><td>Niestandardowa</td><td>sekwencja docelowa IDT = CGTGGAGAACGCCATTGCCACGG</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td>IDT</td><td>1072532</td><td>do wyżarzania za pomocą crRNA</td></tr><tr><td>Amaxa Urządzenie Nucleofector</td><td>LONZA</td><td>AAN-1001</td><td>elektroporacja</td></tr><tr><td>Podstawowy zestaw nukleofektorów pasożytów 2</td><td>LONZA</td><td>VMI-1021</td><td>elektroporacja</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td>składnik pożywki do amastigogenezy in vitro</td></tr><tr><td>Hemocytometr jednorazowy Burker-Turk</td><td>Watson</td><td>177-212C</td><td>zliczanie komórek</td></tr><tr><td>Coster 12-dołkowe przezroczyste płytki wielodołkowe poddane działaniu TC</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td><td>044-29765</td><td>pożywka hodowlana</td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca, zdefiniowany</td><td>hyklon</td><td>SH30070,03</td><td>inaktywacja termiczna przed użyciem</td></tr><tr><td>Roztwór siarczanu G-418</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td><td>077-06433</td><td>wybór transformantu</td></tr><tr><td>chlorku hemin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-5533</td><td>składnik pożywki LIT</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>barwienie jąder</td></tr><tr><td>Bulion do infuzji wątroby, Difco</td><td>Becton Dickinson</td><td>226920</td><td>składnik podłoża LIT</td></tr><tr><td>MES</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td><td>349-01623</td><td>składnik pożywki do amastigogenezy in vitro</td></tr><tr><td>PBS (&ndash;)</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864-10ML</td><td>barwienie martwych komórek</td></tr><tr><td>RPMI 1646</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td>podłoże do metacyklogenezy</td></tr></tbody></table>

wprowadzenie nokautu genu bezpośrednio do stadium amastigoty trypanosoma cruzi za pomocą systemu crispr/cas9

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Trypanosoma cruzi to chorobotwórczy pasożyt pierwotniaka, który powoduje chorobę Chagasa głównie w Ameryce Łacińskiej. W celu zidentyfikowania nowego celu terapeutycznego przeciwko T. cruzi ważne jest zweryfikowanie istotności docelowego genu w stadium pasożyta u ssaków, amastigoty. Amastigoty T. cruzi replikują się w komórce gospodarza; W związku z tym trudno jest przeprowadzić eksperyment z nokautem bez przejścia przez inne etapy rozwoju. Niedawno nasza grupa poinformowała o warunkach wzrostu, w których amastigota może replikować się aksenicznie przez okres do 10 dni bez utraty swoich właściwości podobnych do amastigoty. Wykorzystując tę czasową kulturę amastigoty aksonicznej, z powodzeniem wprowadziliśmy gRNA bezpośrednio do amastygoty wykazującej ekspresję Cas9, aby spowodować nokaut genów i przeanalizowaliśmy ich fenotypy wyłącznie w stadium amastigoty. W tym raporcie opisujemy szczegółowy protokół produkcji zewnątrzkomórkowych amastigotów pochodzących z in vitro oraz wykorzystania kultury aksenicznej w eksperymencie nokautu za pośrednictwem CRISPR/Cas9. Fenotyp wzrostu amastigotów z nokautem można ocenić albo na podstawie liczby komórek w kulturze aksenicznej, albo na podstawie replikacji wewnątrzkomórkowego amastigotu po inwazji komórek gospodarza. Metoda ta omija różnicowanie stadiów pasożyta normalnie związane z wytwarzaniem transgenicznej lub nokautującej amastigoty. Wykorzystanie czasowej kultury aksenicznej amastigoty ma potencjał do rozszerzenia swobody eksperymentalnej badań specyficznych dla danego etapu u T. cruzi.

