Wykonywanie ksenoprzeszczepów mięśni szkieletowych u myszy z niedoborem odporności

Protokół ten jest istotny, ponieważ może być wykorzystany do tworzenia ksenoprzeszczepów ludzkich mięśni szkieletowych, które można wykorzystać do modelowania chorób mięśni i przeprowadzania przedklinicznych badań terapeutycznych. Ten model ksenoprzeszczepu pozwala naukowcom badać ludzkie mięśnie in vivo, aby lepiej zrozumieć biologię ludzkich komórek mięśniowych i opracować nowe modele rzadkich lub nabytych chorób mięśni. Po uzyskaniu biopsji mięśnia ludzkiego umieść próbkę na szalce Petriego o wymiarach 100 na 15 milimetrów zawierającej podłoże mięśniowe i użyj mikroskopu stereoskopowego i nożyczek chirurgicznych, aby usunąć pozostałą powięź lub tkankę tłuszczową.

Rozbij biopsję mięśnia na kawałki o wymiarach około siedem na trzy na trzy milimetry, uważając, aby włókna były ułożone wzdłużnie w próbce. Następnie przenieś szalkę Petriego zawierającą wycięty mięsień na lód i umieść syntetyczne, niewchłanialne szwy na szalce Petriego o wymiarach 100 na 15 milimetrów z 70% etanolem. Po potwierdzeniu braku reakcji na szczypanie palców u ośmio- do 12-tygodniowej, znieczulonej myszy NOD-Rag-gamma, nałóż maść na oczy zwierzęcia z niedoborem odporności i użyj trymera, aby usunąć włosy pokrywające piszczel przedni od kostki do kolana.

Następnie nałóż krem do depilacji na odsłoniętą skórę na minutę, a następnie zdezynfekuj miejsce operowane roztworem jodu powidonu i 70% etanolem. Aby przeszczepić ludzką tkankę, najpierw przyklej taśmą nogę myszy i wykonaj proste nacięcie nad piszczelą przednią, zaczynając od dystalnych ścięgien i kończąc się poniżej kolana. Użyj cięcia, aby oddzielić skórę od tkanki mięśniowej i użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie o średnicy mniejszej niż 0,5 milimetra przez nabłonek mięśnia piszczelowego przedniego, zaczynając od ścięgna, a kończąc na kolanie.

Po przecięciu dystalnego ścięgna kości piszczelowej przedniej, chwyć ścięgno kleszczami tęczówki i pociągnij mięsień w kierunku kolana. Następnie przetnij dystalne ścięgno prostownika długiego palca i pociągnij prostownik długi palca w kierunku kolana. Gdy ścięgno bliższe mięśnia strzałkowego długiego jest widoczne, usuń nożyczkami prostownik palca długiego i piszczel przedni

Użyj chusteczki chirurgicznej zwilżonej PBS, aby wywrzeć lekki nacisk, aż do uzyskania hemostazy, i przewlecz szew przez ścięgno bliższe strzałkowe długie, pozostawiając około 1,5-calowy kawałek nici po obu stronach ścięgna. Wykonaj pierwszą połowę dwuręcznego kwadratowego węzła chirurgicznego bez zaciskania, aby utworzyć okrąg, i umieść ksenoprzeszczep w okręgu, zaciskając pętlę, aby zabezpieczyć przeszczepioną tkankę. Wykonaj drugą połowę węzła kwadratowego, aby przyszyć ksenoprzeszczep do bliższego ścięgna mięśnia strzałkowego długiego i przeciągnij szew przez dystalne ścięgno strzałkowe długie, aby powtórzyć technikę węzła kwadratowego na dystalnym ścięgnie.

Gdy oba końce przeszczepu zostaną zabezpieczone, naciągnij skórę na mięsień ksenoprzeszczepowany, uszczelnij nacięcie klejem chirurgicznym i umieść dwie do trzech zszywek chirurgicznych na kleju. Następnie umieść mysz w czystej klatce na podgrzewanej podkładce z monitorowaniem aż do pełnego leżenia. Cztery do sześciu miesięcy po operacji umieść zakrytą zlewkę zawierającą 200 mililitrów 2-metylobutanu w pudełku z suchym lodem na co najmniej 30 minut przed pobraniem ksenoprzeszczepu.

