Name: Specyficzny dla cyklu komórkowego pomiar γH2AX i apoptozy po stresie genotoksycznym za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Poznaj metodę pomiaru γH2AX i apoptozy specyficzną dla cyklu komórkowego po stresie genotoksycznym za pomocą cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia kompleksową analizę odpowiedzi komórek na uszkodzenia DNA w badaniach onkologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy zespołowi Zakładu Cytometrii Przepływowej w Niemieckim Centrum Badań nad Rakiem (DKFZ) za wsparcie.

<ol><li>Jensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+non-small+cell+lung+cancer+with+intensity-modulated+radiation+therapy+in+combination+with+cetuximab%3A+the+NEAR+protocol+%28NCT00115518%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518).</a> BMC Cancer. 6, 122(2006).</li>
<li>Oertel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Glioblastoma+and+Carcinoma+Xenograft+Tumors+Treated+by+Combined+Radiation+and+Imatinib+%28Gleevec%29%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec).</a> Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).</li>
<li>Timke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor%2FPlatelet-Derived+Growth+Factor+Receptor+Inhibition+Markedly+Improves+Radiation+Tumor+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy.</a> Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimodal+glioblastoma+treatment+consisting+of+concurrent+radiotherapy%2C+temozolomide%2C+and+the+novel+TGF-%CE%B2+receptor+I+kinase+inhibitor+LY2109761%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761.</a> Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).</li>
<li>Blattmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suberoylanilide+hydroxamic+acid+affects+expression+in+osteosarcoma%2C+atypical+teratoid+rhabdoid+tumor+and+normal+tissue+cell+lines+after+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation.</a> Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).</li>
<li>Hoeijmakers, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Damage%2C+Aging%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">DNA Damage, Aging, and Cancer.</a> New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).</li>
<li>Rodgers, K., McVey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Error-Prone+Repair+of+DNA+Double-Strand+Breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks.</a> Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).</li>
<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+Damage+Response%3A+Making+It+Safe+to+Play+with+Knives%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives.</a> Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).</li>
<li>Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+DNA+double-strand+break+repair+during+the+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).</li>
<li>Escribano-Díaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cell+Cycle-Dependent+Regulatory+Circuit+Composed+of+53BP1-RIF1+and+BRCA1-CtIP+Controls+DNA+Repair+Pathway+Choice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice.</a> Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).</li>
<li>Bakr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+crosstalk+between+DNA+damage+response+proteins+53BP1+and+BRCA1+regulates+double+strand+break+repair+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice.</a> Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).</li>
<li>Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand-break+repair+in+higher+eukaryotes+and+its+role+in+genomic+instability+and+cancer%3A+Cell+cycle+and+proliferation-dependent+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation.</a> Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).</li>
<li>Lopez Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response+of+clinical+carbon+ion+versus+photon+radiation+in+human+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells.</a> Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).</li>
<li>Oertel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+suberoylanilide+hydroxamic+acid+with+heavy+ion+therapy+shows+promising+effects+in+infantile+sarcoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+oncology%22%5BJournal%5D)">Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines.</a> Radiation oncology. 6 (1), 119(2011).</li>
<li>Blattmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suberoylanilide+hydroxamic+acid+affects+%CE%B3H2AX+expression+in+osteosarcoma%2C+atypical+teratoid+rhabdoid+tumor+and+normal+tissue+cell+lines+after+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation.</a> Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).</li>