Izolacja trypomastigotów za pomocą procedury wypływania (swim-out)
Aby zebrać świeże trypomastigoty zanieczyszczonych, starych EA za pomocą procedury wypływania (swim-out), pellety komórkowe należy inkubować przez co najmniej 1 h. Inkubacja pelletów przez więcej niż 2 h nie zwiększa znacząco liczby trypomastigot pływających w roztworze (Rycina 2B). W tym konkretnym doświadczeniu procent trypomastigot w początkowej mieszaninie wynosił 38%, a procen...

Tutaj opisujemy protokół wprowadzania nokautu genu do zewnątrzkomórkowego amastigotu Trypanosoma cruzi za pomocą systemu CRISPR/Cas9. Fenotyp wzrostu może być śledzony albo przez liczenie komórek w aksenowej kulturze amastigotów, albo przez proliferację wewnątrzkomórkowych amastigotów po inwazji komórek gospodarza.

Wprowadzenie nokautu genu bezpośrednio do stadium amastigoty Trypanosoma cruzi za pomocą systemu CRISPR/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Trudno jest wykorzystać stadium zakażenia gospodarza T. cruzi w eksperymentach, ponieważ amastigote jest obligatoryjnym pasożytem wewnątrzkomórkowym. Nasza technika hodowli pozwala amastigocie na tymczasową replikację poza komórkę gospodarza, dzięki czemu możemy przeprowadzać eksperymenty bezpośrednio na tym klinicznie istotnym stadium pasożyta. Procedurę zademonstruje Yukie Akutsu, technik z naszego instytutu.Utrzymuj wspólną kulturę pasożyta żywiciela zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Gdy pasożyt wykazujący ekspresję Cas9 jest gotowy do różnicowania, należy zebrać supernatant do stożkowej probówki i sprawdzić jakość próbki pod mikroskopem. Jeśli występuje znaczna liczba zewnątrzkomórkowych amastigotów, należy przeprowadzić procedurę wypływania, aby wyizolować trypomastigoty.Wirować mieszaninę trypomastigotów i amastigotów przez piętnaście minut jako 2, 100 razy G. Następnie wyrzuć większość supernatantu, pozostawiając 0,5 do 1 mililitra pożywki w probówce. Luźno zakryj probówkę i inkubuj osad w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin, co pozwoli aktywnym trypomastigotom wypłynąć z osadu. Po inkubacji przenieść supernatant z trypomastigotami do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej.Zakręć go w dół i ponownie zasymij granulkę z 5 mililitrami DMEM. Przenieś pasożyta do kolby hodowlanej T-25 i inkubuj kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza poniżej 5% dwutlenku węgla w wilgotnym inkubatorze. Około 95% pasożytów różnicuje się w amastigoty po 24 godzinach.Odwirować kulturę zewnątrzkomórkowych amastigotów przez 15 minut w temperaturze 2, 100 razy G i odrzucić supernatant. Zawiesić osad za pomocą buforu elektroporacyjnego zawierającego dostarczony roztwór suplementu do końcowej gęstości komórek od 10 do 8 komórek na mililitr. Porcję 100 mikrolitrów zawieszonych pasożytów do 1,5-litrowych probówek do mikrowirówek.Następnie dodać od pięciu do 10 mikrogramów przewodnika RNA i delikatnie wymieszać pipetując. Przenieś mieszaninę do kuwety elektroporacyjnej o odstępie dwóch milimetrów i zastosuj impuls za pomocą urządzenia do elektroporacji. Następnie przenieść zawartość kuwety do kolby T-25, zawierającej pięć mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki LIT, pozostawić nasadkę luźną i inkubować kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla.Monitoruj wzrost komórek albo przez kontynuację hodowli aksenicznej, albo jako wewnątrzkomórkowe amastigoty po zakażeniu komórek gospodarza. W przypadku monitorowania wzrostu komórek jako aksowych amastigotów, delikatnie potrząśnij kolbą, aby ponownie zawiesić zewnątrzkomórkowe amastigoty w roztworze i wymieszać 20 mikrolitrów kultury z jednym mikrolitrem roztworu jodku propidyny w probówce do mikrowirówki. Ważne jest, aby nie pozostawiać kolby hodowlanej na zewnątrz inkubatora dłużej niż to konieczne, ponieważ temperatura jest jednym z czynników umożliwiających proliferację aksenu amastigoty.Nałożyć próbkę na hemocytometr i obserwować ją pod mikroskopem fluorescencyjnym. Następnie policz liczbę żywotnych amastigotów, które nie są zabarwione jodkiem propidyny. Aby monitorować wzrost komórek nokautujących jako wewnątrzkomórkowych amastigotów, należy zasiać komórki 3T3 gospodarza w 12-dołkowej płytce z DMEM.Jednego dnia po elektroporacji zbierz nokautujące amastigoty przez odwirowanie, odrzuć supernatant i ponownie zawieś pasożyty za pomocą dwóch mililitrów DMEM. Usuń pożywkę z hodowli komórek gospodarza i dodaj zawieszone amastigoty. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla przez dwa dni, co pozwoli amastigotom na wykrycie infekcji.Po dwóch dniach zmyj zewnątrzkomórkowe amastigoty na zewnątrz komórek gospodarza za pomocą DMEM i dodaj świeży DMEM. Kontynuuj inkubację przez dodatkowe dwa dni, a następnie wizualizuj jądra komórek gospodarza i wewnątrzkomórkowe amastigoty. Wykazano, że amastigoty T. Cruzi transfekowane Guide RNA przeciwko niezbędnemu genowi TcCGM1 wykazują znaczny defekt wzrostu w porównaniu z grupą kontrolną.Podczas monitorowania wzrostu jako wewnątrzkomórkowych amastigotów, frakcja jąder gospodarza związanych z jądrami T. Cruzi jest znacznie niższa w grupie nokautu TcCGM1 w porównaniu z kontrolą. Wręcz przeciwnie, transfekcja Guide RNA przeciwko jednemu z białek pałeczek przyrzęspnych TcPAR1 nie wpływa znacząco na wzrost komórek po czterech dniach hodowli aksenicznej ani nie hamuje wzrostu wewnątrzkomórkowych amastigotów. Jednak pięć dni po zakażeniu liczba trypomastigotów, które wyłaniają się z komórki gospodarza, jest znacznie niższa w kokulturze z nokautem TcPAR1 w porównaniu z kokulturą kontrolną.Co więcej, zróżnicowane trypomastigoty wewnątrz komórki gospodarza w grupie kontrolnej wydawały się bardziej aktywne niż te w grupie nokautowej. Metoda ta może być również wykorzystana do badania wpływu egzogennych genów na stadium amastigoty, zamiast transfekować Guide RNA do amastigoty eksprymującej Cas9, można transfekować plazmid do amastigoty typu dzikiego w celu ekspresji genu egzogennego.