Gdy 2-metylobutan ostygnie, potwierdź brak reakcji na szczypanie palców u nóg i usuń włosy leżące nad piszczelą przednią od kostki do kolana za pomocą trymera i kremu do depilacji. Szwy utrzymujące ksenoprzeszczep na miejscu należy obserwować przez skórę. Zabezpiecz nogę taśmą i użyj nożyczek i kleszczyków do tęczówki, aby otworzyć skórę nad ksenoprzeszczepem, aż oba szwy zostaną odsłonięte.

Użyj skalpela, aby przeciąć między ksenoprzeszczepem a piszczelem, aby uwolnić jedną stronę ksenoprzeszczepu przed przecięciem między mięśniem strzałkowym długim a mięśniem brzuchatym łydki. Przeciąć poniżej dystalnego szwu i przez dystalne ścięgno mięśnia strzałkowego długiego i użyć kleszczyków tęczówki, aby chwycić i odchylić szew w kierunku kolana, używając nożyczek, aby odciąć ksenoprzeszczep od leżącej poniżej tkanki mięśniowej. Następnie za pomocą nożyczek przeciąć powyżej proksymalnego szwu, aby usunąć ksenoprzeszczep i mięśnie strzałkowe długie, a pobrany preparat umieścić na małym kawałku tektury.

Przypnij tkankę jak najbliżej szwów, delikatnie rozciągając mięsień, aby upewnić się, że orientacja włókien zostanie utrzymana podczas procesu zamrażania zatrzaskowego. Gdy szpilki są bezpiecznie na swoim miejscu, wsuń mięsień w górę szpilek, tak aby tkanka spoczywała tuż nad kartonem, i zatrzaskowo zamroź ksenoprzeszczep we wstępnie schłodzonym 2-metylobutanie do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Udany ksenoprzeszczep wykazuje solidną regenerację ludzkich włókien mięśniowych, zidentyfikowaną za pomocą przeciwciał specyficznych dla człowieka.

Dodatnie barwienie miozyny embrionalnej w obrębie części włókien mięśniowych wskazuje, że proces regeneracji nadal trwa. Natomiast zła technika chirurgiczna lub nieodpowiedni wycinek mogą prowadzić do słabej regeneracji włókien mięśniowych. Ksenoprzeszczepy wykonane od pacjenta, u którego zdiagnozowano idiopatyczną miopatię zapalną, wykazują umiarkowaną liczbę zregenerowanych ludzkich włókien mięśniowych po cztero- i sześciomiesięcznych pobraniach, a barwienie embrionalnej miozyny utrzymuje się po sześciu miesiącach.

Komórki zapalne są również obecne w ksenoprzeszczepie, co obserwuje się za pomocą barwienia H i E. Indywidualne rozmiary włókien mięśniowych są podobne od czterech do sześciu miesięcy w ksenoprzeszczepach idiopatycznej miopatii zapalnej. Rzadkie włókna o polu przekroju poprzecznego większym niż 3 500 mikrometrów kwadratowych obserwuje się w ksenoprzeszczepach, ale nie w biopsjach idiopatycznej miopatii zapalnej, co wskazuje, że niektóre włókna mięśniowe w ksenoprzeszczepach mogą zregenerować się do obszaru przekroju poprzecznego podobnego wielkością do zdrowych włókien mięśniowych.

Najważniejszą częścią tej procedury jest zidentyfikowanie wszystkich ścięgien w kostce po wykonaniu pierwszego nacięcia i pomyślne przecięcie epimysium. Kompetencję funkcjonalną ksenoprzeszczepów można ocenić poprzez enzymatyczną izolację pojedynczych włókien mięśniowych i testowanie stanów przejściowych wapnia lub poprzez wykonywanie wymuszonych pomiarów wywołanych po stymulacji elektrycznej.