<li>Thiemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+efficacy+of+the+histone+deacetylase+inhibitor+suberoylanilide+hydroxamic+acid+in+combination+with+radiotherapy+in+a+malignant+rhabdoid+tumor+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model.</a> Radiation Oncology. 7 (1), 52(2012).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+retain+their+defining+stem+cell+characteristics+after+exposure+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+Biology+Physics%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+are+resistant+to+carbon+ion+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy.</a> Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+exhibit+resistance+to+topoisomerase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+letters%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition.</a> Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+maintain+their+defining+stem+cell+characteristics+after+treatment+with+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin.</a> Scientific Reports. 6, 20035(2016).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+are+sensitive+to+bleomycin+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment.</a> Scientific Reports. 6, 26645(2016).</li>
<li>Rühle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin+radiosensitizes+radioresistant+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells.</a> Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).</li>
<li>Münz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+lose+their+functional+properties+after+paclitaxel+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment.</a> Scientific Reports. 8 (1), 312(2018).</li>
<li>Rühle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Radiation+Resistance+of+Human+Multipotent+Mesenchymal+Stromal+Cells+Is+Independent+of+Their+Tissue+of+Origin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+Biology+Physics%22%5BJournal%5D)">The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).</li>
<li>Dean, P. N., Jett, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mathematical+analysis+of+DNA+distributions+derived+from+flow+microfluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry.</a> Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).</li>
<li>Fox, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+the+computer+analysis+of+synchronous+DNA+distributions+obtained+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry.</a> Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).</li>
<li>Costes, S. V., Boissière, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+features+that+discriminate+between+foci+induced+by+high-+and+low-LET+radiation+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts.</a> Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).</li>
<li>Meyer, B., Voss, K. -O., Tobias, F., Jakob, B., Durante, M., Taucher-Scholz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustered+DNA+damage+induces+pan-nuclear+H2AX+phosphorylation+mediated+by+ATM+and+DNA-PK%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK.</a> Nucleic Acids Research. 41 (12), 6109-6118 (2013).</li>
<li>Lopez Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+light+microscopy+shows+nanostructure+of+carbon+ion+radiation-induced+DNA+double-strand+break+repair+foci%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB%22%5BJournal%5D)">Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci.</a> FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).</li>
<li>Schipler, A., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand-break+complexity+levels+and+their+possible+contributions+to+the+probability+for+error-prone+processing+and+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice.</a> Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).</li>
<li>Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+fragmentation+by+charged+particle+tracks%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Space+Research%22%5BJournal%5D)">DNA fragmentation by charged particle tracks.</a> Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).</li>
<li>Friedland, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+track-structure+based+evaluation+of+DNA+damage+by+light+ions+from+radiotherapy-relevant+energies+down+to+stopping%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping.</a> Scientific Reports. 7, 45161(2017).</li>
<li>Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+DNA+Fragments+Are+a+Hallmark+of+Heavy+Charged-Particle+Irradiation+and+May+Underlie+Their+Greater+Therapeutic+Efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy.</a> Frontiers in Oncology. 6, 130(2016).</li>
<li>Böcker, W., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+Methods+for+analysis+of+foci%3A+validation+for+radiation-induced+gamma-H2AX+foci+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells.</a> Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).</li>
<li>Löbrich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3H2AX+foci+analysis+for+monitoring+DNA+double-strand+break+repair%3A+Strengths%2C+limitations+and+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization.</a> Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisywana metoda jest łatwa w użyciu i oferuje szybki, dokładny i powtarzalny pomiar odpowiedzi na uszkodzenie DNA, w tym indukcję i naprawę pęknięcia podwójnej nici (DSB), efekty cyklu komórkowego i apoptozę śmierci komórki. Połączenie tych punktów końcowych zapewnia pełniejszy obraz ich wzajemnych relacji niż poszczególne testy. Metoda ta może być szeroko stosowana jako kompleksowe badanie genotoksyczności w dziedzinie biologii radiacyjnej, terapii i ochrony, a bardziej ogólnie w onkologii (np. do oceny środowiskowych ...