introducing-gene-knockout-directly-into-amastigote-stage-trypanosoma

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Przedstawiono szczegóły dotyczące sposobu wykorzystania mapowania QTL z mapą genetyczną opartą na całej sekwencji genomu do identyfikacji genu oporności na leki w Toxoplasma gondii i jak można to zweryfikować za pomocą systemu CRISPR/Cas9, który skutecznie edytuje cel genomowy, w tym przypadku gen oporności na leki.

Mapowanie QTL i edycja CRISPR/Cas9 w celu identyfikacji genu oporności na leki w Toxoplasma gondii

Opisana tutaj technika genotypowania, która łączy reakcję łańcuchową fluorescencyjnej polimerazy (PCR) z elektroforezą żelu kapilarnego, pozwala na wysokoprzepustowe genotypowanie klonów nokautujących za pośrednictwem nukleazy. Omija ograniczenia, z jakimi borykają się inne techniki genotypowania, i jest bardziej opłacalna niż metody sekwencjonowania.

Wykorzystanie techniki fluorescencyjnej elektroforezy żelowej kapilarnej PCR do genotypowania mutantów nokautujących za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w formacie wysokoprzepustowym

Ten protokół opisuje kroki klonowania wielu pojedynczych przewodnikowych RNA do jednego wektora konkategorującego RNA przewodnika, co jest szczególnie przydatne w tworzeniu wielogenowych nokautów przy użyciu technologii CRISPR/Cas9. Wytwarzanie podwójnych nokautów w organoidach jelitowych przedstawiono jako możliwe zastosowanie tej metody.

