Solidny test oparty na reakcji łańcuchowej polimerazy do ilościowego oznaczania powtórzeń trinukleotydu cytozyno-guaninowo-guaninowego w genie łamliwego X upośledzenia umysłowego-1

Ta opłacalna metoda może znaleźć szerokie zastosowanie w diagnostyce molekularnej i badaniach przesiewowych zaburzeń związanych z FXS i łamliwym chromosomem X. To szybki czas realizacji i mniejsze inwestycje w sprzęt. Nasz test oparty na PCR może ułatwić klasyfikację pełnego spektrum zaburzeń związanych z FXS i łamliwym chromosomem X, w tym mutacji pośredniej, premutacji i pełnej mutacji, z solidnością i szybkim czasem raportowania.

Procedura zostanie zademonstrowana przez Weng Chua z PerkinElmer Singapore. Zacznij od wyjęcia mieszaniny buforowej PCR, rozcieńczalnika do próbek i próbek DNA z zamrażarki o temperaturze 20 stopni Celsjusza i pozostawienia ich w temperaturze pokojowej na 20 do 30 minut do rozmrożenia. Przed użyciem odczynników należy je odwirować i krótko odwirować.

Zmierzyć stężenie próbki DNA za pomocą spektrofotometru i, jeśli to konieczne, rozcieńczyć ją do 25 nanogramów na mikrolitr za pomocą rozcieńczalnika do próbek. Oznacz dołki na płytce PCR, aby zidentyfikować referencyjne i badane próbki DNA oraz obliczyć liczbę reakcji potrzebnych do przeprowadzenia testu, próbki referencyjnego i próbek kontroli ujemnej. Przygotować główną mieszankę PCR, łącząc 15 mikrolitrów mieszaniny buforowej PCR z 0,6 mikrolitra rozcieńczalnika do próbki i 0,4 mikrolitra polimerazy dla każdej reakcji.

Zmieszaj mieszankę i odwiruj ją. Następnie dozuj 18 mikrolitrów mieszaniny do każdej studzienki. Następnie odpipetować dwa mikrolitry każdego DNA do odpowiedniego dołka.

Wymieszać odczynniki, pipetując pięć razy w górę i w dół, a następnie uszczelnić płytkę. Umieść płytkę w termocyklerze i uruchom PCR zgodnie ze wskazówkami rękopisu. Rozgrzej wytrząsarkę inkubatora do 65 stopni Celsjusza i dodaj 80 mikrolitrów buforu 1X TE do każdego produktu PCR.

Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś próbki na płytkę czyszczącą do PCR i umieść płytkę w shakerze. Inkubuj w temperaturze 65 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 1200 obr./min przez 10 minut. Po inkubacji schłodzić wytrząsarkę inkubatora do 25 stopni Celsjusza, ustawić przyrząd próżniowy na 250 milibarów i zassać roztwór przez filtr.

Po 15 minutach w studzienkach nie powinno pozostać żadne płyny. Wyłącz próżnię i dodaj 50 mikrolitrów buforu 1X TE do każdej studzienki. Zasysać roztwór przez 10 minut, używając poprzednich ustawień próżni.

Osusz spód płyty filtracyjnej, mocno dociskając ją do stosu ręczników papierowych, a następnie dodaj 20 mikrolitrów buforu 1X TE do dolnej środkowej części każdej studzienki. Umieścić płytkę w wytrząsarce i inkubować w temperaturze 25 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 1200 obr./min przez pięć minut. Po inkubacji przenieść co najmniej 15 mikrolitrów oczyszczonego produktu PCR na świeżą 96-dołkową płytkę PCR.

Przed rozpoczęciem przynieś koncentrat barwnika DNA, matrycę żelu DNA, marker DNA, drabinę DNA i oczyszczone próbki DNA do temperatury pokojowej. Ustaw stację zalewającą, wymieniając strzykawkę i regulując płytę podstawy, a następnie zwolnij dźwignię zacisku strzykawki i przesuń ją do górnej pozycji. Uruchom oprogramowanie do doboru rozmiaru i przygotuj mieszankę barwników żelowych.

Wiruj koncentrat barwnika przez 10 sekund, a następnie odwiruj go. Następnie dodaj 25 mikrolitrów barwnika do fiolki z matrycą żelową i zmieszaj roztwór, aby wymieszać. Przenieś mieszankę barwników żelowych do filtra wirowego, umieść ją w wirówce i wiruj przez 10 minut z prędkością 1500 razy g.

Gdy będziesz gotowy do załadowania mieszanki barwników żelowych, włóż nowy chip DNA do stacji zalewania i dodaj dziewięć mikrolitrów mieszanki barwników żelowych do studzienki oznaczonej G. Zamknij stację zalewania i upewnij się, że tłok jest umieszczony na znaku jednego mililitra. Wcisnąć tłok strzykawki w dół, aż zostanie przytrzymany przez zacisk. Odczekaj dokładnie 30 sekund, a następnie zwolnij klips.

Odczekaj jeszcze pięć sekund, a następnie powoli pociągnij tłok z powrotem do pozycji jednego mililitra. Otwórz stację zasysania i dodaj dziewięć mikrolitrów mieszanki barwników żelowych do studzienek oznaczonych G. Dodaj pięć mikrolitrów markera do studzienki oznaczonej symbolem drabinki i każdej z 12 studzienek na próbki. Dodaj jeden mikrolitr drabiny do studzienki z symbolem drabiny i jeden mikrolitr produktu PCR lub wody do dołków na próbki.

Wiruj chip przez jedną minutę z prędkością 2400 obr./min. Włóż go do bioanalizatora i uruchom chip w ciągu pięciu minut. Po zakończeniu przebiegu wyeksportuj dane szczytowe jako pliki tabeli csv.

Jako próbki referencyjne stosuje się próbkę żeńską z premutacją i próbkę żeńską z pełną mutacją. Górny i dolny pik znacznikowy są zawarte w profilu wielkości fragmentu, a zwykle występuje pik kompleksu starterów na około 95 parach zasad. Te próbki referencyjne są używane do konstruowania krzywej standardowej regresji.

Krzywa standardowa regresji liniowej jest następnie używana do obliczania powtarzalnych rozmiarów nieznanych próbek. Kliniczne próbki normalnej, pośredniej, premutacyjnej, pełnej mutacji i mozaikowej pełnej mutacji można prawidłowo sklasyfikować tą metodą. W niektórych przypadkach w wynikach elektroforezy mikroprzepływowej wyświetlany jest tylko jeden pik, co jest prawdopodobnie spowodowane obecnością normalnych homozygotycznych alleli.

Jednym z rodzajów nieoptymalnych wyników jest błąd systematyczny, który może być niejednoznaczny lub niemożliwy do zinterpretowania i podejrzewa się, że jest spowodowany nieprawidłowym działaniem urządzenia. Podejmując próbę wykonania tej procedury, ważne jest, aby zapewnić odpowiednią ilość DNA i jakość przed rozpoczęciem protokołu. Sekwencjonowanie genu FMR1 można przeprowadzić w celu zidentyfikowania wzorca przerwania AGG.

Do monitorowania stanu metylacji można zastosować wrażliwy na metylację enzym restrykcyjny lub test modyfikacji wodorosiarczku. Jest to szybka, solidna i opłacalna technika. Pomoże to innym badaczom w przeprowadzeniu badania populacyjnego dotyczącego statusu nosicielstwa FXS i zaburzeń związanych z łamliwym chromosomem X.