Celem onkologii jest zabijanie lub inaktywacja komórek rakowych bez uszkadzania normalnych komórek. Wiele terapii bezpośrednio lub pośrednio indukuje stres genotoksyczny w komórkach nowotworowych, ale także w pewnym stopniu w normalnych komórkach. Chemioterapia lub leki celowane są często łączone z radioterapią w celu zwiększenia wrażliwości radioterapii napromieniowanego nowotworu1,2,3,4,5, co pozwala na zmniejszenie dawki promieniowania w celu zminimalizowania normalnego uszkodzenia tkanek.
Promieniowanie jonizujące i inne czynniki genotoksyczne wywołują różne rodzaje uszkodzeń DNA, w tym modyfikacje zasad, wiązania krzyżowe nici oraz pęknięcia jedno- lub dwuniciowe. Pęknięcia dwuniciowe DNA (DSB) są najpoważniejszymi zmianami w DNA, a ich indukcja jest kluczem do zabijania komórek przez promieniowanie jonizujące i różne leki cytostatyczne w radiochemioterapii. DSB nie tylko szkodzą integralności genomu, ale także sprzyjają powstawaniu mutacji6,7. Dlatego podczas ewolucji rozwinęły się różne szlaki naprawy DSB i mechanizmy eliminacji nieodwracalnie uszkodzonych komórek, takich jak apoptoza. Cała odpowiedź na uszkodzenie DNA (DDR) jest regulowana przez złożoną sieć szlaków sygnałowych, które sięgają od rozpoznawania uszkodzeń DNA i zatrzymania cyklu komórkowego, aby umożliwić naprawę DNA, do zaprogramowanej śmierci komórki lub inaktywacji w przypadku niepowodzenia naprawy8.
Przedstawiona metoda cytometrii przepływowej została opracowana do badania DDR po stresie genotoksycznym w jednym kompleksowym teście, który obejmuje indukcję i naprawę DSB, a także konsekwencje niepowodzenia naprawy. Łączy w sobie pomiar szeroko stosowanego markera DSB γH2AX z analizą cyklu komórkowego i indukcją apoptozy, przy użyciu klasycznej analizy subG1 i bardziej szczegółowej oceny aktywacji kaspazy-3.
Połączenie tych punktów końcowych w jednym teście nie tylko redukuje czas, robociznę i koszty, ale także umożliwia specyficzny dla cyklu komórkowego pomiar indukcji i naprawy DSB, a także aktywację kaspazy-3. Takie analizy nie byłyby możliwe w przypadku niezależnie przeprowadzonych testów, ale są one bardzo istotne dla kompleksowego zrozumienia reakcji na uszkodzenie DNA po stresie genotoksycznym. Wiele leków przeciwnowotworowych, takich jak związki cytostatyczne, jest skierowanych przeciwko dzielącym się komórkom, a ich skuteczność jest silnie uzależniona od etapu cyklu komórkowego. Dostępność różnych procesów naprawy DSB zależy również od etapu cyklu komórkowego i wyboru ścieżki, co ma kluczowe znaczenie dla dokładności naprawy, a to z kolei decyduje o losie komórki9,10,11,12. Ponadto pomiar poziomów DSB specyficzny dla cyklu komórkowego jest dokładniejszy niż analiza zbiorcza, ponieważ poziomy DSB są zależne nie tylko od dawki związku genotoksycznego lub promieniowania, ale także od zawartości DNA w komórce.
Metoda została wykorzystana do porównania skuteczności różnych radioterapii w celu pokonania mechanizmów oporności w glejaku13 oraz do zbadania wzajemnych zależności między promieniowaniem jonizującym a lekami celowanymi w kostniakomięsaku14,15 i atypowe teratoidalne raki rabdoidowe16. Dodatkowo, opisana metoda jest szeroko stosowana do analizy skutków ubocznych radio- i chemioterapii na mezenchymalne komórki macierzyste17,18,19,20,21,22,23,24, które są niezbędne do naprawy prawidłowych uszkodzeń tkanek wywołanych leczeniem i mają potencjalne zastosowanie w medycynie regeneracyjnej.