Protokół wielokrotnego nokautu genów w organoidach jelita cienkiego myszy przy użyciu konkategomera CRISPR

Ukierunkowana edycja genomu w systemie modelowym Danio rerio (danio pręgowany) została znacznie ułatwiona dzięki pojawieniu się metod opartych na CRISPR. W niniejszym artykule opisujemy uproszczony, solidny protokół generowania i identyfikacji nonsensownych alleli pochodzących z CRISPR, który obejmuje test mobilności heterodupleksowej i identyfikację mutacji przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji.

Wydajna produkcja i identyfikacja nokautów genów generowanych przez CRISPR/Cas9 w systemie modelowym Danio rerio

Protokół szybkiego rozerwania genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w pierwotnych komórkach krwiotwórczych myszy i człowieka jest opisany w tym artykule. Rybonukleoproteiny Cas9-sgRNA są wprowadzane przez elektroporację z sgRNA generowanymi przez transkrypcję in vitro i komercyjny Cas9. Wysoka wydajność edycji jest osiągana przy ograniczonych kosztach czasowych i finansowych.

Wysoce skuteczne rozrywanie genów mysich i ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych za pomocą CRISPR/Cas9

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

Opisujemy metodę generowania mutantów warunkowego knockdown opartych na glmS w Plasmodium falciparum przy użyciu edycji genomu CRISPR/Cas9.

Edycja genu CRISPR/Cas9 w celu stworzenia warunkowych mutantów ludzkiego pasożyta malarii P. falciparum

CRISPR/Cas9 jest coraz częściej używany do charakteryzowania funkcji genów w organizmach niemodelowych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób generować linie nokautujące Culex pipiens, od przygotowania mieszanek iniekcyjnych, po pozyskiwanie i wstrzykiwanie zarodków komarów, a także jak hodować, krzyżować i badać przesiewowo komary, którym wstrzyknięto implanty i ich potomstwo pod kątem pożądanych mutacji.

Przygotowanie i wstrzykiwanie zarodków komarów Culex w celu wygenerowania mutacji zerowych przy użyciu CRISPR/Cas9

Celem tego protokołu jest umożliwienie bezproblemowej edycji genomu C. elegans za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych i markera co-CRISPR dpy-10 do badań przesiewowych. Protokół ten może być stosowany do dokonywania różnych modyfikacji genetycznych u C. elegans, w tym insercji, delecji, wymiany genów i podstawiania kodonów.

Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji zarodka Helicoverpa armigera (Hübner) i identyfikacji mutantów nokautujących, stworzony przez edycję genomu CRISPR/Cas9. Zmutowane owady umożliwiają dalsze badania funkcji genów i interakcji między różnymi genami in vivo.

Mikroiniekcja zarodka i identyfikacja mutanta nokautującego Helicoverpa armigera z edytowanym genomem CRISPR/Cas9 (Hübner)

Funkcjonalny zestaw narzędzi genomicznych dla pasożytniczych nicieni Strongyloides stercoralis i Strongyloides ratti obejmuje transgenezę, mutagenezę za pośrednictwem CRISPR/Cas9 oraz RNAi. Protokół ten pokaże, jak wykorzystać mikroiniekcje dogonadalne do wprowadzenia transgenów i składników CRISPR do S. stercoralis i S. ratti.

Generowanie transgeników i nokautów u gatunków Strongyloides za pomocą mikroiniekcji

Poznaj metodę nokautu genu w amastigotach Trypanosoma cruzi za pomocą CRISPR/Cas9. Technika umożliwia badanie fenotypu wzrostowego pasożyta poza komórkami gospodarza.

Wprowadzenie nokautu genu bezpośrednio do stadium amastigoty Trypanosoma cruzi za pomocą systemu CRISPR/Cas9

Przeglądaj więcej filmów