Wprowadzenie nokautu genu bezpośrednio do stadium amastigoty Trypanosoma cruzi za pomocą systemu CRISPR/Cas9

Trudno jest wykorzystać stadium zakażenia gospodarza T. cruzi w eksperymentach, ponieważ amastigote jest obligatoryjnym pasożytem wewnątrzkomórkowym. Nasza technika hodowli pozwala amastigocie na tymczasową replikację poza komórkę gospodarza, dzięki czemu możemy przeprowadzać eksperymenty bezpośrednio na tym klinicznie istotnym stadium pasożyta. Procedurę zademonstruje Yukie Akutsu, technik z naszego instytutu.

Utrzymuj wspólną kulturę pasożyta żywiciela zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Gdy pasożyt wykazujący ekspresję Cas9 jest gotowy do różnicowania, należy zebrać supernatant do stożkowej probówki i sprawdzić jakość próbki pod mikroskopem. Jeśli występuje znaczna liczba zewnątrzkomórkowych amastigotów, należy przeprowadzić procedurę wypływania, aby wyizolować trypomastigoty.

Wirować mieszaninę trypomastigotów i amastigotów przez piętnaście minut jako 2, 100 razy G. Następnie wyrzuć większość supernatantu, pozostawiając 0,5 do 1 mililitra pożywki w probówce. Luźno zakryj probówkę i inkubuj osad w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin, co pozwoli aktywnym trypomastigotom wypłynąć z osadu. Po inkubacji przenieść supernatant z trypomastigotami do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej.

Zakręć go w dół i ponownie zasymij granulkę z 5 mililitrami DMEM. Przenieś pasożyta do kolby hodowlanej T-25 i inkubuj kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza poniżej 5% dwutlenku węgla w wilgotnym inkubatorze. Około 95% pasożytów różnicuje się w amastigoty po 24 godzinach.

Odwirować kulturę zewnątrzkomórkowych amastigotów przez 15 minut w temperaturze 2, 100 razy G i odrzucić supernatant. Zawiesić osad za pomocą buforu elektroporacyjnego zawierającego dostarczony roztwór suplementu do końcowej gęstości komórek od 10 do 8 komórek na mililitr. Porcję 100 mikrolitrów zawieszonych pasożytów do 1,5-litrowych probówek do mikrowirówek.

Następnie dodać od pięciu do 10 mikrogramów przewodnika RNA i delikatnie wymieszać pipetując. Przenieś mieszaninę do kuwety elektroporacyjnej o odstępie dwóch milimetrów i zastosuj impuls za pomocą urządzenia do elektroporacji. Następnie przenieść zawartość kuwety do kolby T-25, zawierającej pięć mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki LIT, pozostawić nasadkę luźną i inkubować kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla.

Monitoruj wzrost komórek albo przez kontynuację hodowli aksenicznej, albo jako wewnątrzkomórkowe amastigoty po zakażeniu komórek gospodarza. W przypadku monitorowania wzrostu komórek jako aksowych amastigotów, delikatnie potrząśnij kolbą, aby ponownie zawiesić zewnątrzkomórkowe amastigoty w roztworze i wymieszać 20 mikrolitrów kultury z jednym mikrolitrem roztworu jodku propidyny w probówce do mikrowirówki. Ważne jest, aby nie pozostawiać kolby hodowlanej na zewnątrz inkubatora dłużej niż to konieczne, ponieważ temperatura jest jednym z czynników umożliwiających proliferację aksenu amastigoty.

Nałożyć próbkę na hemocytometr i obserwować ją pod mikroskopem fluorescencyjnym. Następnie policz liczbę żywotnych amastigotów, które nie są zabarwione jodkiem propidyny. Aby monitorować wzrost komórek nokautujących jako wewnątrzkomórkowych amastigotów, należy zasiać komórki 3T3 gospodarza w 12-dołkowej płytce z DMEM.

Jednego dnia po elektroporacji zbierz nokautujące amastigoty przez odwirowanie, odrzuć supernatant i ponownie zawieś pasożyty za pomocą dwóch mililitrów DMEM. Usuń pożywkę z hodowli komórek gospodarza i dodaj zawieszone amastigoty. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla przez dwa dni, co pozwoli amastigotom na wykrycie infekcji.

Po dwóch dniach zmyj zewnątrzkomórkowe amastigoty na zewnątrz komórek gospodarza za pomocą DMEM i dodaj świeży DMEM. Kontynuuj inkubację przez dodatkowe dwa dni, a następnie wizualizuj jądra komórek gospodarza i wewnątrzkomórkowe amastigoty. Wykazano, że amastigoty T. Cruzi transfekowane Guide RNA przeciwko niezbędnemu genowi TcCGM1 wykazują znaczny defekt wzrostu w porównaniu z grupą kontrolną.

Podczas monitorowania wzrostu jako wewnątrzkomórkowych amastigotów, frakcja jąder gospodarza związanych z jądrami T. Cruzi jest znacznie niższa w grupie nokautu TcCGM1 w porównaniu z kontrolą. Wręcz przeciwnie, transfekcja Guide RNA przeciwko jednemu z białek pałeczek przyrzęspnych TcPAR1 nie wpływa znacząco na wzrost komórek po czterech dniach hodowli aksenicznej ani nie hamuje wzrostu wewnątrzkomórkowych amastigotów. Jednak pięć dni po zakażeniu liczba trypomastigotów, które wyłaniają się z komórki gospodarza, jest znacznie niższa w kokulturze z nokautem TcPAR1 w porównaniu z kokulturą kontrolną.

Co więcej, zróżnicowane trypomastigoty wewnątrz komórki gospodarza w grupie kontrolnej wydawały się bardziej aktywne niż te w grupie nokautowej. Metoda ta może być również wykorzystana do badania wpływu egzogennych genów na stadium amastigoty, zamiast transfekować Guide RNA do amastigoty eksprymującej Cas9, można transfekować plazmid do amastigoty typu dzikiego w celu ekspresji genu egzogennego.