<table><tbody><tr><td>1 000 i mikro; Końcówki filtracyjne L</td><td>Nerbe plus</td><td>07-693-8300</td><td></td></tr><tr><td>100-1,000 &micro; Pipeta L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm Probówki z nasadką sitka komórkowego, 35 &mikro; m rozmiar oczek</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>probówki 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>200 &mikro; Końcówki filtra L</td><td>Nerbe plus</td><td>07-662-8300</td><td></td></tr><tr><td>20-200 &micro; L pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidin-2-fenylindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Rozpuścić w wodzie o stężeniu 200 &mikro; g/ml i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-H2A.X Phospho (Ser139) przeciwko H2A.X Fluor 488, RRID: AB_2248011</td><td>BioLegend</td><td>613406</td><td>Rozcieńczyć 1:20</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Antyaktywne przeciwciało przeciw kaspazie-3 królika, AB_1727414</td><td>Pharmingen</td><td>560626</td><td>Rozcieńczony 1:20</td></tr><tr><td>BD FACSPrzedstaw odchudzany BD</td><td>Biosciences</td><td>340345</td><td>Do rutynowego czyszczenia cytometru po pomiarze</td></tr><tr><td>BD FACSRinse roztwór</td><td>BD Biosciences</td><td>340346</td><td>Do rutynowego czyszczenia cytometru po pomiarze</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Biochrom</td><td>L 182</td><td>Rozpuścić w wodzie do stężenia 1x Zmodyfikowana</td></tr><tr><td>pożywka Eagle's Medium firmy Dulbecco ze stabilną glutaminą</td><td>Biochrom</td><td>FG 0415</td><td>Rutynowy materiał do hodowli komórkowej dla przykładowej linii komórkowej użytej w protokole</td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td>VWR</td><td>20821.330</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS Superior (płodowa surowica bydlęca)</td><td>Biochrom</td><td>S 0615</td><td>Rutynowy materiał do hodowli komórek dla przykładowej linii komórkowej użytej w protokole</td></tr><tr><td>FlowJo v10 software</td><td>LLC</td><td>zamówienie</td><td></td>online</tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>Podłoże do zatapiania do opcjonalnego przygotowania preparatów mikroskopowych z barwionych próbek</td></tr><tr><td>Filtry celulozowe składane, klasa 3hw</td><td>NeoLab</td><td>11416</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr LSRII lub LSRFortessa</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Calbiochem</td><td>474787</td><td>opcjonalny lek do apoptozy kontrola pozytywna</td></tr><tr><td>Multifuge 3SR+</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>AppliChem</td><td>A3813</td><td>Przygotuj świeży 4,5% roztwór. Rozcieńczyć w PBS przez podgrzanie do 80 & deg; C z powolnym mieszaniem pod wyciągiem. Przykryj kolbę folią aluminiową, aby zapobiec utracie ciepła. Pozwól roztworowi ostygnąć do temperatury pokojowej i dostosuj ostateczną objętość. Przepuść roztwór przez filtr celulozowy.</td></tr><tr><td>Fosfo-histon H3 (Ser10) (D2C8) XP Królik mAb (koniugat Alexa Fluor&reg; 555) RRID: AB_10694639</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>#3475</td><td>Rozcieńczony 3:200</td></tr><tr><td>PIPETBOY acu 2</td><td>Integra Biosciences</td><td>155 016</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne, 10 ml</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne, 25 ml</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne, 5 ml</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>SuperKillerTRAIL (zmodyfikowany ligand indukujący apoptozę związaną z TNF)</td><td>Biomol</td><td>AG-40T-0002-C020</td><td>opcjonalny lek do apoptozy kontrola pozytywna</td></tr><tr><td>Kolby do hodowli komórkowych T25</td><td>Greiner bio-one</td><td>690160</td><td>Rutynowy materiał do hodowli komórkowej dla przykładowej linii komórkowej stosowanej w protokole</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>PAN Biotech</td><td>P10-025500</td><td>Rutynowy materiał do hodowli komórkowej dla przykładowej linii komórkowej użytej w protokole</td></tr><tr><td>U87 MG komórki glejaka wielopostaciowego</td><td>ATCC</td><td>ATCC-HTB-14</td><td>Przykładowa linia komórkowa wykorzystana w protokole</td></tr></tbody></table>

specyficzny dla cyklu komórkowego pomiar γh2ax i apoptozy po stresie genotoksycznym za pomocą cytometrii przepływowej

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Przedstawiona metoda lub nieco zmodyfikowane wersje zostały opracowane do badania konkretnych odpowiedzi na leczenie i skutków ubocznych różnych terapii przeciwnowotworowych stosowanych w onkologii klinicznej. Umożliwia ilościową i podłużną analizę odpowiedzi na uszkodzenia DNA po stresie genotoksycznym, wywołanym radioterapią i wieloma lekami przeciwnowotworowymi. Metoda obejmuje wszystkie etapy odpowiedzi na uszkodzenie DNA, zapewniając punkty końcowe dla indukcji i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA (DSB), zatrzymania cyklu komórkowego i śmierci komórki przez apoptozę w przypadku niepowodzenia naprawy. Połączenie tych pomiarów dostarcza informacji na temat efektów leczenia zależnych od cyklu komórkowego, a tym samym umożliwia dogłębne badanie wzajemnych zależności między proliferacją komórkową a mechanizmami radzenia sobie z uszkodzeniem DNA. Ponieważ działanie wielu leków przeciwnowotworowych, w tym chemioterapeutyków i promieniowania jonizującego, jest ograniczone lub silnie różni się w zależności od określonych faz cyklu komórkowego, analizy korelacyjne opierają się na solidnej i wykonalnej metodzie oceny wpływu leczenia na DNA w sposób specyficzny dla cyklu komórkowego. Nie jest to możliwe w przypadku testów z pojedynczym punktem końcowym, co stanowi istotną zaletę prezentowanej metody. Metoda nie jest ograniczona do żadnej konkretnej linii komórkowej i została dokładnie przetestowana na wielu liniach komórek nowotworowych i normalnych tkankowych. Może być szeroko stosowany jako kompleksowy test genotoksyczności w wielu dziedzinach onkologii poza radioonkologią, w tym w ocenie środowiskowych czynników ryzyka, badaniach przesiewowych leków i ocenie niestabilności genetycznej w komórkach nowotworowych.

Ludzkie komórki glejaka U87 lub LN229 poddano napromieniowaniu dawką 4 Gy fotonów lub jonów węgla. Poziomy γH2AX specyficzne dla fazy cyklu komórkowego oraz apoptozę mierzono w różnych punktach czasowych do 48 h po napromieniowaniu, stosując przedstawioną tutaj metodę cytometrii przepływowej (Rysunek 3). W obu liniach komórkowych jony węgla wywołały wyższe szczytowe poziomy γH2AX, które spadały wolniej i pozostawały istotnie podwyższone od 24 do 48 h w porównaniu z napromieniowaniem fotonowy...

Prezentowana metoda łączy ilościową analizę pęknięć dwuniciowych DNA (DSB), dystrybucji cyklu komórkowego i apoptozy, aby umożliwić specyficzną dla cyklu komórkowego ocenę indukcji i naprawy DSB, jak również konsekwencji niepowodzenia naprawy.

Specyficzny dla cyklu komórkowego pomiar γH2AX i apoptozy po stresie genotoksycznym za pomocą cytometrii przepływowej

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Metoda dostarcza informacji na temat efektów leczenia zależnych od cyklu komórkowego i umożliwia dogłębne badanie wzajemnych oddziaływań między proliferacją komórkową a mechanizmami radzenia sobie z uszkodzeniem DNA. Metoda ta łączy ważne punkty końcowe odpowiedzi na uszkodzenie DNA, w tym rozpoznawanie i naprawę dwuniciowych fragmentów, efekty cyklu komórkowego i ostateczną śmierć komórki przez apoptozę, w jeden kompleksowy test. Wykorzystaliśmy tę technikę głównie do zbadania specyficznych odpowiedzi na leczenie i skutków ubocznych leczenia radiochemioterapeutycznego w onkologii klinicznej.Test jest bardzo przydatny w badaniach korelacyjnych w dziedzinie radiobiologii i radioterapii, ale może być również stosowany w różnych innych dziedzinach onkologii. Po pobraniu komórek z hodowli zgodnie ze standardowymi procedurami pobierania komórek, ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze PBS. I przenieś komórki do dwóch mililitrów roztworu utrwalającego w okapie.Po 10 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej zebrać komórki przez odwirowanie i zdekantować supernatant. Ważne jest, aby utrwalić komórki jako zawiesinę pojedynczej komórki i utrzymać stały czas wiązania dla wszystkich próbek. Daj przylegającym komórkom wystarczająco dużo czasu na odłączenie się, aby uzyskać ładnie zaokrąglone komórki do analizy.Następnie poluzuj osad, stukając i ponownie zawieś ogniwa w trzech mililitrach 70% etanolu. Aby umyć komórki przed barwieniem, osadź komórki przez odwirowanie i poluzuj granulkę, stukając. Następnie ponownie wymieszaj komórki w dwóch kolejnych płukaniach trzema mililitrami roztworu myjącego i jednym płukaniu jednym mililitrem roztworu myjącego.Odrzucanie supernatantu między każdym praniem. Po ostatnim praniu ostrożnie zassać supernatant bez naruszania osadu i ponownie zawiesić przezroczysty osad w 100 mikrolitrach interesującego nas koktajlu przeciwciał. Po jednej godzinie w temperaturze pokojowej zebrać komórki przez odwirowanie i ostrożnie zassać supernatant, nie naruszając osadu.Następnie ponownie zawieś poluzowany osad w 100 do 250 mikrolitrach roztworu do barwienia DNA i dozuj komórki przez nasadkę sitka komórkowego probówki z próbką o wielkości porów 35 mikrometrów. Aby przeanalizować komórki za pomocą cytometrii przepływowej, otwórz zakładkę parametry w oknie cytometru i wybierz parametry zgodnie ze wskazaniami w tabeli. Następnie otwórz okno arkusza roboczego i utwórz wykresy zgodnie ze wskazaniami.Załaduj próbkę kontrolną do cytometru i naciśnij przycisk uruchamiania. Wybierz pierwszą rurę w oknie przeglądarki i kliknij nazwę rury. Dostosuj napięcia detektora dla rozproszenia przedniego i bocznego oraz DAPI w zakładce parametrów okna inspektora.Naciśnij przycisk gotowości, aby kontynuować konfigurację arkusza roboczego w oprogramowaniu. Użyj narzędzia bramki wielokątnej, aby zdefiniować populację komórek w obszarze rozproszenia do przodu w porównaniu z wykresem obszaru rozproszonego z boku, a także użyj narzędzia bramki prostokątnej, aby zdefiniować populację pojedynczych komórek na wykresie DAPI z wykresem obszaru w porównaniu z DAPI. Naciśnij G , aby wyświetlić hierarchię populacji i kliknij domyślne nazwy bram, aby zmienić ich nazwy.Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy wszystkie histogramy, aby wybrać pokaż populacje i pojedyncze komórki z menu kontekstowego. Pobieranie próbek kontrolnych i poddanych działaniu substancji w celu optymalizacji napięć detektora dla fluoroforów sprzężonych z przeciwciałami, aby pokryć pełny zakres dynamiczny sygnału. Aby zmierzyć próbki, naciśnij przycisk uruchamiania na cytometrze i użyj pulpitu nawigacyjnego akwizycji w oprogramowaniu do pomiaru próbek.Następnie wybierz pozycję plik, eksport i eksperymenty, aby wybrać pozycję eksportu katalogu w oknie dialogowym, aby zapisać dane jako pliki FCS z kropką. Aby ocenić dane, przeciągnij i upuść pliki FCS z kropkami do przeglądarki próbek w oprogramowaniu do analizy cytometrii przepływowej. Za pomocą narzędzia wielokątów można zdefiniować populację komórek na wykresie obszaru rozproszenia z przodu i z boku oraz wykluczyć zanieczyszczenia z analizy.Na wykresie DAPI z porównaniem obszaru DAPI użyj narzędzia prostokąt, aby zdefiniować populację pojedynczych komórek i wykluczyć z analizy wszelkie dublety lub skupiska komórek. Na histogramie obszaru DAPI użyj narzędzia dwusiecznego, aby odróżnić pojedyncze komórki o normalnej zawartości DNA od komórek apoptotycznych ze zdegradowanym DNA. Wybierz narzędzie biologia i cykl komórkowy, aby otworzyć narzędzie do modelowania cyklu komórkowego i wybierz Dean-Jett Fox, aby oszacować częstotliwość komórek w fazach G, jeden, S i G, dwie M.Utwórz bramki fazowe G, jeden, S i G, dwa i M w DAPI z wykresem obszaru w funkcji DAPI populacji cyklu komórkowego, aby umożliwić pomiar gamma H dwa A X specyficzny dla cyklu komórkowego. Użyj narzędzia dwusiecznego, aby odróżnić trzy dodatnie i ujemne komórki fosfohistonu H w histogramie obszaru Alexa 555 populacji cyklu komórkowego oraz aby rozróżnić trzy dodatnie i ujemne komórki CAS o podstawie CAS na histogramie obszaru Alexa 647 populacji pojedynczych komórek. Naciśnij Control T, aby otworzyć edytor tabel i skonfigurować tabelę zgodnie ze wskazaniami.Następnie wybierz opcję Do pliku, aby ustawić format i miejsce docelowe w sekcji danych wyjściowych wstążki menu i wyeksportować dane do arkusza kalkulacyjnego. Jony węgla indukują wyższe poziomy gamma H, dwa szczyty AX w komórkach glejaka, które zmniejszają się wolniej i pozostają znacznie podwyższone w ciągu 24 do 48 godzin w porównaniu z promieniowaniem fotonowym w tej samej dawce fizycznej. Zarówno w przypadku jonów węgla, jak i promieniowania fotonowego, poziomy gamma H dwa AX były najwyższe w komórkach jednofazowych G, prawdopodobnie dlatego, że naprawa pęknięć podwójnej nici DNA jest ograniczona do szlaku łączenia niehomologicznych końców na tym etapie cyklu komórkowego.Zgodnie z wyższą szybkością indukcji pękania podwójnej nici i wolniejszą kinetyką naprawy, jony węgla indukują silniejsze i dłużej trwające zatrzymanie cyklu komórkowego w dwufazowej G i wyższą szybkość apoptozy niż fotony. W zależności od siły efektu leczenia, rozwiązanie różnych faz cyklu komórkowego może być trudne. W niektórych liniach komórkowych stężenie DAPI ma duży wpływ na jakość profilu cyklu komórkowego i musi zostać dostosowane.Z pozostałych próbek po cytometrii przepływowej można przygotować szkiełka w celu oceny liczby, wielkości i kształtu ognisk gamma H dwóch AX oraz rozróżnienia ogniskowego i parjądrowego barwienia gamma H dwa AX. Korzystając z naszej metody, mogliśmy wykazać, że mezenchymalne komórki macierzyste są stosunkowo odporne na promieniowanie jonizujące i hamowanie topoizomerazy, ale wrażliwe na glejomyanę. Ponieważ opary PFA są toksyczne, zawsze używaj dygestorium podczas przygotowywania roztworu utrwalającego i na etapie utrwalania.Pamiętaj również o noszeniu rękawiczek podczas obsługi DAPI.

cell-cycle-specific-measurement-h2ax-apoptosis-after-genotoxic-stress

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ilościowe oznaczanie pęknięć obu nici DNA z wykorzystaniem formowania γH2AX jako markera molekularnego stało się nieocenionym narzędziem w radiobiologii. W niniejszej pracy demonstrujemy zastosowanie testu immunofluorescencyjnego do ilościowego oznaczania ognisk γH2AX po narażeniu komórek na promieniowanie.

Ilościowe oznaczanie ognisk &gamma;H2AX w odpowiedzi na promieniowanie jonizujące

Ilościowe oznaczanie pęknięć dwuniciowych DNA na podstawie ognisk γH2AX stało się nieocenionym narzędziem, szczególnie w radiobiologii, służącym do oceny radiowrażliwości tkanek oraz efektów związków modyfikujących działanie promieniowania. W niniejszym materiale demonstrujemy zastosowanie testu immunofluorescencyjnego do ilościowego oznaczania ognisk γH2AX w próbkach tkanek.

Ilościowe oznaczenie ognisk $\gamma$H2AX w próbkach tkanek

W tym filmie opisujemy technikę mikroskopii immunofluorescencyjnej do wykrywania specyficznych białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA zlokalizowanych w miejscach pęknięć dwuniciowych DNA w ludzkich komórkach jednojądrzastych. Białka są rozpoznawane przez specyficzne przeciwciała pierwszorzędowe, które z kolei wiążą się z przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi fluoroforem, które fluoryzują podczas wizualizacji mikroskopowej, umożliwiając wizualizację białek jako odrębnych ognisk...

Mikroskopia immunofluorescencyjna do analizy pęknięć dwuniciowych DNA

Ten protokół opisuje wykorzystanie wychwytu bromodeoksyurydyny (BrdU), aby umożliwić czasowe śledzenie komórek, które były w fazie S w określonym momencie. Dodanie barwników DNA i znakowanie przeciwciałami ułatwia szczegółową analizę losów komórek fazy S w późniejszym czasie.

Czasowe śledzenie progresji cyklu komórkowego za pomocą cytometrii przepływowej bez konieczności synchronizacji

Przedstawiono protokół oceny zmian w poziomach uszkodzeń DNA i zdolności do naprawy DNA, które mogą być wywołane przez przewlekłe napromienianie in vivo niskimi dawkami limfocytów śledziony myszy, poprzez pomiar fosforylowanego histonu H2AX, markera pęknięć dwuniciowych DNA, za pomocą cytometrii przepływowej.

Pomiar uszkodzeń i naprawy DNA w splenocytach myszy po przewlekłej ekspozycji in vivo na bardzo niskie dawki promieniowania beta i gamma

Ten manuskrypt zawiera protokół do analizy pęknięć dwuniciowych DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej γH2AX i 53BP1.

Mikroskopia immunofluorescencyjna γH2AX i 53BP1 do analizy powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA

Po uszkodzeniu DNA, ludzkie komórki aktywują niezbędne szlaki naprawcze, aby przywrócić integralność swojego genomu. W tym miejscu opisujemy metodę immunofluorescencji pośredniej jako sposób na wykrycie białek naprawy DNA, analizę ich przestrzennej i czasowej rekrutacji oraz pomoc w badaniu interakcji białko-białko w miejscach uszkodzenia DNA.

Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

Ten protokół przedstawia przygotowanie preparatu i automatyczną ocenę testu ognisk γ-H2AX na limfocytach krwi obwodowej. Aby zilustrować metodę i czułość testu, izolowane limfocyty napromieniano in vitro. Ta zautomatyzowana metoda wykrywania DNA DSB jest przydatna w szybkich i wysokowydajnych zastosowaniach dozymetrii biologicznej.

Zautomatyzowana mikroskopowa metoda oceny ognisk γ-H2AX w ludzkich limfocytach krwi obwodowej

Tutaj prezentujemy metodę opartą na cytometrii przepływowej do wizualizacji i kwantyfikacji wielu markerów związanych ze starzeniem się w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne obrazowanie i wykrywanie za pomocą cytometrii przepływowej wielu fluorescencyjnych markerów starzenia w starczych komórkach nowotworowych wywołanych terapią

Ten protokół przedstawia metodę oceny powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA poprzez jednoczesne wykrywanie ognisk γH2AX i 53BP1 w jądrach interfazowych ludzkich limfocytów obwodowych traktowanych bleomycyną.

Podwójna immunofluorescencja γH2AX i 53BP1 w ludzkich limfocytach obwodowych

Tutaj prezentujemy prosty i szybki protokół wykrywania oddziaływań białek w miejscach uszkodzenia DNA.

Test ligandów zbliżeniowych do lokalizacji białek w miejscach uszkodzenia DNA

Poznaj metodę pomiaru γH2AX i apoptozy specyficzną dla cyklu komórkowego po stresie genotoksycznym za pomocą cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia kompleksową analizę odpowiedzi komórek na uszkodzenia DNA w badaniach onkologicznych.

Specyficzny dla cyklu komórkowego pomiar γH2AX i apoptozy po stresie genotoksycznym za pomocą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów